מאמר שיטה

העברה מיטוכונדריאלית באמצעות ננו-צינוריות מנהור בין תאי גזע מזנכימליים ואפיתל פיגמנט ברשתית במבחנה

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66917

⸱

4 באוקטובר 2024

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הכולל מעקב מיטוכונדריאלי, הליכי תרבית משותפת ישירה של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית (ARPE19), כמו גם שיטות לצפייה וניתוח סטטיסטי של היווצרות ננו-צינוריות מנהור (TNT) והעברה מיטוכונדריאלית כדי לאפיין חילופי מיטוכונדריה באמצעות TNT בין MSCs ותאי ARPE19.

תקציר

העברה מיטוכונדריאלית היא תופעה פיזיולוגית נורמלית המתרחשת באופן נרחב בקרב סוגים שונים של תאים. במחקר עד כה, המסלול החשוב ביותר להובלה מיטוכונדריאלית הוא באמצעות ננו-צינוריות מנהור (TNT). מחקרים רבים דיווחו כי תאי גזע מזנכימליים (MSC) יכולים להעביר מיטוכונדריה לתאים אחרים על ידי TNT. עם זאת, מחקרים מעטים הדגימו את התופעה של העברה מיטוכונדריאלית דו-כיוונית. כאן, הפרוטוקול שלנו מתאר גישה ניסיונית לחקר תופעת המעבר המיטוכונדריאלי בין MSCs לבין תאי אפיתל פיגמנט ברשתית במבחנה על ידי שתי שיטות מעקב מיטוכונדריאלי.

תרבית משותפת של תאי MSC נגועים במיטו-GFP עם תאי ARPE19 נגועים במיטו-RFP (קו תאי אפיתל פיגמנט ברשתית) במשך 24 שעות. לאחר מכן, כל התאים הוכתמו בפלואידין וצולמו במיקרוסקופ קונפוקלי. נצפו מיטוכונדריה עם פלואורסצנטיות ירוקה בתאי ARPE19 ומיטוכונדריה עם פלואורסצנטיות אדומה בתאי MSC, מה שמצביע על כך שהעברה מיטוכונדריאלית דו-כיוונית מתרחשת בין תאי MSC ותאי ARPE19. תופעה זו מצביעה על כך שהובלה מיטוכונדריאלית היא תופעה פיזיולוגית נורמלית המתרחשת גם בין תאי MSC ותאי ARPE19, והעברה מיטוכונדריאלית מתאי MSC לתאי ARPE19 מתרחשת בתדירות גבוהה הרבה יותר מאשר להיפך. התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-MSCs יכולים להעביר מיטוכונדריה לתוך אפיתל פיגמנט ברשתית, ובאופן דומה מנבאות כי MSCs יוכלו לממש את הפוטנציאל הטיפולי שלהם באמצעות הובלה מיטוכונדריאלית באפיתל פיגמנט הרשתית בעתיד. בנוסף, העברה מיטוכונדריאלית מתאי ARPE19 לתאי MSC עדיין צריכה להיחקר.

מבוא

מיטוכונדריה משמשים כמקור האנרגיה העיקרי עבור רוב סוגי התאים, כאשר תפקוד לקוי של המיטוכונדריה משפיע במיוחד על רקמות עתירות אנרגיה כמו רשתית1. שינויים מטבוליים ברשתית יכולים לעורר משבר ביו-אנרגטי, ובסופו של דבר לגרום למוות של פוטורצפטורים ו/או תאי RPE2. טיפולים מבוססי תאי גזע מזנכימליים (MSC) הוכיחו יעילות בטיפול בניוון עיני, וניתן לייחס את אחד המנגנונים המדויקים העומדים בבסיס ההשפעות המועילות של MSCs על רקמות הרשתית להעברה מיטוכונדריאלית תפקודית 3,4,5,6. בשנת 2004, Rustom et al. דיווחו לראשונה על תופעת המעבר המיטוכונדריאלי באמצעות אינטראקציה חדשה בין תאים המתאפשרת על ידי ננו-צינוריות מנהור (TNTs)7.

בתרבית דו-ממדית, ננו-צינוריות מנהור (TNTs) מזוהות על ידי בליטות הקרום הדקות שלהן (20-700 ננומטר) שאורכן נע בין עשרות למאות ננומטרים, אשר תלויות מעל המצע ויכולות ליצור קשרים ישירות בין שני תאים הומוטיפיים והטרוטיפיים או יותר. מבנים אלה מועשרים במיוחד באקטין F ומקלים על הובלת מטענים, כגון מיטוכונדריה, בין תאים. בנוסף, ל-TNT יש פתחים בשני הקצוות, המאפשרים המשכיות של תוכן ציטופלזמי בין תאים מחוברים8.

קשה לזהות העברה מיטוכונדריאלית בתיווך TNT in vivo בגלל הסידור התאי הצפוף והאתגרים במעקב אחר מיטוכונדריה. ניסויים במבחנה, תוך שימוש בתרבית תאים משותפת ובטכניקות מעקב מיטוכונדריאלי, מאפשרים תצפית על היווצרות TNT והעברה מיטוכונדריאלית 8,9. כמו כן, צפינו בתופעה של העברה מיטוכונדריאלית בתיווך TNT על ידי תרבית משותפת של MSCs ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית במבחנה10.

מחקרים קודמים רבים הבחינו רק בהעברה מיטוכונדריאלית חד-כיוונית מתאי MSC לתאים אחרים 3,4,5,6. בעבר, ניסינו גם לנתח את העברת המיטוכונדריה הדו-כיוונית באמצעות שני סוגים של תאים המסומנים בירוק עוקב מיטו ובאדום עוקב מיטו, בהתאמה, אך הדיבור המשולב של הצבעים הפריע לתוצאות הניסוי. כדי לחקור העברה דו-כיוונית מיטוכונדריאלית בצורה מדויקת יותר, כאן, בנינו שני קווי תאים עם פלואורסצנטיות מיטוכונדריאלית שונה באמצעות טכניקת הטרנספקציה הלנטי-ויראלית, ולאחר מכן, צפינו וניתחנו את התופעות של היווצרות TNT והעברה דו-כיוונית מיטוכונדריאלית באמצעות תרבית משותפת ישירה במבחנה.

בקצרה, פרוטוקול שלב אחר שלב וניתן לפעולה מתואר כאן כיצד לעקוב אחר מיטוכונדריה, תרבית משותפת של MSCs עם תאי ARPE19, ולנתח היווצרות TNT והעברה מיטוכונדריאלית. תוצאות ניסוי זה הדגימו העברה מיטוכונדריאלית דו-כיוונית בתיווך TNT, אשר לא רק הוכיחה כי הובלה מיטוכונדריאלית היא תופעה פיזיולוגית נפוצה, אלא גם הראו את היכולת הטיפולית הפוטנציאלית של MSCs על תאי הרשתית.

פרוטוקול

1. יצירת קווי תאים MSC-mito-GFP ו-ARPE19-mito-RFP

  1. תרבית תאים
    הערה: רק MSCs משמשים כאן כדוגמה.
    1. תרבית MSCs אנושיים בצלחת של 6 בארות בתווך hMSC עם 1% פניצילין וסטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים) עד שצפיפות התא מגיעה ל-80%-90%. בהתאם לצפיפות צמיחת התא, לשנות את המדיום אחת ל 2-3 ימים.
      1. הסר את המדיום המקורי ושטוף את התאים פעם אחת במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) (ראה טבלת חומרים). הוסף 1 מ"ל של תערובת טריפסין-EDTA-DPBS (0.05% טריפסין-EDTA: 0.25% טריפסין-EDTA מדולל עם DPBS ביחס של 1:5; ראה טבלת חומרים), ודגור במשך 3-4 דקות (תלוי בתאים) באינקובטור של 37°C.
        הערה: התבונן בעיכול התאים תחת מיקרוסקופ ועצור את העיכול אם רוב התאים מעוגלים ומנותקים.
      2. טפחו בעדינות על צלחת 6 הבארות כדי לנתק את התאים הדבוקים לפני השטח, ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של מדיום שלם טרי כדי לסיים את העיכול.
      3. בעדינות להשעות מחדש את כל התאים עם אקדח פיפטה ולאחר מכן להעביר את כל התאים שנאספו לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
      4. צנטריפוגה את התאים ב 200 × גרם במשך 5 דקות.
      5. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום טרי. קח 10 μL של תרחיף תאים לספירת תאים.
      6. שמונה עשרה עד 24 שעות לפני טרנספקציה lentiviral, זרע תאי MSC בצפיפות של 1 × 105 תאים לכל באר בלוחות 6 באר, להבטיח כי צפיפות התא בזמן transfection הוא כ 50%.
  2. טרנספקציה של lentivirus
    הערה: כל הפעולות הקשורות transfection lentiviral צריך להתבצע בארון בטיחות ביולוגית.
    1. החלף את המדיום הראשוני עם 2 מ"ל של מדיום טרי למחרת, והוסף 25 μL של תרחיף lentivirus (5.00E + 08 TU / mL) עם adjuvants, ואחריו דגירה ב 37 ° C.
      הערה: אריזת Lentivirus בוצעה באמצעות פלסמיד Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (ראה טבלת חומרים ואיור משלים S1) על ידי חברה.
    2. לאחר 6 שעות של דגירה, להחליף את המדיום המכיל וירוס עם 2 מ"ל של מדיום טרי. ממשיכים לדגור ולהחליף את המדיום פעם ביום.
      הערה: ביטוי פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי משמעותי נצפה ב- MSCs 48 שעות לאחר הטרנספקציה, עם שיפור נוסף ניכר בנקודת הזמן של 72 שעות.
    3. מסך תאים נגועים בהצלחה על ידי השלמת המדיום תרבית עם puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) 2 ימים לאחר transfection. במקביל, הוסף ריכוז שווה ערך של פורומיצין לתאי גזע מזנכימליים חסרי טרנספקציה ויראלית כביקורת.
      הערה: וקטור המיטו-GFP הנגיפי מהונדס כך שיכלול את הגן לעמידות לפורומיצין.
    4. שנה את המדיום מדי יום עם המבוא של puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל). עצור את חיבור הפורומיצין עם מוות תאי כמעט מוחלט בקבוצת הביקורת.
      הערה: המדיום אינו מכיל ריכוז זה של puromycin. תוספת של puromycin נדרש רק כאשר המדיום מתווסף צלחת 6 באר.
    5. ממשיכים לתרבית ללא פורומיצין עד למעבר התאים ולהקפאתם. תן שם לסוג תא זה כ- MSC-mito-GFP.
      הערה: תאי ARPE19 הופקו מבנק תאי ATCC וגודלו בתרבית ב-DMEM/F12 המכילים 10% FBS ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים), ושיטות העיכול והמעבר שלהם זהות לאלה של MSCs. פלסמיד מיטו-RFP שונה מ-Mito-GFP על ידי חברה. לבסוף, קראנו לתאים הנגועים בהצלחה בשם ARPE19-mito-RFP.

2. תרבית משותפת ישירה של תאי MSC ו- ARPE19

הערה: במערכת תרבית משותפת זו, תאי MSC-מיטו-GFP ישמשו כתאי התורם ואילו תאי ARPE19-mito-RFP יתפקדו כתאים המקבלים. כדי להבחין בין תאים תורמים לתאים מקבלים, עקבנו אחר תאים מקבלים.

  1. תייג תאי ARPE19-mito-RFP עם CellTrace Violet (ראה טבלת חומרים) בקרום הציטופלזמי.
    הערה: העירור והפליטה של צבע CellTrace סגול הם 405 ננומטר ו 450 ננומטר, בהתאמה.
    1. הכינו תמיסת מלאי CellTrace Violet (ראו טבלת חומרים) על ידי הוספת 20 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לבקבוקון של מגיב CellTrace Violet וערבוב היטב מיד לפני השימוש.
    2. הגדל את תאי ARPE19-mito-RFP לצפיפות הרצויה של 80%-90%.
    3. יש לדלל את תמיסת CellTrace Violet ב-DPBS שחומם מראש (37°C) לריכוז העבודה הרצוי (1:1,000). זהו פתרון הטעינה.
      הערה: דילול CellTrace Violet חייב להתבצע עם DPBS ולא ניתן להחליפו במדיום תרבית מכיוון שהדבר יוביל לתוצאות צביעה גרועות מאוד.
    4. הסר את מדיום התרבות והחלף אותו עם 1 מ"ל של פתרון טעינה. לדגור על התאים במשך 10 דקות ב 37 ° C.
      הערה: אם התנאים מאפשרים זאת, ניתן לצפות בכתמים במיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 5 דקות. ניתן לסיים את הצביעה ברגע שהתוצאות הרצויות מושגות, מכיוון שתאים מסוימים עשויים שלא להיות מסוגלים לסבול חשיפה ממושכת ל- DPBS.
    5. הסר את תמיסת הטעינה, שטוף את התאים 2x עם DPBS, והחלף עם 2 מ"ל של מדיום שלם טרי. יש לדגור על התאים לפחות 10 דקות לאחר הצביעה כדי לאפשר ל-CellTrace Violet לעבור הידרוליזה אצטט.
      הערה: שלב זה הכרחי כדי שהתאים יחזרו למצבם האופטימלי ולהימנע מהפרעה לניסויים הבאים.
  2. הכינו צלחת של 24 בארות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של DPBS לכל באר. לאחר מכן, הכניסו את זכוכית הכיסוי (בקוטר מוגדר של 15 מ"מ) (ראו טבלת חומרים) לתוך הצלחת ואפשרו לה לשקוע למשך דקה. הסר את ה- DPBS מהבארות, תוך שימוש בלחץ שלילי כדי להבטיח שמגלשת הכיסוי קרובה לתחתית הצלחת.
  3. טריפסיניזציה של MSCs תורם ותאי ARPE19 מושתל כמתואר בשלב 1.1.1.
  4. ספירת תאים
    1. מניחים 10 μL של תרחיף תאים על צלחת ספירה לספירה.
      הערה: אם צפיפות התאים גבוהה מדי, ניתן לדלל אותם פי 10 עם מדיום ולאחר מכן להמשיך כאמור לעיל.
    2. זרעו 10,000 MSCs ו-10,000 תאי ARPE19 ב-500 מיקרוליטר של תווך לכל באר של צלחת בת 24 בארות. מערבבים היטב את התאים לפני הוספתם לצלחת 24 בארות. ראה את החישובים המוצגים להלן בהינתן ספירת MSC של A/mL וספירת תאים ARPE19 של B/mL.
      הערה: עבור 4 בארות, 40,000 MSCs ו 40,000 תאים ARPE19 נדרשים ב 2 מ"ל של תווך.
      נפח השעיית MSC (C) המכיל 40,000 MSC = 40,000/A μL
      נפח מתלה ARPE19 (D) המכיל 40,000 MSCs = 40,000/B μL
      לפצות את נפח ל 2 מ"ל עם 2 - (C + D) מ"ל של בינוני.
  5. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ, נערו את הצלחת עד שהתאים מופצים באופן שווה, ואז דגרו עליהם בתרבית במשך 24 שעות.

3. תרבית משותפת עקיפה של תאי MSC ו- ARPE19 במערכת טרנסוול

  1. בצע תרבית תאים, תיוג, עיכול וספירה כמתואר בשלבים 2.1 עד 2.4.1.
  2. זרעו 20,000 תאי ARPE19 ב 1 מ"ל של בינוני לכל באר של צלחת 24 בארות.
    הערה: בניסוי הזה השתמשנו בתאי ARPE19 ללא מיטוכונדריה מסומנת.
  3. הניחו את האינסרט בבאר שבה נזרע התא.
  4. זרעו 10,000 MSCs ב-100 מיקרוליטר של תווך בתא העליון לכל באר.
  5. חזור על שלב 2.5.

4. צביעת שלד ציטוסקטון

הערה: יש להגן מפני אור במהלך הניסוי.

  1. מוציאים את המדיום מהצלחות בנות 24 הבארות. שטפו את כל התאים פעם אחת עם 500 μL/well של 4% פוליפורמלדהיד (PFA), הוסיפו 500 μL של 4% PFA טרי וקבעו את הדגימות למשך 20 דקות.
    הערה: הכניסות של מערכת transwell מושלכות.
    הערה: מאחר שננו-צינוריות הן שבירות מאוד, שטפנו את התאים ישירות עם 4% PFA במקום DPBS כדי למקסם את השמירה של ננו-צינוריות שלמות.
  2. הסר את הקיבוע ולשטוף את הדגימות במשך 3 x 10 דקות עם DPBS.
  3. הוסיפו 500 מיקרוליטר/באר של תמיסת חסימה המורכבת מ-0.5% טריטון X-100 (ראו טבלת חומרים) ו-4% אלבומין בסרום בקר (BSA) (ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את פתרון החסימה ושטוף את הדגימות במשך 3 x 10 דקות עם DPBS.
  5. הכנת תמיסת צביעת פלואדין (ראה טבלת חומרים)
    הערה: העירור והפליטה של פאלואידין הם 650 ננומטר ו- 668 ננומטר, בהתאמה.
    1. הכינו תמיסות מלאי על ידי המסת תכולת הבקבוקון ב-150 מיקרוליטר של DMSO נטול מים כדי להניב תמיסת מלאי פי 400.
    2. הכן את תמיסת הצביעה על-ידי דילול פתרון האחסון 400x ל-1x עם DPBS. זוהי תמיסת צביעת הפלואידין.
  6. מוסיפים 200 μL של תמיסת צביעת פלואדין לכל באר ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  7. לשחזר את פתרון הצביעה ולשטוף את הדגימה 3 x 10 דקות עם DPBS.
    הערה: בעת שטיפת התאים עם DPBS, עדיף להשאיר את הצלחת על שייקר.
  8. בחרו את הכיסוי עם מחט מזרק והניחו לה להתייבש באוויר.
    הערה: המצב האופטימלי הוא מצב שבו לא ניתן לראות נוזל נראה על זכוכית הכיסוי אך הוא גם אינו יבש.
  9. יש למרוח כמות קטנה של אמצעי הרכבה (ראו רשימת חומרים) על השקופית ולהפוך בזהירות את זכוכית הכיסוי על המגלשה כדי להבטיח שהמדיום מצפה באופן שווה את כל המשטח. אטמו את הקצוות בלק.
    הערה: המתן מספר דקות כדי לאפשר ללק להתייבש.
  10. צלם תמונה קונפוקלית מיד או העבר אותה לקופסת פרוסה ואחסן אותה בטמפרטורה של 4°C למשך זמן קצר.
    הערה: זמן אחסון אידיאלי הוא שבועיים. אם זמן זה הוא חריגה, אפקט הדמיה עלול להידרדר.

5. הדמיה קונפוקלית

הערה: הדמיה קונפוקלית מבוצעת בהתאם למדריך ההפעלה ועשויה להשתנות בין מיקרוסקופים. כאן אנו נותנים רק חלק מהשלבים המרכזיים.

  1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ופתח ארבע תעלות לייזר (405, 488, 561, 640) על פי מדריך ההפעלה.
  2. גש לתוכנה במחשב ובצע פרמטרים ראשוניים של התוכנה.
    1. הוסף את התעלות הפלואורסצנטיות CF-405, CF-488, CF-561 ו- CF-640 ללוח ניהול התהליכים .
    2. התאם את זמן החשיפה של כל ערוץ פלואורסצנטי ל- 200 אלפיות השנייה והגדר את עוצמת ההגברה ל - 2 בלוח הבקרה של המצלמה .
    3. התאם את שילוב הלייזר/LED לערך של 80.
  3. בצע מניפולציה בלוח הבקרה החיצוני של המיקרוסקופ כדי להתאים את עדשת המטרה להגדלה של פי 20 וודא שהעדשה ממוקמת במיקום הנמוך ביותר שלה.
  4. מקם את השקופית בכיוון הפוך בטבלת המוביל.
  5. הפעל את הלייזר 405 ננומטר ותפעל את המיקוד באמצעות ספירלות המיקוד הגסות והעדינות. התבונן בדגימה מתחת לעינית עד שתאים פלואורסצנטיים כחולים גלויים.
  6. בחר Live Imaging בממשק התוכנה במחשב, עבור לערוץ CF-405 והתאם מחדש את סליל המיקוד העדין עד שתמונה ברורה של התאים המציגים פלואורסצנטיות כחולה תיראה על מסך המחשב.
  7. כוונן את עדשת האובייקט להגדלה של פי 40 ועבור לערוץ CF-640, ולאחר מכן כוונן בזהירות את המיקוד עד שנראה מבנה מיקרופילמנט תאי ברור.
  8. שמירה על אורך מוקד קבוע, מעבר לערוצי CF-405, CF-488 ו-CF-561 ברצף, ושינוי הפרמטרים של זמן חשיפה אופטימלי, עוצמת הגברה ושילוב לייזר/לד להדמיה בכל ערוץ, לפי הצורך.
  9. הפעילו את הפונקציה Z Image Stack והגדירו את נקודות ההתחלה והסיום של ציר Z באמצעות טיפול באורך המוקד כדי ללכוד תמונה עם עומק באמצעות ציר Z.
  10. לחץ על הלחצן Start בחלונית Process Management כדי לצלם תמונה.
  11. בחרו 10 שדות תצוגה באופן אקראי לכל פרוסה.
    הערה: לא אמורה להיות חפיפה בין שני שדות ראייה.
  12. הפעל את פונקציית קיטועי הזמן, תוך ציון משך הדמיה כולל של 24 שעות ומרווח צילום של 5 דקות לאחר זיהוי שדה הראייה הרצוי.
    הערה: כדי ללכוד רצף קיטועי זמן, יש צורך לחסן תאים בצלחת עם תחתית זכוכית ולמקם אותם בתוך קופסה מאווררת המכילה 5% גז CO2 .
  13. שמור וייצא את כל התמונות.
    הערה: כדי לשפר את הבדיקה של TNT והעברה מיטוכונדריאלית, נעשה שימוש בהדמיה ברזולוציית על. הדמיה ברזולוציית על בוצעה באמצעות HIS-SIM מסחרי, המכונה HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) שסופק על ידי חברה. התמונות נרכשו באמצעות יעד טבילה בשמן 100x/1.5 NA.

6. ניתוח נתונים

  1. לצורך ניתוח סטטיסטי של כל תמונה, כימות מספר התאים הכולל, מספר הננו-צינוריות, מספר תאי ARPE19-mito-RFE חיוביים לסגול, מספר התאים החיוביים לסגול המציגים פלואורסצנטיות ירוקה (המייצג את מספר תאי ARPE19 עם העברה מיטוכונדריאלית מתאי MSC), ומספר התאים השליליים לסגול המציגים פלואורסצנטיות אדומה (המייצגת את מספר תאי MSC עם העברה מיטוכונדריאלית מתאי ARPE19).
    1. כדי לכמת את היווצרות TNT, חשב את היחס בין מספר הננו-צינוריות הבין-תאיות למספר התאים הכולל.
    2. חשב את קצב ההעברה המיטוכונדריאלי כיחס בין מספר התאים החיוביים לסגול המציגים פלואורסצנטיות ירוקה למספר הכולל של תאים חיוביים לסגול (המייצג את המעבר המיטוכונדריאלי מתאי MSC לתאי ARPE19) או היחס בין מספר התאים השליליים לסגול המציגים פלואורסצנטיות אדומה למספר הכולל של תאים שליליים סגולים (המייצגים את המעבר המיטוכונדריאלי מתאי ARPE19 לתאי MSC).

תוצאות

התרשים הסכמטי שמדגים את התרבית המשותפת הישירה של תאי גזע מזנכימליים (MSC) ותאי ARPE19 מתואר באיור 1. MSCs, שהונדסו לבטא מיטו-GFP, כאשר תאי התורם ותאי ARPE19-mito-RFP עם ממברנות ציטופלזמיות המסומנות בסגול כתאים מקבלים עברו תרבית משותפת ביחס של 1:1. לאחר תקופה של 24 שעות של תרבית משותפת, התאים הוכתמו לפלואידין ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אוכלוסיות התאים שהתקבלו כללו תאי MSC-mito-GFP, תאי ARPE19-mito-RFP, תאי ARPE19-mito-RFP המכילים מיטו-GFP, ותאי MSC-mito-GFP המכילים מיטו-RFP. יש לציין כי נוכחות מיטו-GFP בתאי ARPE19 ומיטו-RFP בתאי MSC הצביעה על העברה דו-כיוונית מיטוכונדריאלית.

פרטים ספציפיים על היווצרות TNT מוצגים באיור 2. המבנים האלה יכולים ליצור קשרים בין-תאיים בין תאים מאותו סוג (איור 2A-C), כמו גם בין תאים מסוגים שונים (איור 2D). ננו-צינוריות מנהור (TNTs) משמשות כצינורות המחברים תאים סמוכים, ומציגות מבנה קרום ייחודי עשיר באקטין F עם קצוות פתוחים המאפשרים המשכיות ציטופלזמית והובלת מיטוכונדריה. באמצעות הדמיה של ציר Z, ניכר כי TNT אינם מעוגנים היטב למטריצה החוץ תאית אלא מרחפים בתוך תווך התרבית, ובכך מבדילים אותם מהבליטות התאיות הקונבנציונליות. העברה מיטוכונדריאלית ניכרת באיור 3, היכן שתאי ARPE19 חיוביים לסגול מציגים פלואורסצנטיות מפוזרת ומנוקדת בירוק, המעידה על מיטוכונדריה שמקורה ב-MSCs (איור 3A). MSCs שליליים סגולים המכילים פלואורסצנטיות מנוקדת אדומה מייצגים את המעבר המיטוכונדריאלי מתאי ARPE19 (איור 3B). איור 4 מראה היווצרות TNT והעברה מיטוכונדריאלית תחת הדמיה ברזולוציית על, שממנה אנו יכולים לראות פרטים נוספים על העברת מיטוכונדריה באמצעות TNT. סרטון 1 מציג את הדינמיקה של הובלה מיטוכונדריאלית דרך TNT.

כדי להדגים עוד יותר שהתנאי המוקדם להעברה מיטוכונדריאלית הוא מגע פיזי, כמו TNT, ולא הפרשה וספיגה של מיטוכונדריה, השתמשנו בשיטה10 שדווחה בעבר על תרבית משותפת. כפי שניתן לראות באיור 5A, תאי MSC ותאי ARPE19 נזרעו בחדרים העליונים והתחתונים של לוח טרנסוול, בהתאמה. הם הופרדו על ידי מסנן עם נקבוביות של 0.4 מיקרומטר, שחסם את המגע הישיר בין MSCs לתאי ARPE19 אך איפשר מעבר מיטוכונדריה. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, תאי ARPE19 בחדר התחתון נבדקו, ונצפו מעט מיטו-GFP מתאי MSC בחדר העליון (איור 5B). תוצאות אלה מצביעות על כך שהעברה מיטוכונדריאלית דורשת מגע ישיר בין MSCs ותאי ARPE19.

בסופו של דבר, נערך כימות של היווצרות TNT והעברה מיטוכונדריאלית, כאשר התוצאות המקבילות מתוארות באיור 6. MSCs היו בעלי יכולת גבוהה משמעותית לתרום מיטוכונדריה מאשר תאי ARPE19 (p = 0.0286). ממצאים אלה מצביעים על כך שלתאי MSC יש את היכולת להעביר מיטוכונדריה לתאי אפיתל פיגמנט ברשתית.

figure-results-1
איור 1: תצוגה סכמטית של תרבית משותפת של תאי MSC ותאי ARPE19. תאי MSC המבטאים מיטו-GFP ותאי ARPE19-mito-RFP המסומנים ב-CellTrace Violet עוברים תרבית משותפת במשך 24 שעות ביחס של 1:1. מיטוכונדריה בתאים סגולים+ מסמנת את העברת המיטוכונדריה מתאי MSC לתאי ARPE19, ואילו מיטוכונדריה בתאים סגולים מסמנת את העברת המיטוכונדריה מתאי ARPE19 לתאי MSC. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; MSCs = תאי גזע מזנכימליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: היווצרות TNT בין תאי MSC ותאי ARPE19. ראשי חץ לבנים מציינים היווצרות TNT, ראשי חץ ירוקים מציינים מיטוכונדריה עם מיטו-GFP וראשי חץ אדומים מציינים מיטוכונדריה עם מיטוכונדריה. (א,ב) היווצרות TNT בין תאי ARPE19. (C) היווצרות TNT בין MSCs. (D) היווצרות TNT בין MSCs ותאי ARPE19. הדמיה של ציר Z המראה TNT תלוי בתווך תרבית. פסי קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: MSCs = תאי גזע מזנכימליים; TNTs = ננו-צינוריות מנהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: העברה מיטוכונדריאלית מתאי MSC לתאי ARPE19. (A) העיגול המקווקו הלבן מציין מעבר מיטוכונדריאלי (מיטו-GFP) מתאי MSC לתאי ARPE19, ו-(B) העיגול המקווקו הצהוב מציין העברה מיטוכונדריאלית (מיטו-RFP) מתאי ARPE19 לתאי MSC. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצור: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; MSCs = תאי גזע מזנכימליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: היווצרות TNT והעברה מיטוכונדריאלית בין תאי MSC ותאי ARPE19 במיקרוסקופ ברזולוציית על. (A ו-B) העברה מיטוכונדריאלית מתאי MSC לתאי ARPE19. (C) פירוט של TNT תחת הדמיה ברזולוציית על. (D) מיטוכונדריה ירוקה מתאי MSC הנמצאים בתאי ARPE19 בהדמיה ברזולוציית על. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. קיצורים: MSCs = תאי גזע מזנכימליים; TNTs = ננו-צינוריות מנהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: העברה מיטוכונדריאלית כמעט בלתי ניתנת לגילוי בתרבית משותפת עקיפה במערכת טרנסוול של תאי MSC ותאי ARPE19. (A) תצוגה סכמטית של תרבית משותפת של תאי MSC ותאי ARPE19 במערכת transwell. (B) תמונות מייצגות של תאי ARPE19 בתחתית לוח הטרנסוול לאחר תרבית משותפת עקיפה עם MSCs במשך 24 שעות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: כימות היווצרות TNT והעברה מיטוכונדריאלית. (A) היווצרות TNT, (B) העברה מיטוכונדריאלית. קיצורים: M = MSCs = תאי גזע מזנכימליים; A = תאי ARPE19; TNTs = ננו-צינוריות מנהור; M-A = היווצרות TNT בין תאי MSC ותאי ARPE19; M-M = היווצרות TNT בין MSCs; A-A = היווצרות TNT בין תאי ARPE19. n = 4, ממוצע ± SD, מבחן U-Mann-Whitney, *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: מיפוי פלסמיד pCT-Mito-copGFP. Mito-GFP (CYTO102-PA-1) נרכשה. המיטוכונדריה Cyto-Tracer, pCT-Mito-GFP (CMV), מתמזג עם copGFP באמצעות תג Cox8, וכתוצאה מכך תיוג של מיטוכונדריה עם copGFP. היתוך copGFP זה מונע על ידי מקדם CMV, המאפשר ביטוי חזק בקווי תאים כגון HeLa, HEK293 ו- HT1080. Mito-RFP שונה מ-mito-GFP על ידי החלפת GFP ב-RFP; הוא נושא גן עמידות לפורומיצין. אריזה Lentiviral של פלסמיד זה נעשה על ידי חברות מיוחדות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו 1: הובלה מיטוכונדריאלית בתיווך TNT בין MSCs ותאי ARPE19. TNT נוצר באמצעות תנועה דו-כיוונית של תאי MSC ו-ARPE19, מה שמקל על העברת מיטוכונדריה מתאי MSC לתאי ARPE19. קיצורים: MSCs = תאי גזע מזנכימליים; TNTs = ננו-צינוריות מנהור. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

דיון

מחקרים רבים הוכיחו כי תופעת המעבר המיטוכונדריאלי בתיווך TNT היא תהליך פיזיולוגי שכיח בסוגים שונים של תאי רקמה 10,11,12,13. תרומה מיטוכונדריאלית תפקודית מתאי MSC לתאים עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מציגה פוטנציאל טיפולי חזק 3,14,15,16,17,18.

כאן, כדי להציג העברה מיטוכונדריאלית דו-כיוונית בתיווך TNT בין MSCs ותאי ARPE19, בנינו קווי תאים MSC-mito-GFP ו-ARPE19-mito-RFP. לאחר מכן, שני סוגי התאים עברו תרבית משותפת במשך 24 שעות, וצביעה ציטו-שלדית בוצעה בסוף התרבית המשותפת. באמצעות הדמיה קונפוקלית צפינו וספרנו היווצרות TNT וקצב העברה מיטוכונדריאלי. התוצאות של תצפיות אלה עשויות להיות מושפעות מגורמים כגון שיעור התאים בתרבית משותפת וצפיפות התא. במהלך תרבית משותפת, הכרחי לערבב היטב את שני סוגי התאים ולשמור אותם במצב של תא אחד כדי למזער את היווצרות מושבות התאים על ידי תאים הומוטיפיים, ובכך להפחית את התרחשות המעבר המיטוכונדריאלי בין שני סוגי התאים.

ניתוח ציטומטרי של זרימה יכול לשמש באופן דומה לניתוח קצבי העברה מיטוכונדריאליים, ושיטה זו פשוטה יותר מסטטיסטיקה לאחר הדמיה. עם זאת, קצב העברת המיטוכונדריה המחושב בשיטה זו יהיה נמוך במקצת מהערך בפועל, מכיוון שכמויות קטנות של העברה מיטוכונדריאלית עשויות שלא להיות נרשמות. בפרוטוקול זה, ספירת תוצאות ההדמיה צריכה להיעשות בזהירות רבה כדי למנוע השמטות או ספירה שגויה של אותות מזויפים פלואורסצנטיים.

המחקר של העברה מיטוכונדריאלית דו-כיוונית על ידי בניית שני קווי תאים עם פלואורסצנטיות מיטוכונדריאלית הוא חידוש של פרוטוקול זה. השיטה מונעת התערבות של צבעים פלואורסצנטיים והופכת את תוצאות הניסוי לאמינות יותר. העברת מיטוכונדריה מתאי רשתית לתאי MSC ראויה למחקר נוסף, למשל, כדי לחקור שינויים בשיעור המיטוכונדריה המועברים לשני הכיוונים בתנאי לחץ.

על ידי הקפדה על ההליכים הניסיוניים המתוארים בפרוטוקול זה, הצלחנו לוודא כי MSCs יכולים להעביר מיטוכונדריה לתאי אפיתל פיגמנט ברשתית דרך ננו-צינוריות מנהור. תופעה זו עשויה לשמש כמנגנון מתקבל על הדעת העומד בבסיס ההשפעות המועילות של MSCs על רקמות הרשתית, ובכך לסייע בהבהרת טיפולים רגנרטיביים מונעי MSCs לרקמות העין.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מנוגדים.

תודות

אנו מודים ל- Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd על הדמיה עם מיקרוסקופ סופר-רזולוציה מסחרי (HIS-SIM), רכישת נתונים, שחזור תמונת SR, ניתוח ודיון. עבודה זו נתמכת חלקית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82125007,92368206) והקרן למדעי הטבע בבייג'ינג (Z200014).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTAGibco25200-056
4% פרפורמלדהידSolarbioP1110
צלחת 6 בארותNEST703001
צינור צנטריפוגה 15 מ"לBD Falcon352097
צלחת 24 בארותNEST702001
תאי ARPE19ATCCCRL-2302קווי תאים
אלבומין סרום בקר (BSA)BeyotimeST025
CellTrace סגולInvitrogenC34557
שקופית כיסויNEST801007
DMSOsigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
בקר עוברי סרום (FBS)VivaCellC04002-500
FluorSave מגיבMillipore345789
MSCsNuwacellRC02003קווי תאים
ncMissionShowninRP02010
עט StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1פלסמיד; מתוך  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
פיפטהאקסיג'ןTF-1000-R-S
פלואידיןInvitrogenA22287
טריטון X-100SolarbioT8200
צלחת טרנסוולקורנינג3470

מקורות

  1. Caprara, C., Grimm, C. From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease. Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).
  2. Ferrington, D. A., Fisher, C. R., Kowluru, R. A. Mitochondrial defects drive degenerative retinal diseases. Trends Mol Med. 26 (1), 105-118 (2020).
  3. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  4. Wei, B., et al. Mitochondrial transfer from bone mesenchymal stem cells protects against tendinopathy both in vitro and in vivo. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 104(2023).
  5. Borcherding, N., Brestoff, J. R. The power and potential of mitochondria transfer. Nature. 623 (7986), 283-291 (2023).
  6. Liu, D., et al. Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 65(2021).
  7. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  8. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-the path forward. Embo j. 40 (8), e105789(2021).
  9. Qin, Y., et al. The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells. Front Oncol. 11, 672781(2021).
  10. Jiang, D., et al. Bioenergetic crosstalk between mesenchymal stem cells and various ocular cells through the intercellular trafficking of mitochondria. Theranostics. 10 (16), 7260-7272 (2020).
  11. Domhan, S., et al. Intercellular communication by exchange of cytoplasmic material via tunneling nano-tube like structures in primary human renal epithelial cells. PLoS One. 6 (6), e21283(2011).
  12. Zhang, J., Zhang, Y. Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells. Sci China Life Sci. 56 (11), 994-999 (2013).
  13. Cheng, X. Y., et al. Human ipscs derived astrocytes rescue rotenone-induced mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in vitro by donating functional mitochondria. Transl Neurodegener. 9 (1), 13(2020).
  14. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  15. Li, C. J., Chen, P. K., Sun, L. Y., Pang, C. Y. Enhancement of mitochondrial transfer by antioxidants in human mesenchymal stem cells. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8510805(2017).
  16. Paliwal, S., Chaudhuri, R., Agrawal, A., Mohanty, S. Regenerative abilities of mesenchymal stem cells through mitochondrial transfer. J Biomed Sci. 25 (1), 31(2018).
  17. Lin, T. K., et al. Mitochondrial transfer of wharton's jelly mesenchymal stem cells eliminates mutation burden and rescues mitochondrial bioenergetics in rotenone-stressed melas fibroblasts. Oxid Med Cell Longev. 2019, 9537504(2019).
  18. Hu, X., Duan, T., Wu, Z., Xiong, Y., Cao, Z. Intercellular mitochondria transfer: A new perspective for the treatment of metabolic diseases. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 53 (7), 958-960 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Mito GFPMito RFP
העברה מיטוכונדריאלית באמצעות ננו-צינוריות מנהור בין תאי גזע מזנכימליים ואפיתל פיגמנט ברשתית במבחנה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.