אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם

Anastasia M. W. Cooper; Kaitlin Pfeiffer; Kathryn Reif; Kristopher Silver; Dana Mitzel

doi:10.3791/66877

מאמר שיטה

אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 בנובמבר 2024

Anastasia M. W. Cooper¹^,² , Kaitlin Pfeiffer¹ , Kathryn Reif² , Kristopher Silver¹ , Dana Mitzel³

¹Department of Entomology, Kansas State University, ²Department of Pathobiology, Auburn University, ³National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארים נהלים לחקר התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם באמצעות אלקטרו-חדירה AC-DC.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתושים מעבירים פתוגנים המשפיעים לרעה על בריאות האדם ובעלי החיים. ניתן לנצל הבנה טובה יותר של הביולוגיה של הזנת הדם שלהם והאינטראקציות עם פונדקאים ופתוגנים כדי לפתח מטרות חדשות לשליטה במחלות המועברות על ידי יתושים. לרוע המזל, התנהגויות גישוש (כלומר, עקיצה) של יתושים אינן מובנות היטב מכיוון שהן מתרחשות בתוך רקמות המארח. כאן, מתואר הליך לא פולשני לשימוש באלקטרו-חדירה AC-DC (EPG) כדי לדמיין ולכמת בעקיפין התנהגויות האכלת יתושים על ידי רישום שינויים באותות חשמליים הנוצרים בעת חיטוט ובליעה על ידי אדם. חוטי זהב דקים מחוברים ליתושים באמצעות דבק כסף מוליך ומחוברים למכשיר ה- EPG. המארח האנושי מחזיק ביד בדיקת מתח מצע. גישוש המארח על ידי היתוש החוטי משלים את המעגל החשמלי, ואותות חשמליים נרשמים במחשב כ"צורות גל" שניתן למדוד ולספור לניתוח. מתודולוגיה זו שימשה לאפיון התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Aedes aegypti ו-Culex tarsalis וניתן ליישם אותה על מיני יתושים אחרים. ניתן להשתמש ב-EPG כדי לחקור את ההשפעות של פתוגנים, קוטלי חרקים וגורמים אחרים על התנהגויות האכלת יתושים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתושים גורמים לסבל ולהפסד כלכלי ברחבי העולם בשל תפקידם כמחוללי מחלות ומזיקים מטרידים¹. יתושי אנופלס מעבירים מלריה, הגורמת מדי שנה לכ-219 מיליון מקרים ברחבי העולם, יותר מ-400,000 מקרי מוות², ו-12 מיליארד דולר בעלויות ישירות³. יתושי אדס הם הווקטורים הבולטים ביותר של חשיבות לבריאות הציבור מכיוון שיש להם נוכחות כמעט גלובלית והם מעבירים חומרים של צ'יקונגוניה, קדחת דנגי, פילריאזיס לימפטי, קדחת עמק השבר, קדחת צהובה וזיקה, שגובים חיים, מציפים את מערכות הבריאות וגורמים לסבל כרוני, תחלואה לכל החיים ונכות⁴^,⁵. בנוסף, יתושי קולקס מעבירים חומרים של דלקת מוח סוסים, דלקת מוח יפנית, פילריאזיס לימפטי, דלקת המוח של סנט לואיס וקדחת מערב הנילוס, המשפיעים על בריאות האדם ובעלי החיים כאחד³^,⁴.

הדברת וקטור בגישות מבוססות קוטלי חרקים היא השיטה המובילה לשליטה במחלות הנישאות על ידי וקטור ברחבי העולם⁶^,⁷. עם זאת, מספר קוטלי החרקים הזמינים להדברת יתושים מוגבל. בנוסף, עמידות לקוטלי חרקים מתפתחת במינים רבים, במיוחד ביתושי Aedes, מה שמשפיע על יכולתנו להילחם במחלות הנישאות על ידי וקטורים ומניע את הצורך באסטרטגיות הדברה חדשות⁶^,⁸. הבנה טובה יותר של הביולוגיה של יתושים, אינטראקציות יתוש-מארח-פתוגן והתהליכים המווסתים את העברת הפתוגנים יכולה להקל על פיתוח כלים חדשים לבקרת וקטורים⁶.

התנהגויות בדיקה ובליעה ברקמות המארח יכולות להשפיע על העברת פתוגנים ופתולוגיה של מחלות⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². לדוגמה, יותר מיקרופילאריות נבלעו כאשר Aedes aegypti ניזון ישירות מהנימים במקום להצטבר דם מחוץ לכלי דם קרועים¹³. לפיכך, מחקר בסיסי ויישומי בנושא זה יכול לסייע בפיתוח, חידוד והערכה של אסטרטגיות הדברת יתושים ואמצעי נגד אחרים להעברת פתוגנים. עם זאת, קיימים פערי ידע משמעותיים בפרטים של התנהגויות הזנת דם מוצפנות המתרחשות מתחת לפני השטח של עור הפונדקאי מכיוון שהתנהגויות אלה דורשות לעתים קרובות הליכים פולשניים במודלים של בעלי חיים חיים או משתמשות במצעים מלאכותיים שקופים או דיאטות נוזליות⁹^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵. טכניקות אלקטרו-חדירה לא פולשניות (EPG; נקראת גם גרף חדירה חשמלי) שימשו לחקר התנהגויות האכלה של חרקים הניזונים מצמחים הקשורות להעברת פתוגנים בצמחים, עמידות צמחים מארחים ודרכי פעולה של קוטלי חרקים מכיוון שהן מאפשרות לחוקרים להתבונן, לתעד ולכמת בעקיפין תנועות והתנהגויות של חלקי הפה המתרחשות בתוך רקמות מארחות¹⁰^,¹².

מאז שנות ה-50 של המאה ה-20, טכניקות ניטור חדירה אלקטרוניות יושמו על פרוקי רגליים הניזונים מדם, כולל יתושים¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. עם זאת, EPG מעולם לא אומץ באופן נרחב עבור פרוקי רגליים הניזונים מדם מכיוון שפעילויות ביולוגיות המתאימות לצורות הגל מעולם לא אומתו²¹. בנוסף, העיצובים והאלקטרוניקה של מכשירים מוקדמים הביאו להדגשת יתר של כמה אותות חשמליים, יחסי רעש לאות גבוהים, רזולוציה נמוכה ועיוות של צורות גל, וגירוי למארחי חוליות¹²^,²². מכשיר עדכני יותר, AC-DC EPG MONITOR²³, כולל הגדרות משתנות ועיבוד אותות משופר, מה שהופך אותו למתאים יותר לתיעוד פרוקי רגליים הניזונים מדם ולפענוח המקורות הביולוגיים של צורות הגל במחקרי מתאם ניסיוניים¹⁰^,¹².

עבור EPG, אות חשמלי מופעל על המארח דרך בדיקת מתח מצע (כלומר, אלקטרודת ייחוס). פרוקי הרגליים מחוברים לאלקטרודה מקליטה ומונחים על המארח. כאשר פרוקי הרגליים מכניסים את חלקי הפה שלהם (כלומר, סטיילטים) לתוך המארח, האות החשמלי מועבר למוניטור AC-DC EPG לעיבוד אותות. לאחר מכן, האותות החשמליים מוצגים במחשב כ"צורות גל" המתאימות להתנהגויות ספציפיות כגון תנועות של חלקי הפה, בליעה, רוק ורכישה/חיסון של פתוגנים¹⁰^,¹². לאחר מכן ניתן לחשב משתני תגובה עוקבים ולא רציפים הקשורים למשך ולספירה של צורות הגל²⁴^,²⁵ ברמות היררכיות שונות (משפחות, סוגים ותתי סוגים) על סמך התדירות ומשך צורות הגל כדי לקבל תובנה לגבי התנהגויות האכילה המתרחשות בתוך ובין מינים, ובתגובה לגורמים ביוטיים ואביוטיים, כגון מארחים, פתוגנים, חומרי הדברה ותנאים סביבתיים¹⁰^,¹².

עד כה, נעשה שימוש במוניטור AC-DC EPG כדי לאפיין את התנהגויות הבדיקה והבליעה של Ae. aegypti²⁶ ו-Culex tarsalis²⁷ יתושים הניזונים מידיים אנושיות, וקרציות Dermacentor variabilis ו-Amblyomma americanum הניזונות מעגלי בקר²⁸. בנוסף, מודל עכברים עבור EPG²⁹ פותח לאחרונה כדי להקל על מחקרי פתוגנים באמצעות מכשיר זה. ידיים אנושיות אידיאליות לאפיון צורת הגל הראשונית של יתושים מכיוון שמארחים אנושיים יכולים לדווח מתי הם מרגישים את היתוש מגשש כמו גם התנהגויות אחרות, מה שמקל על המתאם בין צורות גל להתנהגויות (טבלה 1). בנוסף, הבנה טובה יותר של הפלסטיות בהתנהגויות האכלה בקרב יתושים באוכלוסיות אנושיות שונות יכולה לתרום לפיתוח התערבויות ניהול מיוחדות יותר עבור יתושים והפתוגנים שהם מעבירים.

טבלה 1: תיאור של משפחות צורות גל המשמשות לסיווג אותות חשמליים שנרשמו מטרסליס קולקס על ידיים אנושיות באמצעות AC-DC EPG. שלב הבדיקה והפעילויות הביולוגיות המתאימות לכל משפחת צורות גל. ראה Cooper et al.²⁷ למידע נוסף. קיצור: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, EPG = אלקטרו-חודרגרף. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

כדי להקל על השימוש ב-EPG לחקר ביולוגיה של יתושים ואינטראקציות מארח-וקטור, מוצגת כאן מתודולוגיה לכימות התנהגויות האכילה של יתושי Cx. tarsalis על ידי אדם באמצעות צג AC-DC EPG. פרוטוקולים אלה מתבססים על נהלי AC-DC EPG הבסיסיים המתוארים במשאבים מקוונים³⁰ ומניחים שלמשתמשים יש ידע בסיסי בעבודה של AC-DC EPG ותוכנה קשורה³¹. ניתן לשנות את הנהלים המתוארים עבור מיני יתושים ומארחים אחרים ולספק בסיס להקל על מחקר מונחה השערות של התנהגויות האכלת יתושים.

טבלה 2: הגדרות של טרמינולוגיה נפוצה של AC-DC EPG. ההגדרות מבוססות על אלה שניתנו במשאבים מקוונים³⁰^,³¹ וספרות מדעית³². קיצור: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, EPG = אלקטרו-חודרגרף. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה (IRB-10729) אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) למחקר בבני אדם באוניברסיטת קנזס סטייט²⁷ והוא מיועד לשימוש עם יתושים נטולי פתוגנים בלבד. מתנדבים אנושיים נתנו את הסכמתם מדעת להשתתף במחקר ולפרסם את הנתונים שלהם. לפני התחלת עבודה כלשהי עם בעלי חיים, בני אדם או מפגעים ביולוגיים, ודא שכל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי הוועדות הרגולטוריות המוסדיות המתאימות או אנשי פיקוח. עיין בטבלת החומרים לפרטים על כל הציוד והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנה והגדרה ראשונית

הגדר את צג ה-AC-DC EPG (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1A), כלוב פאראדיי (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1B,C), ותוכנה כפי שתואר קודם לכן³⁰^,³¹ באמצעות השינויים המתוארים להלן (שלבים 1.1.1-1.1.5). עיין במשאבים מקוונים³⁰ לקבלת הדרכות שלב אחר שלב על הגדרה ושימוש בציוד ובתוכנה. שמור את ההגדרה הרצויה כברירת מחדל בתוכנת ניהול החומרה וסקירת צורות הגל. עיין בטבלה 2 לרשימה של טרמינולוגיה נפוצה של AC-DC EPG והגדרותיהם.
1. חבר ראש tagampliifier (ראש amp) ומצע כרךtagבדיקה לערוץ 1 של תיבת הבקרה.
  הערה: הקלטה מערוץ יחיד מוצגת למרות שצג AC-DC יכול להכיל בו זמנית ארבעה חרקים ומארחים.
2. ודא שערוץ 1 בתיבת הבקרה מופעל והערוצים המתאימים Pre-1 ו-Post-1 בתיבת ממשק המתג מופעלים.
  הערה: ערוצים שאינם בשימוש חייבים להישאר כבויים.
3. השתמש בתוכנת ניהול החומרה כדי לאפשר לערוצים 1 ו-3 בלוח ה-A/D DI-710 (אך לא לאחרים) להקליט את האותות המתוקנים לפני ואחרי
4. פרמט את תוכנת ניהול החומרה כדי להציג/לחפוף את צורות הגל לפני ואחרי התיקון (למשל, 1 = 1 עבור האות המקדים ו-2 = 3 עבור האות שלאחר האות).
5. הגדר את קצב הדגימה בתוכנת ניהול החומרה ל-100 דגימות לשנייה לכל ערוץ (כלומר, S/s/CHAN: 100).
בנה קטעי חרקים²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰:
1. מחממים את הברזל לטמפרטורה המומלצת עבור הלחמת ליבת הרוזין הספציפית.
2. השתמש בכלי חותך-מסיר חוטים כדי להפשיט את ציפוי הפלסטיק ~6 ס"מ מהקצה של גליל חוט נחושת 20 AWG, אך הימנע מניתוק או סימון צרור חוטי הנחושת בפנים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2A). לאחר מכן, חתכו את צרור חוטי הנחושת החשוף ופרמו לגדילים בודדים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2B).
3. השתמש בצבת עם אף מחט כדי לעטוף גדיל אחד של חוט הנחושת סביב הפיר של סיכת מנעול מתאימה מתחת לראש (כלומר, חלק עליון שטוח) כך שרוב חוט הנחושת משתרע מעבר לראש הסיכה. קפלו את זנב החוט מעל ראש הסיכה כדי להדק את החוט במקומו (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2C).
  הערה: התאם את פיני הבדיקה כדי לזהות את אלה שמתאימים היטב ליציאת הראש amp (כאשר הוא כבוי, מנותק מהחשמל ומוגדר ל-10⁶ אוהם (Ω)).
4. הצמד את פיר סיכת המנעול בעזר ההלחמה של הידיים המסייעות כך שחוט הנחושת יצביע כלפי מעלה. לאחר מכן, החל טפיחה קטנה (~0.2 ס"מ כדור) של שטף מסיס במים על הצומת של סיכת ה-escutcheon וחוט הנחושת (איור 2D).
  זהירות: השטף רעיל ויש לטפל בו בזהירות.
5. שחרר ~ 10 ס"מ של הלחמה ויישר אותו. החזק את הברזל החם כנגד ראש הסיכה למשך מספר שניות עד שהשטף נמס והמתכת חמה. לאחר מכן, לחץ על קצה ההלחמה לראש הסיכה שליד הברזל עד שההלחמה נמסה ומצפה לחלוטין את הצומת, וממזגת את הסיכה והחוט לתוך בדל חרקים.
6. בזמן שבדל החרקים מתקרר, יש לנקות את קצה הברזל עם צמר פלדה וספוג לח.
7. לאחר שהתקרר, הסר את בדל החרקים מהידיים המסייעות. שטפו את בדל החרקים באתנול 70% ולאחר מכן במים כדי להסיר שטף שיורי. חתוך את חוט הנחושת לאורך הרצוי (~3 ס"מ, <מחלקה חזקה = "xfig">איור 2E).
8. חזור על שלבים 1.2.3-1.2.7 עד לבניית 20-30 גבעולי חרקים.
הרכיבו שואב חרקים²⁶^,²⁷:
1. העבירו את קצה פיפטת פסטר מזכוכית דרך להבה, סובבו מעט את הפיפטה. חזור על הפעולה עד שקצה הפיפטה יהיה בגודל המתאים כדי להתאים היטב סביב בטן החרק.
2. מכסים את הקצה הגדול של פיפטת פסטר שהשתנתה בכילה נגד יתושים, ואז מכניסים אותה ישירות לצינור הסיליקון המחובר לשואב מעבדה ומאבטחים את הצומת עם סרט חשמלי ליצירת שואב חרקים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2H).
  הערה: ניתן להכניס את הפיפטה והרשת של פסטר לחתיכה קצרה של צינורות פלסטיק המצוידת בניתוק מהיר למעבר קל בין גדלים שונים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2H).

figure-protocol-1
איור 1: מערך ציוד צג AC-DC EPG להקלטה על ידי אדם. (A) רכיבי ה-EPG, כולל (1) תיבת בקרה, (2) תיבת ממשק מתגים, (3) ספק-כוח, (4) לוח A/D DI-710, (5) מחשב, (6) מייצב הספקת-כוח, ו-(B) כלוב פאראדיי המכיל (C) מיקרוסקופ דיגיטלי (7) על מעמד צוואר אווז, (8) ניילון בועות וכריות אוויר, (9) בדיקת מתח מצע, ו-(10) מגבר שלב ראש על מעמד מעבדה. קיצורים: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, EPG = אלקטרו-חודרגרף. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2: אלקטרודות הקלטה עבור חיווט יתושים ושואב חרקים עבור מניפולציה של יתושים במהלך החיווט. (A) חוט נחושת 20 AWG עם 6 ס"מ של ציפוי פלסטיק שהוסר כדי לחשוף את צרור חוטי הנחושת בפנים. (ב) גדילים בודדים של צרור חוטי הנחושת. (C) גדיל אחד של חוט נחושת כרוך סביב ראשו של סיכת פליז כשזנב החוט מקופל מעל ראש הסיכה. (D) טיפה של שטף על הצומת של סיכת הפליז וחוט הנחושת המוחזקים על ידי עזר הלחמה בידיים עוזרות כהכנה להלחמה. (E) בדל חרקים שלם הבנוי ממסמר פליז המולחם לחוט נחושת. (F) אלקטרודת הקלטה הבנויה מחוט זהב הכרוך סביב קצה חוט הנחושת של בדל חרקים ומאובטח במקומו בדבק כסף. (G) תקריב של לולאת הזהב בקצה אלקטרודת ההקלטה. (H) שואב חרקים מורכב (למעלה) ומפורק (למטה) העשוי מפיפטות פסטר מותאמות, כילה נגד יתושים, צינורות פלסטיק, סרט חשמלי ומנתקים מהירים זכריים, ליד צינור השואב המעבדתי המצויד בניתוק מהיר נקבה (מימין למעלה). פסי קנה מידה = 1 ס"מ (A-F), 200 מיקרומטר (G). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. חיווט יתושים

הכינו יתושים ודבק כסף (אחר הצהריים/ערב לפני EPG):
1. אחורי ותחזק יתושים מזן Cx. tarsalis KNWR כפי שתואר קודם לכן²⁷.
2. נקבות יתושים בוגרות מהירות, 5-17 ימים לאחר האקלוזיה, למשך 8-12 שעות כדי לשפר את שיעורי הגישוש אך לאפשר גישה למים כדי למנוע תמותה.
3. הכן דבק כסף טרי²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰:
  1. הוסף 510 מ"ג של פתית כסף 4-8 מיקרומטר לכוס של 20 מ"ל. ערערו את האיזון והוסיפו 1,100 מ"ג של דבק בית ספר לא רעיל לכוס על גבי פתית הכסף.
  2. ערוך את האיזון, הוסף 510 מ"ג של פתית כסף 8-10 מיקרומטר לכוס על גבי הדבק, ולאחר מכן הוסף 1,000 מיקרוליטר מים באמצעות פיפטה.
  3. הוסיפו בעדינות מוט ערבוב לכוס והניחו אותו על צלחת הערבוב. מתחילים לערבב לאט, הופכים בהדרגה למצב 'מהיר' ומערבבים במשך 4 דקות. ודא שכל התוכן משולב.
  4. השתמש בפיפטה העברה (כשהקצה מנותק) כדי להעביר את דבק הכסף לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  5. עוטפים את החלק העליון של צינורות הדבק הכסופים עם Parafilm ושומרים על הספסל עד לשימוש.
    הערה: לדבק כסף יש את העקביות הנכונה עד יומיים, אך מומלץ להכין דבק טרי בערב שלפני השימוש³⁰.
הכן אלקטרודות הקלטה²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰:
1. מערבל במרץ את דבק הכסף לפני השימוש.
2. עטפו גוש קצף בניילון טרי כדי להחזיק את דודי החרקים המוכנים והיתושים החוטיים.
  הערה: הקצף חייב להיות גדול מספיק כדי לאפשר ליתושים החוטים לעמוד על פני השטח מבלי לגעת זה בזה אך קטן מספיק כדי להיכנס לקופסת אחסון. זהירות: טיפות הפרשה המשתחררות לאחר הזנת דם עלולות להכיל פתוגנים. השלך את הניילון/גוש הקצף כראוי לאחר השימוש.
3. הסר כתמים (ודבק כסף ישן אם נעשה שימוש חוזר בדלי חרקים) מקצה חוט הנחושת על ידי גירוד 1 ס"מ העליונים של חוט הנחושת בעזרת סכין גילוח עד שהוא מבריק מכל הצדדים. הכינו בדל חרקים אחד לכל יתוש, בתוספת כמה תוספות.
4. חותכים חוט זהב בקוטר 0.025 מ"מ לחתיכות באורך 4-5 ס"מ. החזק תמיד את החוט במלקחיים עם סגירה עצמית מוסווים בסרט כדי למנוע פגיעה בחוט.
  הערה: הרבה יותר קל לראות חוט זהב על רקע שחור.
5. הנח את קצה חוט הזהב לאורך הקצה הנקי של חוט הנחושת של בדל החרקים ועטוף בעדינות את חוט הזהב פי 3 סביב חוט הנחושת.
6. השתמש בבדיקת דיסקציה כדי למרוח דבק כסף כדי להחזיק את חוט הזהב במקומו. ודא שאין זנב או קצה רופף. מניחים את בדל החרקים בקצף עד שהדבק מתייבש.
7. לטפו בעדינות את חוט הזהב שמחובר לבדל החרק כדי להחליק ולעצב אותו לקשת ארוכה ועדינה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2F). חתוך את החוט לאורך הרצוי (~2.5-3 ס"מ).
8. בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במלקחיים עדינים כדי ליצור לולאת זהב בקצה חוט הזהב, וכופף את הלולאה בזווית של 90 מעלות כמתואר להלן (שלבים 2.2.8.1-2.2.8.4; <מחלקה חזקה="xfig">איור 2E,F). ודא שלולאת הזהב סגורה לחלוטין. החזר את בדל החרקים לגוש הקצף.
  1. בעזרת היד הלא דומיננטית, החזק את בדל החרק במסמר הפליז, כאשר קצה חוט הזהב נוגע בבמת המיקרוסקופ. בעזרת היד הדומיננטית, אחוז בקצה חוט הזהב בעזרת מלקחיים דקים.
  2. בעזרת המלקחיים העדינים חוצים את קצה חוט הזהב מעל חוט הנחושת של בדל החרקים ליד המקום שבו מודבק חוט הזהב. גע בקצה המלקחיים העדינים וחוט הזהב כלפי מטה כנגד שלב המיקרוסקופ.
  3. משוך בעדינות את בדל החרקים עד שחוט הזהב יוצר לולאת זהב קטנה סביב קצה המלקחיים העדינים (אל תמשוך חזק מדי). שחרר את חוט הזהב והסר בזהירות את המלקחיים.
  4. בעודך מחזיק את בדל החרק ביד הלא דומיננטית, אחוז בלולאת הזהב עם המלקחיים הנקודתיים העדינים כך שהמלקחיים יהיו בזווית מאונכת לצוואר החוט וקצה המלקחיים משתרע על אמצע לולאת הזהב, ובכך אוחז בשני צידי הלולאה. משכו בעדינות את בדל החרק תוך כדי סיבוב קל של המלקחיים הרחק מבדל החרק עד שהלולאה מכופפת בזווית של 90 מעלות לצוואר החוט (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2G).
חבר אלקטרודות הקלטה ליתושים²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰ (בוקר ה-EPG):
1. הרדמת יתושים בצום עם גז CO₂ עד שכל התנועה נעצרת. מקמו את היתושים על גבם על משטח ההרדמה, כשהבטן שלהם פונה לחוקר.
2. הניחו חתיכת סרט מעבדה בגודל ~2 ס"מ מתחת למיקרוסקופ דיסקציה, הצד הדביק כלפי מטה. הניחו טיפה של 0.5 ס"מ (~ 10 מיקרוליטר) של דבק כסף על הקלטת.
3. שאפו את הבטן של יתוש מורדם לתוך פיפטת פסטר שהשתנתה באמצעות היניקה רק מספיק זמן כדי להושיב את הבטן במקומה. החזק את היתוש מתחת לטווח החיתוך מעל דבק הכסף באמצעות השואב.
  הערה: הכנפיים יכולות להיות בתוך או מחוץ לקצה פיפטת פסטר ששונה, אך הימצאותן בפנים תעזור למנוע את נפילת היתוש. הימנע מכיפוף או פגיעה בכנפיים.
4. עובדים במהירות, טובלים סיכה דקה בדבק הכסף ומורחים שכבה דקה על הפרונטום של היתוש (כלומר, המשטח הגבי של בית החזה). המשך מיד לשלב הבא במידת האפשר (או הרדם מחדש את היתוש במידת הצורך).
  הערה: מומלץ להסיר קשקשים על הפרונטום על ידי שפשוף הסיכה קדימה ואחורה כדי להבטיח חדירת דבק לנקבוביות בציפורן. הימנע מקבלת דבק על כל חלק אחר של היתוש.
5. טבלו במהירות את לולאת הזהב בקצה אלקטרודת ההקלטה בדבק הכסף והניחו אותה על נקודת הדבק הכסופה על הפרונטום של היתוש. נדנד את הלולאה קדימה ואחורה כדי להבטיח שהיא יושבת צמודה לפרונטום. החזק את החוט עד שהדבק מתייבש (~20-25 שניות).
6. החזר את בדל החרקים בקצף בזווית המאפשרת ליתוש החוטי לעמוד בנוחות כשהוא מתעורר. המשך בחיווט היתוש הבא.
  הערה: רצוי לרשום הערות לגבי האיכות של כל עבודת חיווט.
7. לאחר חיבור מספר היתושים הרצוי, הנח את גוש הקצף בקופסת אחסון. שמור על היתושים בתנאי גידול רגילים עד לשימוש.

3. הגדרה והכנה של EPG (בבוקר שלפני EPG)

הפעל את צג ה-AC-DC EPG (על ידי הפניית המתג בספק הכוח) לפחות 30 דקות לפני ההקלטה כדי לאפשר שיווי משקל של המכשיר וכל פתרון בעיות.
הערה: ניתן להשאיר את הערוצים הנמצאים בשימוש בתיבת הבקרה ובתיבת ממשק המתגים מופעלים.
הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ניהול החומרה.
הערה: אם האותות אינם מופיעים כקווים דקים שטוחים, נדרש פתרון בעיות (ראה סעיף דיון).
בצע את בדיקת המגע²⁷^,³⁰ כדי לאמת את פונקציונליות הציוד:
1. בעודו מקורקע (כלומר, נוגע בכלוב פאראדיי בעור חשוף), סובב את החוגה בראש amp ל-10⁶ Ω והכנס את הפיר של בדל חרקים לתוך היציאה.
  הערה: ביצוע בדיקת המגע ברמת התנגדות כניסה גבוהה יותר (Ri) עלול לגרום נזק לראש amp.
2. בעודו מקורקע, הפעל את מגבר הראש ואחז בחוזקה בחוט הנחושת של בדל החרקים בין האצבע המורה לאגודל שלוש פעמים. אם ה- EPG פועל כהלכה, שלוש פסגות גדולות יופיעו הן באותות המקדים והן באותות הפוסט על המסך. אם זה לא המקרה, נדרש פתרון בעיות (ראה סעיף דיון).
כוונן את הגדרות המכשיר לזרם חילופין (AC) של 150 mV עם Ri של 10⁷ Ω, רווח חומרה של פי 20-40, היסט שלילי, קו בסיס מקורי ורווח תוכנה של 8-16x²⁷^,³⁰, כמתואר להלן (שלבים 3.4.1-3.4.3).
1. הגדר את המתח, סוג הזרם, רווח החומרה (טווח, רווח ומכפיל), ההיסט וקו הבסיס (אפס) באמצעות המתגים והחוגות בערוץ 1 של תיבת הבקרה.
  הערה: הגדרת רווח החומרה המתאימה תלויה באיכות עבודת החיווט ובדבק הכסף, ולכן צפויה שונות בהגדרות הרווח האופטימליות מיתוש ליתוש ויומיומי. ייתכן שיהיה צורך לכוונן את רווח החומרה באמצע ההקלטה אם האות מגיע לשיא (מוגדר בטבלה 2 ומוצג ב<מחלקה חזקה="xfig">איור 3A,C) או קטן מכדי להמחיש. כל שינוי ברווח החומרה ישפיע לצמיתות על ההקלטה (מוצג ב<מחלקה חזקה="xfig">איור 3A,C).
2. הגדר את רמת ה-Ri באמצעות החוגה בראש amp.
3. הגדר והתאם את רווח התוכנה באמצעות תוכנת ניהול החומרה (למשל, בחר את האות לפני או אחרי ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית כדי להעלות את רווח התוכנה או לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד את רווח התוכנה).
  הערה: כל שינוי רווח שבוצע בתוכנה לא ישפיע לצמיתות על ההקלטה.
הגדר הקלטה חדשה בתוכנת ניהול החומרה, אך אל תתחיל להקליט עד שלב 4.3 בסעיף הבא.

4. EPG על ידיים אנושיות²⁶^,²⁷ :

לאחר קבלת הסכמה מדעת (כפי שצוין על ידי ה-IRB של מוסד הבית), בקש מהמארח לשבת ליד כלוב פאראדיי עם זרוע אחת בפנים תוך שהוא אוחז בבדיקת מתח המצע ומחזיק אותו מתחת לראש amp.
הערה: הזרוע חייבת לנוח בנוחות על ניילון בועות או מצע לא מוליך דומה. אסור למתח היד והתת-מצב ליצור קשר עם כלוב פאראדיי או ראש amp בזמן ההקלטה. כדי למנוע נזק, הכרחי שהמתנדב לא ייגע במגבר הראש לאחר הפעלתו. אם נוגעים במגבר הראש בטעות, בצע את בדיקת המגע שתוארה לעיל כדי להעריך את הפונקציונליות שלו.
לאחר שהמארח נמצא במקומו, סובב את הראש amp הצידה. הסר יתוש חוטי מקופסת האחסון וחבר אותו למכשיר על ידי הכנסת סיכת הפליז של בדל החרקים ליציאה בראש amp. השאירו את היתוש משתלשל.
הערה: שמור בקבוק ריסוס של 70% אתנול בקרבת מקום כדי לשלוט בכל יתושים שמתנתקים מהחוט.
התחל את ההקלטה באמצעות תוכנת ניהול החומרה. מקם את מגבר הראש מעל היד כך שהיתוש יוכל לעמוד ולבדוק בנוחות.
הפעל את הראש amp כשהוא מקורקע. התחל טיימר של 10 דקות. התאם את מיקום היד המארחת לפי הצורך כדי לסייע בבדיקת הצלחה.
הערה: בעת שימוש ביתושים הנוטים לחקור מיד, הפעל את הראש amp לפני הצבת היתוש על היד. ניתן להשתמש בדיבל עץ דק או בידית מברשת צבע לא מוליכה כדי לכופף את חוט הנחושת של בדל החרקים כדי להתאים עוד יותר את מיקום היתוש. זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ דיגיטלי על מעמד צוואר אווז יכולים לסייע בהתבוננות ביתוש במהלך EPG, במיוחד עבור מחקרי מתאם התנהגותי.
השתמש בתוכנת ניהול החומרה כדי לבצע תצפיות עם חותמת זמן (למשל, סמני אירועים) במהלך ההקלטה לגבי תגובות המארח, התנהגויות יתושים, שינויי רווח וכו'). התאם את מיקום האותות על המסך ואת רווח התוכנה לפי הצורך כדי לשמור על שני האותות גלויים בבירור על המסך. כוונן את רווח החומרה אם האותות מגיעים לשיא (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3A, C וטבלה 2) או אם הגלים נראים קטנים מדי כאשר רווח התוכנה מגיע למקסימום. כוונן את ההיסט אם נצפה קיפול מיישר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3C, C' וטבלה 2). עיין במדריך התוכנה^{31 ובמשאבים מקוונים}³⁰ לקבלת הוראות מפורטות כיצד לבצע התאמות אלה.
1. כדי להתאים את מיקום האותות על המסך, בחר את האות המקדים או הפוסט (למשל, על ידי לחיצה על
  1 = 1 או 2 = 3) ולאחר מכן גרור את האות למיקום הרצוי על המסך (באופן אידיאלי קרוב לאמצע המסך אך לא חופף).
2. כדי להתאים את רווח התוכנה, השתמש בתוכנת ניהול החומרה המתוארת בשלב 3.4.3.
3. כדי לכוונן את רווח החומרה, התחל בסיבוב חוגת הרווח עבור ערוץ 1 ימינה או שמאלה כדי להעלות או להוריד את ההגבר, בהתאמה. אם התאמה זו אינה מספיקה כדי לבטל את השיא החוצה (רווח גבוה מדי; <מחלקה חזקה = "xfig">איור 3A,C) או לאפשר לפרטי האות להיות חזותיים בבירור (רווח נמוך מדי), הפוך את טווח ערוץ 1 ומתגי המכפיל כדי לכוונן את הרווח עוד יותר.
  הערה: מומלץ להשתמש בסמני אירועים כדי לתעד מתי כוונן רווח החומרה כדי לסייע בפירוש נתוני צורת הגל.
4. כדי לכוונן את ההיסט, הפוך את מתג ההיסט של ערוץ 1 בתיבת הבקרה למצב שלילי, ולאחר מכן סובב את חוגת ההיסט של ערוץ 1 עד שהפסגות באותות המקדים והפוסטים יתרחשו באותו כיוון על מסך המחשב. אם חוגת ההיסט מסובבת רחוק מדי, האות הפוסט יתהפך שוב.
אם היתוש לא בודק תוך 10 דקות (או נקודת זמן מוגדרת אחרת), כבה את הראש amp. אם היתוש נמצא באמצע הבדיקה בסימן הזמן, אפשר לו לסיים את הבדיקה לפני כיבוי הראש amp. בקש מהמארח להסיר בזהירות את ידו, ולאחר מכן הסר את היתוש עם בדל החרקים המצורף. החלף את היתוש בקופסת האחסון.
עצור/סגור את ההקלטה באמצעות תוכנת ניהול החומרה. המשך עם EPG על היתוש הבא (שלב 4.2).
הערה: זכור לשנות את שם הקובץ אחרי כל יתוש.
כבה את הראש amp ומקור החשמל בסוף ההפעלה וסגור את התוכנה.
עיין בהצהרת התחקיר של המשתתף או דומה עם המתנדב כמפורט ב-IRB המאושר.
יש להשליך יתושים בהתאם לדרישות הפרוטוקול. הסר את הניילון מגוש הקצף והשליך אותו כראוי.
לאחר השלמת כל איסוף הנתונים, סקור ומדוד את צורות הגל ונתח את הנתונים כפי שתואר קודם לכן²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁹^,³⁰. עיין במשאבים מקוונים³⁰ לקבלת הדרכות שלב אחר שלב לשימוש בתוכנת סקירת צורות הגל, יצירת דמויות המתארות את צורות הגל, מדידת צורות הגל, ייצוא הנתונים לניתוח, ביצוע הניתוח הסטטיסטי והסבר מפורט על משתני תגובה נפוצים לצורות גל.

figure-protocol-3
איור 3: דוגמאות להקלטות תת-אופטימליות עקב יציאה לשיא, שינויי הגבר בתיבת הבקרה, שינויי מתח לא ברורים מחיווט נחות, קיפול מיישר ורעש. צורות גל מיתושי Culex tarsalis הניזונים עד למילוי על ידי אדם, מעוותים על ידי (A) שיא החוצה (חץ אופקי כחול) ושינוי הרווח של תיבת הבקרה שלאחר מכן מ-100x ל-80x ל-40x ל-60x ל-40x ל-20x (חצים אנכיים כתומים), (B) שינויי מתח לא ברורים, ו-(C) קיפול מיישר באות שלאחר (שחור) בהשוואה לאות שלפני (אדום) (ראה צורת גל J, תקריב מוצג בפאנל C'), רעש קו (גל סינוס של 11 הרץ הנראה באות קדם-יישור (אדום) בלבד, תקריב מוצג בפאנל C'), שיא החוצה (חץ אופקי כחול), ושינוי הגבר תיבת בקרה מ-500x ל-200x (חץ אנכי כתום). שמות צורות גל מוצגים לאורך החלק העליון של כל לוח. החצים הסגולים בפינה הימנית התחתונה של פאנל C מציינים מתי מגבר הראש כבה לאחר השלמת הגשושית ומספקים דוגמה נוספת לקיפול מיישר. קווים אופקיים אדומים הקשורים לאות התיקון המקדים בלוח C מציינים מתי נעשה שימוש בסמני אירועים לרישום הערות עם חותמת זמן. רמות Ri, אותות מיושמים, סולמות זמן ורווחי תוכנה הם (A) 10⁷ Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x; (B) 10⁷ Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x; ו-(ג) 10⁷ Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0.2 s/div, 8x. קיצורים: AC = זרם חילופין, DC = זרם ישר, Ri = התנגדות כניסה, mV = מילי-וולט, Ω = אוהם, s/div = שניות לכל חלוקה. נתון זה הוכן עם נתונים מ-Cooper et al.²⁷. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AC-DC EPG הקלטות של יתושי Cx. tarsalis הניזונים מידיים אנושיות (איור 4) יצרו צורות גל ניתנות לפירוש המתאימות לניתוח ופרסום²⁷. צורות גל הניתנות לפירוש הכילו דפוסים חוזרים מובחנים וניתנים להבחנה שניתן לסווג למשפחות צורות גל (טבלה 1 ו-<מחלקה חזקה="xfig">איור 4), סוגים ותת-סוגים כאשר הדחיסה (המוגדרת בטבלה 2) ורווח התוכנה הותאמו בתוכנת סקירת צורות גל²⁷^,³¹. כל משפחות צורות הגל (J, K, L, M, N) והסוגים (L1, L2, M1, M2) שתוארו בעבר ב-Ae. aegypti הניזון מידיים אנושיות²⁶ זוהו בצורות הגל שנוצרו על ידי Cx. tarsalis הניזון מידיים אנושיות, ואימות תקפות השיטות המתוארות כאן. בנוסף, זוהו שלושה סוגי צורות גל חדשים (M3, N1, N2) ותת-סוגים רבים של L1, L2, M1 ו-M2²⁷. בנוסף, ירידת המתח חזרה לקו הבסיס כאשר חלקי הפה נמשכים מהמארח נקראה משפחת צורות הגל W²⁷.

שינוי שיטתי של הגדרות המכשיר (סוג זרם ורמות Ri) תוך ביצוע הנהלים המתוארים כאן אפשרו לקבוע את ההגדרות האופטימליות לרישום Cx. tarsalis הניזון מידיים אנושיות, המקורות החשמליים של כל צורת גל, משך הזמן הממוצע בשניות של בדיקות שלמות ולא שלמות לכל יתוש, ולהשוואה סטטיסטית של משך צורת הגל בשניות לכל חרק (WDI), מספר אירועי צורת הגל לכל חרק (NWEI), ומשך צורת הגל בשניות לכל אירוע לכל חרק (WDEI) על פני ההגדרות²⁷. יתושים נקטעו גם במהלך צורות גל שונות ונותחו כדי לקבוע איזו צורת גל הייתה בקורלציה עם בליעת דם²⁷. מחקר דומה בוצע עבור Ae. aegypti באמצעות מתודולוגיה דומה²⁶.

בשל האופי הרגיש והמורכב של EPG, לא כל ההקלטות היו בתוליות כמו אלה שהוצגו באיור 4. שיא (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3A,C), שינויי רווח חומרה (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3A,C), עבודות חיווט נחותות (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3B), קיפול מיישר בצורת גל J (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3C,C'), ורעש חשמלי (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3C,C') מדי פעם עיוותו והסתירו את צורות הגל, מה שהפך אותן לבלתי מתאימות לשימוש בנתוני איכות פרסום והקשה על ניקוד וניתוח. לפיכך, מומלץ מאמץ קדמי כדי לשכלל את כישורי החיווט, לייעל את הגדרות הרווח והמתח, להתאים את ההיסט ולשלוט ברעש חשמלי. באופן מעניין, קיפול מיישר נצפה רק במשפחת צורות הגל J עבור Cx. tarsalis (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3C,C') ולא חזר על עצמו לאחר שההיסט הותאם בתחילה, אפילו כאשר נעשה שימוש במינים אחרים של יתושים (Ae. aegypti ו-Culex quinquefasciatus) (נתונים לא מוצגים). בנוסף, פתרון בעיות גילה כי הרעש החשמלי הבלתי מבוקר המוצג ב<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3 (לוחות C ו-C') נבע מכלוב פאראדיי פגום. ההקלטות שנעשו בכלוב פאראדיי הפגום עדיין היו שמישות, אך בעיות רעש נפתרו כאשר נבנה כלוב פאראדיי משופר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1B).

גם כאשר ננקטו כל אמצעי הזהירות והאופטימיזציות הקדמיות, שינויים קלים באיכות חיבור האלקטרודה ליתוש וגורמים לא ידועים אחרים שעיוותו את האות ושינו את יחס האות לרעש מעת לעת גרמו לכך שהיה צורך להתאים את רווח החומרה באמצע ההקלטה כדי להבטיח שהאות נמצא בטווח הנראה והרזולוציה של הפסגות בכל צורת גל מספיקה לזיהוי ואפיון צורות גל. לרוע המזל, התאמת רווח החומרה באמצע ההקלטה עלולה לגרום לשינויי מתח פתאומיים (איור 3A, C), מה שהופך את צורות הגל לבלתי מתאימות לפרסום אך עדיין שמישות (כולן או חלקן) למדידה וניתוח.

figure-results-1
איור 4: צורות גל מייצגות מגשושית טרסליס של Culex על יד אנושית שהוקלטו עם Ri של 10⁷ Ω תוך שימוש באות מופעל של 250 mV AC. שמות צורות גל ברמת המשפחה (NP, J, K, L, M, W) מוצגים לאורך החלק העליון של כל לוח. החלוניות התחתונות מציגות הגדלות של אזורים נבחרים בחלונית A. לוחות שהוכנסו מציגים הגדלות של אזורים שצוינו. סולמות הזמן ורווחי התוכנה הם (A) 7.0 s/div, פי 16; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 שניות/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 שניות/div, פי 32; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x. קיצורים: AC = זרם חילופין, Ri = התנגדות כניסה, mV = מילי-וולט, Ω = אוהם, s/div = שניות לכל חלוקה. נתון זה הוכן עם נתונים מ-Cooper et al.²⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת שימוש ב-AC-DC EPG, זה קריטי לקבל הבנה בסיסית של פעולת חומרה ותוכנה³⁰ ולעקוב בקפידה אחר הפרוטוקולים המתוארים כאן כדי למנוע נזק לציוד. בעיקר, הימנע מלגעת במגבר הראש כאשר הוא מופעל אלא אם כן הוא מקורקע על כלוב פאראדיי. מומלץ להקליט כמה שיותר אחורה בכלוב פאראדיי³⁰. אין צורך לסגור את דלתות הכלוב כדי לקבל צורות גל הניתנות לפירוש אלא אם כן הקלטה בסביבה עם רעש חשמלי סביבתי מוגזם. שום דבר ממונע לא יכול להיות בכלוב פאראדיי. חשוב לציין כי כלוב פאראדיי עצמו חייב להיות מוארק חשמלית אך ורק דרך מגבר הראש כדי שיפעל כראוי. זה מושג על ידי חיבור מגבר הראש למעמד מעבדה ממתכת כאשר הצבע משייף מרגל אחת של המעמד כדי לאפשר נתיב מוליך לחשמל שנלכד על ידי כלוב פאראדיי לזרום למעמד המעבדה, לתוך מעטפת המתכת של מגבר הראש, במורד הכבל לתיבת הבקרה, דרך אספקת החשמל לשקע קיר מוארק כהלכה, ולתוך האדמה דרך קרקע הבניין³⁰. ניתן להשתמש במולטימטר כדי לבדוק את איכות החיבור בין הרכיבים בתוך הכלוב על ידי מדידת ההתנגדות (שהיא היפוך המוליכות) בין נקודות שונות. ניתן גם למקם רדיו AM אלחוטי בתוך כלוב פאראדיי כדי לוודא שהצליל מופחת משמעותית (או באופן אידיאלי) כאשר הדלתות סגורות, מה שמאשר שכלוב פאראדיי לוכד כראוי אותות חשמליים הנישאים באוויר (E. Backus per Comm.).

הכנה נכונה וסטנדרטית של דבק הכסף והצמדת אלקטרודות ההקלטה לחרקים הם קריטיים להשגת הקלטות שמישות. ציפורן חרקים היא מבודדת ופועלת כקבל אם דבק הכסף אינו חודר כראוי לנקבוביות הקוטיקולה כדי ליצור נתיב לחשמל לעבור מתוך החרק לחוט הזהב על פני השטח של הפרונוטום³⁰. הכן את דבק הכסף במקביל לפני כל מפגש EPG, עבד עם דבק כסף טרי מהצינור והחלף אותו בדבק כסף מערבולת נמרצת לעתים קרובות במהלך הליך החיווט. ודא שלולאת הזהב ממוקמת כנגד בית החזה כך שהלולאה כולה תהיה במגע עם הקוטיקולה ולא מוטה לצד אחד או מופרדת על ידי שכבה עבה של דבק כסף וקשקשים כדי לסייע ביצירת חיבור חשמלי חזק וכן למנוע ניתוק ובריחה של היתוש מהחוט.

יש לייעל את הפרוטוקולים המתוארים כאן כאשר עובדים עם מיני יתושים שונים. יש לקבוע בניסוי את הגדרות ה-EPG האופטימליות (רמת Ri, כרךtagה, סוג זרם ורווח חומרה) להקלטה על פרוקי רגליים נתון^12,30. עם זאת, לאחר התאמת הקיזוז, לא יהיה צורך להתאים אותו מחדש בעבודה עם יתושים דומים. נקבעו הגדרות אופטימליות עבור AC-DC EPG עם Ae. aegypti²⁶ ו-Cx. tarsalis²⁷. ספריות צורות גל (המוגדרות בטבלה 2) עבור מינים נוספים יקלו על אימוץ EPG עבור יתושים. כמו כן, יש צורך לייעל את ההרדמה עבור היתוש המעניין, שכן התנהגות הזנת הדם יכולה להיות מושפעת באופן דיפרנציאלי על סמך מיני היתושים ובחירת ההרדמה. לדוגמה, Cx. tarsalis דורש תקופת החלמה של 4 שעות לאחר 15 דקות של הרדמה עם CO₂, בעוד שעבור Ae. aegypti, תקופת החלמה של 15 דקות מספיקה לאחר תקופת הרדמה של 15 דקות עם קרח. עם זאת, קשה להפיל את Culex tarsalis בחשיפה לקור, ולכן נעשה שימוש בעיקר ב-CO₂ למרות תקופת ההחלמה הארוכה.

בעוד שצג AC-DC EPG פשוט לשימוש לאחר סקירת משאבים מקוונים^30,31 או הדרכה עם משתמש מנוסה, נדרש פתרון בעיות מסוים. בתחילה, בהקלטות ה-EPG של המחבר של בדיקות יתושים היה גל סימן בלתי צפוי של 11 הרץ באות המקדים שלא נצפה או דווח על ידי Wayadande ועמיתיו²⁶. התייעצות עם E. Backus הצביעה על כך שכלוב פאראדיי היה ככל הנראה הבעיה בגלל לולאות קרקע מפריעות. כלוב פאראדיי חדש הבנוי ממסך נחושת מוליך מאוד המחובר למסגרת אלומיניום המוברגת ללוחית רצפה גדולה מאלומיניום הנתמכת על ידי רגלי גומי כדי לבודד אותה מהטבלה למטה (איור 1B), פתר את אות הרעש של 11 הרץ (איור 3C, C'). בנוסף, מדי פעם, כאשר ספק הכוח של EPG הופעל לראשונה, האותות לפני ואחרי התיקון היו מופיעים כקווים עבים ומטושטשים במקום קווים ישרים, חלקים ודקים. זה תוקן בדרך כלל על ידי כיבוי המכשיר ובדיקת כל חיבורי הכבל. אם זה נכשל, ניתוק המכשיר למשך 1-3 דקות בדרך כלל עזר. לעתים רחוקות מאוד, האותות לפני ואחרי הופכים עבים ומטושטשים במהלך הפעולה, דבר שטופל על ידי כיבוי המכשיר וחיבורו לשקע אחר או שימוש בווסת מתח ומזגן חשמל כדי לחבר את ה-EPG לפני חיבורו לקיר. באופן אידיאלי, קו ייעודי לצג ה-EPG יבטל רעשי קו הנובעים ממקררים וציוד אחר המחובר לאותו מעגל חשמלי כמו ה-EPG³⁰.

נכון לעכשיו, ישנן שתי מגבלות עיקריות לשימוש ב-EPG לחקר יתושים. ראשית, מעט מחקרי מתאם בוצעו כדי לאמת אילו התנהגויות בדיקה תואמות לצורות הגל. בעוד שישנן השערות חזקות לגבי מה שקורה במהלך כל משפחת צורות גל (טבלה 1) וחלק מסוגי צורות הגל (M1 ו-M2), מעט מההשערות הללו אושרו בניסוי, פרט לכך שבליעת דם נמצאת בקורלציה עם משפחת צורות הגל M^26,27. והכי חשוב, יש לזהות צורות גל המתאימות לאירועי רוק מכיוון שפתוגנים רבים מועברים ברוק. מתאם של צורות גל EPG עם פעילויות ביולוגיות ביתושים יידרש כדי לפרש באופן משמעותי הבדלים משמעותיים במשך צורת הגל ובספירה בין קבוצות הטיפול. שנית, שיעורי הבדיקה והבליעה במהלך EPG יכולים להיות נמוכים בהרבה מהצפוי²⁷. קשירת יתושים בנפרד לחוטים קצרים והנחתם ישירות על הפונדקאי יכולה למנוע התנהגויות חיפוש פונדקאי והזנה חברתית למרחקים ארוכים, שעלולות להשפיע על התנהגויות גישוש ובליעה. חרקים מחווטים כהלכה יכולים ללכת ולעוף כרגיל. ובכל זאת, יתושים לעתים קרובות מושכים בחוטים ולפעמים מסתבכים או מחזיקים את עצמם בזוויות לא טבעיות, מה שמצביע על כך שהחוטים משפיעים על התנהגותם במידה מסוימת. המחברים בדקו אסטרטגיות רבות להגברת שיעורי הבדיקה במהלך EPG, וצום היתושים במהלך הלילה, שימוש באנשים מבוגרים, חשיפתם לנשימה אנושית מיד לפני הנחתם על היד, ומריחת רוק אנושי על היד היו היעילים ביותר, כמו גם שימוש במארחים שביצעו כל הזמן התאמות בקנה מידה עדין למיקום היד שלהם כדי להבטיח שהיתוש נמצא במיקום האידיאלי לחקור²⁷.

למרות מגבלות אלו, ל-AC-DC EPG יתרונות רבים על פני גישות אחרות לחקר התנהגויות גישוש ובליעה. מערכות כמו BiteOScope¹¹, flyPAD¹⁵ ופלטפורמת ביו-חומרים אוטומטית¹⁴ שתוכננו לכמת התנהגויות בדיקה ובליעה והפרשות רוק במהלך הזנת דם משתמשות במצעים מלאכותיים שקופים ודיאטות נוזליות שחסרות מערכות רקמת מארח רגילות ורמזים מארחים. בעוד שפלטפורמות סינתטיות אלה שימושיות למטרות ניסוי רבות, יתרון ברור של AC-DC EPG הוא היכולת לחקור התנהגויות פרוקי רגליים אלה ומשתנים מעניינים בתוך מערכות מארחות טבעיות. יתר על כן, יכולת ההסתגלות המוגדרת על ידי המשתמש של מערכת AC-DC EPG מציעה יתרון נוסף על פני מכשירי EPG אחרים^22,33 והתקני ניטור אלקטרוניים דמויי EPG^16,21, שאין להם רמות Ri מתכווננות, סוגי זרם ורמות מתח הדרושות כדי להשיג צורות גל עם כמות המידע המקסימלית ולמזער השפעות שליליות על מגוון רחב של המארחים ופרוקי הרגליים²²^,²³. טכניקות אלקטרומיוגרפיה (EMG) משמשות גם לחקר הזנת דם. עם זאת, המעגל החשמלי כולל בדרך כלל רק את פרוקי הרגליים ורק פוטנציאל השריר הקרוב ביותר לאלקטרודה המקליט נרשמים, כך שצורות הגל אינן מספקות מידע על פעילויות מפורטות המתרחשות בממשק המארח-חרק כמו קרעים בתאים, מיקומים ופעילויות סטילט ופוטנציאל זרימה דרך חלקי הפה^28,34. ניתן להשתמש בטכניקות מיקרוסקופיה תוך-חיוניות כדי לדמיין תנועות ופעילויות מפורטות של חלקי הפה ברקמות מארח חיות ישירות, אך טכניקות אלה כוללות הליכים פולשניים במודלים של בעלי חיים^{חיים 9}. רק צג ה-AC-DC EPG יכול לספק מידע מפורט ביותר בזמן אמת על התנהגויות בדיקה, בליעה והפרשת רוק המתרחשות ברקמות מארח אטומות חיות ללא צורך בפרוצדורות פולשניות וניתן להתאמה לשימוש במגוון רחב של פרוקי רגליים^10,12.

זהו ההליך המפורט הראשון שלב אחר שלב לחיווט יתושים, בניית שואב חרקים וביצוע EPG על מארחים אנושיים. פרוטוקולים אלה צפויים להקל על אימוץ AC-DC EPG על יתושים הניזונים ממארחים אנושיים. דוגמאות למאמצי מחקר עתידיים המשתמשים ב-AC-DC EPG עשויות לכלול מחקרים על מנגנונים בסיסיים של הזנת דם ונזק לרקמת המארח¹⁰, כולל זיהוי רצפים סטריאוטיפיים של התנהגויות בדיקה לפני בליעת דם, חקירת זרימת הדם דרך חלקי הפה, והשוואה של פלסטיות האכלה בתוך ובין מיני פרוקי רגליים/שלבי התפתחות²⁶. ניתן להשתמש ב-EPG גם כדי לכמת את ההשפעות של קוטלי חרקים, נוגדי הזנה ודוחים¹². הנהלים המוצגים כאן לשימוש ב-AC-DC EPG לחקר יתושים על ידי אדם יאיצו את המחקרים הללו ויאפשרו תובנות חדשות לגבי הביולוגיה של הזנת דם יתושים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה נועד אך ורק למטרת מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקאי. המסקנות בדוח זה הן של המחברים ואינן מייצגות בהכרח את עמדות ה-USDA.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לפרופ' אסטרי וואיאדנדה מאוניברסיטת אוקלהומה סטייט על חלוץ הליך החיווט ליתושים, ולד"ר איליין באקוס מ-USDA-ARS בפרלייה, קליפורניה, ולמר אנדרו דואל מ-EPG Technologies Inc. בגיינסוויל, פלורידה, על הסיוע בפתרון בעיות בציוד ה-EPG. אנו מודים גם לד"ר דסטין סוונסון ולמר וויליאם יארנל מ-USDA-ARS Insectary במנהטן, קנזס, על אספקת יתושים, ולגברת מרים רוהינדה מאוניברסיטת קנזס סטייט במנהטן, קנזס על עזרתה בצילום הסרטונים הפרוצדורליים. עבודה זו התאפשרה הודות לגישה לליבת האנטומולוגיה המולקולרית המשולבת (IEMC) באוניברסיטת קנזס סטייט. מחקר זה נתמך על ידי הסכם פיתוח כוח העבודה למחקר, חינוך וכלכלה של משרד החקלאות האמריקאי (#58-3022-0-002) ופרויקט האץ' הרב-מדינתי (NE1943). כתב יד זה הוא תרומה מס' 24-194-J מתחנת הניסויים החקלאיים של קנזס, אוניברסיטת קנזס סטייט, מנהטן, קנזס, ארה"ב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Instrumentation
AC-DC 4-channel electropenetrograph	EPG Technologies, Inc.		עבור EPG, כולל את ספק הכוח, תיבת הבקרה, תיבת ממשק המתגים, ארבעה ראשי tagamplifiers, ארבעה בדיקות מתח מצע וכבלים נלווים
כריות אוויר	Amazon.com		למארח האנושי להניח את ידו/זרועו במהלך חומרת רכישת נתונים EPG
DI-710 (לוח AD)	DATAQ Instruments Inc.		לדיגיטציה של אותות ה-EPG האנלוגיים כך שניתן יהיה להמחיש אותם במחשב
מנורת מגדלת לד הניתנת לעמעום, זכוכית מגדלת גדולה 5X ללא ידיים עם אור ומעמד לקריאת תחביבים מלאכת יד תפירה	Amazon.com		לתצפית התנהגותית במהלך EPG; השתמש רק במנותק מהחשמל במהלך EPG או רעש עלול לגרום
למיקרוסקופ דיגיטלי Dino-Lite Edge (הגדלה פי 250)	Dino-Lite	AF4915ZT	לתצפית התנהגותית במהלך EPG
Dino-Lite Flex-arm Desktop	Stand Dino-Lite	MS22B	לאחיזה ומניפולציה של המצלמה
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod Set	Fisher Scientific	S41740	להחזקת מגבר הבמה הראשי והארקת כלוב פאראדיי (חייב להיות עשוי מתכת)
סדנה מקוונת EPG	UF IFAS Extension	https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022	AKA, "משאבים מקוונים" ללימוד EPG (הגדרת מכשירים, איסוף וניתוח נתונים, בניית פאראדיי, הכנת דבק כסף, בניית בדל חרקים וכו')
Furman P-1800 AR ווסת כוח/מרכך כוח	Amazon.com		להפחתת רעשי הקו
עטיפת ריפוד בועות קטנה	Amazon.com		לשימוש כמחסום בין המארח לכלוב פאראדיי
Troemner Talboys Labjaws מחזיק מהדק רגיל	פישר סיינטיפיק	02-217-121	להחזקת מגבר הבמה הראשי והארקת כלוב פאראדיי (חייב להיות עשוי מתכת ולא מצופה בפלסטיק)
מחשב Windows	Best Buy		עבור EPG וניתוח סטטיסטי
Software
Backus 2.0 ניתוח נתונים תוכנית SAS	הרחבת UF IFAS	https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	לניתוח סטטיסטי של נתוני צורות גל
Ebert 1.0 מניפולטור קבצים ובודק שגיאות תוכניות SAS	הרחבת UF IFAS	https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	להכנת קבצים לניתוח סטטיסטי של נתוני צורות גל
SAS גרסה 9.4	SAS Institute, Inc.		לניתוח סטטיסטי של נתוני צורות גל
WinDaq Lite	DATAQ אינסטרומנטס בע"מ		להקלטה וסקירה של נתוני EPG. כולל את תוכנת WinDaq Hardware Manager (AKA, "תוכנת ניהול חומרה") ואת תוכנת WinDaq Waveform Browser (AKA, "תוכנה לסקירת צורות גל"). לשימוש במחשבי Windows בלבד.
Faraday Cage
מסך אלומיניום	הום דיפו	MSCF5167	עבור קירות גיליון האלומיניום של כלוב פאראדיי
, 0.125 (1/8) 3003-H14	מחסן מתכות	S318	עובי לבסיס כלוב פאראדיי
פלטות פינתיות, 1 אינץ'	הום דיפו	339547	עבור קירות כלוב פאראדיי
ברגי מכונת פיליפס עם ראש שטוח, #6-32 x 1 אינץ'	הום דיפו		459999 לבניית כלוב פאראדיי
מכונות כביסה שטוחות, #6	638977 הום דיפו		לבניית כלובי פאראדיי
מולטימטר דיגיטלי Fluke 15B+, ליישומים חשמליים, מודד מדידות מתח וזרם AC/DC עד 1000V ו-10A, יחד עם יכולות התנגדות, המשכיות, דיודה וקיבול	Amazon.com		לבדיקת כלוב
פאראדיירדיו נייד AM FM, רדיו טרנזיסטור גודס עם רמקול חזק, שקע אוזניות, רדיו המופעל על ידי סוללה 2AA לקליטה לטווח ארוך, רדיו כיס לשימוש פנימי, חיצוני וחירום	Amazon.com		הטהור של Faraday Cage
, רשת 16 x 16 בקוטר חוט 0.11, 36 אינץ' x 12'Metro	Screenworks		עבור קירות כלוב פאראדיי
ברגי מכונה משולבת ראש עגול, #6-32 x 3/4 אינץ'	הום דיפו	528466	לבניית כלוב פאראדיי
נייר חול, 1/2 אינץ' על 1 אינץ', 150 Grit	Home Depot	19036-20-CC	להסרת הצבע מתחתית מעמד המעבדה
פינות מסגרת מסך, 5/16 אינץ'	WCORN516	הום דיפו	עבור קירות כלוב פאראדיי
ספליין מסך, 0.14 אינץ'	הום דיפו	3034719	עבור קירות כלוב פאראדיי
<חזק>בדל חרקים
Brass Escutcheon Pins	הום דיפו	801294	לבניית בדלי-חרקים
חוטי נחושת,	Amazon.com		לבניית בדלי-חרקים
שפעת מסיסה במים של האריס	הום דיפו	355398	לסיוע בהלחמה בציפוי חוט בדל החרקים ויצירת חיבור חזק
צבת אף מחט	הום דיפו		לכיפוף חוט בעת בניית בדלי חרקים
ערכת Pro 900-015 עזרה לידיים עזר הלחמה	Amazon.com		להחזקת סיכות אסכוך במהלך הלחמה
הלחמה (עם ליבת רוזין)	הום דיפו	296497	לבניית בדלי-חרקים
כלי חשפנית חותך תיל	הום דיפו		להפשטה וחיתוך חוטי נחושת בעת בניית בדלי חרקים
YIHUA 928D-III ברזל הלחמה, הספק גבוה 110W, תצוגה דיגיטלית מלאה ברזל הלחמה	Amazon.com		לבניית בדלי חרקים; מגיע עם מעמד, ספוג וצמר פלדה לניקוי
<חזק>שואב חרקים
Accuris ASPIRE מעבדה שואב	מכשירי Accuris	V0020	להפעלת יניקה על שואב החרקים; כולל את בקר הוואקום הידני, מתאם הנירוסטה בעל הקצה העדין (40 מ"מ), ומתאם קצה הפיפטה
Chemglass Life Sciences Pasteur פיפטות,	NC0230004	פישר סיינטיפיק	לשימוש כשואב חרקים בעת חיווט יתושים
סרט חשמלי מסחרי ויניל חשמלי קלטת חשמל	הום דיפו		לחיבור פיפטת פסטר שהשתנתה לקו הוואקום
בד שירות כילה נגד יתושים, 10 x 10 ס"מ	מרובע Joann Fabrics	16651622	למניעת שאיבת יתושים לתוך משאבת הוואקום
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16	Fisher Scientific	50-206-8914	למעבר מהיר וקל בין פיפטות פסטר שונות ששונו
Thermo Scientific Nalgene HDPE ניתוקים מהירים (3/8 עד 7/16 אינץ'. תעודת זהות)	פישר סיינטיפיק	15-315B	למעבר מהיר וקל בין פיפטות פסטר שונות ששונו
Silver Glue
Elmer's דבק לבן רב תכליתי	Amazon.com		להכנת דבק כסף
פתית כסף 99.9% טהור, 4-8 ומיקרו; m	ThermoFisher	786.09	להכנת דבק כסף
פתית כסף 99.95% טהור, 8-10 ומיקרו; m	Inframat Advanced Materials	47MR-12F	להכנת דבק כסף
הרדמת חרקים
CO₂ ערכת בועות, 1000 מ"ל, #9 פקק גומי	FlyStuff	59-181	למניעת ייבוש חרקים בזמן השימוש במשטח הזבובים
Flypad מסגרת, גודל סטנדרטי	FlyStuff	59-118	למניעת נפילת יתושים ממשטח הזבובים
מברשת Flystation	FlyStuff	59-205	להפחתת חשמל סטטי בעת עבודה על משטח זבוב
Flystuff Flypad גודל סטנדרטי	FlyStuff	59-114	AKA "כרית הרדמה" להרדמת יתושים
משפך (קוטר 4 אינץ')Amazon.com			לגז כוסות יתושים לפני העברתו לכרית הזבובים
זכוכית פלקסי או מכסה פלסטיק שטוח (חתוך לגודל)	הום דיפו	MC-27	לכיסוי כרית הזבובים אם היתושים מתחילים להתעורר
כיבוי צינור צינורות פלסטיק מהדקים במיקום יחיד ופתוח מתכוונן (מגוון 1/8 אינץ' עד 1/2 אינץ')	Amazon.com		להפניית גז בין משטח הזבוב למשפך
חד שלבי וסת CO₂	FlyStuff	59-142	לוויסות זרימת הגז מה-CO₂tank
" T” מתאים לצינורות זיהוי 1/8 אינץ'	FlyStuff	59-123	לחיבור משטח הזבוב והמשפך למיכל CO₂
צינורות, שקוף	FlyStuff	59-124C	לחיבור המשפך ומשטח הזבוב לווסת על מיכל ה-CO₂ tank
חיווט חרקים
שחור, (65 ליברות, 176 גרם/מ²) 8.5 אינץ' x 11 אינץ'	Michael's Stores Inc.	327826	כדי להקל על הדמיית חוט זהב
נייר בנייה שחור מרובע 3.5 אינץ' x 4.0 אינץ'	סיכות	956221	כדי להקל על הדמיית חוטי
זהב כדורי כותנה	Amazon.com		לצום יתושים
קצף מלאכה #12 בלוק (3.1 ס"מ x 17.2 ס"מ x 30.2 ס"מ)	ג'ואן בד וחנות יצירה	1941079	להחזקת יתושים חוטיים
סרט סטייה מתקן,	Amazon.com		לאחסון חוטי זהב
מלקחיים אנטומולוגיה במשקל נוצה	Fisher Scientific	S72110	למניפולציה של חרקים
מלקחיים עדינים (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)	Fine Science Tools	91150-20	להכנת לולאת זהב בעת חיווט יתושים
מברשת צבע עדינה	Amazon.com		למניפולציה של יתושים במהלך חיווט ו- EPG; חייב להיות בעל ידית פלסטיק או עץ אם משתמשים בו עבור EPG
צנרת העברה סטנדרטית עם קצה עדין, צרה, 5.8 מ"ל	תומאס סיינטיפיק	7761D21	להכנת דבק כסף
חוט זהב, 99.99% טהור, עובי 0.025 מ"מ	Goodfellow	AU005121	לחיווט יתושים
סיכות Minutien, קצה 0.2 מ"מ, 1 ס"מ	Fisher Scientific	NC9681411	למריחת דבק על היתושים
כוסות נייר		נייר קשיח	לצום יתושים
סגן סיכה	פישר סיינטיפיק	50-996-811	להחזקת סיכת הזבובים במהלך חיווט חרקים
קופסת אחסון מפלסטיק עם מכסה (7 אינץ' x 9 אינץ' x 14 אינץ')	Amazon.com		להובלת יתושים קוויים
זכוכית פלקסי או מכסה פלסטיק שטוח (חתוך לגודל)	הום דיפו	MC-27	לכיסוי כרית הזבובים אם היתושים מתחילים להתעורר
מלקחיים לסגירה עצמית	פישר סיינטיפיק	08-906	להחזקה ומניפולציה של חוטי זהב
גז דחוס
CO_{2 גז}	Matheson Gas		להרדמת יתושים עם משטח זבוב
*פריטי מעבדה נפוצים*
שקיות חיטוי חד פעמיות Biohazard, 8 1/2 אינץ' x 11 אינץ'	פישר סיינטיפיק	03-410-591	לסילוק יתושים הניזונים מדם
מבער בונסן או לפיד פרופאן	Amazon.com		לשינוי פיפטות פסטר
סרט מעבדה צבעוני	דייגר מספק	EF9763R	לתיוג, הכנת דבק כסף ומלקחיים מיסוך
קצות פיפטות חד פעמיות, 1000 ומיקרו; ל	פישר סיינטיפיק		לציון מים בעת הכנת דבק כסף
מיקרוסקופ דיסקציה	Leica Microsystems		לחיווט יתושים
בדיקת דיסקציה	NC9109673	מדעי פישר לערבוב ומריחת דבק כסף
בקבוק Erlenmeyer, 1000 מ"ל	פישר סיינטיפיק		למניעת ייבוש חרקים בזמן השימוש
באתנול Flypad, 70%	פישר סיינטיפיק	04-355-122	לשיקום יתושים שנמלטו
צלחות פטרי מזכוכית	פישר סיינטיפיק	08-747B	להרדמת יתושים עם כפפות קרח
	פישר סיינטיפיק		להגנה אישית
Kimwipes KimTech Science מותג מגבים עדינים למשימות	פישר סיינטיפיק	06-666	לריסוק יתושים
מעילי מעבדה	פישר סיינטיפיק		להגנה אישית
בקבוקי ספריי LiBa, בקבוקי ריסוס ריקים למילוי חוזר (אלכוהול בטוח)Amazon.com			לשחזור יתושים שנמלטו
מוט ערבוב מגנטי, באורך 2 ס"מ	פישר סיינטיפיק		לערבוב דבק כסף
פיפטה מכנית חד-ערוצית, 1000 ומיקרו; ל	פישר סיינטיפיק	13-690-032	להצעת מחיר מים בעת הכנת צינורות
מיקרוצנטריפוגה דבק כסף, 1.5 מ"ל	פישר סיינטיפיק	780420	לאחסון דבק כסף
Parafilm M	פישר סיינטיפיק	50-998-944	לאיטום צינורות דבק
כסף ניילון נצמד	Amazon.com		לכיסוי בלוק הקצף
פיירקס 20 מ"ל	פישר סיינטיפיק	07-250-051	לערבוב דבק כסף
חצי מיקרו איזון	פישר סיינטיפיק	10-919-370	לשקילת דבק ופתית כסף
עט שארפי, Amazon.com			לתיוג
סכין גילוח חד קצה	מיקרוסקופיה אלקטרונית	71980	לניקוי דודי חרקים
פיפטות העברה חד פעמיות סטנדרטיות	פישר מדעי	133-711-7 מ"ל	להעברת דבק כסף לצינור אחסון
צלחת מוקפץ	פישר סיינטיפיק		לערבוב דבק כסף
טיימר/שעון עצר	פישר סיינטיפיק		לתזמון כמה זמן המארח נחשף לכל חרק
Ultrapure (18 MΩ) מים	פישר סיינטיפיק		להכנת דבק כסף
מספריים שימושיים	פישר סיינטיפיק	08-945	לחיתוך חוטי זהב
מערבל מערבולת	פישר סיינטיפיק		לערבוב דבק כסף
*מחקר אורגניזמים*
Culex tarsalis יתושים	USDA ARS Center for Grain and Animal Health Research במנהטן, KS		לשימוש כנבדקי מחקר

מסגרת לבדיקת מסך הנחושת 20 AWG באורך 5 3/4 אינץ' שקוף צינור . . עדין מדעי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים