פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס מודל פשוט ויעיל להשתלת עוברים במבחנה להערכת המולקולות הרלוונטיות המשפיעות על תהליך השתלת העוברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלת עובר היא הצעד הראשון בביסוס הריון מוצלח. מודל במבחנה להשתלת עוברים הוא קריטי למחקר ביולוגי בסיסי, פיתוח תרופות והקרנה. מאמר זה מציג מודל פשוט, מהיר ויעיל ביותר במבחנה להשתלת עוברים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים תחילה רכישת בלסטוציסט עכבר והכנת תאי אדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית (אישיקאווה) להשתלה, ולאחר מכן את שיטת התרבית המשותפת עבור עוברי עכברים ותאי אישיקאווה. לבסוף, ערכנו מחקר כדי להעריך את ההשפעה של ריכוזים משתנים של 17-β-אסטרדיול (E2) ופרוגסטרון (P4) על שיעורי הידבקות עוברים בהתבסס על מודל זה. הממצאים שלנו גילו כי ריכוזים גבוהים של E2 הפחיתו באופן משמעותי את הידבקות העובר, בעוד שתוספת של פרוגסטרון יכולה להחזיר את קצב ההידבקות. מודל זה מציע פלטפורמה פשוטה ומהירה להערכה וסינון של מולקולות המעורבות בתהליך ההדבקה, כגון ציטוקינים, תרופות וגורמי שעתוק השולטים בהשתלה ובקליטת רירית הרחם.
מבוא
השתלת עוברים, השלב הראשון של הריון מוצלח, חיונית להבנת הבסיס הביולוגי שלה ולהתמודדות עם אתגרי אי הפוריות. עם זאת, אילוצים אתיים מציבים מגבלות משמעותיות באיסוף דגימות עוברים קליניים אנושיים, ופוגעים במחקר על האינטראקציות המורכבות בין עוברים אנושיים לרירית הרחם במהלך תחילת ההריון1. הבנה מעמיקה של מנגנונים מורכבים אלה חיונית לקידום מחקר ביולוגי בסיסי, גילוי תרופות ובריאות הרבייה.
מודלים קודמים במבחנה השתמשו במודלים של הידבקות שבהם תאי אפיתל רירית הרחם האנושיים (RL95-2)2 היו בתרבית משותפת עם תחליפים עובריים, כגון BeWo, JAr, או Jeg-33 choriocarcinoma cells. אף על פי כן, בחירת גודל הספרואידים, בין 70-100 מיקרומטר, הייתה קריטית מכיוון שצברי תאים גדולים או קטנים יותר עלולים לפגוע בדיוק הניסוי. יש לציין כי רק 25% מהספרואידים בכל תכשיר עמדו בתקן במידה4 המתאימה, והיו הבדלים משמעותיים בהשוואה לתנאים הפיזיולוגיים של בלסטוציסטים.
יתר על כן, מערכות תרבית תלת ממדיות (3D) עבור רירית הרחם והבלסטוציסט מציעות סביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית5, אך הן דורשות מומחיות טכנית גבוהה, צמיחת תאים איטית, עלויות משאבים ותחזוקה גבוהות, קושי בסטנדרטיזציה ויכולת שחזור נמוכה6.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל חסכוני ומהיר של השתלת עוברים שניתן לפתח ולהשתמש בו ברוב המעבדות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק פלטפורמה אמינה וניתנת לשחזור לחקר יחסי הגומלין בין עוברים לרירית הרחם בסביבה מבוקרת. על ידי סימולציה של אירועי מפתח של השתלת עוברים במבחנה, מודל זה נועד לגשר על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין הגדרות קליניות, ולאפשר מחקר מדויק וממוקד יותר.
בהשוואה לתחליפים עובריים, השימוש בבלסטוציסטים של עכבר מציע ייצוג רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית של תהליך השתלת עובר in vivo7. בנוסף, קו תאי אישיקאווה, הנגזר מאדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית, הוא בעל מאפיינים מעורבים של אפיתל בלוטי ואפיתל לומן הרחם1, המאפשרים לו לבטא אנזימים, חלבונים מבניים וקולטני סטרואידים פונקציונליים הדומים לאלה הנמצאים ברירית הרחם הרגילה, ובכך לספק מצע רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להשתלת עוברים. הפשטות והמהירות של מערכת התרבות המשותפת מאפשרות סינון בתפוקה גבוהה ובדיקות סמים 8,9,10. על ידי מתן פלטפורמה חזקה וניתנת לשחזור, שיטה זו מציעה הזדמנות לקדם את הבנתנו את השתלת העוברים והשפעתה על בריאות האדם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
טיפול בעכברים ומחקרים ניסיוניים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי החיים של מכון שנגחאי לטכנולוגיות ביו-רפואיות ופרמצבטיות. הקפידו על נהלי בטיחות: לבשו תמיד ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת טיפול בכימיקלים או בחומרים ביולוגיים.
1. רכישת עוברי עכבר
הערה: סעיף זה מתאר את תהליך קבלת עוברי עכבר. נקבות עכברים בוגרות (בנות 6-8 שבועות, היברידיות C57BL/6 ו-DBA/2) נשמרו בתנאים סביבתיים סטנדרטיים של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך ב-20-25 מעלות צלזיוס ו-40-60% לחות עם מזון ומים שסופקו עד לליביטום.
- יש להזריק לנקבות עכברים תוך צפקיות 10 IU של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) ולאחר מכן, להזריק 10 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) במרווח של 42-48 שעות.
- קשרו כל נקבת עכבר עם זכר בגיל דומה ובדקו אם יש פקק בנרתיק למחרת בבוקר.
הערה: פקק נרתיקי הוא גוש צהוב בהיר של נרות שנוצר לאחר שהזרע מתמצק בפתח הנרתיק. - הרדימו את נקבות העכברים עם פקקי נרתיק על ידי שאיפתCO2 .
- לפתוח את הבטן ולאתר את איבר המין הנשי; למתוח את oviduct, השחלה, כריות שומן עם מלקחיים; לחתוך את oviduct ואת השחלה עם מספריים; ואז, חתכו את האובידוקט ואת הרחם (איור 1).
- מעבירים את האובידוקט המתקבל לצלחת פטרי 35 מ"מ ממולאת מראש בתווך M2.
הערה: M2 בינוני צריך להיות מחומם מראש באינקובטור (37 ° C, 5% CO2) במשך 30 דקות. - נקבו את האמפולה המוגדלת של האובידוקט עם מחט של 25 גרם כדי לשחרר או לצבוט את קומפלקס קומולוס-זיגוטה (איור 2).
- השתמשו במלקחיים כדי להעביר את קומפלקס הקומולוס-זיגוטה לתמיסת M2 המכילה היאלורונידאז במינון 0.5 מ"ג/מ"ל ולדגור במשך מספר דקות עד שתאי הקומולוס יתנתקו (איור 3).
- אספו את הזיגוטה באמצעות פיפטה להעברת ביצים ושטפו אותן בתווך M2 המכיל 4 מ"ג/מ"ל BSA כדי להסיר שאריות היאלורונידאז, תאי קומולוס וזיהומים.
2. תרבית חוץ גופית של עובר עכבר
הערה: סעיף זה מפרט את התהליך של גידול עוברי עכבר במבחנה מזיגוטה לבלסטוציסט. יש להכין מיקרו-טיפות תרבית KSOM 24 שעות קדימה כדי להבטיח טמפרטורה ושיווי משקל גזים.
- הכינו 12 מיקרו-טיפות של מדיום KSOM, כל אחת בנפח של 20 μL, בתחתית צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. כסו את המיקרו-טיפות ב-3-5 מ"ל שמן מינרלי (איור 4), והניחו את צלחות הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 לצורך איזון.
- מעבירים את עוברי העכבר ממדיום M2 למדיום KSOM באמצעות פיפטת העברה לשטיפה יסודית.
הערה: שלב זה דורש סטריאומיקרוסקופ עם שלב חימום של 37 מעלות צלזיוס. צמצמו את משך הטיפול בעוברים מחוץ לאינקובטור. - הניחו את העוברים שטופים במיקרו-טיפות KSOM שהוכנו ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 4 ימים.
הערה: כדי להבטיח תזונה נאותה, תרבית 5-10 עוברים לכל 20 מיקרו-טיפה. - בחר בלסטוציסטים מועילים על פי גודלם (100-130 מיקרומטר), מסת התא הפנימית (מסת התא הפנימית מורכבת מתאים רבים שכולם דחוסים), מספר תאי טרופובלסט (הטרופקטודרמיס מורכב מתאים רבים מלוכדים ודחוסים יחד), ומידת ההתפשטות (בלסטוקול תופס 80-100% מהעובר).
3. הכנת תאי רירית הרחם
- בתוך ארון בטיחות ביולוגית, שאפו 1 מ"ל של 2% ג'לטין באמצעות פיפטה והניחו אותו לצלחת תרבית בת 12 בארות. סובבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח כיסוי מלא של התחתית עם הג'לטין. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, שאפו את עודפי הג'לטין והניחו לתחתית הצלחת להתייבש לחלוטין.
- לאחר השלמת תהליך הציפוי, תרבית תאי אדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית (אישיקאווה) עם DMEM/F12 (ראה טבלת חומרים לפרטים), 1 מ"מ נתרן פירובט, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -100 IU / מ"ל פניצילין, זרע אותם לתוך צלחות 12 בארות מצופות ג'לטין (2 × 105תאים / באר), ודגר במשך 24 שעות.
4. התקשרות עובר
- הניחו בעדינות 5-15 בלסטוציסטים טריים בכל באר של צלחת בת 12 בארות המכילה תאי אישיקאווה שהוכנו בשלב הקודם לתרבית משותפת (איור 5).
- לאחר דגירה של 48 שעות, התבוננו בעוברים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את מצב ההתקשרות שלהם. כדי לצפות בחיבור עובר, הזז במהירות את הצלחת שלוש פעמים. עוברים שאינם מחוברים יציגו תנועה צפה או מתגלגלת על פני השטח של תאי אישיקאווה.
- חישוב קצב השתלת העובר באמצעות משוואה (1); השתמש בקצב ההידבקות של העובר כדי לייצג את אפקט ההשתלה.
שיעור השתלת עוברים = (עוברים מחוברים/המספר הכולל של עוברים מושתלים) × 100% (1)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בתהליך של טכניקות רבייה מסייעות, גירוי יתר מבוקר של השחלות (COH) הוא צעד מכריע, המוביל לרמות אסטרוגן גבוהות באופן משמעותי בחולות ביותר מפי 10-20 בהשוואה למחזורים טבעיים11. בהקשר זה, שאלנו האם ריכוזי אסטרוגן גבוהים בסרום משפיעים על השתלת עוברים במהלך החזרת עוברים טריים. בהתבסס על מודל השתלת עוברים זה, חקרנו את ההשפעות של ריכוזים שונים של E2 ו-P4 על שיעורי השתלת עוברים12. לאחר טיפול ברעב, תאי אישיקאווה הודגרו עם E2 (0, 0.1, 1, 10 ו-100 ננומטר) או שילוב ש...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפשטות והמהירות של מודל המבחנה המוצע להשתלת עוברים מציעים יתרונות יוצאי דופן לבדיקות סקר תרופתיות בשלב מוקדם וליישומי מחקר אחרים. הפרוטוקול הפשוט, יחד עם אופי התפוקה הגבוהה של קווי תאי אישיקאווה, הופכים אותו למועמד אידיאלי למסכים בקנה מידה גדול, במיוחד בשלבים המוקדמים של גילוי תרופות. ליאנג13 מצא כי הפלת TAGLN2 הפחיתה את יכולת הפלישה של תאי טרופובלסט. גרין14 הראה כי גורם גדילה דמוי אינסולין שיפר את יכולת ההיצמדות של בלסטוציסט העכבר בהתבסס על מערכת תאי העובר-אישיקאו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים כספיים או אחרים להצהיר.
תודות
המחקרים שלנו נתמכו על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82171603), קרן ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (202140341), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנחאי (23JC1403803), ותוכנית קידום חדשנות של NHC ומעבדות מפתח שנחאי, SIBPT (RC2023-02).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 17-&בטא;-אסטרדיול | SIGMA | 3301 | ההורמון האסטרוגני החזק ביותר של יונקים |
| BD Falcon | BD | 353001 | צלחות פטרי בקטריולוגיות בסגנון 35 x 10 מ"מ עם מכסה הדוק, פוליסטירן בתולי בדרגת קריסטל, |
| ארון בטיחות ביולוגית | ESCO | class  BSC | פעולות אספטיות, הכנת מנות תרבית, ציטוט ריאגנטים וכו |
| CO2 חממה | Thermo | 8000DH | צלחת תרבית עובר |
| קורנינג | 3506 | תרבית תאים | |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), נוזל 1:1, מכיל L-גלוטמין ו-15 מ"מ מאגר HEPES |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10099141 | סרום בקר עוברי, מוסמך, |
| ג'לטין | ממקור אוסטרליה SIGMA | G9391 | סוג B, אבקה, BioReagent, מתאים לתרבית תאים |
| HCG Nanjing Aibei | M2520 | מגיב עיקור, הזרקה תוך צפקית, 50 IU/mL | |
| Hyaluronidase | SIGMA | V900833 | דרגת ריאגנט, אבקה |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), אבקה, ללא פנול אדום, 5 x 10 מ"ל |
| L-גלוטמין | Gibco | 25030081 | L-גלוטמין-200 מ"מ (100x), נוזלי |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 בינוני (1x), נוזלי, עם פנול אדום |
| שמן מינרלי | SIGMA | M8410 | מתאים לשימוש כשכבת כיסוי לבקרת אידוי וזיהום צולב ביישומי ביולוגיה מולקולרית שונים |
| פניצילין-סטרפטומיצין, | ג'יבקו | 15140122 | 10,000 יחידות פניצילין (בסיס) ו-10,000 יחידות סטרפטומיצין (בסיס), תוך שימוש בפניצילין G (מלח נתרן) וסטרפטומיצין סולפט ב-0.85% |
| PMSG | נאנג'ינג Aibei | M2620 | מגיב עיקור, הזרקה תוך צפקית, 50 IU/mL |
| פרוגסטרון | SIGMA | 5341 | הורמון סטרואידים המופרש על ידי הגופיף הצהוב במחצית השנייה של המחזור החודשי |
| נתרן פירובט | Gibco | 11360070 | נתרן פירובט מתווסף בדרך כלל למצע תרבית תאים כמקור פחמן בנוסף לגלוקוז |
| סטריאומיקרוסקופ | אולימפוס | SZX7 | שאיבת עוברים והתבוננות בהתפתחות העובר |
מקורות
- Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
- Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).
- Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines. Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).
- Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. A high-throughput in vitro model of human embryo attachment. Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).
- Karvas, R. M., et al. Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens. Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).
- Berneau, S. C., et al. Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation. Cells. 8 (5), 432(2019).
- Jiang, R., et al. Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure. Cell Death Discov. 3, 17057(2017).
- Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models. Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).
- Duan, C. C., et al. Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study. J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).
- Chen, G., et al. Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer. J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).
- Liang, X., et al. Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization. FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).
- Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro. Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).
- Kang, Y. J., et al. MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R. J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).
- Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
- Ahn, J., et al. Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip. Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).
- Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation. Cells. 10 (8), 2008(2021).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
