מאמר שיטה

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

DOI:

10.3791/66881

⸱

24 ביולי 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שתרגום mRNA הוא תהליך מחולק מאוד בתוך תא, וכי תנועה תת-תאית ומיקום של mRNA ספציפי הם המפתח להבטחת ייצור חלבונים עם פונקציות ספציפיות לתחום בסביבה האידיאלית ובכמויות מתאימות. עם זאת, טכניקות לבידוד תת-תאי ואפיון הריבוזומים שמתרגמים את ה-mRNA הללו הוגבלו עד כה, כך שרבים עדיין לא ידועים לגבי האופן שבו הרכב המכונות התרגומיות תורם לוויסות תרגום mRNA מקומי.

כאן, אנו מדגימים את ALIBi (ביוטינילציה מוגברת למיקום מוגבל למיקום ספציפי ל-AviTag), שיטה המשלבת תיוג אפיטופים, ליגז ביוטין מפוצל שפותח לאחרונה ומופעל אופטוגנטית, וטיהור אפיניטיות, כדי לסמן ולבודד במהירות ובאופן מדויק ריבוזומים הממוקמים בכל תא תת-תאי. ראשית, עריכת CRISPR/Cas9 משמשת למיזוג פפטיד AviTag, אתר חיתוך פרוטאז של וירוס טבק (TEV), ותג אפיטופ FLAG לחלבון ריבוזומי. ליגז הביוטין המפוצל, המאוחד לדומיין המיועד לאברונים, מתבטא בקו תאים זה ואינו פעיל בריכוזי ביוטין רגילים. לאחר הפעלה באמצעות ביוטין משלים והארה באור כחול, הביוטינילטים של הליגז ריבוזומים מתויגים בסביבה הקרובה, מה שמאפשר טיהור אפיניטי של ריבוזומים ביוטיניליים וחלבונים ו-mRNA נלווים על חרוזים מצופים סטרפטווידין. שחרור שאינו דנטור באמצעות חיתוך פרוטאז ב-TEV מניב דגימות המתאימות לאפיון בהמשך של חלבוני ריבוזומים מרכזיים, חלבונים קשורים לריבוזום ו-mRNA קשורים לריבוזום באמצעות ריצוף RNA או פרוטאומיקת ספקטרומטריית מסה.

בפרוטוקול זה, אנו סוקרים את עקרונות העיצוב למיזוג AviTag לחלבון ריבוזומי ומיקוד באנזים ליגאז ביוטין מפוצל לאברון הרלוונטי. אנו מראים הפעלה של מערכת ALIBI, ניתוק תאים, טיהור זיקה והסרת דגימות. לבסוף, נדון בתוצאות טיפוסיות ובפתרון תקלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש צורך חשוב בכלים שיכולים לבודד דגימות ביולוגיות ממחלקות תת-תאיות ספציפיות כדי לחקור טוב יותר כיצד ארגון תת-תאי והתנועה משתלבים בתהליכים תאיים. תרגום mRNA הוא דוגמה מרכזית לתהליך כזה: עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהתרגום מחולק מאוד למחלקה, ובמיוחד, שרבים מה-mRNA ממוקמים באברונים שבהם החלבונים המקודדים שלהם ימצאו 1,2. עם זאת, פחות ידוע על המיקום התת-תאי של מכונות תרגום. ריבוזומים מתחילים את קיומם בגרעין ובגרעין, שם מתחילה הרכבה מחלבוני ריבוזום (RPs) ורנ"א ריבוזומליים (rRNAs). לאחר מכן הם מיוצאים לציטופלזמה לשלבים הסופיים של ההרכבה, ולאחר מכן הם מתחילים לתרגם mRNA 3,4. אתרי התרגום הקנוניים כוללים את הציטופלזמה והרשת האנדופלזמית; האחרון הוא המקום שבו חלבוני ממברנה אינטגרליים וחלבונים המיועדים לאברונים קשורים לממברנה או להפרשה חוץ-תאיתמסונתזים 5. אתרים שזוהו לאחרונה של תרגום מקומי כוללים את המיטוכונדריה, פרוקסיזום ותהליכים נוירונים 6,7,8,9,10,11,12. מעניין לציין שגם מתגלות ראיות לכך שתכונות מכניקת תרגום כגון חלבונים הקשורים לריבוזום, שינויים לאחר תרגום, שינויים ב-rRNA וסטוכיומטריה לא קנונית של חלבוני ליבה ריבוזומליים מעורבים במנגנוני ויסות השולטים בתרגום של mRNA ופרמטרים מסוימים כגון נאמנות תרגוםוקצב 13,14,15,16,17,18, 19, 20. לדוגמה, מאות חלבונים זוהו שמגיבים עם הריבוזום ויכולים להוביל להבדלים בהרכב הריבוזום התת-תאי13. עם זאת, טכניקות לבידוד אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות הוגבלו עד כה; לכן, עדיין לא ידוע הרבה לגבי האופן שבו הרכב מכונות תרגום תורמות לווסת תרגום mRNA מקומי. הופעת שיטות גמישות לבידוד אוכלוסיות ריבוזומי תת-תאיות, במיוחד אלו התואמות למערכות מודל יונקים, תאפשר חקירת תכונות מכונות התרגום הללו ברמה התת-תאית.

השיטות המוקדמות ביותר לבידוד שברים תת-תאיים המכילים ריבוזומים התבססו על עקרונות של פירוק רציף וצנטריפוגציה21,22. בדרך כלל, שיטות אלו מוגבלות לאברונים מסוימים ולעיתים דורשות זמני עיבוד ארוכים. שיטה עדכנית יותר מבוססת על ליגז ביוטין BirA, אשר מבצע ביוטינילציה ספציפית למצע פפטידי AviTag 10,23,24. ה-BirA יכול להיות ממוקם גנטית לאברון המעניין בתאים שבהם ריבוזומים סומנו ב-AviTag. עם זאת, מאחר ש-BirA פעיל בריכוזים פיזיולוגיים של ביוטין, יש צורך לגדל תאים בתנאי דלדול ביוטין כדי להימנע מביוטינילציה מרכיבה ולא ספציפית של ריבוזומים נושאי AviTag10,24. דבר זה מגביל את השימוש ב-BirA בסוגי תאים הרגישים לדלדול ביוטין25. לבסוף, פותחו שיטות ביוטינילציה פרומיסקואיות המשתמשות באנזימים מהונדסים כגון BioID, TurboID, ו-APEX 26,27,28. בעת ההשראה, אנזימים אלו מייצרים ביתווך ביוטין תגובתי שמתאים באופן קוולנטי כל שיירת ליזין ברדיוס של האנזים. שיטות ביוטינילציה פרומיסקואיות שימושיות מאוד למיפוי פרוטאומים תת-תאיים, אך פחות אינפורמטיביות להבחנה בין חלבונים בסביבה כללית של ריבוזומים מקומיים לעומת חלבונים הקרובים אליהם.

כאן, אנו מדגימה את השיטה שפיתחנו לאחרונה לתיוג ובידוד אוכלוסיות ריבוזומים תת-תאיים, הנקראת AviTag-specific Location-Limited Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi). שיטה זו מנצלת פיצול מהונדס של BirA המאוחד למתגי מגנט אופטוגנטיים משופרים (eMag) (איור 1A) שמתרוצצים תחת הארה באור כחול29; ותג פפטיד המורכב מאפיטופ FLAG, אתר חיתוך פרוטאז של וירוס טבק (TEV), ו-AviTag (FTA) המאוחד לחלבון ריבוזום Rpl31 (איור 1B). האנזים המפוצל יכול להיות מכוון גנטית לאברונים נבחרים, אינו פעיל בריכוזים פיזיולוגיים של ביוטין, וניתן להשתקם תוך דקות עם הארת אור כחול והוספת ביוטין משלים (איור 1C-E). פירוק תאים לאחר מכן, טיהור זיקה והסרת אנזימים ללא דנטורה באמצעות חיתוך פרוטאז TEV מניבים ריבוזומים ומולקולות טיהור משותף כגון mRNA וחלבונים הקשורים לריבוזום, המתאימות לשיטות אנליטיות בהמשך כמו ריצוף RNA ופרוטאומיקת ספקטרומטריית מסה (איור 1A). לכן, שיטה זו חושפת לא רק את הרכב הריבוזומים אלא גם את ה-mRNA שאליהם הריבוזומים קשורים. במאמר עדכני שתיאר את היישום המייסד של ALIBi לאפיון אוכלוסיות ריבוזומים תת-תאיים, הצלחנו למקד את האנזים המפוצל לציטופלזמה, גרעין, גרעין, רשתית אנדופלזמית, ממברנת פלזמה ומיטוכונדריה (טבלה 1)30. ההשוואה שנוצרה בין מכונות תרגום בין מחלקות תת-תאיות אלו הובילה לממצאים חדשים ובלתי צפויים בנוגע לתרגום ברשתית האנדופלזמית ובמיטוכונדריה, וכן למובילים פוטנציאליים לחקר עתידי של גורמי ביוגנזה של ריבוזום בגרעין ובגרעין.

פרוטוקול זה כולל הדגמה מפורטת של טרנספקציה והפעלה של מערכת ALIBI, פירוק תאים, טיהור אפיניטיות והסרת דגימות. אנו גם דנים כיצד לאמת טיהור אפיניטי מוצלח באמצעות Western Blot וממליץ על ביצוע ריצוף RNA במורד הזרם או ניתוח פרוטאומי של ספקטרומטריית מסה (MS) (ראו קובץ משלים 1). פרוטוקול זה נכתב לניסויים המשתמשים בתאי גזע עובריים של עכבר (mESCs) המבטאים את Rpl31 המוזג ל-FTA (L31-FTA) באופן הומוזיגוטי מהאתר האנדוגני Rpl31; קו תאים זה זמין מהמחברים לפי בקשה. האסטרטגיה ליצירת קו תאים זה מתוארת בקובץ המשלים 1 ובאיור המשלים S1 ובאיור המשלים S2. פלסמידים המקודדים את האנזימים המפוצלים המיועדים למספר אברונים זמינים ב-Addgene (מספרי קטלוג #235608 עד 235643). עקרונות העיצוב למיקוד האנזימים המפוצלים לאברונים אלו מתוארים בקובץ משלים 1. הפרוטוקול מניח שכל דגימה מגיעה מ-mESCs שגדלו בלוח בגודל 10 ס"מ. מצאנו כי קנה המידה של 10 ס"מ מספק חומר מספק לפרוטאומיקה של ספקטרומטריית מסה, בעוד שקנה המידה של 6 בארות מספיק לכתמים מערביים או ריצוף RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאי mESC

הערה: לפני הפעלת ALIBi וניתוק תאים, יש לטפל ב-mESCs בטכניקת סטרילית סטנדרטית לתרבות תאים. צנטריפוגציה של mESCs שלמים צריכה להתבצע ב-200 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. חימום המדיום ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים לפני השימוש אלא אם צוין אחרת. יש להעביר mESCs לפלטת תרבית רקמה טרייה שעברה ג'לטין במהלך הלילה (ראו שלב 1.1).

  1. ביום שלפני הפשרת L31-FTA, ציפוי את תחתית לוח בגודל 10 ס"מ ב-5 מ"ל של 0.1% ג'לטין. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בלילה.
  2. משלבים רכיבי מדיה mESC (טבלה 2) ועברו דרך פילטר של 0.2 מיקרון. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
  3. ביום ההפשרה, חמם 5 מ"ל אליקוט של מדיום לדילול התאים המופשרים ו-10 מ"ל אליקו לציפוי.
  4. שלפו קריוביאל המכיל ~5 × 106 L31-FTA mESCs מאגירת חנקן נוזלי. הפשרה מיידית על ידי סיבוב תחתית הבקבוקון באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. מערבבים בעדינות 0.5–1 מ״ל מדיה מאליקוט של 5 מ״ל עם תכולת הקריוביאלית כפי שקיבולת הבקבוקון מאפשרת, ואז העבירו את התוכן הקרייביאלי חזרה לאליקווט המדיה של 5 מ״ל.
  6. תשחרר את התאים בצנטריפוגה. שאפו את הסופרנטנט.
  7. החזירו את הכדור לתא עם ה-10 מ"ל מדיה אליקווט.
  8. שאיפת הג'לטין מהפלטה של 10 ס"מ והעבירה מיידית את תליית התא ללוחית. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס.
  9. כל 24 שעות (למעט בימי עוזב), שואבים מדיה ישנה מהפלטה והחליפו ב-10 מ"ל מדיה טרייה.
  10. כאשר המושבות מתאחדות ב-70%–80% (בדרך כלל 48 שעות לאחר הציפוי), שאופים את המדיום הישן ושוטפים פעמיים עם 10 מ"ל של מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco.
  11. לאחר שאיפת ה-DPBS, ציפו את הפלטה ב-2 מ"ל של 0.05% טריפסין (טבלה 2). דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  12. לנטרל את הטריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיה mESC קרה לפלטה. מיד השתמש בפיפט סרולוגי בנפח 5 או 10 מ"ל כדי להעלות ולמטה פי 15 בלוח כדי לפרק מושבות לתלייה חד-תאית.
  13. העבר את המתלה לצינור קוני. באופן אופציונלי, להסיר אליקו כדי לספור תאים באמצעות המוסיטומטר.
  14. תשחרר את התאים בצנטריפוגה. שאפו את הסופרנטנט.
  15. תלה מחדש את כדור התא במדיה טרייה. לוח 5 × 106תאים (בדרך כלל יחס מעבר של 1:6) בלוח ג'לטיני טרי בגודל 10 ס"מ ומודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. חזור על השלבים 1.9–1.15 לפי הצורך עד שתהיה מוכן להמשיך בטרנספקציה.
  16. כדי ליצור מלאי תאים קפואים, יש לטריפסין לוח של mESCs (כמו בשלבים 1.10–1.14). החזירו את כדור התא לתקשורת הקפאה (250–500 מיקרוליטר ל-5 × 10או 6 תאים), מחברים לקריוביאלים, והקפאו לאט במיכל הקפאה בטמפרטורה של מינוס 80°C במהלך הלילה לפני העברתם לאחסון חנקן נוזלי.

2. טרנספקציה

הערה: בצע טרנספקציה ביום שבו ה-mESC מוכנים למעבר מעבר. פלסמידים עשויים להתחיל להתבטא כבר 3-5 שעות לאחר הטרנספקציה. לאחר הביטוי, אנו ממליצים לטפל בתאים בחושך ולהפחית חשיפה לטמפרטורות מתחת ל-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע הפעלה מוקדמת, שכן מחקרים קודמים הראו כי דומיינים אופטוגנטיים של מגנט מתפוגגים לא רק תחת אור כחול אלא גם בחשיפה לקור31. שמרו את הלוחות באינקובטור ייעודי או הגנו על מדף באינקובטור משותף מפני אור באמצעות נייר אלומיניום. כאשר מטפלים בתאים מחוץ לאינקובטור, כבו או חסמו את כל אורות החדר והחלונות מראש, והשתמשו בפנס אדום כדי לראות. אל תשאיר את דלת האינקובטור פתוחה יותר מהנדרש. הוציאו רק מנות קטנות של צלחות מהאינקובטור בכל פעם, והניחו את הלוחות על משטח בידוד (כלומר, מכסה קופסת קלקר נקי) בזמן הטיפול כדי למזער מגע עם משטחי עבודה בטמפרטורת החדר. חום את המדיה במלואה לפני השימוש. אין לבדוק לוחות תחת מיקרוסקופ פולט אור.

  1. ביום שלפני הטרנספקציה, ג'לטין של צלחת בגודל 10 ס"מ.
  2. ביום הטרנספקציה, יש לשאוב ג'לטין מהצלחת ולהוסיף 7.5 מ"ל מדיום לחימום מוקדם ב-37 מעלות צלזיוס. מדיום סרום מופחת לפני חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להשעיית תאים.
  3. לדלל 18.75 מיקרוליטר של תגובת הטרנספקציה ב-250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. טפחו בעדינות לערבוב ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. אם מבטאים יחד שני פלסמידים המקודדים את מקטעי ה-N וה-C, הוסף 3.75 מיקרוגרם מכל פלסמיד ל-250 מיקרו-ליטר של מדיום סרום מופחת. אם מבטאים רק פלסמיד אחד (כלומר, בקרה שלילית GFP או בקרה חיובית BirA באורך מלא), הוסף 7.5 מיקרוגרם מהפלסמיד היחיד במקום.
  5. הוסיפו את תערובת הפלסמיד/מדיום עם סרום מצומצם לתערובת המגיב הטרנספקטיוני/מדיום עם סרום מופחת והפכו לערבוב. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  6. בינתיים, טריפסיניז ופלט mESCs (שלבים 1.10–1.14). החזירו את הכדור למרחק חם עם סרום מופחת לריכוז של 10 ×10 6 תאים/מ"ל.
  7. הוסף 7.5 × 106 (750 מיקרוליטר) תאים תלויים לתערובת הפלסמיד/תגובת טרנספקציה/מדיום סרום מצומצם. הפוך את הצינור כדי לערבב. דגרו 10 דקות ב-RT, הפכו את הצינורות מדי פעם כדי לשמור על תלויים בתאים.
  8. הפוך את הצינורות שוב לזמן קצר והוסף את תערובת mESC/פלסמיד/תגובת טרנספקציה/מדיום סרום מופחת לפלטה המכילה מדיה מחוממת. נדנד בעדינות את הפלטה כדי לפזר את התאים באופן שווה.
  9. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3–5 שעות, ומאפשרים לתאים להיצמד בתוך תקופה זו.
    הערה: מהנקודה הזו ואילך, אנו ממליצים להקפיד על אמצעי הזהירות הנ"ל מפני חשיפה לאור וטמפרטורות מתחת ל-37 מעלות צלזיוס.
  10. שאפו בעדינות את המדיה הישנה. הוסיפו מדיום מחומם טרי, תוך פייפטרינג בצד הצלחת כדי למנוע הזזת תאים. המשך את הדגירה ב-37 מעלות צלזיוס.
  11. אם מפעיל/מתבצע 24 שעות לאחר הטרנספקציה, המשך לסעיף 3. אם מתכננים להפעיל/ליז ב-48 שעות אחרי הטרנספקציה, החלף מדיום ~24 שעות אחרי הצלחת התאים שעברו.

3. הפעלת ALIBi וניתוק תאים

הערה: המשך לטפל בתאים/דגימות בחושך עד תחילת ההסרה (שלב 5.4). לאחר שהתאים הוקררו על קרח (שלב 3.15), שמרו דגימות קרות והשתמשו רק בתגובות מקוררות עד תחילת השחרור. ודאו שמשטחי עבודה, ציוד, תגובות ופלסטיקים נקיים מ-RNAse על ידי שימוש בפריטים שנפתחו זה עתה וניגוב או שטיפה של משטחים קשים בתמיסת ניקוי RNAse ו-70% אתנול. לבשו כפפות בכל פעם שאתם מטפלים בדגימות או ציוד. לדגימות המיועדות לפרוטאומיקה של MS, יש גם לצמצם זיהום קרטין על ידי שמירה על חלל העבודה נקי מאבק; כיסוי עור חשוף, וקשור שיער ארוך לאחור.

  1. קירר את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. כאשר האורות כבויים, העבירו את הלוחות המועברים לאינקובטור זמני בטמפרטורה של 37°C כדי שלא ייחשפו לתנודות טמפרטורה באינקובטור הראשי לאחר שהטרנסליומינטור הונח בפנים.
  3. נגב את מנוטר האור הכחול עם 70% אתנול וחבר אותו לחשמל. הניחו את הטרנסליומינטור באינקובטור הראשי ואפשרו לתנאי האינקובטור להתאזן מחדש תוך המשך ההגדרה.
  4. חממו אליקו של מדיה למינון ביוטין וציקלוהקסימיד (CHX) (10 מ"ל מדיה לכל צלחת 10 ס"מ) ל-37 מעלות צלזיוס. אם מריצים דגימות ביקורת ללא ביוטין משלים, כדאי גם לחמם אליקוט נפרד למינון של CHX בלבד.
    הערה: חלק מרכיבי הבופר ניתנים לערבב יום לפני השימוש ואחסון למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (ראו טבלה 2). יש לשים לב שמתכונים שונים לליזיס ובופר שטיפה שימשו בניסויים שנועדו ל-Western Blot או MS פרוטאומיקס וכן לריצוף RNA.
  5. קרר אליקו של DPBS למינון CHX (20 מ"ל לפלטה של 10 ס"מ).
  6. הכינו את בופר הסרת RNAse, שטיפת מלח, בופר ליזיס ובופר שטיפה (ראו טבלה 2). לבופרים עם רכיבים צפופים/צמיגים כמו גליצרול וטריטון X-100, יש לפיפט את הבופר המושלם כדי להבטיח ערבוב אחיד. קרר את הבופרים על הקרח לפני השימוש.
    הערה: בשלבי שטיפת החרוזים, סובבו בקצרה את הצינור המכיל חרוזים בבופר הנוכחי בצנטריפוגה כיסית כדי לאסוף את התכולה בתחתית. הנח את הצינור במתקן מגנטי למשך דקה אחת או עד שהחרוזים נדדו לגמרי. שאפו את הסופרנטנט מבלי לגעת בכדור החרוזים. בלי לתת לגלגלת החרוזים להתייבש, הוסיפו את הבופר הבא. כדי להחזיר את כדור החרוזים, יש לגלגל בעדינות את הצינור הסגור בין האצבעות תוך כדי החזקתו כנגד המתקן המגנטי, כך שהחרוזים נמשכים במהירות לכיוונים שונים על ידי המגנט. לבסוף, הפכו את החרוזים התלויים מספר פעמים כדי לוודא שדפנות הפנימיות של הצינור נשטפו.
  7. תלה מחדש את בקבוק החרוזים של סטרפטווידין על ידי פיפטינג עדין או נדנוד. העבר 450 מיקרוליטר של חרוזים לצינור עם קישור חלבוני נמוך עבור כל צלחת mESC באורך 10 ס"מ.
  8. בהתאם להערה הנ״ל על שטיפת חרוזים, השליכו את בופר אחסון החרוזים ושטפו חרוזים פעמיים עם בופר הסרת RNAse של 900 מיקרוליטר.
    הערה: המשך לשלב הבא ללא דיחוי; זמן ממושך בבופר הסרת RNAse עלול להפחית את יכולת הקישור של החרוזים.
  9. שטוף חרוזים פעם אחת עם 900 מיקרוליטר מלח.
  10. חרוזי שטיפה פעמיים עם 900 מיקרוליטר של Wash I Buffer. לאחר השעיית החרוזים בסבב השני של בופר Wash I, אחסן את החרוזים בבופר Wash I בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך ביצוע הפעלה וניתוק תאים.
  11. הוסף ביוטין (ריכוז סופי של 50 מיקרומון; דילול של 1:1,000 של מלאי 50 מ"מ) ו-CHX (ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל; דילול של 1:1,000 של מאגר 100 מ"ג/מ"ל) לפי ההתאמה לאליקווט(ים) המחוממים של המדיה. שמור על 37 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  12. הוסף CHX (ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל; דילול של 1:1,000 של 100 מ"ג/מ"ל) לאליקווט הקר של DPBS ושמור על קירור עד השימוש.
    הערה: שני השלבים הבאים מתארים את הפעלת ALIBi באמצעות הארה משלימה של ביוטין ואור כחול. משך הפעלה אידיאלי ארוך מספיק כדי להניב כמות מספקת של ביוטינילציה של ריבוזום לבדיקות במורד הזרם, אך קצר מספיק כדי לשמור על רזולוציה מרחבית-זמנית. זמן ההפעלה האידיאלי עשוי להשתנות בהתאם לפרמטרים כגון סוג התא, היקף הניסוי, רמת הביטוי של האנזימים המפוצלים, שפע הריבוזומים ליד האברון הרלוונטי, ורגישות טכניקת הניתוח. אנו ממליצים על 15 דקות כנקודת התחלה, שהיא זמן ההפעלה שבו משתמשים בתוצאות המייצגות שלנו (איור 2) ובעבודההנלווית שלנו 30.
  13. שאיבת מדיה מהלוחות המועברים. מיד הוסיפו 10 מ"ל מדיום חם המכיל CHX ± ביוטין לכל צלחת.
  14. כדי שכל לוחות בקרה שליליים לא יהיו מוארים, שים אותם באינקובטור חשוך. כדי להאיר את הלוחות, יש להניח אותם ישירות מעל הטרנסלומיניימטור, להדליק את הטרנסלומינור ולדגור אותו למשך 15 דקות.
  15. כאשר ההארה מסתיימת, שטוף מיד את הלוחות פעמיים עם 10 מ"ל DPBS קר + CHX לכל פלטה. הנח את הצלחות על קרח בין השטיפות ואחריהן. לאחר שאפירת השטיפה השנייה, הטה את הפלטה ושאיפת כל DPBS שנותרה.
  16. תוך שמירה על כל צלחת שטוחה ככל האפשר על הקרח, המשיכו לליסיס על ידי הוספת 2 מ"ל של בופר ליזיס קר כקרח. הדגרו את הפלטת על הקרח במשך 5 דקות, והקישו על הלוח כדי לשחרר תאים 2–3 פעמים במהלך הזמן הזה.
    הערה: אם נשארים כהים מתחת לנייר כסף ועל קרח, ניתן להזיז את הלוחות מחוץ לאזור תרבית התאים לחלל חשוך אחר בתקופה זו.
  17. הסרת כל תאים שנותרו באמצעות מיקרופיפטה לפיפט של הליזאט למעלה ולמטה על פני המשטח תוך הימנעות מהיווצרות בועות, ואז העבר ליזאט לצינור חלבוני מקורר ומסומן בעל קשירה נמוכה.
    הערה: אופציונלי: עבור חלק מהאברונים שקשה לפרק אותם כמו הגרעין והגרעין, סוניקציה עשויה לעזור.
  18. במקרה של אברונים שקשה לפרק אותם, סוניקט את כל הדגימות בניסוי למשך 45 שניות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (הגדרת הספק של 3 וואט). אם עיצוב הסוניקטור דורש הכנסת גלאי לצינור דגימה פתוח, העבר את הליזאט תחילה מהלוח לצינור גדול יותר כדי למנוע הצפה במהלך סוניקציה; לאחר מכן, העבר אותו לצינור של 2 מ"ל.
  19. דגרו את הליזאט על קרח למשך 15 דקות.
  20. צנטריפוגה את הליזאט ב-17,000 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבר את הסופרנטנט (ליזאט מובהק) לצינור חלבון מקורר בעל קישור נמוך מבלי להפריע לכדור פסולת התאים.
    הערה: אם מתכוונים לניתוח RNA-seq, ניתן כעת לאסוף אליקווט של הליזאט המובהק כחלק הכולל של ה-RNA (ראו קובץ משלים 1, "המלצות לריצוף RNA" שלב 1.1) לפרטים.
    הערה: אם כמויות התאים, תנאי הטרנספקציה/תרבית ותנאי הליזה היו אחידים לכל הדגימות, אנו בדרך כלל מניחים שריכוזי הליזאט ניתנים להשוואה בין דגימות וממשיכים מבלי לכמת את ריכוז החלבון הכולל. זה ממזער את הזמן שחלף בין ההפעלה לטיהור הזיקה.

4. טיהור זיקה

  1. הגלגלים את חרוזי הסטרפטווידין השטופים באמצעות מתקן מגנטי. שאפו את ה-Wash I buffer.
  2. העבר 1,200 מיקרוליטר של ליזאט מובהק לצינור המכיל את החרוזים השטופים. פיפט בעדינות כדי להחזיר את החרוזים. אחסן את שארית הליזאט המובהר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  3. דגרו את הליזאט עם חרוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה על מסובב הצינור.
  4. במהלך דגירה זו, יש להכין את בופר ההסרה של TEV (טבלה 2).

5. Elution

  1. בהתאם להערות על שטיפת חרוזים בסעיף 3, שחררו את החרוזים על מתקן מגנטי והעבירו את הסופרנטנט לצינור חלבוני מקורר עם קישור נמוך. אחסן את הסופרנטנט בטמפרטורה של -80°C.
  2. חרוזי שטיפה פעמיים עם 900 מיקרוליטר של בופר Wash I.
  3. חרוזי שטיפה פעם אחת עם 900 מיקרוליטר של בופר Wash II.
    הערה: לאחר סיום שלב זה, אין צורך עוד לטפל בדגימות בחושך.
  4. הוסיפו 450 מיקרוליטר של בופר שחרור TEV לחרוזים.
  5. דגרו חרוזים בבופר שחרור TEV למשך שעה בטמפרטורת החדר על סיבוב הצינור. לניסויים בקנה מידה קטן יותר המשתמשים בנפחים נמוכים של בופר שחרור TEV, יש לדגור את הצינורות על שייקר במהירות של 1,000–2,000 סל"ד במקום.
  6. הכדור את החרוזים על המתקן המגנטי. העבר את האלואט לצינור עם קישור חלבון נמוך. אם מתכוונים לניתוח פרוטאומיקס או ווסטרן בלוט, יש לאחסן את האלואט בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. אם מתכוונים לניתוח RNA-seq, ראו קובץ משלים 1 "המלצות לריצוף RNA" שלב 1.2 להוראות אחסון שחרור.
  7. אופציונלי: כדי לקבוע באופן ראשוני האם טיהור האפיניטי הניב rRNA/mRNA משמעותי (המצביע על בידוד ריבוזומים), לנתח אלוטים על ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח באמצעות בופר שחרור TEV כריק.
    הערה: נוזלים מתאים המכילים את המערכת המופעלת צריכים להיות בעלי ספיגה גבוהה יותר ב-260 ננומטר מאשר מתאים שחסרים את האנזימים המפוצלים, אור כחול/ביוטין או L31-FTA.

6. כתם מערבי

הערה: עד שדגימות הליזאט וה-flow-through יעברו דנטור בבופר Laemmli, אנו ממליצים להמשיך להימנע מחשיפה לאור. אנו משתמשים בג'לים מוכנים מראש, בבופר העברה ובופר רץ זמינים מסחרית, ובמערכת העברה חצי-יבשה (ראו טבלת החומרים). SDS-PAGE ו-Western Blot מבוצעים בהתאם להוראות היצרן עבור רכיבים אלו, אלא אם צוין אחרת להלן.

  1. הוסיפו 6x בופר Laemmli לדגימות הליזאט, הזרימה ו/או ה-eluate לריכוז סופי של 1x בופר Laemmli. חמם ב-95 מעלות צלזיוס בבלוק חימום או תרמחזור למשך 10 דקות. אם נוצר עיבוי על מכסה/דפנות הצינור, סובב את הצינורות לזמן קצר.
  2. התקן ג'ל עם בופר רץ במיכל הג'ל, לפי הוראות יצרן המיכל. טען את הדגימות ואת הסולם.
  3. הרץ את הג'ל ב-125 וולט במשך 45–75 דקות עד שהחזית של הצבע מתקרבת לתחתית הג'ל. בינתיים, הכינו PBST ומאגרי חסימה (טבלה 2).
  4. בצע העברה חצי-יבשה לפי הוראות יצרן מערכת ההעברה.
    הערה: בכל שלבי שטיפת הממברנה/אינקובציה, ודאו שהממברנה טבולה לחלוטין והניחו את מגש הממברנה על מנוף אורביטלי או נדנדה מוטה. למגש בגודל 10 על 15 ס"מ, נדרש 25–50 מ"ל של בופר.
  5. הסר את הממברנה מערימת ההעברה והמשיך מיד לשלב הבא כדי לוודא שהממברנה לא תתייבש.
    הערה: אופציונלי: כתמים יבשים על הממברנה עלולים לגרום לחסימה לא אחידה או לקשירת פרוב, במיוחד בגלאים עם דגירה קצרה כמו פרוקסידאז סטרפטאוידין-חזרת. כדי להימנע מהבעיה הזו, אנחנו מרטיבים מחדש את הממברנות לאחר ההעברה ב-100% מתנול במשך 30 שניות, ואז במים במשך 5 דקות. אמצעי זה דומה להמלצות כלליות להרטיבת ממברנות PVDF שהתייבשו לאחר העברה32,33.
  6. שטוף את הממברנה ב-PBST למשך 3 פעמים 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. בהתאם לתנאים שצוינו בטבלה 3 לכל גלאי ווסטרן בלוט, יש לבצע את החסימה, השטיפה, דגירה של הפרוב והדגירות המשניות של נוגדנים.
  8. לאחר הכביסה הסופית בשלב 6.7, מערבבים את רכיבי המצע של ECL לפי הוראות היצרן וציפו את הממברנה באופן אחיד. צלם את התמונה במערכת הדמיה ג'ל כימילומינסנציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ווסטרן בלוט (סעיף 6 בפרוטוקול) הוא הדרך המהירה ביותר להעריך באופן ראשוני את הצלחת הניסוי. כאשר ממברנות נבדקות עם סטרפטבדין-HRP, ליזאט מתאים שבהם כל רכיבי המערכת היו קיימים אמור להכיל רצועה התואמת לביוטינילציה L31-FTA (איור 2A, נתיב 20). אותו רצועה אמורה להיות נוכחת, בדרך כלל בעוצמה גבוהה יותר, אם תאים עברו טרנספקט עם BirA באורך מלא כבקרה חיובית (איור 2A, נתיבים 1–4). תחום זה אמור להיות חלש יותר או חסר בדגימות שבהן הושמט רכיב מער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi מציע מספר יתרונות בהשוואה לטכניקות קיימות לחקר תרגום תת-תאי ויש לו יישומים פוטנציאליים בעתיד בביולוגיית הריבוזום ומעבר לה. פרוטוקול זה דורש זמן דומה או פחות בהשוואה לליזיס ולצנטריפוגציה רציפה21,22, והוא עשוי להתאים לכל תא תת-תאי שניתן למקד גנטית באמצעות רצף פפטיד מקומי. בהשוואה ל-BirA10,24 פעיל באופן קונסטיביטי, שיטה זו אינה דורשת תרבית תאים במדיה מדוללת מביוטין. רי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לחברי מעבדת ברנה על דיונים מועילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
-80 °C storageלתרבית תאים
0.1% ג'לטין במיםMilliporeSigmaES-006-Bלתרבית תאים
יחידות סינון 0.2 µmFisher04-977-158לתרבית תאים
0.5% trypsin-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054לתרבית תאים
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010לליזה & טיהור זיקה
1 M Tris pH 7.5ThermoFisher15567027לליזה & טיהור זיקה
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855Gאופציונלי: להכנסת FTA למקום חלבון ריבוזומלי אנדוגני
1.5 ו-2 mL צינורות מיקרוצנטריפוגה, מעוקריםלטרנספקציה
1.5, 2 mL, ו-5 mL צינורות מיקרוצנטריפוגה לחלבון עם קישור נמוךEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		לליזה & טיהור זיקה
צלחות תרבית רקמות של 10 ס”מלתרבית תאים
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLלליזה & טיהור זיקה
10x Tris/glycine/SDS running buffer concentrateBio-Rad1610772ל-Western blot
חממת תרבית רקמות של 37 °C x 2לתרבית תאים. אחת מהן משמשת כחממת התרבית העיקרית לתרבית תאים והארה של תאים טרנספקטים. יש צורך במרחב זמני בחממה שנייה ביום הפעלת ALIBi כדי להכיל תאים טרנספקטים בעת הגדרת המאירה הטרנספורמטיבית בחממה הראשית.
אמבט מים של 37 °Cלתרבית תאים
5 M NaClThermoFisherAM9010לליזה & טיהור זיקה
50 mM biotinThermoFisherB20656לליזה & טיהור זיקה
6x Laemmli bufferFIsher50-196-784ל-Western blot
70% אתנוללחיטוי
אצטוניטרילFisherA955אופציונלי: להכנת דגימות לספקטרומטריית מסה
ערכת AcTEV proteaseThermoFisher12575015לליזה & טיהור זיקה
פלסמיד C-fragment של ALiBiAddgene#235615, 235636 – 235641דרוש קנה-מד לטרנספקציה
פלסמיד N-fragment של ALiBiAddgene#235614, 235635, 235642, 235643דרוש קנה-מד לטרנספקציה
נייר אלומיניוםלליזה & טיהור זיקה
אמוניום ביקרבונטMilliporeSigma5.3305אופציונלי: להכנת דגימות לספקטרומטריית מסה
נוגדן anti-FLAGMilliporeSigmaF3165ל-Western blot
נוגדן anti-GAPDHCell Signaling5174ל-Western blot
נוגדן משני anti-עכברGE HealthcareNA931Vל-Western blot
נוגדן משני anti-ארנבGE HealthcareNA934Vל-Western blot
נוגדן anti-Rpl12Abcamab175219ל-Western blot
נוגדן anti-Rpl31Abcamab103991ל-Western blot
נוגדן anti-Rpl5ProteinTech15430-1-APל-Western blot
נוגדן anti-V5ThermoFisherR960-25ל-Western blot
ApyraseNEBM0398Lלליזה & טיהור זיקה
Beta-mercaptoethanol (55 mM)ThermoFisher21985-023לתרבית תאים
תאורה אחורית בתאורה כחולהClare Research ChemicalDR46B (קטנה) או DR196 (גדולה)לליזה & טיהור זיקה
אלבומין מסום בקר (BSA)FisherBP1600-100ל-Western blot
טיפים C18 (טיפים OMIX C18)AgilentA57003100אופציונלי: להכנת דגימות לספקטרומטריית מסה
מיכל הקפאה לתאיםלתרבית תאים
צנטריפוגה המתאימה לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל ו/או 50 מ"ללתרבית תאים
צנטריפוגה לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5-2 מ"ללליזה & טיהור זיקה. אמור להיות מסוגל להתקרר עד 4 C ומהירות של עד 17,000 g. באופן אידיאלי, הוא ממוקם בחדר שניתן להחשיך אותו באופן זמני בעת העברת צינורות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
  2. Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
  3. Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
  4. Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
  5. Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.
  6. Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.
  7. Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.
  8. Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.
  9. Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.
  10. Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.
  11. Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.
  12. Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.
  13. Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.
  14. Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.
  15. Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.
  16. Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.
  17. Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.
  18. Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.
  19. Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.
  20. Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.
  21. Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.
  22. Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.
  23. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.
  24. Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.
  25. Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.
  26. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.
  27. Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.
  28. Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.
  29. Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.
  30. Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.
  31. Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.
  32. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.
  33. Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.
  34. Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.
  35. Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.
  36. Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.
  37. Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.
  38. Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.
  39. Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.
  40. Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.
  41. Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.
  42. Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.
  43. Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233JoVE

מאמרים קשורים