הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירת פרופיל pH לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66900

⸱

5 ביולי 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology & Cell Biology, Montana State University, 2Department of Physics, Boston University

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות pH באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמה אנושית באמצעות מיקרואלקטרודות לאפיון מרחבי-זמני של פיזיולוגיה תוך-לומינלית.

תקציר

אופטימיזציה ואפיון מפורט של מודלים אורגנואידים במערכת העיכול דורשים שיטות מתקדמות לניתוח הסביבה הלומינלית שלהם. מאמר זה מציג שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה למדידה מדויקת של pH בתוך הלומינה של אורגנואידי קיבה אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרואלקטרודות מבוקרות מיקרומניפולטור. מיקרואלקטרודות ה- pH זמינות באופן מסחרי ומורכבות מקצות זכוכית משופעים בקוטר 25 מיקרומטר. לצורך מדידות, מיקרואלקטרודת ה- pH מתקדמת ללומן של אורגנואיד (>200 מיקרומטר) התלוי במטריג'ל, בעוד אלקטרודת ייחוס מונחת שקועה בתווך שמסביב בלוח התרבית.

באמצעות מיקרואלקטרודות כאלה לפרופיל אורגנואידים שמקורם בגוף הקיבה האנושי, אנו מראים כי pH לומינלי עקבי יחסית בכל תרבית היטב ב~7.7 ± 0.037 וכי ניתן להשיג מדידות רציפות במשך מינימום של 15 דקות. בכמה אורגנואידים גדולים יותר, המדידות חשפו שיפוע pH בין משטח האפיתל לבין הלומן, מה שמרמז על כך שניתן להשיג מדידות pH באורגנואידים ברזולוציה מרחבית גבוהה. במחקר קודם, מיקרואלקטרודות שימשו בהצלחה למדידת ריכוזי חמצן לומינלי באורגנואידים, והדגימו את הרבגוניות של שיטה זו לניתוח אורגנואידים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי חשוב לאפיון פונקציונלי של המרחב הלומינלי המורכב בתוך אורגנואידים תלת-ממדיים.

מבוא

אורגנואידים – מבנים רב-תאיים זעירים שמקורם בתאי גזע – חוללו מהפכה ביכולתנו לחקור את הפיזיולוגיה האנושית ומתחילים להחליף מודלים של בעלי חיים, אפילו במסגרות רגולטוריות1. מאז התיאור הראשוני של אורגנואידים במעיים על ידי Sato et al. בשנת 2009, טכנולוגיית אורגנואידים הפכה פופולרית מאוד2. מספר רב של מחקרים אפיינו את ההרכב והתפקוד התאי של מודלים אורגנואידים בפירוט רב 3,4,5,6. עם זאת, המרחב המואר של מבנים רב-תאיים תלת-ממדיים אלה נותר במידה רבה בלתי מוגדר 7,8. לומן הוא החלל המרכזי של אורגנואידים שמקורם ברקמות ריריות המוקף בחלקים אפיים של תאי אפיתל מקוטבים. מכיוון שהפרשת התאים והבליעה מתרחשות בעיקר על פני השטח של האפיתל האפיקאלי, המיקרו-סביבה הלומינלית של אורגנואידים נשלטת על ידי תהליכים פיזיולוגיים חשובים אלה. מודלים אורגנואידים הנמצאים בשימוש כיום מדגימים שינויים בדפוסי איתות תאים, גבעול כללי, שיפועי ריכוז מטבוליטים ותנאי סביבה9. הבנת הפיזיולוגיה הלומינלית של אורגנואיד נחוצה אפוא למידול מדויק של תפקוד איברים ופתולוגיה. למרבה הצער, חוסר הנגישות היחסי של לומן מעכב באופן משמעותי ניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית באורגנואידים תלת ממדיים10.

היכולת לבחון פרופילי pH חשובה במיוחד בקיבה, הידועה לשמצה בכך שיש לה את שיפוע הפרוטונים התלול ביותר בגוף, הנע בין בערך 1-3 בלומן, לכמעט נייטרלי באפיתל 11,12,13. עדיין קיים פער משמעותי בהבנתנו את התחזוקה המיקרוסקולית של שיפוע ה-pH בקיבה, ואת הרלוונטיות של מודלים אורגנואידים בשחזור הסביבה הדינמית הזו על פני שכבת ריר הקיבה. גישות מסורתיות לניתוח pH אורגנואידי כללו שימוש בצבעים רגישים ל- pH, שיכולים להיות אינדיקטורים פלואורסצנטיים או קולורימטריים. McCracken et al. השתמשו בהזרקה לומינלית של SNARF-5F-a ratiometric pH אינדיקטור לתוך אורגנואידים כדי לנתח ירידה ב- pH לומינלי בתגובה לטיפול בהיסטמין. צבעים כאלה יכולים להיות משולבים במדיה התרבותית, מה שמאפשר ניטור בזמן אמת ולא פולשני של pH. לא רק שצבעים רגישים ל-pH דורשים שלבי כיול מורכבים התורמים לאמינות ודיוק ירודים במדידות, אלא שצבעים כאלה גם נוטים לפעול בתוך טווחי זיהוי ספציפיים שעשויים שלא לייצג את טווח החומציות המלא בתוך המיקרו-סביבה המעניינת14,15. זה יכול להיחשב סביר, עם זאת, להשתמש בצבעי אינדיקטור עבור ניסויים מאששים. פותחו גם ננו-חיישנים אופטיים המשתמשים בגישות פלואורסצנטיות מבוססות אופטודה וחישת pH; עם זאת, טכניקות חישה כאלה דורשות הדמיה מיקרוסקופית והן רגישות גם לפוטו-הלבנה, פוטוטוקסיות, כמו גם הטיית הדמיה16,17. בנוסף, לברוקס ועמיתיו יש לוחות רב-באר מודפסים בתלת-ממד המכילים מיקרואלקטרודות שעליהן ניתן לצפות אורגנואידים18. גישה זו, עם זאת, אינה מאפשרת מדידות ישירות בתוך לומן אורגנואידים.

מדידות pH מבוססות אלקטרודות יכולות להשיג דיוק משופר בהשוואה לשיטות אחרות, כמו גם לספק ניטור pH בזמן אמת. בנוסף, אלקטרודות pH המותקנות על מיקרומניפולטורים מאפשרות רזולוציה מרחבית מעולה של מדידות pH מכיוון שניתן לשלוט היטב במיקום המדויק של קצה האלקטרודה. זה מאפשר את הגמישות הגבוהה ביותר האפשרית ויכולת שחזור בניתוחים של מודלים אורגנואידים. האלקטרודות המשמשות כאן הן מיקרואלקטרודות pH ממוזערות הפועלות על בסיס דיפוזיה של פרוטונים דרך זכוכית pH סלקטיבית המקיפה חוט פלטינה דק. המיקרואלקטרודה מחוברת לאלקטרודת ייחוס חיצונית Ag-AgCl ולאחר מכן מחוברת למטר מיליוולט בעל עכבה גבוהה. הפוטנציאל החשמלי בין שני קצות האלקטרודות כאשר הם שקועים באותה תמיסה ישקף את רמת החומציות של התמיסה19. מערכות מיקרופרופילינג כאלה שימשו בניתוח מטבולי של ביופילמים 20,21, אצות פלנקטוניות22, דגימות כיח אנושי23, ואפילו בספרואידים של תאי גזע מזנכימליים24. הן המעבדה שלנו והן מרפי ועמיתיו השתמשו בעבר במיקרואלקטרודות O2 מבוקרות מיקרומניפולטור כדי להעריך את ריכוזי החמצן בחללים הלומינליים של אורגנואידים. מרפי ועמיתיו שילבו שיטה זו עם מודלים מתמטיים כדי לחשוף שיפוע חמצן בתוך הספרואידים שלהם. הקבוצה שלנו הצליחה למצוא רמות חמצן לומינליות מופחתות באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמות, בהשוואה למטריצה החוץ-תאית25 שמסביב.

כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת לפרופיל מיקרואלקטרודות ידני של ה- pH הלומינלי באורגנואידים כדוריים במערכת העיכול שתאפשר הבנה פיזיולוגית משופרת של המיקרו-סביבה הלומינלית המורכבת שלהם. אנו צופים כי טכניקה זו תוסיף ממד חדש לחקר הפיזיולוגיה של אורגנואידים באמצעות מדידות בזמן אמת ברזולוציה גבוהה של רמות pH בקנה מידה מיקרו. יתר על כן, ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול הבא לניתוח של O2, N2O, H2, NO, H2S, חמצון-חיזור וטמפרטורה בסוגים שונים של מודלים אורגנואידים. פרופיל פיזיולוגי משמש ככלי רב ערך לאופטימיזציה של תנאי תרבית אורגנואידים כדי לחקות טוב יותר בסביבות in vivo , ובכך לשפר את הרלוונטיות והתועלת של מודלים אורגנואידים במחקר ביו-רפואי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה דורש אורגנואידים תלת-ממדיים בקוטר של לפחות 200 מיקרומטר, בעלי לומן מובחן ומוטמעים במטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ECM, למשל, Matrigel). רקמות קיבה אנושיות לגזירת אורגנואידים התקבלו באישור מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מונטנה סטייט והסכמה מדעת מחולים שעברו אנדוסקופיה עליונה ב- Bozeman Health (פרוטוקול # 2023-48-FCR, ל- D.B.) או כדגימות פטורות מכריתת קיבה שלמה או שרוול מהמחלף הלאומי לחקר מחלות (פרוטוקול #DB062615-EX). מידע על קווי האורגנואידים ומספרי המעבר ששימשו למחקר זה מופיע בטבלה 1, והרכב המדיה מופיע בטבלה 2. עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר ליצירה ותחזוקה של קווי אורגנואידים במערכת העיכול 6,26,27.

1. הכנת אורגנואידים בקיבה אנושית לפרופיל pH

  1. ליזום ולתחזק תרביות אורגנואידים בקיבה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. שמור על אורגנואידים על לוחות של 24 בארות במדיית התפשטות של 500 מיקרוליטר לכל באר (טבלה 2). המעבר קבע קווי אורגנואידים כל 5-7 ימים, ועבר לצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ כהכנה לניסויי פרופיל pH.
    הערה: תרביות אורגנואידים עבור הניסויים שלנו נגזרות מתכשירי בלוטת קיבה, המתקבלים מרקמה בוגרת כמתואר לעיל. אנו משתמשים בשיטת עיכול רקמת קולגנאז כדי לבודד בלוטות אלה לפני שהן מושעות ב- ECM, כפי שתואר קודם לכן 25,28,29.
  2. מתרביות אורגנואידים הגדלות באופן פעיל במעברים 1-15, בחרו בארות המכילות לפחות 100 אורגנואידים (כ-2 מיליון תאים) בקטרים שבין 200 ל-700 מיקרומטר לצורך העברה והרחבה על צלחות פטרי בקוטר 3.5 מ"מ.
  3. בעת הכנת אורגנואידים לציפוי (שלבים 1.4-1.8), אפשרו למטריקס חוץ-תאי (ECM) להפשיר על קרח במשך 45 דקות לפחות. יש לשמור על ECM על קרח לאורך כל פרוטוקול זה כדי למנוע ג'לציה. מחממים מראש את צלחות תרבית התאים על ידי הצבתם באינקובטור 37°C, 5% CO2 .
  4. הסר את המדיה מהבארות וקצור את תרביות האורגנואידים בקיבה על ידי הזרקת PBS קר כקרח על כל טיפת ECM וגירוד הג'ל עם קצה פיפטה P1000. פיפטה PBS עם קטעי ECM המכילים אורגנואידים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה הצינור ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. קטעי ECM המכילים את האורגנואידים ייראו כשכבה בתחתית הצינור. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והפיפטה 350 μL של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך כל צינור, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לדגור על הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
  6. לאחר הדגירה עם טריפסין-EDTA, יש להוסיף 600 μL של DMEM קר כקרח עם פניצילין/סטרפטומיצין לכל צינור ופיפטה נמרצת מעלה ומטה לפחות פי 40. צנטריפוגה ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נאנט. כדי להגדיר תרביות למדידות pH, השהה מחדש את כדורית התא ב-ECM נוזלי וקר כקרח ביחס של 1:4 v/v בין גלולת אורגנואיד ל-ECM לצורך ציפוי.
  7. עבור כל דגימה, צלחת 40 μL של ECM נוזלי המכיל שברי אורגנואידים/אורגנואידים בקו אופקי דק לאורך קוטר צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ.
    הערה: חלוקת הג'ל על הצלחת בקו במקום טיפה עגולה מאפשרת גישה קלה יותר לאורגנואידים בודדים על ידי דילול התרבית.
  8. אפשר את הג'ל פילמרי במשך 15-30 דקות; לאחר מכן, להוסיף בזהירות 2 מ"ל של מדיה הרחבת אורגנואיד לצלחת על ידי pipetting לאורך קצה הבאר כדי למנוע הפרעה הג'ל.
  9. החלף מדיה אחת ליומיים. המתינו 4-8 ימים למינימום של 10 אורגנואידים לגדול לקוטר מינימלי של 400 מיקרומטר.
  10. כדי להמשיך בניסוי פרופיל pH, ודא שכל תרבית מכילה לפחות 10 אורגנואידים העונים על הקריטריונים הבאים: >קוטר 200 מיקרומטר, מראה בריא (מעט חומר כהה נראה בתוך אורגנואידים שנצפו במיקרוסקופ שדה בהיר), ולא צפוף על ידי אורגנואידים אחרים.

2. פריקה וכיול של מיקרואלקטרודות

הערה: כדי לאפשר מדידות בקנה מידה מיקרומטרי, נעשה שימוש באלקטרודת ייחוס נפרדת בנוסף למיקרואלקטרודת חיישן ה- pH במקום להשתמש בעיצוב משולב (ולכן מגושם יותר). גם מיקרואלקטרודת pH וגם אלקטרודת ייחוס חייבות להיות מאוחסנות רטובות. אין לאפשר חשיפה לאוויר למשך יותר מ-10 דקות בכל פעם. קבע את גודל העצה המתאים עבור היישום. כאן, השתמשנו במיקרואלקטרודת pH פוטנציומטרית עם קוטר קצה משופע של 25 מיקרומטר.

  1. כאשר המיקרואלקטרודה עדיין בצינור ההגנה שלה, בדוק חזותית את הקצה עבור כל נזק.
  2. חבר את אלקטרודת הייחוס לכבל אלקטרודת ה- pH באמצעות המחבר. לאחר מכן, חברו את המיקרואלקטרודה למגבר ואת המגבר למחשב מוארק באמצעות התוכנה באמצעות כבל USB (איור 1A).
  3. מלא שני צינורות חרוטי 50 מ"ל 2/3 עם 70% אתנול ו deionized H2O (diH2O). הניחו את המיקרואלקטרודה ואת אלקטרודת הייחוס בצינור diH2O, וודאו ששני הקצוות נראים שקועים לפחות 1 ס"מ בנוזל.
    הערה: ניתן להשתמש בכוסות גבוהות גם לצעד זה ולצעדים דומים.
  4. אפשר לאלקטרודות להתאזן למשך ~10 דקות.
    הערה: ניתן גם להשהות את ההליך בשלב זה ולחדש אותו מאוחר יותר מכיוון שניתן לאחסן את האלקטרודות ב- diH2O.
  5. בזמן שהאלקטרודות מתאזנות, פתח את התוכנה (סמל אדום) בתחנת העבודה של המחשב. תחת הכרטיסיה הגדרות, ודא שהתיבה שליד המיקרואלקטרודה מסומנת, ומציינת שהיא מחוברת כראוי ומזוהה על-ידי התוכנה. לחץ על התחל ניסוי בפינה השמאלית העליונה של החלון והזן את שם הקובץ והיעד הרצויים. בחלון הגדרות כיול וניסוי של חיישנים , לחץ על נקה את כל הנקודות כדי להכין את התוכנה לכיול חדש.
  6. מלא שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל 2/3 במאגרי כיול pH 4.01 ו- pH 9.21. ייבשו בעדינות את צינורית המגן ואת אלקטרודת הייחוס בעזרת מגבון מעבדה עדין.
  7. החל מהאלקטרודות במאגר pH 4.01, הזן 4.01 כערך ה- pH הידוע. לאחר שקריאת mV התייצבה, בחר נקודת הוספה. אשר שהאות יציב ב~380 mV. לאחר הוספת הנקודה, הניחו את שתי האלקטרודות בחזרה ב-diH2O כדי לשטוף, ואז ייבשו שוב.
  8. חזור על השלב הקודם עם מאגר 9.21 ולחץ על הוסף נקודה כאשר האות יציב (~ 83 mV). בדוק שהמיקרואלקטרודות מגיבות באופן ליניארי בין pH 4.01 ל- 9.21; לכן, יש צורך בעקומת כיול דו-נקודתית בלבד. ודא כי הקו המתקבל בין נקודות אלה יש שיפוע שלילי של 50-70 mV / pH יחידה. לחץ על שמור והשתמש בכיול.
    הערה: כעת אתה מוכן להתחיל להקליט מדידות30.

3. פרופיל pH של אורגנואידים קיבה אנושיים

הערה: הפרוטוקול הבא מתואר עבור משתמש ימני. התראה: הפוך את כל אפשרויות החיסכון בחשמל במחשב ללא זמינות מכיוון שהמדידות המתמשכות יופרעו אם המחשב ייכנס למצב שינה.

  1. הרכיבו מעמד טבעתי עם מהדק בצד שמאל של סטריאומיקרוסקופ כדי להחזיק את אלקטרודת הייחוס. מקמו מיקרומניפולטור מחובר למעמד מעבדה כבד בצד ימין של המיקרוסקופ (איור 1A).
  2. הסר בזהירות את המיקרואלקטרודה ממארז ההגנה שלה על ידי הנחתה שטוחה על הספסל ומשיכת המארז בתנועה מהירה ומהירה.
    זהירות: המיקרואלקטרודות שבירות להפליא ויש להקפיד להבטיח שהקצה לא יבוא במגע עם חומר קשיח ומוצק. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצע מדידות על ספסל יציב ללא ציוד שעלול לגרום לרטט של הספסל או לתזוזה לא רצויה של האלקטרודות.
  3. הרכיבו את המיקרואלקטרודה על מיקרומניפולטור וסדרו את הסטריאוסקופ והמיקרומניפולטור כך שהמיקרואלקטרודה תוכל להתקדם לעבר צלחת התרבית מבלי לפגוע במטרה או בחלקים אחרים של המיקרוסקופ.
  4. מקמו את צלחת התרבית שמכילה את האורגנואידים כך שתהיה להם הדמיה נאותה של האורגנואיד הראשון שאמור להיות בפרופיל (איור 1B).
  5. אבטחו קלות את אלקטרודת הייחוס למהדק שעל מעמד הטבעת משמאל לסטריאוסקופ. מקם את אלקטרודת הייחוס כך שהיא תישען בתווך המקיף את ה-ECM. דאגו לוודא שזה לא ישבש את האורגנואידים כאשר הבמה מועברת בין מדידות.
  6. בהסתכלות ישירה על צלחת התרבית (לא לתוך המיקרוסקופ), מקדמים את קצה המיקרואלקטרודה עד שהיא שקועה מספיק במדיה. תחת הכרטיסייה אוגר נתונים בתוכנה, לחץ על לחצן התחל (משולש בודד המצביע ימינה) כדי להתחיל בהקלטה. ודא שתיבת הסימון מכויל נבחרה בצד ימין של המסך.
    הערה: אפשר ~10 שניות לכל קריאה להתייצב לפני ההתקדמות לאזור הבא.
  7. לפני הכניסה ל-ECM, ודא שקצה האלקטרודה גלוי מתחת למיקרוסקופ ושהוא ממוקם כדי להתקדם באופן ליניארי לעבר האורגנואיד הראשון המעניין. מקדמים באיטיות את האלקטרודה לתוך הג'ל, מבלי ליצור מגע עם אורגנואידים. רשום לפחות שלוש קריאות pH וחשב את הממוצע.
  8. מקמו את המיקרואלקטרודה כך שתהיה מוכנה להתקדם לעבר האורגנואיד הראשון המעניין לאורך הציר בניצב לפני השטח. אפשרו לאלקטרודה לבצע כניסה קלה על משטח האפיתל מבלי לחדור (איור 1C).
    הערה: שלב זה יספק גם תובנה אם האורגנואיד יישאר במקומו או אם הוא עשוי לנוע בחופשיות רבה יותר ב- ECM.
  9. בתנועה מהירה אחת, קדם את המיקרואלקטרודה לתוך האורגנואיד. אם האורגנואיד נע סביב המיקרואלקטרודה או מתרחק, נסו זווית מעט שונה, או גבו אותו כנגד אורגנואיד אחר או שפת הפלסטיק המקיפה את תחתית הזכוכית המכסה של המנה. מדוד את ה- pH הלומינלי (שלוש פעמים בודדות) של 10 אורגנואידים שונים עבור כל תנאי ניסוי. בסיום הקלטת המדידות, לחץ על לחצן העצירה הריבועי.
    זהירות: הערך את קוטר האורגנואיד כדי להחליט כמה רחוק לקדם את האלקטרודה לתוך לומן האורגנואידים, תוך זהירות לא לחדור דרכו. לקבלת דיוק רב יותר, מדדו את הקוטר באמצעות תוכנת המצלמה של המיקרוסקופ, אם זמינה. הערה: אם קצה המיקרואלקטרודה הופך להיות מצופה באופן ניכר בפסולת לאחר מדידה אחת או יותר, שטפו את המיקרואלקטרודה בתמיסת דיסוציאציה של תאים, PBS, EtOH ולאחר מכן diH2O לפני שתמשיכו.

4. פרופיל ממונע (אופציונלי)

הערה: אפשרות זו דורשת מיקרומניפולטור המורכב על שלב מנוע מכני, אשר נשלט בסופו של דבר על ידי תוכנת מחשב באמצעות בקר מנוע31.

  1. פתח את תוכנת יצירת פרופיל (סמל חום) והתחל ניסוי חדש תחת הכרטיסיה פרופיל.
  2. ההגדרות עבור ציר z יזהו באופן אוטומטי מנוע כאשר מנגנון מנוע מחובר כראוי.
    הערה: התנועה בכיווני x ו- y עדיין נשלטת באופן ידני עם הגדרה זו.
  3. אתר את הכרטיסיה אינטראקציה פרופיל30. לפני שתגיעו למתחילים, ודאו שניתן לעבור במהירות להתבוננות בעינית המיקרוסקופ כדי להבטיח כניסת אורגנואיד במרחק הרצוי. עבור אל הגדרות פרופיל ובצע את הפעולות הבאות:
    1. ציין שמרחק ההתחלה הוא 0 מיקרומטר.
      זהירות: אם קליפת האפיתל קשה במיוחד באורגנואיד נתון, האורגנואיד עלול להידחף הצידה או להתעוות במקום לחדור. אם הדחיפה היא המקרה, המשך להתקדם באלקטרודה אך שים לב לנקודה שבה מתרחשת הכניסה, מכיוון שהתוכנה אינה יכולה להקליט זאת באופן אוטומטי.
    2. אם לשפוט את גודל האורגנואיד הנבדק, יש לציין מרחק קצה שאינו עולה על 3/4 דרך הקוטר המשוער של אורגנואיד.
      הערה: שלב מסוים זה נועד למנוע נזק לקצה האלקטרודה.
    3. ציין את גודל המדרגה הרצוי – 100 מיקרומטר כפי שמוצג באיור 2E. ודא שגודל המדרגה המינימלי תואם לגודל קצה האלקטרודה (לדוגמה, 25 מיקרומטר עבור קצה אלקטרודה pH-25 של 25 מיקרומטר).
    4. ציין מיקום בטוח שאליו יחזיר המנוע את קצה האלקטרודה בין פרופילים.
      הערה: זה צריך להיות גובה נוח מעל הדגימה (מחוץ לאורגנואיד) שבו ניתן להזיז את החיישן בבטחה הצידה בכיווני x ו- y באמצעות המיקרומניפולטור הידני. השאר את זווית החיישן בהגדרת ברירת המחדל שלו.
    5. כדי לאפשר לאלקטרודה להתאזן, ציין לפחות 3 שניות תחת המתן לפני מדידה.
    6. הגדר את תקופות המדידה לשנייה אחת לפחות. המדידות בתקופה זו יהיו ממוצעות.
      הערה: בעת ביצוע מדידות בסביבה עתירת רעש חשמלי, כדאי לציין פרק זמן ארוך יותר.
    7. הגדר את ההשהיה בין (ים) לשנייה אחת לפחות.
    8. הגדר את מספר העותקים המשוכפלים המועדף למדידה בכל עומק.
    9. התחל להקליט מדידות על ידי לחיצה על התחל לחצן.

5. ניקוי אלקטרודות

  1. הניחו את האלקטרודה לניקוי בחזרה בצינור ההגנה שלה.
  2. שטפו את האלקטרודות עם diH2O לאחר המדידות.
  3. שטפו את האלקטרודות עם 70% אתנול למשך מספר דקות.
  4. שטפו את האלקטרודות עם חוצץ pH 4.01.
  5. שטפו את האלקטרודות פעם נוספת עם diH2O לפני שתמשיכו במדידות.

6. אחסון אלקטרודות

הערה: יש לאחסן את שתי האלקטרודות בטמפרטורת החדר במקום עם פעילות נמוכה, בטוח מפני נזק מקרי.

  1. לאחר השימוש במיקרואלקטרודת ה- pH, החלק אותה בזהירות אופקית בחזרה לצינור ההגנה שלה (מחליק לאורך ספסל המעבדה לתמיכה אופקית).
  2. מחזיקים את המיקרואלקטרודה זקופה (קצה מכוון כלפי מעלה), ממלאים בעדינות את צינור ההגנה במים סטריליים. חבר את צינור ההגנה עם הפקק שאיתו הגיעה האלקטרודה. ודא שכל החורים בצינור ההגנה אטומים בסרט חשמלי. יש לאחסן בקופסה חסינת ניפוץ עד לשימוש הבא.
    הערה: מומלץ להשתמש בקופסה המקורית שבה הגיעו האלקטרודות מכיוון שהיא תכיל תוספות מגן שנועדו לשמור על אלקטרודות במקומן בעת אחסונן.
  3. אחסן את אלקטרודת הייחוס בכד או גליל מדורג מלא בתמיסת KCl 3M. מכסים את הגליל המדורג/מדורג בפרפילם כדי למנוע אידוי של התמיסה.
    הערה: אם משתמשים בצילינדר מדורג, מומלץ להצמיד אותו לספסל המעבדה עם נייר דבק כדי למנוע תנועה מקרית.

7. הזרקת מתיל אדום (אופציונלי)

הערה: אדום מתיל הוא צבע אינדיקטור קולורימטרי שניתן להשתמש בו כדי לאמת את מדידות המיקרואלקטרודות.

  1. מלאו נימי זכוכית בנפח 2 מיקרוליטר בשמן מינרלי סטרילי, טענו אותו על מזרק אוטומטי nL הנשלט על ידי מיקרומניפולטור, ולאחר מכן מלאו אותו בתמיסה המכילה 0.02% מתיל אדום ו-150 מילימטר הידרוכלוריד.
    הערה: התמיסה צריכה להופיע אדומה/ורודה בזמן שהיא בתוך הנימים בגלל החומציות של HCl.
  2. להזריק אורגנואידים בקוטר של לפחות 300 מיקרומטר עם 9.2 μL של תמיסה25.
  3. צלמו תמונות או וידאו באמצעות מצלמה המותאמת לסטריאומיקרוסקופ (איור 2G).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרשת חומצה היא פונקציה מכרעת של הקיבה האנושית. עם זאת, עד כמה ניתן למדל הפרשת חומצה באורגנואידים היא עדיין נושא לוויכוח 6,32,33,34. לכן פיתחנו את הפרוטוקול המפורט לעיל כדי למדוד במדויק את ייצור החומצה באורגנואידים בקיבה. יש לציין כי השתמשנו באורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים ללא גירוי שגודלו בתרבית בתנאי התפשטות סטנדרטיים שעברו מספר פעמים, מה שהוביל לאובדן תאים קודקודיים35

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גישה מוגבלת למרחב הלומינלי של אורגנואידים הגבילה מאוד את הבנתנו את הדינמיקה הפיזיולוגית של מיקרו-סביבה זו. כלי אמין לניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית ירחיב את יכולתנו למנף אורגנואידים כמודלים חוץ גופיים לפיזיולוגיה, פרמקולוגיה וחקר מחלות. אורגנואידים הם מודלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עם פוטנציאל נוסף לשכפל שונות גנטית בתוך האוכלוסייה האנושית. שיטות קיימות למדידת pH בתוך לומן אורגנואיד השתמשו בצבעים רגישים ל- pH או ננו-חלקיקים, שיטות שלעתים קרובות חייבות להיות משולבות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר אלן לאושנור, ד"ר פיל סטיוארט ובנגיסו קיליק על עבודתם הקודמת ועל עזרתם במיקרו-חיישנים O2 ; אנדי סברל להכשרה בתרבית אורגנואידים ומיקרומניפולציה; לקסי בורצ'אם לסיוע בתרבות אורגנואידים, הכנת מדיה, רישום נתונים וארגון; וד"ר סוזי קוהוט לייעוץ כללי באלקטרופיזיולוגיה. ברצוננו להודות לד"ר היידי סמית על עזרתה בדימות ולהודות למרכז להנדסת ביופילם מתקן הדמיה ביולוגית באוניברסיטת מונטנה, הנתמך על ידי מימון מתוכנית MRI של הקרן הלאומית למדע (2018562), קרן הצדקה M.J. Murdock (202016116), משרד ההגנה האמריקאי (77369LSRIP &W911NF1910288), ומתקן הננוטכנולוגיה במונטנה (חבר NNCI הנתמך על ידי NSF Grant ECCS-2025391).

תודה מיוחדת לכל צוות יוניסנס שאיפשר עבודה זו, במיוחד לד"ר אנדרו קרסקוס, ד"ר לורה וודס, ד"ר לארס לארסן, ד"ר טייג' דלסגארד, ד"ר ליין דאוגארד, ד"ר קארן מגארד ומטה גמלגארד. המימון למחקר שלנו ניתן על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01 GM13140801 (D.B., R.B.) ו- UL1 TR002319 (K.N.L), ופרס הרחבת מחקר מהמשרד למחקר ופיתוח כלכלי באוניברסיטת מונטנה (D.B). איור 1A נוצר באמצעות BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3 M KClUnisense
5 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,CellTreat229091B
10 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,CellTreat229092B
15 מ"ל צינור צנטריפוגה - מתלה קצף,CellTreat229412
צלחת תרבית רקמות 24 באר,CellTreat229124
25 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,CellTreat229093B
צלחת 35 מ"מ | מס' 1.5 כיסוי | קוטר זכוכית 20 מ"מ | MatTekP35G-1.5-20-C
50 מ"ל - מתלה קצף,CellTreat229422
70% אתנולBP82031GALBP82031GAL
70 μ m מסננת תאים, עטופה בנפרד, CellTreat סטרילי229483 
1,000 ומיקרו; L אורך מורחב קצות פיפטה עם שמירה נמוכה, מתלה,CellTreatסטרילי 229037
תמיסת אמפוטריצין B (Fungizone)HyClone Laboratories, IncSV30078.01
ארון בטיחות ביולוגיתNuaire NU-425-600Class II סוג A/B3
סרום בקר אלבומיןפישר ביוריאגנטיםBP1605-100
תמיסת התאוששות תאיםקורנינג354253תמיסת דיסוציאציה של תאים
DMEM/F-12 (DMEM מתקדם)Gibco12-491-015
השינוי של דולבקו של מדיום הנשרים (DMEM)פישר סיינטיפיק15017CV
סרום בקר עובריHyClone Laboratories, IncSH30088
G418 סולפטקורנינג30-234-CR
ג'נטמיצין סולפטIBI ScientificIB02030
HEPES, חומצה חופשיתCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2 ב-1 14 אינץ' מחשב נייד Intel Core i3HPM03840-001
חומצה הידרוכלוריתפישר מדעיA144C-212
חממהפישר סיינטיפיק11676604
אייפון 12 מצלמהאפל
L-גלוטמיןCytivaSH3003401
גדול קימברלי-קלארק מקצועי Kimtech Science Kimwipes מגבים עדינים למשימה, 1 רובדפישר סיינטיפיק34133
M 205 FA סטריאומיקרוסקופLeica
מטריצת ממברנה Matrigel 354234קורנינגCB-40234
MC-1 בקר UniMotorUnisense
מתיל אדום
MM33 מיקרומניפולטורMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000ימני
MS-15 שלב ממונעUnisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204מזרק אוטומטי ננוליטר
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH מיקרואלקטרודותUnisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160תוכנת SensorTrace אינה תואמת למחשבי אפל
אלקטרודה ייחוסUnisenseREF-RM-001652תוכנת SensorTrace אינה תואמת ל מחשבי אפל
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
מתאם מצלמת סמארטפוןGosky
מפרט מעמד מעבדה LSUnisenseLS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, פנול אדוםGibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc  מגרדי תאים מיני 200/PKפישרMCS-200
Y-27632 דיהידרוכלורידTocris Bioscience12-541-0&MICRO
; ערכת כיול חיישניםUnisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 ו-9.21, מנות 20 מ"ל
סטרילי סטרילי סטרילי סטרילי סטרילי צינור צנטריפוגה לא מצופה סטרילי

מקורות

  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188(2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A. Organoids and Mini-organs. Davies, J. A., Lawrence, M. L. , Academic Press. Ch. 1-2 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423(2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801(2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023).
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096(2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353(2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851(2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), e153 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219(2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023).
  31. Microprofiling system user manual. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023).
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), e616 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. Unisense. , Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024).
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פרופיל pH לומינלימיקרו-אלקטרודות pHכיול מיקרו-אלקטרודותאורגנואידים של קיבה אנושיתבקרת מיקרו-מניפולטורהסביבה הלומינלית של האורגנואידמדידת מדרג pHהזרקת מתיל אדוםאפיון תפקודי של אורגנואידים
יצירת פרופיל pH לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.