מאמר שיטה

אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

במאמר זה

סיכום

מתוארים נהלים לחקר התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם באמצעות אלקטרו-חדירה AC-DC.

תקציר

יתושים מעבירים פתוגנים המשפיעים לרעה על בריאות האדם ובעלי החיים. ניתן לנצל הבנה טובה יותר של הביולוגיה של הזנת הדם שלהם והאינטראקציות עם פונדקאים ופתוגנים כדי לפתח מטרות חדשות לשליטה במחלות המועברות על ידי יתושים. לרוע המזל, התנהגויות גישוש (כלומר, עקיצה) של יתושים אינן מובנות היטב מכיוון שהן מתרחשות בתוך רקמות המארח. כאן, מתואר הליך לא פולשני לשימוש באלקטרו-חדירה AC-DC (EPG) כדי לדמיין ולכמת בעקיפין התנהגויות האכלת יתושים על ידי רישום שינויים באותות חשמליים הנוצרים בעת חיטוט ובליעה על ידי אדם. חוטי זהב דקים מחוברים ליתושים באמצעות דבק כסף מוליך ומחוברים למכשיר ה- EPG. המארח האנושי מחזיק ביד בדיקת מתח מצע. גישוש המארח על ידי היתוש החוטי משלים את המעגל החשמלי, ואותות חשמליים נרשמים במחשב כ"צורות גל" שניתן למדוד ולספור לניתוח. מתודולוגיה זו שימשה לאפיון התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Aedes aegypti ו-Culex tarsalis וניתן ליישם אותה על מיני יתושים אחרים. ניתן להשתמש ב-EPG כדי לחקור את ההשפעות של פתוגנים, קוטלי חרקים וגורמים אחרים על התנהגויות האכלת יתושים.

מבוא

יתושים גורמים לסבל ולהפסד כלכלי ברחבי העולם בשל תפקידם כמחוללי מחלות ומזיקים מטרידים1. יתושי אנופלס מעבירים מלריה, הגורמת מדי שנה לכ-219 מיליון מקרים ברחבי העולם, יותר מ-400,000 מקרי מוות2, ו-12 מיליארד דולר בעלויות ישירות3. יתושי אדס הם הווקטורים הבולטים ביותר של חשיבות לבריאות הציבור מכיוון שיש להם נוכחות כמעט גלובלית והם מעבירים חומרים של צ'יקונגוניה, קדחת דנגי, פילריאזיס לימפטי, קדחת עמק השבר, קדחת צהובה וזיקה, שגובים חיים, מציפים את מערכות הבריאות וגורמים לסבל כרוני, תחלואה לכל החיים ונכות4,5. בנוסף, יתושי קולקס מעבירים חומרים של דלקת מוח סוסים, דלקת מוח יפנית, פילריאזיס לימפטי, דלקת המוח של סנט לואיס וקדחת מערב הנילוס, המשפיעים על בריאות האדם ובעלי החיים כאחד3,4.

הדברת וקטור בגישות מבוססות קוטלי חרקים היא השיטה המובילה לשליטה במחלות הנישאות על ידי וקטור ברחבי העולם6,7. עם זאת, מספר קוטלי החרקים הזמינים להדברת יתושים מוגבל. בנוסף, עמידות לקוטלי חרקים מתפתחת במינים רבים, במיוחד ביתושי Aedes, מה שמשפיע על יכולתנו להילחם במחלות הנישאות על ידי וקטורים ומניע את הצורך באסטרטגיות הדברה חדשות6,8. הבנה טובה יותר של הביולוגיה של יתושים, אינטראקציות יתוש-מארח-פתוגן והתהליכים המווסתים את העברת הפתוגנים יכולה להקל על פיתוח כלים חדשים לבקרת וקטורים6.

התנהגויות בדיקה ובליעה ברקמות המארח יכולות להשפיע על העברת פתוגנים ופתולוגיה של מחלות9,10,11,12. לדוגמה, יותר מיקרופילאריות נבלעו כאשר Aedes aegypti ניזון ישירות מהנימים במקום להצטבר דם מחוץ לכלי דם קרועים13. לפיכך, מחקר בסיסי ויישומי בנושא זה יכול לסייע בפיתוח, חידוד והערכה של אסטרטגיות הדברת יתושים ואמצעי נגד אחרים להעברת פתוגנים. עם זאת, קיימים פערי ידע משמעותיים בפרטים של התנהגויות הזנת דם מוצפנות המתרחשות מתחת לפני השטח של עור הפונדקאי מכיוון שהתנהגויות אלה דורשות לעתים קרובות הליכים פולשניים במודלים של בעלי חיים חיים או משתמשות במצעים מלאכותיים שקופים או דיאטות נוזליות9,11,14,15. טכניקות אלקטרו-חדירה לא פולשניות (EPG; נקראת גם גרף חדירה חשמלי) שימשו לחקר התנהגויות האכלה של חרקים הניזונים מצמחים הקשורות להעברת פתוגנים בצמחים, עמידות צמחים מארחים ודרכי פעולה של קוטלי חרקים מכיוון שהן מאפשרות לחוקרים להתבונן, לתעד ולכמת בעקיפין תנועות והתנהגויות של חלקי הפה המתרחשות בתוך רקמות מארחות10,12.

מאז שנות ה-50 של המאה ה-20, טכניקות ניטור חדירה אלקטרוניות יושמו על פרוקי רגליים הניזונים מדם, כולל יתושים16,17,18,19,20. עם זאת, EPG מעולם לא אומץ באופן נרחב עבור פרוקי רגליים הניזונים מדם מכיוון שפעילויות ביולוגיות המתאימות לצורות הגל מעולם לא אומתו21. בנוסף, העיצובים והאלקטרוניקה של מכשירים מוקדמים הביאו להדגשת יתר של כמה אותות חשמליים, יחסי רעש לאות גבוהים, רזולוציה נמוכה ועיוות של צורות גל, וגירוי למארחי חוליות12,22. מכשיר עדכני יותר, AC-DC EPG MONITOR23, כולל הגדרות משתנות ועיבוד אותות משופר, מה שהופך אותו למתאים יותר לתיעוד פרוקי רגליים הניזונים מדם ולפענוח המקורות הביולוגיים של צורות הגל במחקרי מתאם ניסיוניים10,12.

עבור EPG, אות חשמלי מופעל על המארח דרך בדיקת מתח מצע (כלומר, אלקטרודת ייחוס). פרוקי הרגליים מחוברים לאלקטרודה מקליטה ומונחים על המארח. כאשר פרוקי הרגליים מכניסים את חלקי הפה שלהם (כלומר, סטיילטים) לתוך המארח, האות החשמלי מועבר למוניטור AC-DC EPG לעיבוד אותות. לאחר מכן, האותות החשמליים מוצגים במחשב כ"צורות גל" המתאימות להתנהגויות ספציפיות כגון תנועות של חלקי הפה, בליעה, רוק ורכישה/חיסון של פתוגנים10,12. לאחר מכן ניתן לחשב משתני תגובה עוקבים ולא רציפים הקשורים למשך ולספירה של צורות הגל24,25 ברמות היררכיות שונות (משפחות, סוגים ותתי סוגים) על סמך התדירות ומשך צורות הגל כדי לקבל תובנה לגבי התנהגויות האכילה המתרחשות בתוך ובין מינים, ובתגובה לגורמים ביוטיים ואביוטיים, כגון מארחים, פתוגנים, חומרי הדברה ותנאים סביבתיים10,12.

עד כה, נעשה שימוש במוניטור AC-DC EPG כדי לאפיין את התנהגויות הבדיקה והבליעה של Ae. aegypti26 ו-Culex tarsalis27 יתושים הניזונים מידיים אנושיות, וקרציות Dermacentor variabilis ו-Amblyomma americanum הניזונות מעגלי בקר28. בנוסף, מודל עכברים עבור EPG29 פותח לאחרונה כדי להקל על מחקרי פתוגנים באמצעות מכשיר זה. ידיים אנושיות אידיאליות לאפיון צורת הגל הראשונית של יתושים מכיוון שמארחים אנושיים יכולים לדווח מתי הם מרגישים את היתוש מגשש כמו גם התנהגויות אחרות, מה שמקל על המתאם בין צורות גל להתנהגויות (טבלה 1). בנוסף, הבנה טובה יותר של הפלסטיות בהתנהגויות האכלה בקרב יתושים באוכלוסיות אנושיות שונות יכולה לתרום לפיתוח התערבויות ניהול מיוחדות יותר עבור יתושים והפתוגנים שהם מעבירים.

טבלה 1: תיאור של משפחות צורות גל המשמשות לסיווג אותות חשמליים שנרשמו מטרסליס קולקס על ידיים אנושיות באמצעות AC-DC EPG. שלב הבדיקה והפעילויות הביולוגיות המתאימות לכל משפחת צורות גל. ראה Cooper et al.27 למידע נוסף. קיצור: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, EPG = אלקטרו-חודרגרף. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

כדי להקל על השימוש ב-EPG לחקר ביולוגיה של יתושים ואינטראקציות מארח-וקטור, מוצגת כאן מתודולוגיה לכימות התנהגויות האכילה של יתושי Cx. tarsalis על ידי אדם באמצעות צג AC-DC EPG. פרוטוקולים אלה מתבססים על נהלי AC-DC EPG הבסיסיים המתוארים במשאבים מקוונים30 ומניחים שלמשתמשים יש ידע בסיסי בעבודה של AC-DC EPG ותוכנה קשורה31. ניתן לשנות את הנהלים המתוארים עבור מיני יתושים ומארחים אחרים ולספק בסיס להקל על מחקר מונחה השערות של התנהגויות האכלת יתושים.

טבלה 2: הגדרות של טרמינולוגיה נפוצה של AC-DC EPG. ההגדרות מבוססות על אלה שניתנו במשאבים מקוונים30,31 וספרות מדעית32. קיצור: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, EPG = אלקטרו-חודרגרף. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

פרוטוקול

פרוטוקול זה (IRB-10729) אושר על ידי הוועדה המוסדית לבקרת אתיקה (IRB) למחקר בבני אדם באוניברסיטת Kansas State27 ונועד לשימוש עם יתושים נקיים מפתוגנים בלבד. מתנדבים אנושיים נתנו את הסכמתם המודעת להשתתף במחקר ולפרסם את נתוניהם. לפני תחילת כל עבודה עם בעלי חיים, בני אדם או סיכונים ביולוגיים, ודאו שכל ההליכים נסקרו ואושרו על ידי הוועדות הרגולטוריות המוסדיות המתאימות או הגורמים המפקחים. ראו את ה- טבלת חומרים לפרטים על כל הציוד והחומרים ששימשו בפרוטוקול זה.

1. הכנה ראשונית והקמה

  1. הגדירו את נגן ה-AC-DC EPG (איור 1A), כלוב פאראדיי (איור 1B,C), ואת התוכנה כפי שתואר בעבר30,31 תוך שימוש בשינויים המתוארים להלן (שלבים 1.1.1-1.1.5). עיינו במשאבים מקוונים30 עבור מדריכים שלב-אחרי-שלב להגדרה ושימוש בציוד ובתוכנה. שמרו את ההגדרה הרצויה כברירת מחדל בתוכנת ניהול החומרה ובתוכנת סקירת גלי הנעים. עיינו בטבלה 2 לרשימה של מונחי AC-DC EPG נפוצים והגדרותיהם.
    1. חברו מגבר שלב ראש (head stage amplifier) ופרוב מתח של תשתית לערוץ 1 של תיבת הבקרה.
      הערה: הקלטה מערוץ בודד מוצגת למרות שנגן ה-AC-DC יכול להכיל בו-זמנית ארבעה חרקים ומארחים.
    2. וודאו שערוץ 1 בתיבת הבקרה מופעל ושהערוצים התואמים Pre-1 ו-Post-1 בתיבת ממשק המיתוג מופעלים.
      הערה: ערוצים שאינם בשימוש חייבים להישאר כבויים.
    3. השתמשו בתוכנת ניהול החומרה כדי להפעיל את ערוצים 1 ו-3 בלוח ה-DI-710 A/D (אך לא אחרים) כדי להקליט את האותות לפני ואחרי היישור (rectification).
    4. עצבו את תוכנת ניהול החומרה לצפייה/החפפה של גלי הנעים לפני ואחרי היישור (למשל, 1 = 1 עבור אות ה-pre ו-2 = 3 עבור אות ה-post).
    5. הגדירו את קצב הדגימה בתוכנת ניהול החומרה ל-100 דגימות לשנייה לכל ערוץ (כלומר, S/s/CHAN: 100).
  2. הכינו בדילי חרקים (insect stubs)26,27,29,30:
    1. חממו מראש את מלחם הבדיל לטמפרטורה המומלצת עבור סוג בדיל ליבת השרף הספציפי.
    2. השתמשו בכלי חיתוך וקלופה של חוטים כדי לקלף את ציפוי הפלסטיק כ-6 cm מקצהו של גליל חוט נחושת 20 AWG, אך הימנעו מחיתוך או סימון של צרור חוטים הנחושת שבפנים (איור 2A). לאחר מכן, חתכו את צרור נחושת החשוף ופרקו אותו לגדילים בודדים (איור 2B).
    3. השתמשו בפלייר שפיץ כדי ללפף גדיל אחד של חוט הנחושת סביב ציר של פין קישוט (escutcheon pin) מתאים מתחת לראש הפין (כלומר, החלק העליון השטוח), כך שרוב חוט הנחושת בולט מעבר לראש הפין. קפלו את קצה החוט מעל ראש הפין כדי לקבע את החוט במקומו (איור 2C).
      הערה: התאימו פיני קישוט בבדיקת התאמה כדי לזהות את אלו המתאימים באופן הדוק לחיבור של מגבר השלב הראש (כאשר הוא כבוי, מנותק מהחשמל ומוגדר ל-106 Ohms (Ω)).
    4. אחזו בציר של פין הקישוט בעזר למלחם ("helping hands") כך שחוט הנחושת פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מרחו טיפה קטנה (כדור של ~0.2 cm) של פלאקס (flux) מסיס במים על נקודת החיבור של פין הקישוט וחוט הנחושת (איור 2D).
      זהירות: פלאקס הוא רעיל ויש לטפל בו בזהירות.
    5. פרסו כ-10 cm של בדיל ויישרו אותו. החזיקו את המלחם החם כנגד ראש הפין למשך מספר שניות עד שהפלאקס נמס והמתכת חמה. לאחר מכן, לחצו את קצה הבדיל על ראש הפין לצד המלחם עד שהבדיל נמס ומצפה לחלוטין את החיבור, וממזג את הפין והחוט לבדיל חרק (insect stub).
    6. בזמן שבדיל החרק מתקרר, נקו את קצה המלחם בעזרת צמר פלדה וספוג לח.
    7. לאחר הקירור, הוציאו את בדיל החרק מהעזר למלחם. שטפו את בדיל החרק ב-70% ethanol ולאחר מכן במים כדי להסיר שאריות פלאקס. קצצו את חוט הנחושת לאורך הרצוי (~3 cm, איור 2E).
    8. חזרו על שלבים 1.2.3-1.2.7 עד להכנת 20-30 בדילי חרקים.
  3. הרכיבו שואב חרקים (insect aspirator)26,27:
    1. העבירו את קצהו של פיפט פסטור מזכוכית דרך להבה, תוך סיבוב קל של הפיפט. חזרו על הפעולה עד שקצה הפיפט יהיה בגודל המתאים כדי להתאים באופן הדוק סביב בטנו של החרק.
    2. כסו את הקצה הרחב של פיפט הפסטור המותאם ברשת ליתושים, ואז הכניסו אותו ישירות לתוך צינור סיליקון המחובר לשואב מעבדתי וקבעו את החיבור בעזרת סרט בידוד ליצירת שואב חרקים (איור 2H).
      הערה: ניתן להכניס את פיפט הפסטור והרשת לחתיכה קצרה של צינור פלסטיק המצוידת במחבר מהיר למעבר קל בין גדלים שונים (איור 2H).

הקמת מעבדת אלקטרופיזיולוגיה להקלטת EEG; כוללת מגבר, מחשב, כלוב פראדיי וחיישנים.
איור 1הגדרת ציוד מד Monitoring EPG מסוג AC-DC להקלטה על ידיים אנושיות. (Aרכיבי ה-EPG, הכוללים את (1) תיבת הבקרה, (2) תיבת ממשק המתגים, (3) ספק הכוח, (4) לוח DI-710 A/D, (5) המחשב, (6) ווסת המתח, ו-(B) כלוב פאראדיי המכיל (C(א) מיקרוסקופ דיגיטלי (7) על מעמד צוואר-גשרי, (ח) פלסטיק פ bubble wrap וכריות אוויר, (ט) גשש מתח למצע, ו-(י) מגבר שלב-ראש על מעמד מעבדה. קיצורים: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, EPG = אלקטרופניטרוגרף. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תהליך הרכבת קטטר עם צינוריות, חוט וכלים; תרשים הגדרה ניסיונית להעברת נוזלים.
איור 2: אלקטרודות הקלטה לחיווט יתושים ושואב חרקים לטיפול ביתושים במהלך החיווט. (A) חוט נחושת 20 AWG כאשר 6 cm מהציפוי הפלסטי הוסרו כדי לחשוף את צרור חוטי הנחושת שבפנים. (B) גדילים בודדים של צרור חוטי הנחושת. (C) גדיל אחד של חוט נחושת כרוך סביב ראשו של סיכת פליז (escutcheon pin), כאשר זנב החוט מקופל מעל ראש הסיכה. (D) טיפה של פלאקס (flux) בחיבור שבין סיכת הפליז לחוט הנחושת, המוחזקים על ידי עזר להלחמה (helping hands) כהכנה להלחמה. (E) "בסיס חרק" (insect stub) מושלם, הבנוי ממסמר פליז המולחם לחוט נחושת. (F) אלקטרודת הקלטה הבנויה מחוט זהב הכרוך סביב קצה חוט הנחושת של בסיס החרק ומקובעת במקומה בעזרת דבק כסף. (G) תמונת תקריב של לולאת הזהב בקצה אלקטרודת ההקלטה. (H) שואב חרקים מורכב (למעלה) ומפורק (למטה) העשוי מפיפטות פסטור שונו, רשתית יתושים, צינוריות פלסטיק, סרט בידוד חשמלי ומחברי ניתוק מהירים זכריים, לצד צינור שואב מעבדה המצויד במחבר ניתוק מהיר נקבי (למעלה מימין). סרגי קנה מידה = 1 cm (A-F), 200 µm (G). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. חיווט של יתושים

  1. הכנת היתושים ודבק הכסף (בצהריים/ערב לפני ה-EPG):
    1. גידול ותחזוקה של יתושי Cx. tarsalis זן KNWR כפי שתואר בעבר27.
    2. הצמים נקבות בוגרות של יתושים, 5-17 ימים לאחר הבקיעה (post-eclosion), למשך 8-12 שעות כדי להגביר את שיעורי הדיגום (probing), אך אפשרי גישה למים כדי למנוע תמותה.
    3. הכנת דבק כסף טרי26,27,28,29,30:
      1. הוסף 510 mg של פתיתי כסף בגודל 4-8 µm לכלי בכר של 20 mL. אפס את המאזניים והוסף 1,100 mg של דבק ביתי לא רעיל לכלי, מעל פתיתי הכסף.
      2. אפס את המאזניים, הוסף 510 mg של פתיתי כסף בגודל 8-10 µm לכלי מעל הדבק, ולאחר מכן הוסף 1,000 µL של מים באמצעות פיפטה.
      3. הוסף בעדינות מוט ערבוב לכלי והנח אותו על המערבל המגנטי. התחל בערבוב איטי, הגבר בהדרגה עד להגדרת 'מהיר' (fast), וערבב למשך 4 דקות. ודא שכל התוכן התמזג.
      4. השתמש בפיפטת העברה (עם קצה גזור) כדי להעביר את דבק הכסף לשפופרות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
      5. עטוף את ראשי שפופרות דבק הכסף ב-Parafilm ואחסן על המדף עד לשימוש.
        הערה: דבק הכסף שומר על העקביות הנכונה למשך עד יומיים, אך מומלץ להכין דבק טרי בערב לפני השימוש30.
  2. הכנת אלקטרודות הקלטה26,27,29,30:
    1. ערבב נמרצות בעזרת וורטקס (vortex) את דבק הכסף לפני השימוש.
    2. עטוף בלוק ספוג בניילון נצמד טרי כדי להחזיק את תושבות החרקים המוכנות ואת היתושים המחוברים לחוטים.
      הערה: הספוג חייב להיות גדול מספיק כדי לאפשר ליתושים המחוברים לחוטים לעמוד על פני השטח מבלי לגעת זה בזה, אך קטן מספיק כדי להיכנס לקופסת אחסון. זהירות: טיפות הפרשה המשתחררות לאחר הזנה בדם עשויות להכיל פתוגנים. השליך את הניילון הנצמד/בלוק הספוג באופן הולם לאחר השימוש.
    3. הסר חלודה (ודבק כסף ישן אם נעשה שימוש חוזר בתושבות החרקים) מקצה חוט הנחושת על ידי גירוד של 1 ס"מ העליון של חוט הנחושת עם להב תער עד שיהיה מבריק מכל הצדדים. הכן תושבת חרקים אחת עבור כל יתוש, פלוס כמה רזרביות.
    4. גזור חוט זהב בקוטר 0.025 mm לחתיכות באורך 4-5 ס"מ. החזק תמיד את החוט בפינצטה נסגרת העטופה בסרט דביק כדי למנוע פגיעה בחוט.
      הערה: חוט זהב נראה הרבה יותר בקלות על רקע שחור.
    5. הנח את קצה חוט הזהב לאורך הקצה הנקי של חוט הנחושת בתושבת החרקים ולפף בעדינות את חוט הזהב 3 פעמים סביב חוט הנחושת.
    6. השתמש במחט דיסקציה כדי למרוח דבק כסף להחזקת חוט הזהב במקומו. ודא שאין קצה חופשי או בולט. הנח את תושבת החרקים בספוג עד שהדבק יתייבש.
    7. העבר בעדינות את חוט הזהב המחובר לתושבת החרקים כדי להחליק ולעצב אותו לקשת ארוכה ועדינה (איור 2F). קצץ את החוט לאורך הרצוי (~2.5-3 ס"מ).
    8. בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בפינצטה עדינה כדי ליצור לולאת זהב בקצה חוט הזהב, וכופף את הלולאה בזווית של 90° כפי שמתואר להלן (שלבים 2.2.8.1-2.2.8.4; איור 2E,F). ודא שלולאת הזהב סגורה לחלוטין. החזר את תושבת החרקים לבלוק הספוג.
      1. בעזרת היד הלא-דומיננטית, החזק את תושבת החרקים באמצעות המסמר הפליז, כאשר קצה חוט הזהב נוגע במבנית המיקרוסקופ. בעזרת היד הדומיננטית, אחוז בקצה חוט הזהב באמצעות פינצטה עדינה.
      2. בעזרת הפינצטה העדינה, העבר את קצה חוט הזהב מעל חוט הנחושת של תושבת החרקים, סמוך למקום שבו חוט הזהב מודבק. הצמד את קצה הפינצטה וחוט הזהב למבנית המיקרוסקופ.
      3. משוך בעדינות את תושבת החרקים עד שחוט הזהב יוצר לולאת זהב קטנה סביב קצה הפינצטה העדינה (אל תמשוך חזק מדי). שחרר את חוט הזהב והסר בזהירות את הפינצטה.
      4. בעודך מחזיק את תושבת החרקים ביד הלא-דומיננטית, אחוז בלולאת הזהב עם הפינצטה העדינה כך שהפינצטה תהיה בזווית ניצבת לצוואר החוט וקצה הפינצטה יחתוך את מרכז לולאת הזהב, ובכך יחזיק את שני צדי הלולאה. משוך בעדינות את תושבת החרקים תוך כדי סיבוב קל של הפינצטה הרחק מתושבת החרקים עד שהלולאה תכופף בזווית של 90° לצוואר החוט (איור 2G).
  3. חיבור אלקטרודות הקלטה ליתושים26,27,29,30 (בבוקר ה-EPG):
    1. הרדם את היתושים הצמים באמצעות גז CO2 עד להפסקת כל תנועה. הנח את היתושים על גבם על פד ההרדמה, כאשר בטנם פונה לחוקר.
    2. הנח חתיכה של ~2 ס"מ של סרט דביק למעבדה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, כאשר הצד הדביק פונה למטה. הנח טיפה של 0.5 ס"מ (~ 10 µL) של דבק כסף על הסרט.
    3. שאב את בטנו של יתוש מורדם לתוך פיפטת פסטור משופרת באמצעות השאיבה למשך זמן קצר בלבד, רק כדי להושיב את הבטן במקומה. החזק את היתוש תחת מיקרוסקופ הדיסקציה מעל דבק הכסף באמצעות השואב.
      הערה: הכנפיים יכולות להיות בתוך או מחוץ לקצה פיפטת הפסטור המשופרת, אך השארתן בפנים תסייע למנוע מהיתוש לנפול. הימנע מכיפוף או פגיעה בכנפיים.
    4. בעבודה מהירה, טבול סיכה דקה (minutien pin) בדבק הכסף ומרוח שכבה דקה על הפרונוטום (pronotum) של היתוש (כלומר, פני השטח הגבי של החזה). המשך מיד לשלב הבא אם אפשרי (או הרדם מחדש את היתוש במידת הצורך).
      הערה: מומלץ להסיר קשקשים מהפרונוטום על ידי שפשוף הסיכה הלוך ושוב כדי להבטיח חדירת הדבק לנקבים שבקוטיקולה. הימנע מהגעה של דבק לכל חלק אחר של היתוש.
    5. טבול במהירות את לולאת הזהב בקצה אלקטרודת ההקלטה בדבק הכסף והנח אותה על נקודת דבק הכסף שעל הפרונוטום של היתוש. נער את הלולאה קדימה ואחורה כדי לוודא שהיא צמודה לחלוטין לפרונוטום. החזק את החוט עד שהדבק יתייבש (~20-25 שניות).
    6. החזר את תושבת החרקים לספוג בזווית שתאפשר ליתוש המחובר לחוטים לעמוד בנוח כשיתעורר. המשך בחיבור היתוש הבא.
      הערה: מומלץ לרשום הערות על איכות כל פעולת חיבור.
    7. לאחר שמספר היתושים הרצוי חוברו לחוטים, הנח את בלוק הספוג בקופסת אחסון. תחזק את היתושים תחת תנאי גידול רגילים עד לשימוש.

3. הגדרה והכנה של EPG (בבוקר שלפני ה-EPG)

  1. הפעילו את מסך ה-AC-DC EPG (על ידי העברת המתג בספק הכוח) לפחות 30 דקות לפני ההקלטה כדי לאפשר התייצבות של המכשיר וביצוע פתרון בעיות במידת הצורך.
    הערה: ניתן להשאיר את הערוצים בשימוש בתיבת הבקרה ובתיבת ממשק המתגים דלוקים.
  2. הפעילו את המחשב ופתחו את התוכנה לניהול החומרה.
    הערה: אם האותות אינם מופיעים כקווים דקים ושטוחים, נדרש פתרון בעיות (ראו סעיף הדיון).
  3. בצעו את מבחן המגע27,30 כדי לוודא את תקינות הציוד:
    1. בעודכם מוארקים (כלומר, נוגעים בכלוב פאראדיי בעור חשוף), סובבו את החוגה ב-head amp ל-106 Ω והכניסו את מוט ה-insect stub אל היציאה.
      ​הערה: ביצוע מבחן המגע ברמת התנגדות כניסה (Ri) גבוהה יותר עלול לגרום לנזק ל-head amp.
    2. בעודכם מוארקים, הפעילו את ה-head amp ואחזו בחוזקה בחוט הנחושת של ה-insect stub בין האגודל לאצבע המורה שלוש פעמים. אם ה-EPG פועל כראוי, יופיעו שלושה שיאים גדולים הן באות הקדם (pre-signal) והן באות העוקב (post-signal) על המסך. אם לא קרה כך, נדרש פתרון בעיות (ראו סעיף הדיון).
  4. כווןו את הגדרות המכשיר ל-150 mV זרם חילופין (AC) עם Ri של 107 Ω, הגבר חומרה של 20-40x, הסטה שלילית (negative offset), קו בסיס טבעי (native baseline), ו-הגבר תוכנה של 8-16x27,30, כפי שמתואר להלן (שלבים 3.4.1-3.4.3).
    1. קבעו את המתח, סוג הזרם, הגבר החומרה (טווח, הגבר ומכפיל), ההסטה וקו הבסיס (אפס) באמצעות המתגים והחוגות בערוץ 1 של תיבת הבקרה.
      הערה: הגדרת הגבר החומרה המתאימה תלויה באיכות החיווט ובדבק הכסף, לכן צפוי שוני בהגדרות ההגבר האופטימליות מיתושה ליתושה ומיום ליום. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הגבר החומרה במהלך ההקלטה אם האות מגיע לרוויה (מוגדר ב-טבלה 2 ומוצג ב-איור 3A,C) או אם הוא קטן מכדי שניתן יהיה לדמותו חזותית. כל שינוי בהגבר החומרה ישפיע באופן קבוע על ההקלטה (מוצג ב-איור 3A,C).
    2. קבעו את רמת ה-Ri באמצעות החוגה ב-head amp.
    3. קבעו והתאימו את הגבר התוכנה באמצעות התוכנה לניהול החומרה (לדוגמה, בחרו את אות הקדם או אות העוקב ולאחר מכן לחצו לחיצה שמאלית כדי להגביר את הגבר התוכנה או לחיצה ימנית כדי להפחיתו).
      הערה: שינויים בהגבר שבוצעו בתוכנה לא ישפיעו באופן קבוע על ההקלטה.
  5. הגדירו הקלטה חדשה בתוכנה לניהול החומרה, אך אל תתחילו בהקלטה עד לשלב 4.3 בסעיף הבא.

4. EPG על ידיים אנושיות26,27 :

  1. לאחר קבלת הסכמה מדעת (כפי שהוגדר על ידי ה-IRB של המוסד המארח), הנחו את הנבדק לשבת לצד כלוב פאראדיי כאשר זרוע אחת בתוך הכלוב, בעודו אוחז במגש מדידת מתח המצע ומחזיק אותו מתחת למגבר הראש.
    הערה: הזרוע חייבת להישען בנוח על פלפליר (bubble wrap) או על תשתית לא מוליכה דומה. חיישן המתח של כף היד והתשתית לא יבואו במגע עם כלוב פאראדיי או עם המגבר הראשוני (head amp) במהלך ההקלטה. כדי למנוע נזק, חובה שהמתנדב לא יגע במגבר הראשוני לאחר שהופעל. אם חלה מגע מקרי במגבר הראשוני, יש לבצע את בדיקת המגע המתוארת לעיל כדי להעריך את תקינותו.
  2. ברגע שהמארח נמצא במיקומו, סובב את מגבר הראש הצידה. הוצא יתוש עם חיווט מקופסת האחסון וחבר אותו למכשיר על ידי הכנסת הפין הפליז של בסיס החרק לתוך הפתח במגבר הראש. השאר את היתוש תלוי.
    הערה: החזיקו בקרבת מקום בקבוק נתז של אתנול 70% כדי לשלוט ביתושים שמתנתקים מהחוט.
  3. התחילו את ההקלטה באמצעות התוכנה לניהול החומרה. מקמו את המגבר הראשוני (head amp) מעל היד, כך שהיתוש יוכל לעמוד ולדגור בנוחות.
  4. הפעיל את המגבר של הראש (head amp) כאשר הוא מחובר להארקה. הפעל טיימר ל-10 דקות. התאם את תנוחת היד של המארח לפי הצורך כדי לסייע בהצלחת הבדיקה.
    הערה: כאשר משתמשים ביתושים הנוטים לבצע דקירה מיידית, יש להפעיל את מגבר הראש לפני הצבת היתוש על היד. ניתן להשתמש במוט עץ דק או בידית מכחול שאינה מוליכה כדי לכופף את תיל הנחושת של תושבת החרק לצורך התאמה נוספת של מיקום היתוש. זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ דיגיטלי על מעמד צוואר-גמלה יכולים לסייע בתצפית על היתוש במהלך ה-EPG, במיוחד במחקרי קורלציה התנהגותית.
  5. השתמש בתוכנה לניהול החומרה כדי לבצע תצפיות עם חותמת זמן (למשל, סימוני אירועים) במהלך ההקלטה בנוגע לתגובות המארח, התנהגויות הפסיקים, שינויים בהגבר וכו'). כוונן את ה- מיקום האותים על המסך ועל ה- הגברה תוכנתית כפי שנדרש כדי לשמור על שני האותות גלויים בבירור על המסך. כוון את ה- הגברה חומרתית אם האות (או האותות) מגיע לרוויה (איור 3A,C ו- טבלה 2) או אם הגלים נראים קטנים מדי כאשר הגבר (gain) של התוכנה נמצא בערך המקסימלי. כווננו את ה- היסט אם נצפה קריסה (foldover) של המיישר (rectifier) (איור 3C,C' ו- טבלה 2). עיין במדריך למשתמש של התוכנה31 ומשאבים מקוונים30 להוראות מפורטות על אופן ביצוע התאמות אלו.
    1. כדי לכוון את ה- מיקום האותים על המסך, בחרו את ה- pre או אות לאחר (post-signal) (למשל, על ידי לחיצה על 
      1 = 1       או 2 = 3) ולאחר מכן גרור את האות למיקום הרצוי על המסך (באופן אידיאלי ליד מרכז המסך, אך ללא חפיפה).
    2. כדי לכוון את ה- הגברה תוכנתיתהשתמשו בתוכנת ניהול החומרה המתוארת בשלב 3.4.3.
    3. כדי לכוון את ה- הגברה חומרית (Hardware Gain), התחילו בסיבוב ה- חוגה להגבר (Gain Dial) עבור ערוץ 1 ימינה או שמאלה כדי להעלות או להוריד את ההגבר, בהתאמה. אם התאמה זו אינה מספיקה כדי למנוע חריגה (הגבר גבוה מדי; איור 3A,C) או לאפשר ויזואליזציה ברורה של פרטי האות (הגבר נמוך מדי), הפוך את ה- מתגי טווח ומכפיל לערוץ 1 לכיוון נוסף של ההגבר.
      הערה: מומלץ להשתמש בסמני אירועים (event markers) כדי לתעד מתי בוצע כיוונון של הגבר החומרה (hardware gain), כדי לסייע בפירוש נתוני גלי הwaveform.
    4. כדי לכוונן את ה- היסטהפוך את ה- מתג היסט עבור ערוץ 1 בתיבת הבקרה כדי ל- שלילי, ולאחר מכן סובב את ה- חוגת היסט עבור ערוץ 1 עד שהשיאים באותות שלפני ואחרי מופיעים באותו כיוון על מסך המחשב. אם סובבים את חוגת ההיסט (Offset Dial) רחוק מדי, האות שלאחר מכן יתהפך שוב.
  6. אם היתוש אינו דוקר בתוך 10 דקות (או נקודת זמן מוגדרת אחרת), כבו את המגבר של הראש (head amp). אם היתוש נמצא בעיצומו של דקירה בנקודת הזמן שנקבעה, אפשרו לו לסיים את הדקירה לפני כיבוי המגבר של הראש. הנחו את המארח להסיר את ידו בזהירות, ולאחר מכן הסירו את היתוש יחד עם הפיס (stub) של חרקים המחובר אליו. החזירו את היתוש לקופסת האחסון.
  7. הפסיקו/סגרו את ההקלטה באמצעות תוכנת ניהול החומרה. המשיכו ב-EPG על היתוש הבא (שלב 4.2).
    הערה: זכרו לשנות את שם הקובץ לאחר כל יתוש.
  8. כבה את מגבר הראש ומקור המתח בסיום הסשן וסגור את התוכנה.
  9. סקרו את הצהרת דברי הסיום למשתתף (Participant Debriefing Statement) או מסמך דומה עם המתנדב, כפי שהוגדר ב-IRB (ועדת הלסינקי/ועדת אתיקה) המאושר.
  10. יש להשליך את היתושים בהתאם לדרישות הפרוטוקול. יש להסיר את עטיפת הפלסטיק מבלוק הספוג ולהשליכה באופן המתאים.
  11. לאחר השלמת כל איסוף הנתונים, יש לסקור ולמדוד את גלי הצורה (waveforms) ולנתח את הנתונים כפי שתואר קודם לכן.24,25,26,27,29,30יש לעיין במקורות מקוונים30 עבור מדריכים שלב-אחר-שלב לשימוש בתוכנה לבדיקת גלי צורה, יצירת איורים המתארים את גלי הצורה, מדידת גלי הצורה, ייצוא הנתונים לצורך ניתוח, ביצוע הניתוח הסטטיסטי, והסבר מפורט על משתני תגובה נפוצים של גלי צורה.

תרשים נתונים אלקטרופיזיולוגיים הממחיש שינויים חולפים באמפליטודת האות לאורך זמן.
איור 3: דוגמאות להקלטות תת-אופטימליות עקב חריגה מהטווח (peaking out), שינויים בהגבר של קופסת הבקרה, שינויי מתח לא ברורים עקב חיווט לקוי, התכפפות מיישר (rectifier foldover) ורעש. צורות גל מיתושים מסוג Culex tarsalis הניזונים עד לשובע מידיים אנושיות, המעוותות על ידי (A) חריגה מהטווח (חץ אופקי כחול) ושינויים עוקבים בהגבר של קופסת הבקרה מ-100x ל-80x ל-40x ל-60x ל-40x ל-20x (חצים אנכיים כתומים), (B) שינויי מתח לא ברורים, ו-(C) התכפפות מיישר באות שאחרי המיישר (שחור) בהשוואה לאות לפני המיישר (אדום) (ראו צורת גל J, תצוגה מקרוב בלוח C'), רעש רשת (גל סינוס של 11 Hz הנראה רק באות לפני המיישר (אדום), תצוגה מקרוב בלוח C'), חריגה מהטווח (חץ אופקי כחול), ושינוי הגבר של קופסת הבקרה מ-500x ל-200x (חץ אנכי כתום). שמות צורות הגל מוצגים בחלק העליון של כל לוח. החצים הסגולים בפינה הימנית התחתונה של לוח C מעידים על המועד שבו המגבר הראשי (head amp) כובה לאחר השלמת הבדיקה, ומספקים דוגמה נוספת להתכפפות מיישר. קווים אופקיים אדומים הקשורים לאות לפני המיישר בלוח C מציינים מתי נעשה שימוש בסימני אירוע (Event Markers) להקלטת הערות עם חותם זמן. רמות Ri, אותים מופעלים, קשקשי זמן והגברים של התוכנה הם (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x; ו-(C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0.2 s/div, 8x. קיצורים: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, Ri = התנגדות כניסה, mV = מיליוולט, Ω = אוהם, s/div = שניות לחלוקה. איור זה הוכן עם נתונים מ-Cooper et al.27. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

הקלטות AC-DC EPG של יתוש Cx. tarsalis במהלך הזנת דם מידיים של בני אדם (איור 4) הפיקו צורות גל ניתנות לפירוש המתאימות לניתוח ולפרסום27. צורות גל ניתנות לפירוש הכילו דפוסים חוזרים מובחנים שניתן היה לסווג למשפחות של צורות גל (טבלה 1 ו-איור 4), סוגים ותתי-סוגים, כאשר הדחיסה (המוגדרת ב-טבלה 2) והגבר התוכנה הותאמו בתוכנה לבדיקת צורות גל27,31. כל משפחות צורות הגל (J, K, L, M, N) והסוגים (L1, L2, M1, M2) שתוארו בעבר בהזנה של Ae. aegypti מידיים של בני אדם26 זוהו בצורות הגל שהופקו מהזנה של Cx. tarsalis מידיים של בני אדם, ובכך אומת תוקפן של השיטות המתוארות כאן. בנוסף, זוהו שלושה סוגי צורות גל חדשים (M3, N1, N2) ותתי-סוגים רבים של L1, L2, M1 ו-M227. בנוסף, נפילת המתח חזרה לקו הבסיס בעת נסיגת חלקי הפה מהמארח נקראה משפחת צורות גל W27.

שינוי שיטתי של הגדרות המכשיר (סוג הזרם ורמות Ri) תוך כדי ביצוע הפרוטוקולים המפורטים כאן, אפשר לקבוע את ההגדרות האופטימליות להקלטת הזנה של Cx. tarsalis על ידיים אנושיות, את המקורות החשמליים של כל גל, את משך הזמן הממוצע בשניות של בדיקות (probes) מלאות ולא מלאות לכל יתוש, ולביצוע השוואה סטטיסטית של משך הגל בשניות לכל חרק (WDI), מספר אירועי הגל לכל חרק (NWEI), ומשך הגל בשניות לכל אירוע לכל חרק (WDEI) בין ההגדרות השונות27. כמו כן, הופסקו יתושים במהלך גלים שונים ונבצעו להם נתיחות כדי לקבוע איזה גל נמצא במתאם עם בליעת דם27. מחקר דומה בוצע עבור Ae. aegypti תוך שימוש במתודולוגיה מקבילה26.

בשל טבעם הרגיש והמורכב של EPG, לא כל ההקלטות היו נקיות כמו אלה המוצגות ב-איור 4. חריגות גובה (Peaking out) (איור 3A,C), שינויים בהגברה של החומרה (איור 3A,C), חיווט לקוי (איור 3B), קיפול מיישר (rectifier foldover) בצורה J (איור 3C,C'), ורעש חשמלי (איור 3C,C') עוותו והסתירו לעיתים את גלי הwaveform, מה שהפך אותם לבלתי מתאימים לשימוש באיורים באיכות פרסום והקשה על הדירוג והניתוח. לפיכך, מומלץ להשקיע מאמץ מקדים בליטוש מיומנויות החיווט, אופטימיזציה של הגדרות ההגברה והמתח, כיוון ההיסט (offset) ובקרת רעשים חשמליים. באופן מעניין, קיפול מיישר נצפה רק במשפחת גלי הwaveform J עבור Cx. tarsalis (איור 3C,C') ולא חזר לאחר שההיסט כוון בתחילה, גם כאשר נעשה שימוש במיני יתושים אחרים (Ae. aegypti ו- Culex quinquefasciatus) (נתונים לא מוצגים). בנוסף, פתרון תקלות העלה כי הרעש החשמלי הבלתי נשלט המוצג ב-איור 3 (פאנלים C ו-C') נבע מכלוב פאראדיי פגום. ההקלטות שבוצעו בכלוב הפאראדיי הפגום עדיין היו שמישות, אך בעיות הרעש נפתרו כאשר נבנה כלוב פאראדיי משופר (איור 1B).

גם כאשר ננקטו כל אמצעי הזהירות והאופטימיזציות המוקדמות, שינויים קלים באיכות הצמדת האלקטרודה ליתוש וגורמים לא ידועים אחרים שעוותו את האות ושינו את יחס אות-רעש, הפכוו מדי פעם את התאמת הגבר החומרה (hardware gain) במהלך ההקלטה לנחוצה, וזאת כדי להבטיח שהאות יהיה בטווח הנראה ושרזולוציית הפסגות בכל צורת גל תהיה מספיקה לזיהוי ואפיון צורת הגל. למשך, התאמת הגבר החומרה במהלך ההקלטה עלולה להוביל לשינויי מתח פתאומיים (איור 3A, C), מה שהופך את צורות הגל לפחות מתאימות לפרסום, אך עדיין שמישות (במלואן או בחלקן) למדידה ולניתוח.

דיאגרמות של שיווי משקל סטטי המראות ניתוח כוחות; הגרפים מדגישים את המשוואות ΣFx=0, ΣFy=0.
איור 4: צורות גל מייצגות מProbe של Culex tarsalis על יד אנושית, שהוקלטו עם Ri של 107 Ω תוך שימוש באות מופעל של 250 mV AC. שמות צורות הגל ברמת המשפחה (NP, J, K, L, M, W) מוצגים לאורך החלק העליון של כל פאנל. הפאנלים התחתונים מראים הגדלות של אזורים נבחרים בפאנל A. פאנלים מוכנסים מראים הגדלות של אזורים מצוינים. קנה המידה של הזמן וההגבר של התוכנה הם (A) 7.0 s/div,16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 s/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x. קיצורים: AC = זרם חילופין, Ri = התנגדות כניסה, mV = מיליוולט, Ω = Ohms, s/div = שניות לחלוקה. איור זה הוכנה באמצעות נתונים מ-Cooper et al.27. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

בעת שימוש ב-AC-DC EPG, זה קריטי לקבל הבנה בסיסית של פעולת חומרה ותוכנה30 ולעקוב בקפידה אחר הפרוטוקולים המתוארים כאן כדי למנוע נזק לציוד. בעיקר, הימנע מלגעת במגבר הראש כאשר הוא מופעל אלא אם כן הוא מקורקע על כלוב פאראדיי. מומלץ להקליט כמה שיותר אחורה בכלוב פאראדיי30. אין צורך לסגור את דלתות הכלוב כדי לקבל צורות גל הניתנות לפירוש אלא אם כן הקלטה בסביבה עם רעש חשמלי סביבתי מוגזם. שום דבר ממונע לא יכול להיות בכלוב פאראדיי. חשוב לציין כי כלוב פאראדיי עצמו חייב להיות מוארק חשמלית אך ורק דרך מגבר הראש כדי שיפעל כראוי. זה מושג על ידי חיבור מגבר הראש למעמד מעבדה ממתכת כאשר הצבע משייף מרגל אחת של המעמד כדי לאפשר נתיב מוליך לחשמל שנלכד על ידי כלוב פאראדיי לזרום למעמד המעבדה, לתוך מעטפת המתכת של מגבר הראש, במורד הכבל לתיבת הבקרה, דרך אספקת החשמל לשקע קיר מוארק כהלכה, ולתוך האדמה דרך קרקע הבניין30. ניתן להשתמש במולטימטר כדי לבדוק את איכות החיבור בין הרכיבים בתוך הכלוב על ידי מדידת ההתנגדות (שהיא היפוך המוליכות) בין נקודות שונות. ניתן גם למקם רדיו AM אלחוטי בתוך כלוב פאראדיי כדי לוודא שהצליל מופחת משמעותית (או באופן אידיאלי) כאשר הדלתות סגורות, מה שמאשר שכלוב פאראדיי לוכד כראוי אותות חשמליים הנישאים באוויר (E. Backus per Comm.).

הכנה נכונה וסטנדרטית של דבק הכסף והצמדת אלקטרודות ההקלטה לחרקים הם קריטיים להשגת הקלטות שמישות. ציפורן חרקים היא מבודדת ופועלת כקבל אם דבק הכסף אינו חודר כראוי לנקבוביות הקוטיקולה כדי ליצור נתיב לחשמל לעבור מתוך החרק לחוט הזהב על פני השטח של הפרונוטום30. הכן את דבק הכסף במקביל לפני כל מפגש EPG, עבד עם דבק כסף טרי מהצינור והחלף אותו בדבק כסף מערבולת נמרצת לעתים קרובות במהלך הליך החיווט. ודא שלולאת הזהב ממוקמת כנגד בית החזה כך שהלולאה כולה תהיה במגע עם הקוטיקולה ולא מוטה לצד אחד או מופרדת על ידי שכבה עבה של דבק כסף וקשקשים כדי לסייע ביצירת חיבור חשמלי חזק וכן למנוע ניתוק ובריחה של היתוש מהחוט.

יש לייעל את הפרוטוקולים המתוארים כאן כאשר עובדים עם מיני יתושים שונים. יש לקבוע בניסוי את הגדרות ה-EPG האופטימליות (רמת Ri, כרךtagה, סוג זרם ורווח חומרה) להקלטה על פרוקי רגליים נתון12,30. עם זאת, לאחר התאמת הקיזוז, לא יהיה צורך להתאים אותו מחדש בעבודה עם יתושים דומים. נקבעו הגדרות אופטימליות עבור AC-DC EPG עם Ae. aegypti26 ו-Cx. tarsalis27. ספריות צורות גל (המוגדרות בטבלה 2) עבור מינים נוספים יקלו על אימוץ EPG עבור יתושים. כמו כן, יש צורך לייעל את ההרדמה עבור היתוש המעניין, שכן התנהגות הזנת הדם יכולה להיות מושפעת באופן דיפרנציאלי על סמך מיני היתושים ובחירת ההרדמה. לדוגמה, Cx. tarsalis דורש תקופת החלמה של 4 שעות לאחר 15 דקות של הרדמה עם CO2, בעוד שעבור Ae. aegypti, תקופת החלמה של 15 דקות מספיקה לאחר תקופת הרדמה של 15 דקות עם קרח. עם זאת, קשה להפיל את Culex tarsalis בחשיפה לקור, ולכן נעשה שימוש בעיקר ב-CO2 למרות תקופת ההחלמה הארוכה.

בעוד שצג AC-DC EPG פשוט לשימוש לאחר סקירת משאבים מקוונים30,31 או הדרכה עם משתמש מנוסה, נדרש פתרון בעיות מסוים. בתחילה, בהקלטות ה-EPG של המחבר של בדיקות יתושים היה גל סימן בלתי צפוי של 11 הרץ באות המקדים שלא נצפה או דווח על ידי Wayadande ועמיתיו26. התייעצות עם E. Backus הצביעה על כך שכלוב פאראדיי היה ככל הנראה הבעיה בגלל לולאות קרקע מפריעות. כלוב פאראדיי חדש הבנוי ממסך נחושת מוליך מאוד המחובר למסגרת אלומיניום המוברגת ללוחית רצפה גדולה מאלומיניום הנתמכת על ידי רגלי גומי כדי לבודד אותה מהטבלה למטה (איור 1B), פתר את אות הרעש של 11 הרץ (איור 3C, C'). בנוסף, מדי פעם, כאשר ספק הכוח של EPG הופעל לראשונה, האותות לפני ואחרי התיקון היו מופיעים כקווים עבים ומטושטשים במקום קווים ישרים, חלקים ודקים. זה תוקן בדרך כלל על ידי כיבוי המכשיר ובדיקת כל חיבורי הכבל. אם זה נכשל, ניתוק המכשיר למשך 1-3 דקות בדרך כלל עזר. לעתים רחוקות מאוד, האותות לפני ואחרי הופכים עבים ומטושטשים במהלך הפעולה, דבר שטופל על ידי כיבוי המכשיר וחיבורו לשקע אחר או שימוש בווסת מתח ומזגן חשמל כדי לחבר את ה-EPG לפני חיבורו לקיר. באופן אידיאלי, קו ייעודי לצג ה-EPG יבטל רעשי קו הנובעים ממקררים וציוד אחר המחובר לאותו מעגל חשמלי כמו ה-EPG30.

נכון לעכשיו, ישנן שתי מגבלות עיקריות לשימוש ב-EPG לחקר יתושים. ראשית, מעט מחקרי מתאם בוצעו כדי לאמת אילו התנהגויות בדיקה תואמות לצורות הגל. בעוד שישנן השערות חזקות לגבי מה שקורה במהלך כל משפחת צורות גל (טבלה 1) וחלק מסוגי צורות הגל (M1 ו-M2), מעט מההשערות הללו אושרו בניסוי, פרט לכך שבליעת דם נמצאת בקורלציה עם משפחת צורות הגל M26,27. והכי חשוב, יש לזהות צורות גל המתאימות לאירועי רוק מכיוון שפתוגנים רבים מועברים ברוק. מתאם של צורות גל EPG עם פעילויות ביולוגיות ביתושים יידרש כדי לפרש באופן משמעותי הבדלים משמעותיים במשך צורת הגל ובספירה בין קבוצות הטיפול. שנית, שיעורי הבדיקה והבליעה במהלך EPG יכולים להיות נמוכים בהרבה מהצפוי27. קשירת יתושים בנפרד לחוטים קצרים והנחתם ישירות על הפונדקאי יכולה למנוע התנהגויות חיפוש פונדקאי והזנה חברתית למרחקים ארוכים, שעלולות להשפיע על התנהגויות גישוש ובליעה. חרקים מחווטים כהלכה יכולים ללכת ולעוף כרגיל. ובכל זאת, יתושים לעתים קרובות מושכים בחוטים ולפעמים מסתבכים או מחזיקים את עצמם בזוויות לא טבעיות, מה שמצביע על כך שהחוטים משפיעים על התנהגותם במידה מסוימת. המחברים בדקו אסטרטגיות רבות להגברת שיעורי הבדיקה במהלך EPG, וצום היתושים במהלך הלילה, שימוש באנשים מבוגרים, חשיפתם לנשימה אנושית מיד לפני הנחתם על היד, ומריחת רוק אנושי על היד היו היעילים ביותר, כמו גם שימוש במארחים שביצעו כל הזמן התאמות בקנה מידה עדין למיקום היד שלהם כדי להבטיח שהיתוש נמצא במיקום האידיאלי לחקור27.

למרות מגבלות אלו, ל-AC-DC EPG יתרונות רבים על פני גישות אחרות לחקר התנהגויות גישוש ובליעה. מערכות כמו BiteOScope11, flyPAD15 ופלטפורמת ביו-חומרים אוטומטית14 שתוכננו לכמת התנהגויות בדיקה ובליעה והפרשות רוק במהלך הזנת דם משתמשות במצעים מלאכותיים שקופים ודיאטות נוזליות שחסרות מערכות רקמת מארח רגילות ורמזים מארחים. בעוד שפלטפורמות סינתטיות אלה שימושיות למטרות ניסוי רבות, יתרון ברור של AC-DC EPG הוא היכולת לחקור התנהגויות פרוקי רגליים אלה ומשתנים מעניינים בתוך מערכות מארחות טבעיות. יתר על כן, יכולת ההסתגלות המוגדרת על ידי המשתמש של מערכת AC-DC EPG מציעה יתרון נוסף על פני מכשירי EPG אחרים22,33 והתקני ניטור אלקטרוניים דמויי EPG16,21, שאין להם רמות Ri מתכווננות, סוגי זרם ורמות מתח הדרושות כדי להשיג צורות גל עם כמות המידע המקסימלית ולמזער השפעות שליליות על מגוון רחב של המארחים ופרוקי הרגליים22, 23. טכניקות אלקטרומיוגרפיה (EMG) משמשות גם לחקר הזנת דם. עם זאת, המעגל החשמלי כולל בדרך כלל רק את פרוקי הרגליים ורק פוטנציאל השריר הקרוב ביותר לאלקטרודה המקליט נרשמים, כך שצורות הגל אינן מספקות מידע על פעילויות מפורטות המתרחשות בממשק המארח-חרק כמו קרעים בתאים, מיקומים ופעילויות סטילט ופוטנציאל זרימה דרך חלקי הפה28,34. ניתן להשתמש בטכניקות מיקרוסקופיה תוך-חיוניות כדי לדמיין תנועות ופעילויות מפורטות של חלקי הפה ברקמות מארח חיות ישירות, אך טכניקות אלה כוללות הליכים פולשניים במודלים של בעלי חייםחיים 9. רק צג ה-AC-DC EPG יכול לספק מידע מפורט ביותר בזמן אמת על התנהגויות בדיקה, בליעה והפרשת רוק המתרחשות ברקמות מארח אטומות חיות ללא צורך בפרוצדורות פולשניות וניתן להתאמה לשימוש במגוון רחב של פרוקי רגליים10,12.

זהו ההליך המפורט הראשון שלב אחר שלב לחיווט יתושים, בניית שואב חרקים וביצוע EPG על מארחים אנושיים. פרוטוקולים אלה צפויים להקל על אימוץ AC-DC EPG על יתושים הניזונים ממארחים אנושיים. דוגמאות למאמצי מחקר עתידיים המשתמשים ב-AC-DC EPG עשויות לכלול מחקרים על מנגנונים בסיסיים של הזנת דם ונזק לרקמת המארח10, כולל זיהוי רצפים סטריאוטיפיים של התנהגויות בדיקה לפני בליעת דם, חקירת זרימת הדם דרך חלקי הפה, והשוואה של פלסטיות האכלה בתוך ובין מיני פרוקי רגליים/שלבי התפתחות26. ניתן להשתמש ב-EPG גם כדי לכמת את ההשפעות של קוטלי חרקים, נוגדי הזנה ודוחים12. הנהלים המוצגים כאן לשימוש ב-AC-DC EPG לחקר יתושים על ידי אדם יאיצו את המחקרים הללו ויאפשרו תובנות חדשות לגבי הביולוגיה של הזנת דם יתושים.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה נועד אך ורק למטרת מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקאי. המסקנות בדוח זה הן של המחברים ואינן מייצגות בהכרח את עמדות ה-USDA.

תודות

אנו אסירי תודה לפרופ' אסטרי וואיאדנדה מאוניברסיטת אוקלהומה סטייט על חלוץ הליך החיווט ליתושים, ולד"ר איליין באקוס מ-USDA-ARS בפרלייה, קליפורניה, ולמר אנדרו דואל מ-EPG Technologies Inc. בגיינסוויל, פלורידה, על הסיוע בפתרון בעיות בציוד ה-EPG. אנו מודים גם לד"ר דסטין סוונסון ולמר וויליאם יארנל מ-USDA-ARS Insectary במנהטן, קנזס, על אספקת יתושים, ולגברת מרים רוהינדה מאוניברסיטת קנזס סטייט במנהטן, קנזס על עזרתה בצילום הסרטונים הפרוצדורליים. עבודה זו התאפשרה הודות לגישה לליבת האנטומולוגיה המולקולרית המשולבת (IEMC) באוניברסיטת קנזס סטייט. מחקר זה נתמך על ידי הסכם פיתוח כוח העבודה למחקר, חינוך וכלכלה של משרד החקלאות האמריקאי (#58-3022-0-002) ופרויקט האץ' הרב-מדינתי (NE1943). כתב יד זה הוא תרומה מס' 24-194-J מתחנת הניסויים החקלאיים של קנזס, אוניברסיטת קנזס סטייט, מנהטן, קנזס, ארה"ב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Instrumentation
AC-DC 4-channel electropenetrographEPG Technologies, Inc.עבור EPG, כולל את ספק הכוח, תיבת הבקרה, תיבת ממשק המתגים, ארבעה ראשי tagamplifiers, ארבעה בדיקות מתח מצע וכבלים נלווים
כריות אווירAmazon.comלמארח האנושי להניח את ידו/זרועו במהלך חומרת רכישת נתונים EPG
DI-710 (לוח AD)DATAQ Instruments Inc.לדיגיטציה של אותות ה-EPG האנלוגיים כך שניתן יהיה להמחיש אותם במחשב
מנורת מגדלת לד הניתנת לעמעום, זכוכית מגדלת גדולה 5X ללא ידיים עם אור ומעמד לקריאת תחביבים מלאכת יד תפירהAmazon.comלתצפית התנהגותית במהלך EPG; השתמש רק במנותק מהחשמל במהלך EPG או רעש עלול לגרום
למיקרוסקופ דיגיטלי Dino-Lite Edge (הגדלה פי 250)Dino-LiteAF4915ZTלתצפית התנהגותית במהלך EPG
Dino-Lite Flex-arm DesktopStand Dino-LiteMS22Bלאחיזה ומניפולציה של המצלמה
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod SetFisher ScientificS41740להחזקת מגבר הבמה הראשי והארקת כלוב פאראדיי (חייב להיות עשוי מתכת)
סדנה מקוונת EPGUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, "משאבים מקוונים" ללימוד EPG (הגדרת מכשירים, איסוף וניתוח נתונים, בניית פאראדיי, הכנת דבק כסף, בניית בדל חרקים וכו')
Furman P-1800 AR ווסת כוח/מרכך כוחAmazon.comלהפחתת רעשי הקו
עטיפת ריפוד בועות קטנהAmazon.comלשימוש כמחסום בין המארח לכלוב פאראדיי
Troemner Talboys Labjaws מחזיק מהדק רגילפישר סיינטיפיק02-217-121להחזקת מגבר הבמה הראשי והארקת כלוב פאראדיי (חייב להיות עשוי מתכת ולא מצופה בפלסטיק)
מחשב WindowsBest Buyעבור EPG וניתוח סטטיסטי
Software
Backus 2.0 ניתוח נתונים תוכנית SAS הרחבת UF IFAShttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/לניתוח סטטיסטי של נתוני צורות גל
Ebert 1.0 מניפולטור קבצים ובודק שגיאות תוכניות SASהרחבת UF IFAShttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/להכנת קבצים לניתוח סטטיסטי של נתוני צורות גל
SAS גרסה 9.4SAS Institute, Inc.לניתוח סטטיסטי של נתוני צורות גל
WinDaq Lite DATAQ אינסטרומנטס בע"מלהקלטה וסקירה של נתוני EPG.  כולל את תוכנת WinDaq Hardware Manager (AKA, "תוכנת ניהול חומרה") ואת תוכנת WinDaq Waveform Browser (AKA, "תוכנה לסקירת צורות גל"). לשימוש במחשבי Windows בלבד. 
Faraday Cage
מסך אלומיניוםהום דיפוMSCF5167עבור  קירות גיליון האלומיניום של כלוב פאראדיי
, 0.125 (1/8) 3003-H14מחסן מתכותS318עובי לבסיס כלוב פאראדיי
פלטות פינתיות, 1 אינץ' הום דיפו339547עבור   קירות כלוב פאראדיי
ברגי מכונת פיליפס עם ראש שטוח, #6-32 x 1 אינץ'הום דיפו459999 לבניית כלוב פאראדיי
מכונות כביסה שטוחות, #6 638977 הום דיפולבניית כלובי פאראדיי
מולטימטר דיגיטלי Fluke 15B+, ליישומים חשמליים, מודד מדידות מתח וזרם AC/DC עד 1000V ו-10A, יחד עם יכולות התנגדות, המשכיות, דיודה וקיבולAmazon.comלבדיקת כלוב
פאראדיירדיו נייד AM FM, רדיו טרנזיסטור גודס עם רמקול חזק, שקע אוזניות, רדיו המופעל על ידי סוללה 2AA לקליטה לטווח ארוך, רדיו כיס לשימוש פנימי, חיצוני וחירוםAmazon.comהטהור של Faraday Cage
, רשת 16 x 16 בקוטר חוט 0.11, 36 אינץ' x 12'MetroScreenworksעבור  קירות כלוב פאראדיי
ברגי מכונה משולבת ראש עגול, #6-32 x 3/4 אינץ'הום דיפו528466לבניית כלוב פאראדיי
נייר חול, 1/2 אינץ' על 1 אינץ', 150 GritHome Depot19036-20-CCלהסרת הצבע מתחתית מעמד המעבדה
פינות מסגרת מסך, 5/16 אינץ' WCORN516הום דיפועבור  קירות כלוב פאראדיי
ספליין מסך, 0.14 אינץ' הום דיפו3034719עבור  קירות כלוב פאראדיי
<חזק>בדל חרקים
Brass Escutcheon Pinsהום דיפו801294לבניית בדלי-חרקים   
חוטי נחושת,Amazon.comלבניית בדלי-חרקים   
שפעת מסיסה במים של האריס הום דיפו355398לסיוע בהלחמה בציפוי חוט בדל החרקים ויצירת חיבור חזק
צבת אף מחטהום דיפולכיפוף חוט בעת בניית בדלי חרקים
ערכת Pro 900-015 עזרה לידיים עזר הלחמהAmazon.comלהחזקת סיכות אסכוך במהלך הלחמה
הלחמה (עם ליבת רוזין)הום דיפו296497לבניית בדלי-חרקים   
כלי חשפנית חותך תילהום דיפולהפשטה וחיתוך חוטי נחושת בעת בניית בדלי חרקים
YIHUA 928D-III ברזל הלחמה, הספק גבוה 110W, תצוגה דיגיטלית מלאה ברזל הלחמהAmazon.comלבניית בדלי חרקים; מגיע עם מעמד, ספוג וצמר פלדה לניקוי
<חזק>שואב חרקים
Accuris ASPIRE מעבדה שואבמכשירי AccurisV0020להפעלת יניקה על שואב החרקים; כולל את בקר הוואקום הידני, מתאם הנירוסטה בעל הקצה העדין (40 מ"מ), ומתאם קצה הפיפטה
Chemglass Life Sciences Pasteur פיפטות,NC0230004פישר סיינטיפיקלשימוש כשואב חרקים בעת חיווט יתושים
סרט חשמלי מסחרי ויניל חשמלי קלטת חשמלהום דיפולחיבור פיפטת פסטר שהשתנתה לקו הוואקום
בד שירות כילה נגד יתושים, 10 x 10 ס"ממרובע Joann Fabrics16651622למניעת שאיבת יתושים לתוך משאבת הוואקום
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914למעבר מהיר וקל בין פיפטות פסטר שונות ששונו
Thermo Scientific Nalgene HDPE ניתוקים מהירים (3/8 עד 7/16 אינץ'. תעודת זהות)פישר סיינטיפיק15-315Bלמעבר מהיר וקל בין פיפטות פסטר שונות ששונו
Silver Glue 
Elmer's דבק לבן רב תכליתיAmazon.comלהכנת דבק כסף
פתית כסף 99.9% טהור,  4-8 ומיקרו; mThermoFisher786.09להכנת דבק כסף
פתית כסף 99.95% טהור, 8-10 ומיקרו; mInframat Advanced Materials47MR-12Fלהכנת דבק כסף
הרדמת חרקים
CO2 ערכת בועות, 1000 מ"ל, #9 פקק גומיFlyStuff59-181למניעת ייבוש חרקים בזמן השימוש במשטח הזבובים
Flypad  מסגרת, גודל סטנדרטיFlyStuff59-118למניעת נפילת יתושים ממשטח הזבובים
מברשת FlystationFlyStuff59-205להפחתת חשמל סטטי בעת עבודה על משטח זבוב
Flystuff  Flypad  גודל סטנדרטיFlyStuff59-114AKA "כרית הרדמה" להרדמת יתושים
משפך (קוטר 4 אינץ')Amazon.comלגז כוסות יתושים לפני העברתו לכרית הזבובים
זכוכית פלקסי או מכסה פלסטיק שטוח (חתוך לגודל)הום דיפוMC-27לכיסוי כרית הזבובים אם היתושים מתחילים להתעורר
כיבוי צינור צינורות פלסטיק מהדקים במיקום יחיד ופתוח מתכוונן (מגוון 1/8 אינץ' עד 1/2 אינץ')Amazon.comלהפניית גז בין משטח הזבוב למשפך
חד שלבי וסת CO2FlyStuff59-142לוויסות זרימת הגז מה-CO2 tank
" T” מתאים לצינורות זיהוי 1/8 אינץ'FlyStuff59-123לחיבור משטח הזבוב והמשפך למיכל CO2
צינורות, שקוף FlyStuff59-124Cלחיבור המשפך ומשטח הזבוב לווסת על מיכל ה-CO2 tank
חיווט חרקים
שחור, (65 ליברות, 176 גרם/מ2) 8.5 אינץ' x 11 אינץ'Michael's Stores Inc.327826כדי להקל על הדמיית חוט זהב
נייר בנייה שחור מרובע 3.5 אינץ' x 4.0 אינץ'סיכות956221כדי להקל על הדמיית חוטי
זהב כדורי כותנהAmazon.comלצום יתושים
קצף מלאכה #12 בלוק (3.1 ס"מ x 17.2 ס"מ x 30.2 ס"מ)ג'ואן בד וחנות יצירה1941079להחזקת יתושים חוטיים
סרט סטייה מתקן,Amazon.comלאחסון חוטי זהב
מלקחיים אנטומולוגיה במשקל נוצהFisher ScientificS72110למניפולציה של חרקים
מלקחיים עדינים (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20להכנת לולאת זהב בעת חיווט יתושים
מברשת צבע עדינהAmazon.comלמניפולציה של יתושים במהלך חיווט ו- EPG; חייב להיות בעל ידית פלסטיק או עץ אם משתמשים בו עבור EPG
צנרת העברה סטנדרטית עם קצה עדין, צרה, 5.8 מ"לתומאס סיינטיפיק7761D21להכנת דבק כסף
חוט זהב, 99.99% טהור, עובי 0.025 מ"מGoodfellowAU005121לחיווט יתושים
סיכות Minutien, קצה 0.2 מ"מ, 1 ס"מFisher ScientificNC9681411למריחת דבק על היתושים
כוסות נייר נייר קשיחלצום יתושים     
סגן סיכהפישר סיינטיפיק50-996-811להחזקת סיכת הזבובים במהלך חיווט חרקים
קופסת אחסון מפלסטיק עם מכסה (7 אינץ' x 9 אינץ' x 14 אינץ')Amazon.comלהובלת יתושים קוויים
זכוכית פלקסי או מכסה פלסטיק שטוח (חתוך לגודל)הום דיפוMC-27לכיסוי כרית הזבובים אם היתושים מתחילים להתעורר
מלקחיים לסגירה עצמיתפישר סיינטיפיק08-906להחזקה ומניפולציה של חוטי זהב
גז דחוס
CO2 גזMatheson Gasלהרדמת יתושים עם משטח זבוב
פריטי מעבדה נפוצים
שקיות חיטוי חד פעמיות Biohazard, 8 1/2 אינץ' x 11 אינץ'פישר סיינטיפיק03-410-591לסילוק יתושים הניזונים מדם
מבער בונסן או לפיד פרופאןAmazon.comלשינוי פיפטות פסטר
סרט מעבדה צבעונידייגר מספקEF9763Rלתיוג, הכנת דבק כסף ומלקחיים מיסוך
קצות פיפטות חד פעמיות, 1000 ומיקרו; לפישר סיינטיפיק לציון מים בעת הכנת דבק כסף
מיקרוסקופ דיסקציהLeica Microsystemsלחיווט יתושים
בדיקת דיסקציהNC9109673מדעי פישר לערבוב  ומריחת דבק כסף
בקבוק Erlenmeyer, 1000 מ"לפישר סיינטיפיק למניעת ייבוש חרקים בזמן השימוש
באתנול Flypad, 70% פישר סיינטיפיק04-355-122לשיקום יתושים שנמלטו
צלחות פטרי מזכוכיתפישר סיינטיפיק08-747Bלהרדמת יתושים עם כפפות קרח
פישר סיינטיפיקלהגנה אישית
Kimwipes KimTech Science מותג מגבים עדינים למשימות פישר סיינטיפיק06-666לריסוק יתושים
מעילי מעבדהפישר סיינטיפיקלהגנה אישית
בקבוקי ספריי LiBa, בקבוקי ריסוס ריקים למילוי חוזר (אלכוהול בטוח)Amazon.comלשחזור יתושים שנמלטו
מוט ערבוב מגנטי, באורך 2 ס"מפישר סיינטיפיק לערבוב דבק כסף
פיפטה מכנית חד-ערוצית, 1000 ומיקרו; לפישר סיינטיפיק 13-690-032להצעת מחיר מים בעת הכנת צינורות
מיקרוצנטריפוגה דבק כסף, 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק 780420לאחסון דבק כסף
Parafilm M פישר סיינטיפיק50-998-944לאיטום צינורות דבק
כסף ניילון נצמדAmazon.comלכיסוי בלוק הקצף
פיירקס 20 מ"לפישר סיינטיפיק 07-250-051לערבוב דבק כסף
חצי מיקרו איזוןפישר סיינטיפיק 10-919-370לשקילת דבק ופתית כסף
עט שארפי, Amazon.comלתיוג
סכין גילוח חד קצהמיקרוסקופיה אלקטרונית71980לניקוי דודי חרקים
פיפטות העברה חד פעמיות סטנדרטיותפישר מדעי 133-711-7 מ"ללהעברת דבק כסף לצינור אחסון 
צלחת מוקפץפישר סיינטיפיק לערבוב דבק כסף
טיימר/שעון עצרפישר סיינטיפיקלתזמון כמה זמן המארח נחשף לכל חרק
Ultrapure (18 MΩ) מיםפישר סיינטיפיק להכנת דבק כסף
מספריים שימושייםפישר סיינטיפיק08-945לחיתוך חוטי זהב
מערבל מערבולתפישר סיינטיפיק לערבוב דבק כסף
מחקר אורגניזמים
Culex tarsalis יתושיםUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research במנהטן, KSלשימוש כנבדקי מחקר
מסגרת לבדיקת מסך הנחושת 20 AWG באורך 5 3/4 אינץ' שקוף צינור . . עדין מדעי

מקורות

  1. Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
  3. Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
  4. Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
  5. Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
  6. Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
  7. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
  8. Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
  9. Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
  10. Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
  11. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
  12. Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
  13. Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
  14. Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
  15. Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
  16. Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
  17. Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
  18. Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
  19. Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
  20. Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
  21. Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
  22. Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  23. Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
  24. Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
  25. Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
  26. Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
  27. Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
  28. Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
  29. Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
  30. Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
  31. Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
  32. Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  33. Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
  34. Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

התנהגות הזנה של יתושיםהתנהגות דקיקההתנהגות בליעההזנת דםהקלטת אותות חשמלייםהעברת נגיפיםאלקטרודת חוט זהבאינטראקציה עם מארח אנושי
אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.