יצירת פרופיל pH לומינלי באורגנואידים תלת מימדיים במערכת העיכול באמצעות מיקרואלקטרודות

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות pH באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמה אנושית באמצעות מיקרואלקטרודות לאפיון מרחבי-זמני של פיזיולוגיה תוך-לומינלית.

תקציר

אופטימיזציה ואפיון מפורט של מודלים אורגנואידים במערכת העיכול דורשים שיטות מתקדמות לניתוח הסביבה הלומינלית שלהם. מאמר זה מציג שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה למדידה מדויקת של pH בתוך הלומינה של אורגנואידי קיבה אנושיים תלת-ממדיים באמצעות מיקרואלקטרודות מבוקרות מיקרומניפולטור. מיקרואלקטרודות ה- pH זמינות באופן מסחרי ומורכבות מקצות זכוכית משופעים בקוטר 25 מיקרומטר. לצורך מדידות, מיקרואלקטרודת ה- pH מתקדמת ללומן של אורגנואיד (>200 מיקרומטר) התלוי במטריג'ל, בעוד אלקטרודת ייחוס מונחת שקועה בתווך שמסביב בלוח התרבית.

באמצעות מיקרואלקטרודות כאלה לפרופיל אורגנואידים שמקורם בגוף הקיבה האנושי, אנו מראים כי pH לומינלי עקבי יחסית בכל תרבית היטב ב~7.7 ± 0.037 וכי ניתן להשיג מדידות רציפות במשך מינימום של 15 דקות. בכמה אורגנואידים גדולים יותר, המדידות חשפו שיפוע pH בין משטח האפיתל לבין הלומן, מה שמרמז על כך שניתן להשיג מדידות pH באורגנואידים ברזולוציה מרחבית גבוהה. במחקר קודם, מיקרואלקטרודות שימשו בהצלחה למדידת ריכוזי חמצן לומינלי באורגנואידים, והדגימו את הרבגוניות של שיטה זו לניתוח אורגנואידים. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי חשוב לאפיון פונקציונלי של המרחב הלומינלי המורכב בתוך אורגנואידים תלת-ממדיים.

מבוא

אורגנואידים – מבנים רב-תאיים זעירים שמקורם בתאי גזע – חוללו מהפכה ביכולתנו לחקור את הפיזיולוגיה האנושית ומתחילים להחליף מודלים של בעלי חיים, אפילו במסגרות רגולטוריות¹. מאז התיאור הראשוני של אורגנואידים במעיים על ידי Sato et al. בשנת 2009, טכנולוגיית אורגנואידים הפכה פופולרית מאוד². מספר רב של מחקרים אפיינו את ההרכב והתפקוד התאי של מודלים אורגנואידים בפירוט רב 3,4,5,6. עם זאת, המרחב המואר של מבנים רב-תאיים תלת-ממדיים אלה נותר במידה רבה בלתי מוגדר ^7,8. לומן הוא החלל המרכזי של אורגנואידים שמקורם ברקמות ריריות המוקף בחלקים אפיים של תאי אפיתל מקוטבים. מכיוון שהפרשת התאים והבליעה מתרחשות בעיקר על פני השטח של האפיתל האפיקאלי, המיקרו-סביבה הלומינלית של אורגנואידים נשלטת על ידי תהליכים פיזיולוגיים חשובים אלה. מודלים אורגנואידים הנמצאים בשימוש כיום מדגימים שינויים בדפוסי איתות תאים, גבעול כללי, שיפועי ריכוז מטבוליטים ותנאי סביבה⁹. הבנת הפיזיולוגיה הלומינלית של אורגנואיד נחוצה אפוא למידול מדויק של תפקוד איברים ופתולוגיה. למרבה הצער, חוסר הנגישות היחסי של לומן מעכב באופן משמעותי ניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית באורגנואידים תלת ממדיים¹⁰.

היכולת לבחון פרופילי pH חשובה במיוחד בקיבה, הידועה לשמצה בכך שיש לה את שיפוע הפרוטונים התלול ביותר בגוף, הנע בין בערך 1-3 בלומן, לכמעט נייטרלי באפיתל 11,12,13. עדיין קיים פער משמעותי בהבנתנו את התחזוקה המיקרוסקולית של שיפוע ה-pH בקיבה, ואת הרלוונטיות של מודלים אורגנואידים בשחזור הסביבה הדינמית הזו על פני שכבת ריר הקיבה. גישות מסורתיות לניתוח pH אורגנואידי כללו שימוש בצבעים רגישים ל- pH, שיכולים להיות אינדיקטורים פלואורסצנטיים או קולורימטריים. McCracken et al. השתמשו בהזרקה לומינלית של SNARF-5F-a ratiometric pH אינדיקטור לתוך אורגנואידים כדי לנתח ירידה ב- pH לומינלי בתגובה לטיפול בהיסטמין. צבעים כאלה יכולים להיות משולבים במדיה התרבותית, מה שמאפשר ניטור בזמן אמת ולא פולשני של pH. לא רק שצבעים רגישים ל-pH דורשים שלבי כיול מורכבים התורמים לאמינות ודיוק ירודים במדידות, אלא שצבעים כאלה גם נוטים לפעול בתוך טווחי זיהוי ספציפיים שעשויים שלא לייצג את טווח החומציות המלא בתוך המיקרו-סביבה המעניינת^14,15. זה יכול להיחשב סביר, עם זאת, להשתמש בצבעי אינדיקטור עבור ניסויים מאששים. פותחו גם ננו-חיישנים אופטיים המשתמשים בגישות פלואורסצנטיות מבוססות אופטודה וחישת pH; עם זאת, טכניקות חישה כאלה דורשות הדמיה מיקרוסקופית והן רגישות גם לפוטו-הלבנה, פוטוטוקסיות, כמו גם הטיית הדמיה^16,17. בנוסף, לברוקס ועמיתיו יש לוחות רב-באר מודפסים בתלת-ממד המכילים מיקרואלקטרודות שעליהן ניתן לצפות אורגנואידים¹⁸. גישה זו, עם זאת, אינה מאפשרת מדידות ישירות בתוך לומן אורגנואידים.

מדידות pH מבוססות אלקטרודות יכולות להשיג דיוק משופר בהשוואה לשיטות אחרות, כמו גם לספק ניטור pH בזמן אמת. בנוסף, אלקטרודות pH המותקנות על מיקרומניפולטורים מאפשרות רזולוציה מרחבית מעולה של מדידות pH מכיוון שניתן לשלוט היטב במיקום המדויק של קצה האלקטרודה. זה מאפשר את הגמישות הגבוהה ביותר האפשרית ויכולת שחזור בניתוחים של מודלים אורגנואידים. האלקטרודות המשמשות כאן הן מיקרואלקטרודות pH ממוזערות הפועלות על בסיס דיפוזיה של פרוטונים דרך זכוכית pH סלקטיבית המקיפה חוט פלטינה דק. המיקרואלקטרודה מחוברת לאלקטרודת ייחוס חיצונית Ag-AgCl ולאחר מכן מחוברת למטר מיליוולט בעל עכבה גבוהה. הפוטנציאל החשמלי בין שני קצות האלקטרודות כאשר הם שקועים באותה תמיסה ישקף את רמת החומציות של התמיסה¹⁹. מערכות מיקרופרופילינג כאלה שימשו בניתוח מטבולי של ביופילמים ^20,21, אצות פלנקטוניות²², דגימות כיח אנושי²³, ואפילו בספרואידים של תאי גזע מזנכימליים²⁴. הן המעבדה שלנו והן מרפי ועמיתיו השתמשו בעבר במיקרואלקטרודות O₂ מבוקרות מיקרומניפולטור כדי להעריך את ריכוזי החמצן בחללים הלומינליים של אורגנואידים. מרפי ועמיתיו שילבו שיטה זו עם מודלים מתמטיים כדי לחשוף שיפוע חמצן בתוך הספרואידים שלהם. הקבוצה שלנו הצליחה למצוא רמות חמצן לומינליות מופחתות באורגנואידים בקיבה שמקורם ברקמות, בהשוואה למטריצה החוץ-תאית²⁵ שמסביב.

כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת לפרופיל מיקרואלקטרודות ידני של ה- pH הלומינלי באורגנואידים כדוריים במערכת העיכול שתאפשר הבנה פיזיולוגית משופרת של המיקרו-סביבה הלומינלית המורכבת שלהם. אנו צופים כי טכניקה זו תוסיף ממד חדש לחקר הפיזיולוגיה של אורגנואידים באמצעות מדידות בזמן אמת ברזולוציה גבוהה של רמות pH בקנה מידה מיקרו. יתר על כן, ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול הבא לניתוח של O₂, N₂O, H₂, NO, H₂S, חמצון-חיזור וטמפרטורה בסוגים שונים של מודלים אורגנואידים. פרופיל פיזיולוגי משמש ככלי רב ערך לאופטימיזציה של תנאי תרבית אורגנואידים כדי לחקות טוב יותר בסביבות in vivo , ובכך לשפר את הרלוונטיות והתועלת של מודלים אורגנואידים במחקר ביו-רפואי.

פרוטוקול

פרוטוקול זה דורש אורגנואידים תלת-ממדיים בקוטר של לפחות 200 מיקרומטר, בעלי לומן מובחן ומוטמעים במטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ECM, למשל, Matrigel). רקמות קיבה אנושיות לגזירת אורגנואידים התקבלו באישור מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מונטנה סטייט והסכמה מדעת מחולים שעברו אנדוסקופיה עליונה ב- Bozeman Health (פרוטוקול # 2023-48-FCR, ל- D.B.) או כדגימות פטורות מכריתת קיבה שלמה או שרוול מהמחלף הלאומי לחקר מחלות (פרוטוקול #DB062615-EX). מידע על קווי האורגנואידים ומספרי המעבר ששימשו למחקר זה מופיע בטבלה 1, והרכב המדיה מופיע בטבלה 2. עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר ליצירה ותחזוקה של קווי אורגנואידים במערכת העיכול ^6,26,27.

1. הכנת אורגנואידים בקיבה אנושית לפרופיל pH

1. ליזום ולתחזק תרביות אורגנואידים בקיבה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. שמור על אורגנואידים על לוחות של 24 בארות במדיית התפשטות של 500 מיקרוליטר לכל באר (טבלה 2). המעבר קבע קווי אורגנואידים כל 5-7 ימים, ועבר לצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ כהכנה לניסויי פרופיל pH.
   הערה: תרביות אורגנואידים עבור הניסויים שלנו נגזרות מתכשירי בלוטת קיבה, המתקבלים מרקמה בוגרת כמתואר לעיל. אנו משתמשים בשיטת עיכול רקמת קולגנאז כדי לבודד בלוטות אלה לפני שהן מושעות ב- ECM, כפי שתואר קודם לכן 25,28,29.
2. מתרביות אורגנואידים הגדלות באופן פעיל במעברים 1-15, בחרו בארות המכילות לפחות 100 אורגנואידים (כ-2 מיליון תאים) בקטרים שבין 200 ל-700 מיקרומטר לצורך העברה והרחבה על צלחות פטרי בקוטר 3.5 מ"מ.
3. בעת הכנת אורגנואידים לציפוי (שלבים 1.4-1.8), אפשרו למטריקס חוץ-תאי (ECM) להפשיר על קרח במשך 45 דקות לפחות. יש לשמור על ECM על קרח לאורך כל פרוטוקול זה כדי למנוע ג'לציה. מחממים מראש את צלחות תרבית התאים על ידי הצבתם באינקובטור 37°C, 5% CO₂ .
4. הסר את המדיה מהבארות וקצור את תרביות האורגנואידים בקיבה על ידי הזרקת PBS קר כקרח על כל טיפת ECM וגירוד הג'ל עם קצה פיפטה P1000. פיפטה PBS עם קטעי ECM המכילים אורגנואידים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
5. צנטריפוגה הצינור ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. קטעי ECM המכילים את האורגנואידים ייראו כשכבה בתחתית הצינור. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והפיפטה 350 μL של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך כל צינור, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לדגור על הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות.
6. לאחר הדגירה עם טריפסין-EDTA, יש להוסיף 600 μL של DMEM קר כקרח עם פניצילין/סטרפטומיצין לכל צינור ופיפטה נמרצת מעלה ומטה לפחות פי 40. צנטריפוגה ב 200 × גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נאנט. כדי להגדיר תרביות למדידות pH, השהה מחדש את כדורית התא ב-ECM נוזלי וקר כקרח ביחס של 1:4 v/v בין גלולת אורגנואיד ל-ECM לצורך ציפוי.
7. עבור כל דגימה, צלחת 40 μL של ECM נוזלי המכיל שברי אורגנואידים/אורגנואידים בקו אופקי דק לאורך קוטר צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ.
   הערה: חלוקת הג'ל על הצלחת בקו במקום טיפה עגולה מאפשרת גישה קלה יותר לאורגנואידים בודדים על ידי דילול התרבית.
8. אפשר את הג'ל פילמרי במשך 15-30 דקות; לאחר מכן, להוסיף בזהירות 2 מ"ל של מדיה הרחבת אורגנואיד לצלחת על ידי pipetting לאורך קצה הבאר כדי למנוע הפרעה הג'ל.
9. החלף מדיה אחת ליומיים. המתינו 4-8 ימים למינימום של 10 אורגנואידים לגדול לקוטר מינימלי של 400 מיקרומטר.
10. כדי להמשיך בניסוי פרופיל pH, ודא שכל תרבית מכילה לפחות 10 אורגנואידים העונים על הקריטריונים הבאים: >קוטר 200 מיקרומטר, מראה בריא (מעט חומר כהה נראה בתוך אורגנואידים שנצפו במיקרוסקופ שדה בהיר), ולא צפוף על ידי אורגנואידים אחרים.

2. פריקה וכיול של מיקרואלקטרודות

הערה: כדי לאפשר מדידות בקנה מידה מיקרומטרי, נעשה שימוש באלקטרודת ייחוס נפרדת בנוסף למיקרואלקטרודת חיישן ה- pH במקום להשתמש בעיצוב משולב (ולכן מגושם יותר). גם מיקרואלקטרודת pH וגם אלקטרודת ייחוס חייבות להיות מאוחסנות רטובות. אין לאפשר חשיפה לאוויר למשך יותר מ-10 דקות בכל פעם. קבע את גודל העצה המתאים עבור היישום. כאן, השתמשנו במיקרואלקטרודת pH פוטנציומטרית עם קוטר קצה משופע של 25 מיקרומטר.

1. כאשר המיקרואלקטרודה עדיין בצינור ההגנה שלה, בדוק חזותית את הקצה עבור כל נזק.
2. חבר את אלקטרודת הייחוס לכבל אלקטרודת ה- pH באמצעות המחבר. לאחר מכן, חברו את המיקרואלקטרודה למגבר ואת המגבר למחשב מוארק באמצעות התוכנה באמצעות כבל USB (איור 1A).
3. מלא שני צינורות חרוטי 50 מ"ל 2/3 עם 70% אתנול ו deionized H₂O (diH₂O). הניחו את המיקרואלקטרודה ואת אלקטרודת הייחוס בצינור diH₂O, וודאו ששני הקצוות נראים שקועים לפחות 1 ס"מ בנוזל.
   הערה: ניתן להשתמש בכוסות גבוהות גם לצעד זה ולצעדים דומים.
4. אפשר לאלקטרודות להתאזן למשך ~10 דקות.
   הערה: ניתן גם להשהות את ההליך בשלב זה ולחדש אותו מאוחר יותר מכיוון שניתן לאחסן את האלקטרודות ב- diH₂O.
5. בזמן שהאלקטרודות מתאזנות, פתח את התוכנה (סמל אדום) בתחנת העבודה של המחשב. תחת הכרטיסיה הגדרות, ודא שהתיבה שליד המיקרואלקטרודה מסומנת, ומציינת שהיא מחוברת כראוי ומזוהה על-ידי התוכנה. לחץ על התחל ניסוי בפינה השמאלית העליונה של החלון והזן את שם הקובץ והיעד הרצויים. בחלון הגדרות כיול וניסוי של חיישנים , לחץ על נקה את כל הנקודות כדי להכין את התוכנה לכיול חדש.
6. מלא שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל 2/3 במאגרי כיול pH 4.01 ו- pH 9.21. ייבשו בעדינות את צינורית המגן ואת אלקטרודת הייחוס בעזרת מגבון מעבדה עדין.
7. החל מהאלקטרודות במאגר pH 4.01, הזן 4.01 כערך ה- pH הידוע. לאחר שקריאת mV התייצבה, בחר נקודת הוספה. אשר שהאות יציב ב~380 mV. לאחר הוספת הנקודה, הניחו את שתי האלקטרודות בחזרה ב-diH₂O כדי לשטוף, ואז ייבשו שוב.
8. חזור על השלב הקודם עם מאגר 9.21 ולחץ על הוסף נקודה כאשר האות יציב (~ 83 mV). בדוק שהמיקרואלקטרודות מגיבות באופן ליניארי בין pH 4.01 ל- 9.21; לכן, יש צורך בעקומת כיול דו-נקודתית בלבד. ודא כי הקו המתקבל בין נקודות אלה יש שיפוע שלילי של 50-70 mV / pH יחידה. לחץ על שמור והשתמש בכיול.
   הערה: כעת אתה מוכן להתחיל להקליט מדידות³⁰.

3. פרופיל pH של אורגנואידים קיבה אנושיים

הערה: הפרוטוקול הבא מתואר עבור משתמש ימני. התראה: הפוך את כל אפשרויות החיסכון בחשמל במחשב ללא זמינות מכיוון שהמדידות המתמשכות יופרעו אם המחשב ייכנס למצב שינה.

1. הרכיבו מעמד טבעתי עם מהדק בצד שמאל של סטריאומיקרוסקופ כדי להחזיק את אלקטרודת הייחוס. מקמו מיקרומניפולטור מחובר למעמד מעבדה כבד בצד ימין של המיקרוסקופ (איור 1A).
2. הסר בזהירות את המיקרואלקטרודה ממארז ההגנה שלה על ידי הנחתה שטוחה על הספסל ומשיכת המארז בתנועה מהירה ומהירה.
   זהירות: המיקרואלקטרודות שבירות להפליא ויש להקפיד להבטיח שהקצה לא יבוא במגע עם חומר קשיח ומוצק. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצע מדידות על ספסל יציב ללא ציוד שעלול לגרום לרטט של הספסל או לתזוזה לא רצויה של האלקטרודות.
3. הרכיבו את המיקרואלקטרודה על מיקרומניפולטור וסדרו את הסטריאוסקופ והמיקרומניפולטור כך שהמיקרואלקטרודה תוכל להתקדם לעבר צלחת התרבית מבלי לפגוע במטרה או בחלקים אחרים של המיקרוסקופ.
4. מקמו את צלחת התרבית שמכילה את האורגנואידים כך שתהיה להם הדמיה נאותה של האורגנואיד הראשון שאמור להיות בפרופיל (איור 1B).
5. אבטחו קלות את אלקטרודת הייחוס למהדק שעל מעמד הטבעת משמאל לסטריאוסקופ. מקם את אלקטרודת הייחוס כך שהיא תישען בתווך המקיף את ה-ECM. דאגו לוודא שזה לא ישבש את האורגנואידים כאשר הבמה מועברת בין מדידות.
6. בהסתכלות ישירה על צלחת התרבית (לא לתוך המיקרוסקופ), מקדמים את קצה המיקרואלקטרודה עד שהיא שקועה מספיק במדיה. תחת הכרטיסייה אוגר נתונים בתוכנה, לחץ על לחצן התחל (משולש בודד המצביע ימינה) כדי להתחיל בהקלטה. ודא שתיבת הסימון מכויל נבחרה בצד ימין של המסך.
   הערה: אפשר ~10 שניות לכל קריאה להתייצב לפני ההתקדמות לאזור הבא.
7. לפני הכניסה ל-ECM, ודא שקצה האלקטרודה גלוי מתחת למיקרוסקופ ושהוא ממוקם כדי להתקדם באופן ליניארי לעבר האורגנואיד הראשון המעניין. מקדמים באיטיות את האלקטרודה לתוך הג'ל, מבלי ליצור מגע עם אורגנואידים. רשום לפחות שלוש קריאות pH וחשב את הממוצע.
8. מקמו את המיקרואלקטרודה כך שתהיה מוכנה להתקדם לעבר האורגנואיד הראשון המעניין לאורך הציר בניצב לפני השטח. אפשרו לאלקטרודה לבצע כניסה קלה על משטח האפיתל מבלי לחדור (איור 1C).
   הערה: שלב זה יספק גם תובנה אם האורגנואיד יישאר במקומו או אם הוא עשוי לנוע בחופשיות רבה יותר ב- ECM.
9. בתנועה מהירה אחת, קדם את המיקרואלקטרודה לתוך האורגנואיד. אם האורגנואיד נע סביב המיקרואלקטרודה או מתרחק, נסו זווית מעט שונה, או גבו אותו כנגד אורגנואיד אחר או שפת הפלסטיק המקיפה את תחתית הזכוכית המכסה של המנה. מדוד את ה- pH הלומינלי (שלוש פעמים בודדות) של 10 אורגנואידים שונים עבור כל תנאי ניסוי. בסיום הקלטת המדידות, לחץ על לחצן העצירה הריבועי.
   זהירות: הערך את קוטר האורגנואיד כדי להחליט כמה רחוק לקדם את האלקטרודה לתוך לומן האורגנואידים, תוך זהירות לא לחדור דרכו. לקבלת דיוק רב יותר, מדדו את הקוטר באמצעות תוכנת המצלמה של המיקרוסקופ, אם זמינה. הערה: אם קצה המיקרואלקטרודה הופך להיות מצופה באופן ניכר בפסולת לאחר מדידה אחת או יותר, שטפו את המיקרואלקטרודה בתמיסת דיסוציאציה של תאים, PBS, EtOH ולאחר מכן diH₂O לפני שתמשיכו.

4. פרופיל ממונע (אופציונלי)

הערה: אפשרות זו דורשת מיקרומניפולטור המורכב על שלב מנוע מכני, אשר נשלט בסופו של דבר על ידי תוכנת מחשב באמצעות בקר מנוע³¹.

1. פתח את תוכנת יצירת פרופיל (סמל חום) והתחל ניסוי חדש תחת הכרטיסיה פרופיל.
2. ההגדרות עבור ציר z יזהו באופן אוטומטי מנוע כאשר מנגנון מנוע מחובר כראוי.
   הערה: התנועה בכיווני x ו- y עדיין נשלטת באופן ידני עם הגדרה זו.
3. אתר את הכרטיסיה אינטראקציה פרופיל³⁰. לפני שתגיעו למתחילים, ודאו שניתן לעבור במהירות להתבוננות בעינית המיקרוסקופ כדי להבטיח כניסת אורגנואיד במרחק הרצוי. עבור אל הגדרות פרופיל ובצע את הפעולות הבאות:
   1. ציין שמרחק ההתחלה הוא 0 מיקרומטר.
      זהירות: אם קליפת האפיתל קשה במיוחד באורגנואיד נתון, האורגנואיד עלול להידחף הצידה או להתעוות במקום לחדור. אם הדחיפה היא המקרה, המשך להתקדם באלקטרודה אך שים לב לנקודה שבה מתרחשת הכניסה, מכיוון שהתוכנה אינה יכולה להקליט זאת באופן אוטומטי.
   2. אם לשפוט את גודל האורגנואיד הנבדק, יש לציין מרחק קצה שאינו עולה על 3/4 דרך הקוטר המשוער של אורגנואיד.
      הערה: שלב מסוים זה נועד למנוע נזק לקצה האלקטרודה.
   3. ציין את גודל המדרגה הרצוי – 100 מיקרומטר כפי שמוצג באיור 2E. ודא שגודל המדרגה המינימלי תואם לגודל קצה האלקטרודה (לדוגמה, 25 מיקרומטר עבור קצה אלקטרודה pH-25 של 25 מיקרומטר).
   4. ציין מיקום בטוח שאליו יחזיר המנוע את קצה האלקטרודה בין פרופילים.
      הערה: זה צריך להיות גובה נוח מעל הדגימה (מחוץ לאורגנואיד) שבו ניתן להזיז את החיישן בבטחה הצידה בכיווני x ו- y באמצעות המיקרומניפולטור הידני. השאר את זווית החיישן בהגדרת ברירת המחדל שלו.
   5. כדי לאפשר לאלקטרודה להתאזן, ציין לפחות 3 שניות תחת המתן לפני מדידה.
   6. הגדר את תקופות המדידה לשנייה אחת לפחות. המדידות בתקופה זו יהיו ממוצעות.
      הערה: בעת ביצוע מדידות בסביבה עתירת רעש חשמלי, כדאי לציין פרק זמן ארוך יותר.
   7. הגדר את ההשהיה בין (ים) לשנייה אחת לפחות.
   8. הגדר את מספר העותקים המשוכפלים המועדף למדידה בכל עומק.
   9. התחל להקליט מדידות על ידי לחיצה על התחל לחצן.

5. ניקוי אלקטרודות

1. הניחו את האלקטרודה לניקוי בחזרה בצינור ההגנה שלה.
2. שטפו את האלקטרודות עם diH₂O לאחר המדידות.
3. שטפו את האלקטרודות עם 70% אתנול למשך מספר דקות.
4. שטפו את האלקטרודות עם חוצץ pH 4.01.
5. שטפו את האלקטרודות פעם נוספת עם diH₂O לפני שתמשיכו במדידות.

6. אחסון אלקטרודות

הערה: יש לאחסן את שתי האלקטרודות בטמפרטורת החדר במקום עם פעילות נמוכה, בטוח מפני נזק מקרי.

1. לאחר השימוש במיקרואלקטרודת ה- pH, החלק אותה בזהירות אופקית בחזרה לצינור ההגנה שלה (מחליק לאורך ספסל המעבדה לתמיכה אופקית).
2. מחזיקים את המיקרואלקטרודה זקופה (קצה מכוון כלפי מעלה), ממלאים בעדינות את צינור ההגנה במים סטריליים. חבר את צינור ההגנה עם הפקק שאיתו הגיעה האלקטרודה. ודא שכל החורים בצינור ההגנה אטומים בסרט חשמלי. יש לאחסן בקופסה חסינת ניפוץ עד לשימוש הבא.
   הערה: מומלץ להשתמש בקופסה המקורית שבה הגיעו האלקטרודות מכיוון שהיא תכיל תוספות מגן שנועדו לשמור על אלקטרודות במקומן בעת אחסונן.
3. אחסן את אלקטרודת הייחוס בכד או גליל מדורג מלא בתמיסת KCl 3M. מכסים את הגליל המדורג/מדורג בפרפילם כדי למנוע אידוי של התמיסה.
   הערה: אם משתמשים בצילינדר מדורג, מומלץ להצמיד אותו לספסל המעבדה עם נייר דבק כדי למנוע תנועה מקרית.

7. הזרקת מתיל אדום (אופציונלי)

הערה: אדום מתיל הוא צבע אינדיקטור קולורימטרי שניתן להשתמש בו כדי לאמת את מדידות המיקרואלקטרודות.

1. מלאו נימי זכוכית בנפח 2 מיקרוליטר בשמן מינרלי סטרילי, טענו אותו על מזרק אוטומטי nL הנשלט על ידי מיקרומניפולטור, ולאחר מכן מלאו אותו בתמיסה המכילה 0.02% מתיל אדום ו-150 מילימטר הידרוכלוריד.
   הערה: התמיסה צריכה להופיע אדומה/ורודה בזמן שהיא בתוך הנימים בגלל החומציות של HCl.
2. להזריק אורגנואידים בקוטר של לפחות 300 מיקרומטר עם 9.2 μL של תמיסה²⁵.
3. צלמו תמונות או וידאו באמצעות מצלמה המותאמת לסטריאומיקרוסקופ (איור 2G).

תוצאות

הפרשת חומצה היא פונקציה מכרעת של הקיבה האנושית. עם זאת, עד כמה ניתן למדל הפרשת חומצה באורגנואידים היא עדיין נושא לוויכוח 6,32,33,34. לכן פיתחנו את הפרוטוקול המפורט לעיל כדי למדוד במדויק את ייצור החומצה באורגנואידים בקיבה. יש לציין כי השתמשנו באורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים ללא גירוי שגודלו בתרבית בתנאי התפשטות סטנדרטיים שעברו מספר פעמים, מה שהוביל לאובדן תאים קודקודיים³⁵. לכן, נוכחות של תאים קודקודיים מפרישי חומצה ושחרור חומצה פעילה לא הייתה צפויה במערכת המודל שלנו.

לצורך הניסויים שלנו השתמשנו באורגנואידים בקטרים שבין 200 מיקרומטר ל-1,000 מיקרומטר שנזרעו על כלים עם תחתית זכוכית. ראשית, בדקנו שני גדלי קצה שונים עבור מיקרואלקטרודות – pH-25 עם קוטר קצה של 25 מיקרומטר ו-pH-50 עם קוטר קצה של 50 מיקרומטר. כפי שניתן לראות באיור 2A, לא היה הבדל משמעותי בין המדידות שהתקבלו עם הקצוות הקטנים בהשוואה לקצוות הגדולים יותר. באופן מעניין, ה- pH הבסיסי באורגנואידים נטה להיות מעט בסיסי ב~pH 8. באמצעות קצה pH-25 של 25 מיקרומטר, הערכנו בשלב הבא את השונות ב-pH הלומינלי בתוך עשרה אורגנואידים שונים שנשמרו על אותה לוחית תרבית, עם שלוש מדידות שהתקבלו מכל אורגנואיד (איור 2B). בתוך לוח אחד, ה-pH הלומינלי של אורגנואידים בודדים הראה רק שינויים קלים ולא משמעותיים (8.16 ±-0.12; p ≥0.0445-0.99) (איור 2B). השווינו גם מדידות pH תוך-לומינליות בתוך חמישה קווי אורגנואידים שונים עם מעברים שנעו בין 3 ל-16 (איור 2C). שוב, מצאנו מדידות pH עקביות בתוך כל תרבית, אך שונות משמעותית בין קווי אורגנואידים. עם זאת, pH לומינלי נשאר בדרך כלל בין pH 7.3 ל-pH 8.2, בסדר גודל אחד, ולא הייתה מגמה נראית לעין עבור pH ממוצע כאשר השוו מספרי מעבר מוקדם ומאוחר (איור 2C). לאחר מכן שאלנו אם ה- pH של לומן האורגנואיד קשור ישירות ל- pH של מדיית הרחבת האורגנואידים והמטריצה החוץ תאית (ECM). השוואה בין המדיה, ה-ECM המקיף את האורגנואידים, ולומן האורגנואידים חשפה הבדלים משמעותיים ב-pH, כאשר ה-pH הלומינלי של האורגנואידים נמוך מזה של ה-ECM, וה-ECM pH נמוך מזה של מצע ההתפשטות של האורגנואידים שמסביב (איור 2D), מה שמרמז על כך שה-pH הלומינלי של האורגנואידים היה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ולא נקבע ישירות על-ידי סביבת התרבית. במהלך שישה ניסויים בלתי תלויים, מדדנו pH לומינלי ממוצע שהיה כמעט נייטרלי ועמד על 7.13 ±-0.09.

מיקרומניפולטור ממונע שימש להשגת מדידות pH של לומן אורגנואיד ברזולוציה מרחבית גדולה יותר. גישה זו רלוונטית אם יש צורך לרשום pH או שיפועים אחרים בתוך לומן אורגנואיד מלא ריר²⁹ . איור 2E מראה שתי סדרות מייצגות של מדידות pH באורגנואידים גדולים (>1,000 מיקרומטר), המדגימות את נקודת הכניסה לכל אורגנואיד ומסתיימות בעומק של ~800 מיקרומטר. מכיוון שלשני האורגנואידים שצוינו לא היה אותו קוטר, המדידות אינן ניתנות להשוואה מיידית. בכל מקרה, אנו מראים עדות לשיפוע pH קל של Δ0.6 בין משטח האפיתל לבין לומן האורגנואיד העמוק יותר (איור 2E). כדי לקבוע את ההיתכנות של ביצוע מדידות pH באורגנואידים לאורך זמן, אשר יאפשרו מדידות של תגובות הטיפול בזמן אמת, רשמנו את ה- pH התוך-לומינלי בתוך אורגנואיד מייצג במשך כ-20 דקות, ומצאנו שהקריאה נשארה עקבית מאוד לאחר תקופת הסתגלות ראשונית (איור 2F). כדי לאמת את מדידות ה-pH הלומינלי בשיטה עצמאית, השתמשנו בצבע קולורימטרי רגיש ל-pH (אדום מתיל) שהזרקנו לתוך לומן האורגנואיד באמצעות מזרק אוטומטי ננו-ליטר המותקן על מיקרומניפולטור (איור 2G). הצבע הצהוב של הצבע אישר כי לומן האורגנואיד היה בעל pH >6.2, התואם את מדידות המיקרואלקטרודות שהראו pH כמעט נייטרלי. בסך הכל, תוצאות מייצגות אלה ממחישות את ההיתכנות והשכפול של מדידות pH מבוססות מיקרואלקטרודות בתרביות אורגנואידים.

איור 1: סקירה כללית של השיטה. (A) תרשים סכמטי של הגדרת פרופילים. המיקרואלקטרודה באיור 1A נלקחה מאתר יוניסנס. ³⁶ (B) תמונה מייצגת של תרבית אורגנואידים מוכנה ליצירת פרופילים, סביב ECM והמדיה שמסביב (סרגל קנה מידה = 5 מ"מ). (C) דוגמה למיקום נכון של מיקרואלקטרודות כהכנה לחיטוט אורגנואידים (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). קיצור: ECM = מטריצה חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אימות של פרופיל מיקרו-חיישנים באורגנואידים של קיבה אנושית. (A) השוואה בין מדידות pH של לומן בינוני באמצעות קצות מיקרואלקטרודות של 25 מיקרומטר (pH-25) ו-50 מיקרומטר (pH-50). נתונים מ-10 אורגנואידים בודדים, כל אחד מניסוי מייצג אחד. (B) התקבלו שלוש מדידות pH משוכפלות עבור 10 אורגנואידים בודדים. ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות (p = 0.1229). (C) מדידות pH המתקבלות באמצעות אלקטרודת pH-25 עקביות בתוך כל אחד מחמישה קווי אורגנואידים שנותחו במספרי מעבר שונים; 4-10 אורגנואידים נמדדו בכל שורה על בסיס גודל וזמינות. ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות (p < 0.0001). (D) מדידות pH בתוך אורגנואידים בקיבה והמטריג'ל והמדיה שמסביב (n = 6 ניסויים עצמאיים). מדידות המתקבלות על ידי חדירה אורגנואידים אפיתל קיבה עם pH-25. כל נקודת נתונים היא הממוצע של 10 מדידות pH בודדות בתוך אורגנואיד יחיד. ANOVA חד-כיווני (עמ' < 0.0001). (E) פרופילי pH אפיתל ללומן של שני אורגנואידים מייצגים באמצעות מיקרומניפולטור ממונע. (F) יציבות של pH לאורך זמן (~19.8 דקות) באורגנואיד מייצג אחד. (G) מיקרו-הזרקה של צבע אינדיקטור pH אדום מתיל ו-HCl לתוך לומן אורגנואיד קיבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

			תורם
איור	קו	מעבר	מין	גיל	מוצא אתני
2א	35	6	F	40	B
2ב	7	15	F	26	B
	7	4	F	26	B
	1	16	F	45	C
	34	3	F	44	ידוע
	35	6	F	40	B
2ג	7	15	F	26	B
דו-ממד	36	1	ידוע
	7	5	F	26	B
	37	1	ידוע
	31	3	F	45	H
	7	9	F	26	B
	7	4	F	26	B
2ה	10	15	F	43	ידוע
2ו	34	3	F	33	C
דור 2	7	5	F	26	B

טבלה 1.

בינוני הרחבת אורגנואיד קיבה אנושי (L-WRN)
L-WRN מותנה בינוני	50%
DMEM/F12 מתקדם	37%
סרום בקר עוברי	10%
פניצילין/סטרפטומיצין	1%
ל-גלוטמין	1%
ג'נטמיצין	0.10%
אמפוטריצין ב	0.10%
חיץ HEPES	0.40%
Y-27632	0.10%
SB-431542	0.10%

טבלה 2.

איור משלים S1: ביטוי טרנספורטר יונים באורגנואידים של קיבה אנושית. מספרי העתקה יחסיים מנורמלים ל-18S rRNA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: אורגנואיד קיבה אנושי עם ארכיטקטורה מעוותת בעקבות ניקוב עם בדיקת מיקרו-חיישן pH. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

וידאו משלים S1: ניסיון פרופיל לא מוצלח בתרבית אורגנואיד קיבה. מיקרואלקטרודת pH של 25 מיקרומטר מתקדמת ידנית לעבר האורגנואיד המעניין. לאחר ניסיון כושל עקב טעות בשיפוט הזווית, מנסים לבצע זווית אחרת ומתגלה כי האורגנואיד חסר את השלמות המבנית שיש לאפיין (המבנה הכדורי אינו יציב ומתעוות עם החדירה עם האלקטרודה). לאחר מכן המשתמש מנתב מחדש כדי לנסות אורגנואיד אחר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

גישה מוגבלת למרחב הלומינלי של אורגנואידים הגבילה מאוד את הבנתנו את הדינמיקה הפיזיולוגית של מיקרו-סביבה זו. כלי אמין לניתוחים פונקציונליים של פיזיולוגיה לומינלית ירחיב את יכולתנו למנף אורגנואידים כמודלים חוץ גופיים לפיזיולוגיה, פרמקולוגיה וחקר מחלות. אורגנואידים הם מודלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עם פוטנציאל נוסף לשכפל שונות גנטית בתוך האוכלוסייה האנושית. שיטות קיימות למדידת pH בתוך לומן אורגנואיד השתמשו בצבעים רגישים ל- pH או ננו-חלקיקים, שיטות שלעתים קרובות חייבות להיות משולבות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ספקטרוסקופיה 16,17,37. שיטת הפרופיל מבוססת המיקרו-חיישנים המתוארת מספקת מסלול חדש למדידת ה- pH התוך-לומינלי של אורגנואידים במערכת העיכול בדיוק מרחבי חדש. השיטה שלנו מדגימה מדידה עקבית ואמינה של pH לומינלי אורגנואיד במערכת העיכול, כמו גם עדות לשיפוע pH. בניסויים שלא פורסמו, אישרנו את הביטוי של גנים ממשפחת SLC SLC4A2 ו-26A7, אשר ידועים כאחראים להפרשת ביקרבונט, כמו גם SLC9A3, 9A4 ו-9A8 האחראים לחילופי פרוטונים (איור משלים S1)38,39,40,41. המחקרים שלנו מצביעים על דומיננטיות של הפרשת ביקרבונט ומחסור בתאים קודקודיים באורגנואידים שלנו, מה שעשוי להסביר את הבסיסיות.

חשוב לוודא כי המיקרואלקטרודות המשמשות מתאימות היטב עבור microprofiling אורגנואיד - זה כולל בחירת קוטר קצה הנכון. ניסינו גם קצוות של 25 מיקרומטר וגם של 50 מיקרומטר וקיבלנו תוצאות דומות (איור 2A), אבל החלטנו להתקדם עם גודל הקצה הקטן יותר לפי עצת היצרן, מאחר שהוא צפוי להיות פחות פולשני ולספק רזולוציה מרחבית גבוהה יותר, מאחר שהמדידות ממוצעות על פני אזור החוד המשופע. עם זאת, כחיסרון, טיפים קטנים יותר הם שבירים יותר. יש לקחת בחשבון את גודל האורגנואיד בקביעת הרזולוציה המרחבית הרצויה.

צעד קריטי בפרוטוקול היה הבטחת היכולת להבחין בין ה-pH התוך-לומינלי האורגנואידי לבין ה-pH ב-ECM, ולאחר מכן, בתווך התרבית הסובב אותו. ניתן היה לצפות לכמות סבירה של שטף מטבוליטים לתוך ומחוץ לאורגנואידים⁴². אנו מצפים שה-pH של אורגנואיד יושפע מסביבתו, ומצאנו שהאורגנואידים היו באופן עקבי פחות בסיסיים מסביבתם בשישה ניסויים עצמאיים (איור 2D). בנוסף, יציבות חשובה ביצירת פרופילים לא פחות מאשר במהלך כיול חיישנים.

אורגנואידים שמקורם ברקמה צפויים להציג מידה מסוימת של שונות בין תורם לתורם, ולכן חיוני ליצור פרופיל של כל קו אורגנואידים בנקודת ההתחלה לפני יישום התערבויות ניסיוניות כלשהן כגון טיפול תרופתי⁴³. אנו משערים כי תנודות ב- pH בכל תרבית אורגנואיד אחת עשויות לנבוע משיפועי יונים מקומיים בסקלת המיקרו והפיזור ההטרוגני של ריר לומינלי כפי שנקבע על ידי אימונופלואורסנציה וצביעה אימונוהיסטוכימית (נתונים שלא פורסמו). השינויים הנצפים ב- pH בין קווי אורגנואידים בודדים ומעברים עשויים לנבוע מהבדלים אינדיבידואליים בהרכב התא ובפעילות ההפרשה של האורגנואידים. מצאנו גם שקווי אורגנואידים מסוימים היו מטבעם קשים יותר לחדירה מאחרים. באופן דומה, חלקם עלולים לאבד את שלמותם המבנית ולקרוס עם כניסת האלקטרודות (איור משלים S2 ווידאו משלים S1). זה לא נראה קשור למעבר אורגנואידים אך נצפה לרוב באורגנואידים מעל ~ 1.5 מ"מ קוטר. במחקר קודם הראינו כי הריר בתוך האורגנואידים התפזר בצורה הטרוגנית²⁹. בגלל הטרוגניות זו, קשה לקבוע אם (או באיזו מידה) התפלגות הריר השפיעה על מדידה.

מיקרו-חיישנים הם כלים זעיר פולשניים שיכולים ליצור פרופיל פיזיולוגיה תוך-לומינלית אורגנואידית במהירות גבוהה וברזולוציה מרחבית גבוהה. חיישנים כאלה גם אינם מפריעים לשיפועים כימיים והם רגישים באופן מינימלי למערבולות במיקרו-סביבה המעניינת. העיצוב הקטן מתאפשר על ידי הפרדת אלקטרודת החיישן מאלקטרודת הייחוס הסטנדרטית בדיקות pH מעבדה משלבות את שתי האלקטרודות הללו, מה שמוביל לגודל גדול יותר. ננו-חיישני pH אופטיים ו-O₂ למדידות תוך-תאיות פותחו על ידי קבוצת קאש בבית הספר למכרות של קולורדו והצליחו למדוד מטבוליטים הן במודלים של עכברים והן במודלים של ביופילם. עם זאת, בגלל ההטרוגניות בלומן האורגנואידי, חיישנים כאלה עלולים להוביל לתוצאות בלתי ניתנות לפירוש¹⁷. McCracken et al. ניתחו pH לומינלי באורגנואידים קיבה שמקורם בתאי גזע עובריים על ידי הזרקת SNARF-5F והדמיית הצבע הרגיש ל- pH במיקרוסקופ קונפוקלי^{בזמן אמת 37}. יש לציין כי המדידות שדווחו על-ידי McCracken היו דומות מאוד לערכי ה-pH שהתקבלו במחקר הנוכחי שלנו (איור 2B,C). הטכניקה שלנו יכולה אולי להיות מיושמת בארכיטקטורה חד-שכבתית, עם מערך אנכי יותר כמו בפרופיל ביופילם, אם כי זה עלול להוות סיכון לפגיעה באלקטרודות⁴⁴. מחקרים עתידיים יכולים לכלול גם מדידות רציפות של pH במשך מספר ימים כדי להעריך שינויים הקשורים להתפתחות התא. מכיוון שאורגנואידים בגודל בינוני בדרך כלל מתאוששים ומחלימים לאחר חיטוט, אורגנואיד אחד יכול באופן תיאורטי להיחקר מספר פעמים כל עוד ניתן לשמור על סטריליות התרביות. ככל שאנו מחדדים את הבנתנו את דינמיקת החומציות במודלים אורגנואידים, הרזולוציה המרחבית חייבת להיות בראש סדר העדיפויות למיפוי מדויק של המיקרו-סביבה התלת-ממדית המורכבת והבלתי נגישה מבחינה היסטורית בתוכה.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה מפורטת למדידות מדויקות של pH ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה באמצעות מיקרואלקטרודות pH המותקנות על מיקרומניפולטור וסטריאומיקרוסקופ. שיטה זו אומתה עם אורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים אנושיים והיא מתאימה לאורגנואידים אפיתליאליים בקוטר של לפחות 200 מיקרומטר בעלי לומן מובהק. אנו צופים כי על ידי בחירת מיקרואלקטרודות חלופיות, שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לסוגים אחרים של אורגנואידים ומדידה של תרכובות חלופיות, כגון NO או_{O 2}.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3 M KCl	Unisense
5 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,	CellTreat	229091B
10 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,	CellTreat	229092B
15 מ"ל צינור צנטריפוגה - מתלה קצף,	CellTreat	229412
צלחת תרבית רקמות 24 באר,	CellTreat	229124
25 מ"ל פיפט מתנדנד לא סרולוגי, עטוף בנפרד, נייר/פלסטיק, שקית,	CellTreat	229093B
צלחת 35 מ"מ | מס' 1.5 כיסוי | קוטר זכוכית 20 מ"מ |	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 מ"ל - מתלה קצף,	CellTreat	229422
70% אתנול	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μ m מסננת תאים, עטופה בנפרד, CellTreat סטרילי		229483
1,000 ומיקרו; L אורך מורחב קצות פיפטה עם שמירה נמוכה, מתלה,	CellTreat	סטרילי 229037
תמיסת אמפוטריצין B (Fungizone)	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
ארון בטיחות ביולוגית	Nuaire	NU-425-600	Class II סוג A/B3
סרום בקר אלבומין	פישר ביוריאגנטים	BP1605-100
תמיסת התאוששות תאים	קורנינג	354253	תמיסת דיסוציאציה של תאים
DMEM/F-12 (DMEM מתקדם)	Gibco	12-491-015
השינוי של דולבקו של מדיום הנשרים (DMEM)	פישר סיינטיפיק	15017CV
סרום בקר עוברי	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418 סולפט	קורנינג	30-234-CR
ג'נטמיצין סולפט	IBI Scientific	IB02030
HEPES, חומצה חופשית	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2 ב-1 14 אינץ' מחשב נייד Intel Core i3	HP	M03840-001
חומצה הידרוכלורית	פישר מדעי	A144C-212
חממה	פישר סיינטיפיק	11676604
אייפון 12 מצלמה	אפל
L-גלוטמין	Cytiva	SH3003401
גדול קימברלי-קלארק מקצועי Kimtech Science Kimwipes מגבים עדינים למשימה, 1 רובד	פישר סיינטיפיק	34133
M 205 FA סטריאומיקרוסקופ	Leica
מטריצת ממברנה Matrigel 354234	קורנינג	CB-40234
MC-1 בקר UniMotor	Unisense
מתיל אדום
MM33 מיקרומניפולטור	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	ימני
MS-15 שלב ממונע	Unisense
Nanoject-II	Drummond	3-000-204	מזרק אוטומטי ננוליטר
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-148
pH מיקרואלקטרודות	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	תוכנת SensorTrace אינה תואמת למחשבי אפל
אלקטרודה ייחוס	Unisense	REF-RM-001652	תוכנת SensorTrace אינה תואמת ל מחשבי אפל
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
מתאם מצלמת סמארטפון	Gosky
מפרט מעמד מעבדה LS	Unisense	LS-009238
Trypsin-EDTA 0.025%, פנול אדום	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc  מגרדי תאים מיני 200/PK	פישר	MCS-200
Y-27632 דיהידרוכלוריד	Tocris Bioscience	12-541-0&MICRO
; ערכת כיול חיישנים	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4.01 ו-9.21, מנות 20 מ"ל