בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים ממעילי באפי באמצעות הפרדת חרוזים אימונומגנטית בתפוקה גבוהה

בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) היא טכניקה המפרידה ומבודדת לימפוציטים ומונוציטים ממרכיבי דם שלמים אחרים. PBMCs הם סוג תא רב-תכליתי המשמש ליישומים רבים, כולל, אך לא רק, אימונותרפיה, פיתוח חיסונים, זיהוי מטרה או סמנים ביולוגיים, ופיתוח תרופות נוגדנים/מולקולות קטנות ^1,2. תאים אלה עשויים להיות מבודדים מאנשים בריאים או חולים וניתן להשתמש בהם באופן מיידי בתהליכים במורד הזרם או בהקפאה למחקר עתידי³. במקרים מסוימים, המטרה במורד הזרם ידועה, בעוד שבמקרים אחרים, כפי שמקובל בביו-בנקאות, PBMCs מבודדים ומאוחסנים עבור יישומים עתידיים שלא צוינו⁴.

צנטריפוגת שיפוע צפיפות היא הטכניקה המסורתית לבידוד PBMCs ^5,6,7 מדם שלם, תוך שימוש בהפרדה דיפרנציאלית של סוגי התאים המרכיבים בהתבסס על צפיפות התאים במהלך הצנטריפוגה. אמנם ייתכנו שינויים מסוימים בשיטה זו, דם שלם בדרך כלל מדולל במי מלח חוצצי פוספט (PBS), שכבות על מדיום שיפוע צפיפות בצינור צנטריפוגה מיוחד או סטנדרטי, ולאחר מכן מסובב. התוצאה היא ארבע שכבות נפרדות: שכבת הפלזמה העליונה מועשרת בטסיות דם, שכבת PBMC דקה נמצאת מעל מדיום שיפוע הצפיפות, ולבסוף, השכבה התחתונה מורכבת מכדוריות דם אדומות (RBCs) וגרנולוציטים. אף על פי ששיטה זו כונתה בעבר "תקן הזהב"⁸, ישנן מגבלות להתרחבות, כגון זמן עיבוד ממושך, קיבולת צנטריפוגות, קושי בציטוט מוצרי דם אחרים (כלומר, פלזמה ו- RBCs), ולהיות מייגע לאוטומציה. בעוד אוטומציה אפשרית עבור שיטה^{זו 9}, היא דורשת תכנות מקיף של מטפל נוזלים (עם מודול צנטריפוגה להיות אוטומטי לחלוטין) ויישאר תהליך ארוך.

מעתה, מוצג תהליך עבודה חלופי המשתמש בהפרדת חרוזים אימונומגנטית עם מגנט בעל שמונה מחזיקים לעיבוד ידני או מכשיר לעיבוד אוטומטי לחלוטין. שיטה זו משתמשת בקוקטייל נוגדנים המוסף לתאים וקושר אוכלוסיות תאים לא רצויות, במקרה זה טסיות דם, גרנולוציטים ו-RBC. אוכלוסיות לא רצויות אלה מוסרות לאחר מכן על ידי הפרדה מגנטית, ומשאירות אוכלוסיות מונוציטים ולימפוציטים בחלק השלילי המוכנות לעיבוד במורד הזרם¹⁰. שיטת ברירה שלילית זו מהירה יותר משיטות ברירה חיובית הדורשות צעדים נוספים להסרת קומפלקס הנוגדנים והחרוזים המגנטיים מהמרכזיות. ברירה שלילית היא יתרון נוסף מכיוון שהיא תוארה כדרך לשמר את פונקציונליות התא^11,12.

דגימות דם של בקרת איכות ונתונים שנוצרו בתוך החברה (כגון ספירת תאים, כדאיות וגיל הדגימה בעת העיבוד) התקבלו ממחקרים מוסכמים ב- NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (אישור HREC: 2019/ETH06776). דגימות דם אנושיות בוגרות מעובדות (כלומר, מרוקנות פלזמה), לא מסומנות ולא מזוהות נאספו בצינורות EDTA. דגימות דם אלה של בקרת איכות עובדו פחות מ-72 שעות לאחר האיסוף, ושימשו לניסויי בידוד PBMC שהשוו בין שיפוע הצפיפות לבין שיטות מבוססות חרוזים. לשיטת ההפרדה של שיפוע הצפיפות המשמשת בתוצאות המייצגות, עיין בהליך בקובץ משלים 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת דם מלא

1. יש להפוך בעדינות 10 מ"ל צינוריות דם שלמות (מצופות בחומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית [EDTA], חומצה-ציטראט-דקסטרוז [ACD] או ליתיום הפרין) 10 פעמים בטמפרטורת החדר.
2. אופציונלי: אם יש לאחסן דם שלם, aliquot לתוך cryotubes לאחסון -80 °C.
3. צנטריפוגה את הצינורות באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 22 ° C עם הבלם מופעל (9 תאוצה / 9 האטה).

2. קולקציית מעילי באפי

1. לאחר הצנטריפוגה, הניחו את הדגימות בארון בטיחות ביולוגי ובדקו את שלוש השכבות השונות (כפי שמוצג באיור 1).
   הערה: RBCs נמצאים בשכבה האדומה כהה התחתונה של צינור הצנטריפוגה. שכבה לבנה אטומה המכילה תאי דם לבנים וטסיות נמצאת מעל שכבת RBC, המכונה מעיל באפי. השכבה הצהובה העליונה מכילה פלזמה.
2. אופציונלי: אם יש לאחסן פלזמה, aliquot פלזמה לתוך cryotubes עבור -80 °C אחסון.
3. פיפטה 1 מ"ל של מעיל באפי (חומר מוצא) מצינורית דם של 10 מ"ל והעברה לצינור שצוין ומסומן בשלב 3.1 ושלב 4.1 עבור השיטות הידניות והאוטומטיות, בהתאמה. מערבלים את הפרווה הבאפית (שכבה לבנה אטומה) בעזרת קצה הפיפטה, ואוספים את הפרווה הבאפית על ידי שאיפה.
   הערה: פחות מ -100 μL של פלזמה ו- RBCs מקובלים במהלך שאיפה. אם נאספים צינורות דם מרובים עבור משתתף אחד, ניתן לאגד מעילי באפי; עם זאת, זה עשוי להשפיע על ריכוז טסיות¹³.
4. לעיבוד ידני, המשך לסעיף 3. לעיבוד אוטומטי, המשך לסעיף 4.
5. אופציונלי: אם RBCs רוצים להיות מאוחסנים, aliquot RBCs לתוך cryotubes עבור אחסון -80 °C.

3. טיהור PBMC - שיטה ידנית

הערה: ניתן לעבד עד 8 דגימות לכל מחזיק מגנט על ידי מפעיל יחיד.

1. תווית 3 x 5 מ"ל צינורות פוליסטירן עם אותיות A-C.
   הערה: השתמש במספור רציף אם אתה מבצע יותר מדגימה אחת, כלומר, 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.
2. הוסף 60 μL של 0.1 M EDTA (לריכוז EDTA סופי של 6 mM, pH 8.0, ראה קובץ משלים 2 למתכון) לצינור A המכיל את המעיל האפי שהועבר בשלב 2.3.
3. מוסיפים 50 μL של צינור תערובת הקוקטיילים (ראו טבלת חומרים) לצינור A, מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים, ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף 890 μL של PBS לצינור A וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים.
5. מערבלים את צינור החרוז המגנטי (ראו טבלת חומרים) למשך 30 שניות.
6. הוסף 50 μL של חרוזים מגנטיים לצינור A וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים.
7. הכניסו מיד את צינור A למעמד המגנט ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הכניסו בזהירות את תרחיף התא המועשר לתוך צינור B, ואספו את החלק השקוף עם RBCs ללא / מינימלי (<100 μl) להתאוששות pbmc אופטימלית.
   הערה: אין להפריע לחרוזים הקשורים למגנט. פיפטה העברה מומלצת.
9. הסר את צינור A ממעמד המגנט והשליך.
10. הוסף 50 μL חרוזים מגנטיים לתרחיף התא בצינור B וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה לפחות 3 פעמים.
11. הכניסו מיד את צינור B למעמד המגנט ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
12. בזהירות pipete התא מועשר תרחיף לתוך צינור C, לאסוף רק את החלק הברור.
    הערה: אין להפריע לחרוזים הקשורים למגנט. פיפטה העברה מומלצת.
13. הסירו את צינור B ממעמד המגנט והשליכו אותו.
14. הכניסו מיד את צינור C למעמד המגנט ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
15. יש להכניס בזהירות את מתלה התאים המועשר לצינור צנטריפוגה מסומן ולמלא עד 2 מ"ל עם PBS.
16. מעבירים 50 μL של תרחיף התא לכוס דגימה של מונה התאים האוטומטי. לספירת תאי דילול ביחס של 1:10, יש להוסיף 450 μL של PBS. המשך לסעיף 5 לשלבי ספירת תאים.

4. טיהור PBMC - שיטה אוטומטית

הערה: ניתן לעבד עד 4 דגימות באמצעות מכשיר PBMC אוטומטי יחיד. מכשירים מרובים יכולים להיות מופעלים במקביל על ידי מפעיל יחיד.

1. תווית 2 x 14 מ"ל צינורות עם אותיות A ו- B, 1 x 50 מ"ל צינור צנטריפוגה עם האות C, וצינור צנטריפוגה 1 x 50 מ"ל עם "פסולת".
   הערה: מיכל פסולת אחד בלבד נדרש עבור כל הפעלה במכשיר PBMC אוטומטי. השתמש במספור רציף אם אתה מבצע יותר מדגימה אחת, כלומר 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.
2. הוסף 60 μL של 0.1 M EDTA (לריכוז EDTA סופי של 6 mM) לצינור A המכיל את המעיל האפי המועבר בשלב 2.3.
3. מערבלים את צינור החרוז המגנטי (ראו טבלת חומרים)  למשך 30 שניות.
4. הפעל את מכשיר ה- PBMC האוטומטי על-ידי הפעלת החשמל בקדמת המכשיר.
5. במסך הבית של מכשיר PBMC אוטומטי, בחר פרופיל ובחר את הפרוטוקול הרצוי.
   הערה: EasySep בידוד PBMC אנושי ישיר 19654 - מעיל באפי היה פרופיל הפרוטוקול שנבחר עבור בידוד PBMC זה. ראה את הנוהל הסטנדרטי של היצרן עבור פרופיל זה בדוח פרוטוקול¹⁴.
6. הזן את עוצמת הקול ההתחלתית (כמות המעיל האפי שנשאף לתוך צינור A), וחזור על הפעולה עבור כל דגימה.
7. בחר את כל הרבעים שישתמשו באותה ערכת מגיבים.
   הערה: אם אותו פרוטוקול משמש עבור יותר מרביע אחד, מכשיר ה- PBMC האוטומטי יציע להשתמש באותה ערכת מגיב עבור כל הרבעים¹⁴.
8. טען את קרוסלת המכשיר עם חומרים מתכלים מסומנים, קצוות סינון ומיכל חיץ. ערכת המגיב המכילה את צינור החרוז המגנטי ואת צינור תערובת הקוקטיילים יוטענו לרביע 1.
   הערה: המכשיר ישאל אם המשתמש מעוניין להשתמש בערכת מגיב 1 עבור כל הרבעים. בחר 'כן' וסמן את כל הרבעים באמצעות ערכת המגיב.
9. לאחר השלמת הטעינה, הסר מכסים מחומרים מתכלים וריאגנטים ובחר הפעל במסך המכשיר.
10. בסיום הריצה, בחר בטל פריקה והסר דגימות (המכילות מתלה PBMC המסומן בצינור C) מהקרוסלה של המכשיר. אחסנו את צינור החרוזים המגנטי, צינור תערובת הקוקטיילים ומיכל החיץ בטמפרטורה של 4°C. השליכו שפופרות המסומנות כ-A, B ופסולת (ראו שלב 4.1) ועצות סינון.
    הערה: אין צורך בטעינה עם PBS עבור השיטה האוטומטית, מכיוון שמתלי PBMC מייצרים נפח סופי של 7 מ"ל.
11. העבירו 500 μL של התאים לכוס דגימה לספירת תאים ללא דילול. המשך לסעיף 5 לספירת תאים.

5. ספירת תאים

1. בצע ספירת תאים וכדאיות באמצעות שיטת הרחקת הצבע הכחול טריפאן בהתאם להוראות היצרן¹⁵.
   הערה: עבור התהליכים הפנימיים של המחבר, ניתוח תאים מתבצע באמצעות מונה תאים אוטומטי עם ההגדרות הבאות כדי להשיג PBMCs.
   מקדם דילול = 10 (עבור פרוטוקול ידני, אם מתלה התא הוא בנפח נמוך) או 1 (עבור פרוטוקול אוטומטי)
   סוג תא: PBMC
   טווח ריכוז = 5 x 10⁴ עד 1 x 10⁷ תאים/מ"ל
   טווח מידות (קוטר) = 8 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר
   מספר תמונות = 50

6. הכנה לשימור בהקפאה

1. צנטריפוגה (באמצעות רוטור דלי מתנדנד) צינורות הדגימה ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 22 ° C עם הבלם מופעל (9 תאוצה / 9 האטה).
2. לאחר הצנטריפוגה, החזירו את הדגימות לארון הבטיחות הביולוגי.
3. בעזרת פיפטה, בזהירות להסיר את supernatant. ניתן להשאיר כמות קטנה של סופרנאטנט עם גלולת PBMC כדי להבטיח שהיא לא תופרע.
4. להשעות את הגלולה ב 3 מ"ל של מדיום cryopreservation קר. מערבבים לאט ובעדינות את המתלה מעלה ומטה עד לקבלת מרקם הומוגני.
   הערה: ניתן לכוונן את נפח מדיום השימור בהתאם לריכוז PBMC הסופי הרצוי.
5. יש להוציא 1 מ"ל של PBMC המושעה מחדש לתוך צינור קריו-צינור שהוקצה מראש ולמקם אותו בתוך מיכל הקפאה בקצב בקרה למשך 4 שעות לפחות ב-80°C-.
   הערה: ניתן לכוונן את נפח ה-PBMCs המותאמים לכל צינור קריו-צינור בהתאם להעדפת החוקר.
6. לאחר אחסון cryotubes ב -80 °C למשך מינימום של 4 שעות, להעביר את cryotubes למיכל שלב אדי חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

7. ניתוח נתונים סטטיסטיים

1. נתוני התוצאות המייצגות נותחו באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות כמפורט בקובץ משלים 3.

הפרופורציות של לימפוציטים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים ובזופילים לפני (כלומר, בדם שלם) ואחרי בידוד PBMC נמדדו כאשר PBMCs בודדו באמצעות שיטת ההפרדה ההדרגתית מבוססת חרוזים או צפיפות. הפרופורציות של לימפוציטים ומונוציטים הועשרו באופן משמעותי בשתי השיטות (איור 2A,B). נוסף על כך, הפרופורציות של נויטרופילים, אאוזינופילים ובזופילים (כלומר, גרנולוציטים) ירדו באופן משמעותי ב-PBMCs שבודדו בשיטה מבוססת חרוזים (איור 2C-F). לא היו הבדלים משמעותיים בפרופורציות של לימפוציטים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים בין שיפוע הצפיפות לבין שיטות מבוססות חרוזים (איור 2). אחוזי ההתאוששות חושבו בנוסף עבור סוגי התאים שצוינו לעיל (ראו איור משלים 1). הכדאיות הממוצעת של התאים הייתה מעל 95% בשתי השיטות, ולא הייתה שונה באופן משמעותי (איור 3A). PBMCs נספרו גם באמצעות טווח גדלים (קוטר) של 8 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר, כאשר שיטת ההפרדה ההדרגתית של הצפיפות הפיקה ספירת תאים כוללת גבוהה בערך פי שניים (איור 3B).

לאחר מכן, השיטה האוטומטית מבוססת החרוזים הושוותה לשיטה הידנית. לא זוהו הבדלים משמעותיים בכדאיות התא (איור 4A) או בספירה הכוללת של התאים (איור 4B) בשיטה הידנית או האוטומטית. הזמן לעיבוד 8 הדגימות הללו הושווה, כולל זמן ללא התערבות אנושית. זמן העיבוד הכולל של 8 דגימות היה 43 דקות לעומת . 57 דק' למדריך לעומת השיטה האוטומטית. השיטה האוטומטית כללה 35 דקות של עיבוד ידני (איור 4C).

תהליך העבודה מבוסס החרוזים של בידוד PBMC (עם דם שלם ופלזמה aliquoting) היה פיילוט במשך 9 חודשים, שבו 1410 דגימות PBMC בודדו מדם אנושי לא מסונן באמצעות פלטפורמה ידנית עבור 820 המשתתפים הראשונים ולאחר מכן באמצעות השיטה האוטומטית עבור 590 המשתתפים הבאים. העיבוד בוצע באותו יום או עד 10 ימים לאחר האיסוף בהתאם לקריטריונים לקבלת המחקר, עם עיכובים בעיבוד בעיקר בגלל זמני העברת הדגימה. בשיטה הידנית או האוטומטית, PBMCs שעובדו בתוך 24 שעות מהאיסוף היו בעלי הכדאיות וההתאוששות הגבוהות ביותר (איור 5). הכדאיות הממוצעת של התאים הייתה >90% עבור PBMCs שעובדו תוך 5 ימים ו->70% עבור PBMCs שעובדו תוך 10 ימים (איור 5A). התשואות הממוצעות של PBMC ירדו ב-50% לאחר 5 ימים בהשוואה לדגימות שעובדו תוך 24 שעות (איור 5B).

איור 1: זרימת עבודה סכמטית של פרוטוקול בידוד PBMC מבוסס חרוזים ממעיל באפי. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פרופורציות של לימפוציטים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים בבידוד דם שלם לפני ואחרי PBMC על-ידי שיפוע צפיפות ושיטות מבוססות חרוזים. אחוז הלימפוציטים (A), מונוציטים (B), נויטרופילים (C), אאוזינופילים (D), בזופילים (E) וגרנולוציטים (F) בבידוד תואם של דם שלם לפני PBMC (ריבועים) וב- PBMCs לאחר בידוד באמצעות שיטת שיפוע צפיפות (מעגלים פתוחים) או מבוסס חרוזים (מעגלים סגורים) (n = 8). ns = לא משמעותי, ו- *p < 0.05 כפי שנקבע על ידי ANOVA חד כיווני (A ו- B) או מבחן פרידמן (C- ו). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כדאיות וספירת תאים כוללת של PBMC שבודדו על-ידי שיפוע צפיפות ושיטות מבוססות חרוזים. (A) כדאיות תא ממוצעת (± SD) עבור דגימות שעובדו באמצעות שיפוע צפיפות (ריבועים, פס כהה) לעומת שיטות מבוססות חרוזים (עיגולים, סרגל פתוח) עבור 8 דוגמאות זוגיות. ns = לא משמעותי על ידי מבחן T זוגי. (B) ספירת התאים הכוללת עבור דגימות שעובדו באמצעות שיפוע צפיפות (ריבועים, פס כהה) לעומת שיטות מבוססות חרוזים (עיגולים, סרגל פתוח) עבור 8 דוגמאות זוגיות. *P < 0.05 נקבע באמצעות מבחן T זוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השוואה בין שיטות ידניות ואוטומטיות המבוססות על חרוזים. (A) כדאיות תא ממוצעת (± SD) עבור דגימות שעובדו באמצעות ידני (ריבועים, פס כהה) לעומת שיטות אוטומטיות (עיגולים, סרגל פתוח) מבוססות חרוזים עבור 8 דוגמאות זוגיות. ns = לא משמעותי לפי מבחן מאן-ויטני. (B) ספירת התאים הכוללת עבור דגימות שעובדו באמצעות ידני (ריבועים) לעומת שיטות אוטומטיות (מעגלים) מבוססות חרוזים עבור 8 דוגמאות זוגיות. ns = לא משמעותי על ידי מבחן T זוגי. (ג) זמן עיבוד של 8 דגימות שעובדו באמצעות ידני לעומת שיטות אוטומטיות, כולל הפעלה מעשית (סרגל בהיר) ופרקי זמן ללא ידיים (סרגל כהה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הכדאיות והתשואה של PBMC שבודדו מהשיטה מבוססת החרוזים באופן ידני או באמצעות אוטומציה בהתאם לזמן שבין איסוף הדגימות לאחסון PBMC. (A) כדאיות תאים ממוצעת (± 95% CI) עבור דגימות משתתפים שעובדו באמצעות ידני (סרגל כהה) לעומת שיטות אוטומטיות (בר פתוח) מבוססות חרוזים. טבלה המפרטת את מספרי המשתתפים. ns = לא משמעותי. na = לא ישים. *p < 0.05 לפי מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. (B) ספירת התאים הכוללת עבור דגימות משתתפים שעובדו באמצעות ידני (פס כהה) לעומת שיטות אוטומטיות (בר פתוח) מבוססות חרוזים. טבלה המפרטת את מספרי המשתתפים. ns = לא משמעותי. na = לא ישים. *p < 0.05 לפי מבחן ההשוואה המרובה של Tukey. אין ערך עבור יום 10 אוטומטי מכיוון שהמספר המשוכפל נמוך מ- 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: איור של התאוששות אחוזי תאים דיפרנציאליים עם שיפוע צפיפות ושיטות מבוססות חרוזים. האחוז חושב באמצעות ספירת תאים מוחלטת לפני בידוד בדם שלם ותרחיף תאים לאחר בידוד בשיטת שיפוע צפיפות (ריבועים, סרגל כהה) ושיטה מבוססת חרוזים (עיגולים, סרגל פתוח) (n = 8). ns = לא משמעותי, ו- *p < 0.05 כפי שנקבע על ידי מבחן t לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: פרוטוקול שיפוע צפיפות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: הכנת 0.1 M EDTA, pH 8.0 ב- PBS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: הליכים מפורטים שבוצעו להפקת הנתונים המייצגים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.