שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

Summary

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

Abstract

תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) הם קריטיים לתפקוד תקין של הרשתית. תפקוד לקוי של RPE מעורב בפתוגנזה של מחלות רשתית חשובות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ורטינופתיה סוכרתית. אנו מציגים גישה יעילה לבידוד RPE מעיניים בוגרות. בניגוד לשיטות שדווחו בעבר, גישה זו מאפשרת בידוד ותרבית של RPE טהור ביותר מעכברים בוגרים. שיטה פשוטה ומהירה זו אינה דורשת מיומנות טכנית נרחבת והיא ניתנת להשגה באמצעות כלים מדעיים בסיסיים וריאגנטים. RPE ראשוני מבודד מעכברי רקע C57BL/6 בגילאי 3 עד 14 שבועות על ידי שאיבה של העין ואחריה הסרת המקטע הקדמי. טריפסיניזציה אנזימטית וצנטריפוגה משמשים לניתוק ולבידוד RPE מכוס העין. לסיכום, גישה זו מציעה פרוטוקול מהיר ויעיל לניצול RPE בחקר תפקוד הרשתית ומחלות.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי תאי מיוחד המצפה את קרום ברוך הממוקם בין פוטורצפטורים לבין כורואיד¹. תאי RPE ממלאים תפקיד קריטי בתפקוד תקין של הרשתית. תאי RPE מובילים גלוקוז וויטמין A לקולטני אור, מקדמים ראייה על ידי איזומריזציה מחדש של רשתית all-trans לתוך רשתית 11-cis ושומרים על מקטעים חיצוניים של photoreceptor באמצעות phagocytosis של מקטעים חיצוניים שנשפכו, להסיר מים מהחלל subretinal, ליצור את מחסום הדם-רשתית החיצוני באמצעות נוכחות של צמתים הדוקים להפריש גורמי גדילה נוירוטרופיים (כגון פיגמנט אפיתל נגזר פקטור, ו-Basic Fibroblast Growth Factor) התומכים בפוטורצפטורים². תפקוד לקוי של תאי RPE מעורב בפתוגנזה של רטינופתיות שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ורטינופתיה סוכרתית ^3,4,5. מחקרי מבחנה המשתמשים בתאי RPE הם קריטיים לשיפור הבנתנו את הפתוגנזה של מחלות אלה. תאי RPE ראשוניים מועדפים בהרבה עבור מחקרים אלה מכיוון שקווי תאי RPE, בעוד שהם זמינים, חסרים מאפיינים עיקריים של תאי RPE ראשוניים.

בעוד שמינים שונים שימשו כמקורות לתאי RPE ראשוניים, לעכברים יש את היתרון של שימוש בשינויים גנטיים כדי לעזור להבין את הפתוגנזה של רטינופתיות. פרוטוקולים שתוארו בעבר לבידוד תאי RPE ממכרסמים דורשים שימוש בבעלי חיים בילודים, הם ארוכים, דורשים מיומנות טכנית, או אינם מתאימים לתרבית 6,7,8,9,10,11,12. אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה לבידוד תאי RPE מעכברים בוגרים המניבים תרביות טהורות ביותר של תאים אלה.

Protocol

השימוש בבעלי חיים במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב.

1. הכנת ריאגנטים

1. הכינו את מדיום חיץ הכביסה על ידי השלמת תמיסת המלח המאוזנת של Hank (HBSS), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום עם תמיסת חיץ HEPES של 10 mM. יש לשמור את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
2. הכינו מדיום RPE על ידי השלמת מדיום הנשר המתוקן של Dulbecco עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, תוסף גלוטמקס 1.25x (ריכוז מלאי 100x או 200 mM; ריכוז סופי של 2.5 mM L-גלוטמין), עם 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ותמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 1x MEM (100x). לפני השימוש, לחמם מראש את המדיה ל 37 ° C באמבט מים.

2. חילוץ עין עכבר

1. המתת חסד של העכבר, רצוי בטווח של 3 עד 14 שבועות, באמצעות שיטה מאושרת IACUC של המתת חסד (נקע צוואר הרחם בהרדמה באמצעות קוקטייל קטמין/קסילזין ב 0.1 מ"ל לכל 20 גרם עכבר [87.5 מ"ג / ק"ג קטמין ו 12.5 מ"ג / ק"ג קסילזין] הייתה השיטה ששימשה במחקר זה).
   הערה: עיניים שנאספו מעכברים צעירים יותר יאפשרו תפוקה מוגברת של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית לאורך זמן ויאריכו את היכולת למעברים עוקבים.
2. השכיבו את העכבר שטוח על צדו כשהעין מכוונת כלפי מעלה.
3. הניחו את האצבע המורה והאגודל מעל ומתחת לעין, בהתאמה. הפעילו בעדינות לחץ על מבנה העצם המקיף את העין כדי לגרום לבליטה של גלגל העין.
4. הכנס את קצה המספריים הפתוחים מעט מתחת לעין וסובב בעדינות את פרק כף היד הרחק מהעין ב-90° עד שהעין תתנתק מהשקע.
   הערה: אין לסגור את המספריים כדי לחתוך את העין או את עצב הראייה, מכיוון שזה יקשה על דיסקציה של העין.
5. יש להניח מיד ולגלגל את העין באתנול 70% למשך לא יותר מ-5 שניות לפני העברתו למדיום חיץ לשטיפה השמור על קרח.
6. תחת מיקרוסקופ מנתח, מעבירים עין אחת בכל פעם לצלוחית פטרי מלאה בחיץ כביסה ורצועות גזה ספוגות.
7. לייצב את העין על ידי החזקת עצב הראייה עם פינצטה. יש לבצע בעדינות חתך בגובה האורה-סראטה באמצעות סכין כירורגית בקוטר 3.00 מ"מ 45° או סכין גילוח בגודל 0.009 אינץ'.
8. בעזרת מספריים של Vannas, מחדירים בעדינות את המספריים לתוך החתך וחותכים סביב היקף ה-ora serrata עד שניתן להסיר ולהשליך את המקטע הקדמי והזגוגית.
9. מקלפים בעדינות את הרשתית מהעין בעזרת מלקחיים קשורים, נזהרים שלא להפריע לשכבת ה-RPE.
   הערה: כדי להקל על הסרת הרשתית, מלאו פיפטת העברה במדיום חיץ לשטיפה ומרחו אותה בזהירות על קצוות העין כדי להרים בעדינות את הרשתית.
10. לבסוף, הסר את עצב הראייה ואת רקמת החיבור העודפת מהעין באמצעות מספריים. היזהר לא לנקב את העין.

3. בידוד RPE ראשוני

1. מעבירים את העין לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 0.25% טריפסין + 0.02% EDTA.
   הערה: ניתן להוסיף שתי כוסות עיניים לאליציטוט אחד של טריפסין-EDTA כדי להגדיל את התשואה של RPE הניתן לגידול.
2. מעבירים צינורות מיקרוצנטריפוגות לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C ודגרים למשך 10 דקות. כל 2 דקות, הסר את הצינורות מאמבט המים והקש בחוזקה על תחתית הצינור 40 פעמים על השיש.
3. לאחר 10 דקות, יש לשבש בעדינות את העין באופן מכני באמצעות P1000 או צינור סרולוגי בנפח 2 מ"ל על ידי פיטום למעלה ולמטה לא יותר מ-3 פעמים.
   הערה: פיצול של יריעות RPE הוא חיוני מכיוון שגיליונות גדולים לא יידבקו כראוי.
4. נטרלו את הטריפסין באופן מיידי על ידי שכבות של יריעות RPE מנותקות, אך לא את העין, על 0.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
5. יתר על כן, לדלל את טריפסין על ידי שכבות 3 מ"ל של מדיה RPE dropwise על שכבות של יריעות FBS ו- RPE.
6. צנטריפוגה את RPE ב 340 x גרם במשך 3 דקות.
7. השליכו את תאי הסופרנאטנט והשהו מחדש בכמות מתאימה של מדיית RPE עבור צלחת 24 בארות (1.9 ס"מ²/באר) או צלחת 48 בארות (0.75 ס"מ²/באר).
   הערה: ניתן לצפות RPE על לוחות היטב המצופים בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים, במיוחד למינין, קולגן IV או פיברונקטין כדי להגביר את ההיצמדות¹¹. RPE יכול גם להיות מושעה מחדש ב 1 מ"ל של מדיה RPE ושכבות על שיפוע הפרדת צפיפות 40% כדי לבודד עוד יותר תאי RPE טהורים. בנוסף, סיבוב הצלחת במהירות של 340 x גרם למשך 3-5 דקות עשוי להגביר את היצמדות התאים¹³.
8. יש לדגור ב-37°C ב-5% CO₂.

4. טיפוח RPE

1. אין לשבש את RPE המבודד במשך 3 ימים לפחות. לאחר 72 שעות, הסירו בעדינות את המדיום הישן והחליפו אותו במדיה טרייה שחוממה מראש.
2. שנה את המדיום כל 48 שעות לאחר 3 הימים הראשונים.
3. ברגע שהתאים מגיעים למפגש, עוברים את התאים באמצעות 0.25% טריפסין + 0.02% EDTA ומפחיתים את ה-FBS במדיית RPE ל-2%.
   הערה: בעבר דווח כי RPE ראשוני יתחיל דה-דיפרנציאציה לאחר 5-7 מעברים ויתחיל לאבד את צורת המשושה והפיגמנטציה שלו¹⁴.

Results

הפרוטוקול המתואר שימש בעכברי רקע C57BL/6. נראה כי מגדר אינו משנה את היכולת לתרבות RPE. עכברים מתחת לגיל 6 שבועות מניבים יריעות RPE מוגבלות בהשוואה לעכברים מבוגרים, וייתכן שיהיה צורך ביותר עיניים כדי להגיע למפגש אופטימלי. לאחר הבידוד, לתאי RPE לוקח בערך 3 ימים להתייצב ולהתחבר לצלחת תרבית התא. כ-24 שעות לאחר הבידוד, תאים עגולים ופיגמנטיים שנראים אנוקלאט החלו לשקוע אך לא נצמדו באופן מלא לצלחת (איור 1A). במהלך 48-72 השעות הבאות, התאים מתחילים להיצמד ולהתפשט תוך שמירה על פיגמנטציה כהה וגרעין שקוף (איור 1B,C). לאחר 5 ימים, RPE הגביר את המפגש והחל ליצור מגעים בין תאים שמזכירים שכבה חד-שכבתית מקוטבת עם צורה משושה (איור 1D).

RPE מבודדים הוערכו לטוהר ותקינות צומת הדוקה לאחר 6 ימים בתרבית. RPE הוערך לראשונה עבור נוכחות של רטינואיד איזומרוהידרולאז או חלבון פיגמנט רשתית אפיתל 65 kDA (RPE65), סמן ספציפי עבור RPE (איור 2, ירוק). בנוסף, כדי ש-RPE ייצור שכבה אחת של תאים פיגמנטיים ובצורת משושה, הצמתים בין תאים חייבים להישאר שלמים. חלבון צומת הדוק -1 או zonula occludens-1 (ZO-1) הם חלבוני פיגומים החיוניים לתחזוקה ולשלמות של הצמתים הצפופים בין תאי RPE בודדים¹⁴. תרביות RPE מבודדות שמרו על חלבוני הצומת הבין-תאיים שלהן, שהודגמו על-ידי צביעה של ZO-1 שנמצא בשולי התא (איור 2, אדום). ברגע שתאים אלה מגיעים למפגש ביריעות גדולות, הם שומרים על מגעים בין תאים מבלי לגדול יתר על המידה במשך עד שבועיים. מחקרים קודמים הראו כי ZO-1 מתבטא בצורה גבוהה עד 9 ימים בתרבית¹⁵. סמנים נוספים המשמשים בתרביות של RPE ראשוני כוללים קולגן IV, CRALBP ו-OTX2¹¹.

איור 1. מורפולוגיה של RPE ראשוני עכבר בתרבית על צלחת פוליסטירן סטנדרטית 24 בארות. (A) RPE ראשוני שבודד משתי עיניו של עכבר C57BL/6 ותורבת בבאר אחת של צלחת פוליסטירן 24 בארות תרבית רקמה לא מצופה מיד לאחר הבידוד. (ב,ג) לאחר 48 שעות ו -72 שעות, RPE ראשוני מתחיל להיצמד לצלחת וליצור תאים פיגמנטיים, דו-חיים. (D) לאחר 5 ימים, מיקרוסקופ שדה בהיר מראה שהתאים ההיפרפיגמנטיים בצורת משושה מגבירים את המפגש ומתחילים ליצור מגעים בין תאים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. סמן ספציפי ל-RPE, RPE-65, וסמן צומת בין-תאי, ZO-1, נשמרים ב-RPE מורין ראשוני מבודד. RPE ראשוני משלושה עכברי C57BL/6 תורבתו במשך 6 ימים לפני הקיבוע עם 4% פרפורמלדהיד. התאים היו חדורים עם 0.1% Triton-X ב-PBS למשך 5 דקות, נחסמו עם 5% סרום עיזים רגיל, והודגרו עם נוגדנים נגד RPE-65 (ירוק) או ZO-1 (אדום). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. ייצוג סכמטי פשוט של פרוטוקול בידוד אפיתל פיגמנט ברשתית. לאחר הסרת גלגל העין מהעכבר, לעקר את העין על ידי טבילתה קצרה באתנול 70% לפני המעבר למאגר השטיפה. בחיץ השטיפה, חותכים לאורך האורה-סראטה ומסירים את המקטע הקדמי. הסר את הרשתית והנח את המשקפיים בצינור עם טריפסין/EDTA. טפחו בעדינות על הצינור שעל הדלפק כל 2 דקות למשך 10 דקות בסך הכל, העבירו את הסופרנאטנט לצינור חרוטי של 15 מ"ל, וצנטריפוגו את גלולת RPE. מרחפים מחדש את התאים ואת הצלחת על צלחת 24 או 48 בארות. גרפיקה שנוצרה באמצעות BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

במאמר זה, תיארנו פרוטוקול פשוט לבידוד ולתרבית של אפיתל פיגמנט רשתית מורין. תאי RPE שבודדו מעיניהם של עכברים בוגרים ביטאו סמן ספציפי ל-RPE, RPE65, וסמן צומת בין-תאי, ZO-1. בנוסף, התאים בתרבית התפתחו ליריעות פיגמנטיות משושות בתרבית.

מספר שיטות לבידוד RPE במכרסמים פורסמו בעבר 6,7,8,9,10,11,12. פרוטוקולים רבים מקלפים את שכבות ה-RPE מממברנת הברוך, דורשים מיומנות טכנית ומעלים את הסיכון לנזק ל-RPE או למוות תאי 6,7,9,11,12,16. לפיכך, פרוטוקול זה משתמש בניתוק אנזימטי של שכבת RPE, ולא בדיסוציאציה מכנית, כדי לקדם הישרדות ולשמור על שלמות יריעות RPE בתרבית. שיטה זו מניבה RPE עכברי בתרבית השומרת על מורפולוגיית RPE עם תאים בעלי פיגמנט גבוה ובצורת משושה המשמרים את הביטוי של חלבוני צומת הדוק. בנוסף, פרוטוקול זה חסר שימוש בריאגנטים מורכבים או בחומרים המשמשים בפרוטוקולים אחרים, כגון תוספות קרום חדירות, חלבוני ציפוי מטריצה חוץ-תאיים נוספים, או ריאגנטים מיוחדים לדיסוציאציה של רקמות. במקום זאת, פרוטוקול זה משתמש בעיכול אנזימטי פשוט באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA בשילוב עם תסיסה רקמתית כדי לנתק את שכבת RPE מהקרום של ברוך. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה על עכברים בגילאי 3 עד 14 שבועות; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בעיניים נוספות כדי להשיג בהצלחה תרבות משולבת בעכברים צעירים.

מספר אתגרים עשויים להתעורר במהלך ביצוע פרוטוקול זה. נדרשת מיומנות טכנית כדי לחתוך במדויק סביב האורה-סראטה ולהסיר בזהירות את הרשתית מבלי להפריע לשכבת ה-RPE. הרשתית עלולה להיות מופרעת בעת חיתוך היקף הסקלרה, אשר יכול לשנות את הכדאיות RPE. חידוד טכניקה זו יכול להתבצע רק באמצעות תרגול חוזר ומתמשך. בנוסף, יריעות RPE עשויות להישאר מחוברות לשכבת הרשתית לאחר ההסרה. כדי למנוע אובדן עודף של RPE, לעורר היפרדות רשתית באמצעות מזרק או להעביר פיפטה מלאה במדיום חיץ כביסה כדי להרים בעדינות את הקצוות של הרשתית מן העין. דגירה היאלורונידאז יכולה גם להקל על ניתוק¹⁶. במידה ו-RPE אינם מתנתקים כראוי מהקרום והכורואיד של הברוך, יש להגדיל את זמן הדגירה עם טריפסין באמבט המים. בנוסף, יש להקפיא אליציטוטים של טריפסין טרי בטמפרטורה של -20°C ולהפשיר ישירות לפני השימוש כדי לשמור על פעילות אנזימטית אופטימלית. כישלון של RPE להיצמד לצלחת הבאר לאחר בידוד יכול להתרחש אם תאים נזרעים בצפיפות נמוכה מדי או אם RPE ניזוקו במהלך תהליך הבידוד. בנוסף, הפרוטוקול שלנו אינו דורש ציפוי של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) לתרבית. עם זאת, חלבוני ECM, כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן IV, למינין (laminin) או קולגן I (collagen I) הוכחו כמגבירים את ההתקשרות של תאים, ויש לשקול אותם אם ההיענות לקויה¹¹.

כדי להגדיל את התשואה של חד-שכבות בתרבית RPE, אגרו לפחות 2-3 עיניים של עכברים תואמי גיל עם אותו רקע גנטי; תאים יכולים לאבד את צורת המשושה והפיגמנט שלהם עם הזמן אם לא נזרעים בצפיפות גבוהה מספיק. עבור עכברים מעל גיל 8 שבועות, 2 עיניים לכל צלחת 24 באר צריך להיות מספיק עבור מפגש אופטימלי. אם עכברים הם מתחת לגיל 8 שבועות, 3-4 עיניים יביא להיצמדות טובה יותר ומפגש. עם הזמן, תאים עשויים להיות רגישים למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) עם אובדן פיגמנטציה ורכישת צורה מוארכת. תוספת של מעכבי Rho-Kinase ו-TGFβR-1/ALK5, כגון Y27632 ו-Repsox, בהתאמה, יכולה למנוע EMT של תאי RPE בתרבית¹². בעוד פרוטוקול הבידוד קצר, ודורש רק שעה אחת לבידוד של 2-4 עיניים, התרבית הראשונית עשויה להימשך עד 7-10 ימים כדי להגיע למפגש מלא. בנוסף, RPE עובר מוגבל, עם סיכון מוגבר של EMT בכל מעבר עוקב.

תאי אפיתל פיגמנט ברשתית הם תאים קריטיים לשמירה על הומאוסטזיס בעין. RPE פועלים כפגוציטים כדי לסייע בתחזוקה של פוטורצפטורים, למנוע נזק לשכבות עצביות מאור, ולפעול כמחסום אפיתל הדוק כדי לווסת את התחבורה¹⁷. מחלות המשפיעות ישירות על RPE, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ורטינופתיה סוכרתית, יכולות להחמיר דלקת, להגביר אפופטוזיס ולשבש צמתים תאיים, מה שמוביל להסתברות מוגברת לניוון רשתית ועיוורון¹⁷. טיפוח RPE ראשוני מאפשר את המחקר של הפתוגנזה של מחלות עיניים המשפיעות על RPE. לסיכום, הפרוטוקול שלנו מקצר את משך הבידוד ומפשט את הטכניקות והריאגנטים הדרושים תוך שמירה על תרבית תאים ברמת טוהר גבוהה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין, סודיום פירובט
סרום בקר עוברי	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום
HEPES תמיסת חיץ (1M)		של Gibco
MEM, 100x	Gibco	11140050
סכין מיקרו-Unitome	BVI Beaver	377546
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100x	Corning	30-002-CI
Microstyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well או 48-well
סרום בקר עוברי	רגיל קורנינג	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	עם פנול אדום
Vannas מספריים	Fine Science	Tools 10091-12