בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Summary

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

Abstract

ניוון נימי הרשתית הוא סימן היכר קליני של השלבים המוקדמים של רטינופתיה סוכרתית (DR). המחקרים האחרונים שלנו גילו כי התקשות נימי רשתית הנגרמת על ידי סוכרת ממלאת תפקיד סיבתי מכריע שלא היה מוכר בעבר בניוון מתווך דלקת של נימי הרשתית. העלייה בנוקשות נימי הרשתית נובעת מביטוי יתר של ליזיל אוקסידאז, אנזים המצליב ומקשיח את המטריצה התת-אנדותלית. מכיוון שהתמודדות עם DR בשלב מוקדם צפויה למנוע או להאט את התקדמות DR ואובדן ראייה נלווה, מטריצה תת-אנדותלית ונוקשות נימים מייצגים מטרות טיפוליות רלוונטיות וחדשניות לניהול DR מוקדם. יתר על כן, מדידה ישירה של נוקשות נימי הרשתית יכולה לשמש כשלב אימות פרה-קליני מכריע לפיתוח טכניקות הדמיה חדשות להערכה לא פולשנית של נוקשות נימי הרשתית בבעלי חיים ובבני אדם. בהתחשב בהשקפה זו, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט למדידת בידוד ונוקשות של נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

Introduction

נימי רשתית חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ברשתית ותפקוד הראייה. ואכן, הניוון שלהם בסוכרת מוקדמת מעורב מאוד בהתפתחות סיבוכים מסכני ראייה של רטינופתיה סוכרתית (DR), מצב כלי דם המשפיע על כמעט 40% מכלל האנשים עם סוכרת¹. דלקת כלי דם תורמת באופן משמעותי לניוון נימי הרשתית ב- DR. מחקרים קודמים הדגימו תפקיד חשוב לרמזים מולקולריים וביוכימיים חריגים בדלקת כלי דם ברשתית^הנגרמת על ידי סוכרת ^2,3. עם זאת, עבודה חדשה הציגה פרדיגמה חדשה לפתוגנזה של DR המזהה התקשות נימי רשתית כגורם מכריע אך לא מוכר בעבר של דלקת כלי דם ברשתית וניוון ^4,5,6.

באופן ספציפי, העלייה הנגרמת על ידי סוכרת בנוקשות נימי הרשתית נגרמת על ידי upregulation של אנזים crosslinking קולגן ליזיל אוקסידאז (LOX) בתאי אנדותל רשתית (ECs), אשר מקשיח את המטריצה subendothelial (קרום מרתף)^4,5,6. התקשות מטריצה, בתורה, מקשיחה את ECs הרשתית שמעל (עקב הדדיות מכנית), ובכך מובילה לעלייה הכוללת בנוקשות נימי הרשתית⁴. באופן מכריע, התקשות נימי רשתית זו הנגרמת על ידי סוכרת לבדה יכולה לקדם הפעלת EC ברשתית ומוות EC בתיווך דלקת. ניתן לייחס ויסות מכני זה של פגמים ב- EC ברשתית לשינוי במכנוטרנסדוקציה של האנדותל, התהליך שבו רמזים מכניים מומרים לאותות ביוכימיים כדי לייצר תגובה ביולוגית ^7,8,9. חשוב לציין, רמזים מכניים EC משתנים ומבנה מטריצה תת-אנדותל היו מעורבים גם בניוון כלי דם כורואידי הקשור לניוון מקולרי הקשור לגיל מוקדם (AMD)10,11,12, מה שמעיד על ההשלכות הרחבות יותר של מכנוביולוגיה וסקולרית במחלות רשתית ניווניות.

יש לציין כי התקשות נימי הרשתית מתרחשת בשלב מוקדם בסוכרת, אשר עולה בקנה אחד עם הופעת דלקת ברשתית. לפיכך, העלייה בנוקשות נימי הרשתית עשויה לשמש הן כמטרה טיפולית והן כסמן אבחוני מוקדם עבור DR. לשם כך חשוב לקבל מדידות קשיחות אמינות וישירות של נימי הרשתית והמטריצה התת-אנדותלית. ניתן להשיג זאת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), המציע טכניקה ייחודית, רגישה, מדויקת ואמינה למדידה ישירה של קשיחות תאים, מטריצה חוץ-תאית ורקמות¹³. AFM מפעיל כוח הזחה זעיר (ברמת ננו-ניוטון) על הדגימה שקשיחותה קובעת את המידה שבה ה-AFM הנכנס מתכופף - ככל שהדגימה נוקשה יותר, כך הקנטיל מתכופף יותר, ולהיפך. השתמשנו ב-AFM באופן נרחב כדי למדוד את הנוקשות של תאי אנדותל בתרבית, מטריצות תת-אנדותליות ונימי רשתית מבודדים^{של עכבר} 4,5,6,11,12. מדידות קשיחות AFM אלה סייעו לזהות מכנוביולוגיה אנדותל כגורם מפתח של פתוגנזה של DR ו- AMD. כדי לעזור להרחיב את היקף המכנוביולוגיה בחקר הראייה, כאן אנו מספקים מדריך שלב אחר שלב על השימוש ב- AFM למדידות קשיחות של נימי רשתית עכבר מבודדים ומטריצת תת-אנדותל.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים וטיפול (IACUC; פרוטוקול מספר ARC-2020-030) באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (OLAW institution animal welfare assurance number A3196-01). הפרוטוקול הבא בוצע באמצעות נימי רשתית שבודדו מעכברי C57BL/6J זכרים בוגרים (בני 20 שבועות) במשקל ~25 גרם (עכברים סוכרתיים) ו~32 גרם (עכברים שאינם סוכרתיים; מעבדת ג'קסון).

1. בידוד נימי רשתית עכבר למדידת קשיחות AFM (ימים 1-4)

הערה: פרוטוקול זה, שדווח במחקר⁴ שנערך לאחרונה, מפרט את הקיבוע והקיבוע הקל של עין העכבר, בידוד הרשתית ועיכול טריפסין, ולאחר מכן הרכבה של כלי הדם ברשתית כתוצאה מכך על שקופיות מיקרוסקופיה למדידת קשיחות AFM.

1. חינוך וקיבוע קל (יום 1)
   1. לאחר המתת העכבר בחשיפה לפחמן דו חמצני ואחריו נקע צוואר הרחם, הכנס מיקרו מלקחיים מאחורי גלגל העין, החזק את החיבור השרירי ומשוך בזהירות את העין מבלי לצבוט את המלקחיים הזעירים חזק מדי, מה שעלול לנתק את עצב הראייה.
   2. הניחו את העין המוחדרת בפורמלין 5% (v/v) ב-PBS למשך 24 שעות ב-4°C לקיבוע עדין.
      הערה: בהתבסס על ניסיון⁴, עיניים לא מקובעות או מקובעות קלות יותר מניבות נימים שבירים שהופכים מקוטעים במהלך הכנת דגימת AFM ומדידת נוקשות.
2. בידוד רשתית (יום 2)
   1. הניחו את העין המקובעת על פיסת נייר שעווה מתחת למיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן, באמצעות מיקרו מלקחיים, החזיקו את שאריות השריר ועצב הראייה המחוברים לחלק החיצוני של העין האחורית וכוונו את העין כך שהקרנית תפנה לצד אחד (איור 1).
   2. באמצעות להב כירורגי, לבצע חתך 1-2 מ"מ מאחורי ובמקביל לימבוס (צומת קרנית-סקלרה). לאחר מכן, בזמן שאתם מחזיקים את העין במקומה עם המלקחיים הזעירים, הפעילו כוח כלפי מטה עם הלהב והמשיכו ללחוץ עד שהמקטע הקדמי של העין מופרד לחלוטין מהקצה האחורי (איור 1). יש להשליך את המקטע הקדמי ואת העדשה. אין לראות קדימה ואחורה מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרשתית.
   3. מעבירים את המקטע האחורי (סקלרה, כורויד ורשתית) לצלחת בקוטר 6 ס"מ מלאה ב-PBS (pH 7.4).
   4. באמצעות מרית מיקרו ובו זמנית להחזיק בעדינות את עצב הראייה עם מיקרו מלקחיים, לגרוף החוצה את הרשתית. אחסנו את הרשתית בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל PBS בטמפרטורה של 4°C עד לבידוד נימי.
       
3. שטיפות רשתית
   1. כדי לשטוף רשתית אחת, מלא שש בארות של צלחת 12 בארות עם 1 מ"ל של H₂O מזוקק כפול (ddH₂O). לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר הפוך, להעביר את הרשתית מן צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל לתוך הבאר הראשונה.
   2. שטפו את הרשתית בשייקר המסלול במהירות 120 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   3. בעזרת פיפטה P1000, בזהירות פיפטה מים למעלה ולמטה הסמוך לרשתית, נושף מים על הרשתית כדי לגרום תסיסה עדינה.
   4. בעזרת פיפטת הזכוכית ההפוכה, מעבירים את הרשתית לבאר השנייה וחוזרים על שלבים 1.3.2 ו-1.3.3 4 פעמים, כאשר כל שטיפה נעשית בבאר טרייה (ddH₂O-containing).
   5. לבסוף, העבירו את הרשתית לבאר השישית ושטפו אותה למשך הלילה (O/N) ב-RT על השייקר האורביטלי שנקבע ב-100 סל"ד כדי להקל על הפרדת תאי העצב ברשתית מכלי הדם במהלך עיכול טריפסין.
4. עיכול טריפסין ברשתית (יום 3)
   1. הכינו תמיסת טריפסין 10% (w/v) על ידי המסת אבקת טריפסין 1:250 במאגר Tris (pH 8; 0.1 M). ערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינור החרוטי מספר פעמים כדי למזער את היווצרות הבועות, מה שמקשה על אישור מסיסות הטריפסין.
   2. אזנו את תמיסת הטריפסין 10% באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 10-15 דקות. לאחר שאבקת הטריפסין התמוססה לחלוטין, סננו את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.2 מיקרומטר.
   3. בצלחת של 12 בארות, מוסיפים 2 מ"ל/באר/רשתית של תמיסת טריפסין 10% מסוננת. הוסיפו תמיסת טריפסין נוספת בבאר השכנה (כדי לאזן את דפנות פיפטת הזכוכית לשלבים הבאים).
   4. הוסף 3 מ"ל של ddH₂O בשלוש בארות של צלחת 6 בארות (להקדיש את שלוש הבארות האלה עבור רשתית אחת).
   5. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, הכנס קצה P200 לפני הוספת 4 מ"ל של תמיסת טריפסין 10% מסוננת. העבירו צינור חרוטי זה לאמבטיה בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר לקצה להיות ספוג בטריפסין למשך 2-3 דקות, מכיוון שזה עוזר למנוע מהרשתית להידבק לדפנות הקצה בשלבים האחרונים.
   6. לאחר שטיפת O/N של הרשתית (משלב 1.3.5), יש להשתמש בפיפט P1000 כדי להקפיץ בזהירות מים למעלה ולמטה בסמוך לרשתית, תוך התזת מים על הרשתית כדי לגרום לתסיסה עדינה.
   7. בעזרת פיפטה מזכוכית הפוכה, מעבירים את הרשתית השטופה לבאר המכילה טריפסין של צלחת 12 הבארות (משלב 1.4.3). ודא כי הרשתית מועברת עם כמות מינימלית של ddH_{שיורית 2}O כדי לא לדלל את תמיסת טריפסין באופן משמעותי. לדגור במשך 3 שעות ב 37 ° C.
   8. מרכוז קצה P200 ספוג טריפסין (משלב 1.4.5) על אזור עצב הראייה, מקפיץ בעדינות את כל רשת כלי הדם מעלה ומטה כדי לנתק את הרקמה הלא וסקולרית¹⁴.
   9. בעזרת פיפטה מזכוכית הפוכה שנשטפה מראש בטריפסין (על ידי הזרמת טריפסין למעלה ולמטה 5 פעמים), מעבירים את כלי הדם ברשתית לבאר הראשונה המכילה ddH₂O של צלחת 6 הבארות (משלב 1.4.4).
   10. סובבו את הצלחת והפיפטה את כלי הדם מעלה ומטה באמצעות פיפטת זכוכית הפוכה שטופת טריפסין כדי להסיר שאריות של רקמה לא וסקולרית.
   11. בעזרת פיפטת הזכוכית, מעבירים את כלי הדם ברשתית לבאר השנייה המכילה ddH2O של צלחת 6 הקידוחים ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד להרכבה על המגלשה למדידת קשיחות AFM.
       הערה: כלי דם ברשתית הידרציה (ב-PBS) שלמים מבחינה מבנית ב-4°C למשך עד שבועיים. עם זאת, מדידות נוקשות שגרתיות צריכות להתבצע מנימים טריים מבודדים.
5. הרכבת כלי הדם ברשתית למדידת קשיחות AFM (יום 4)
   1. באמצעות פיפטה זכוכית הפוכה שטופת טריפסין, להעביר את כלי הדם ברשתית לבאר השלישית ddH₂O המכילה את הצלחת 6-well כדי להסיר כל תמיסת טריפסין שיורית.
   2. נקה ביסודיות (באמצעות ddH₂O ורקמת מגב) מגלשת מיקרוסקופ משטח טעונה שתשמש להרכבת רשת כלי הדם למדידת קשיחות AFM.
      הערה: המשטח הטעון של המגלשה מספק קשירה חזקה לרשת כלי הדם במהלך מדידת AFM.
   3. תייג את השקופית וצייר אזור עגול של 4-5 ס"מ סביב המרכז עם עט הידרופובי כדי למנוע שפיכת מים במהלך השלבים הבאים.
   4. באמצעות פיפטה זכוכית שטופת טריפסין הפוכה, בזהירות להעביר את כלי הדם ברשתית למרכז האזור המסומן.
   5. בעזרת פיפטה P200, הסירו בזהירות כמה שיותר עודפי מים מקצה אחד מבלי לשאוף בטעות את כלי הדם לקצה.
   6. הניחו את המגלשה בארון בטיחות ביולוגית (מכסה מנוע BSL-2) קרוב לצד הקדמי (רשת מסוננת) והניחו לשאריות המים להתאדות.
   7. ברגע שכלי הדם כמעט יבשים, תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (הגדלה פי 4), יש לייבש בזהירות את כלי הדם על ידי הוספה איטית של ddH₂O עם פיפטה P200 בצד אחד של האזור המסומן. הוספת ddH₂O ישירות על כלי הדם גורמת לו להתנתק.
   8. צלם תמונות ניגודיות פאזה של כלי הדם המיובשים בהגדלות של 4x ו- 20x כדי להבטיח שיש לו שלמות מבנית טובה והוא פרוש כראוי (לא מתקפל על עצמו) ומחובר למגלשת זכוכית, שהם קריטריונים חיוניים למדידת קשיחות AFM אמינה.

2. קבלת מטריצה תת-אנדותל מתרביות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית (REC) (ימים 1-17)

הערה: פרוטוקול זה, הותאם מ- Beacham et al.¹⁵ ודווח במחקרים אחרונים ^4,5,6, מתאר תרבית REC על כיסויי זכוכית מותאמים, ולאחר מכן דה-צלולריזציה כדי לקבל מטריצה תת-אנדותל למדידת קשיחות AFM עוקבת.

1. הכנת כיסויי זכוכית מצופים ג'לטין וציפוי תאים (יום 1)
   הערה: בצע את ציפוי הג'לטין ואת שלבי השטיפה הבאים של ^PBS++ במכסה מנוע של תרבית רקמה לפני המעבר למכסה אדים כימי לשלבי הטיפול הבאים בגלוטאראלדהיד ובאתנולמין.
   1. מניחים כיסוי זכוכית עגול אחד בקוטר 12 מ"מ לכל באר של צלחת סטרילית בת 24 בארות ומוסיפים 500 μL של ג'לטין סטרילי 0.2% (w/v) שחומם מראש (מדולל ב-PBS המכיל סידן ומגנזיום; PBS⁺⁺) לכל באר המכילה כיסוי. לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   2. שאפו את תמיסת הג'לטין, שטפו את החלקות פעם אחת עם ^PBS++ סטרילי, והצליבו את הג'לטין המצופה על ידי הוספת 500 μL של 1% (v/v) גלוטראלדהיד למשך 30 דקות ב-RT.
   3. יש לאסוף ולסלק כראוי (בהתאם להנחיות המוסדיות) את תמיסת הגלוטראלדהיד לפני שטיפת החלקות עם ^PBS++ למשך 5 דקות על שייקר אורביטלי במהירות 100 סל"ד ב-RT. חזור על שלב שטיפה זה 5 פעמים. במהלך שלוש השטיפות הראשונות, הרימו את הכיסויים באמצעות פינצטה סטרילית כדי לאפשר שטיפה יסודית של הגלוטראלדהיד. כל כמות שיורית יכולה להפחית את כדאיות התא.
   4. הוסף 800 μL של אתנולמין 1M לכיסוי הצולב-ג'לטין למשך 30 דקות ב- RT כדי להרוות את כל שאריות הגלוטאראלדהיד בבאר.
   5. יש לאסוף ולסלק כראוי (בהתאם להנחיות המוסדיות) את תמיסת האתנולמין ולשטוף את הכיסויים 5 פעמים עם ^PBS++ למשך 5 דקות על שייקר אורביטלי ב-100 סל"ד ב-RT. במהלך שלוש השטיפות הראשונות, הרימו את הכיסויים באמצעות פינצטה סטרילית כדי לאפשר שטיפה יסודית של האתנולמין. כל כמות שיורית יכולה להפחית את כדאיות התא.
   6. הכיסויים הצולבים מוכנים כעת לציפוי תאים.
      הערה: למרות שאנו לוחצים תאים באופן שגרתי מיד לאחר הכנת הכיסוי, ייתכן שיהיה כדאי להשוות ציפוי תאים על כיסויי ג'לטין מוצלבים המאוחסנים ב- ^PBS++ ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים.
   7. בתנאים סטריליים בתרבית רקמה, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הרשתית (RECs) ב-500 מיקרוליטר בינוני/באר בצפיפות המשיגה 100% מפגש תוך 24 שעות, כפי שאושר במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
      הערה: חשוב להגיע למפגש תוך 24 שעות, שכן שתיית REC המתקבלת תגדיל את יכולתם של תאים להפריש מטריצה (עיין בשלב הבא). מניסיוננו עם RECs אנושיים, צפיפות ציפוי של 4 x 10⁴ תאים/ס"מ² מספיקה כדי להגיע למפגש תוך 24 שעות. עם זאת, מכיוון שגודל ה-REC משתנה בהתאם למינים (למשל, RECs של עכברים קטנים משמעותית), ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות הציפוי הראשונית.
2. ייצור מטריצה תת-אנדותל על ידי תרבית REC (יום 2-16)
   1. לאחר שהתאים מגיעים למפגש (~ 24 שעות), החלף את מדיום התרבית בתווך טרי בתוספת חומצה אסקורבית מסוננת סטרילית (ריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל).
      הערה: כל טיפול REC עם גורמי סיכון למחלות (למשל, גלוקוז גבוה, תוצרי גליקציה מתקדמים וכו ') או חומרים פרמקולוגיים יכול להתחיל עכשיו, יחד עם טיפול בחומצה אסקורבית.
   2. החליפו את מדיום התרבית עם תוספת חומצה אסקורבית אחת ליומיים למשך 15 יום.
      הערה: חומצה אסקורבית אינה יציבה בתמיסה. הכינו תמיסת מלאי 100X טרייה פעם ביומיים לתוספת בינונית.
3. דה-צלולריזציה של תרביות REC כדי לקבל את המטריצה התת-אנדותל (יום 16)
   1. לאחר 15 יום של טיפול בחומצה אסקורבית, הסירו את המדיום ושטפו את התאים עם PBS נטול סידן/מגנזיום.
   2. נטרל את תרביות REC על ידי הוספת 250 μL/לכל באר של חיץ דה-צלולריזציה חם (20 mM אמוניום הידרוקסיד ו-0.5% Triton X-100 ב-PBS) למשך ~2-3 דקות. אשר את הסרת התאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (הגדלה פי 10).
   3. הסר בעדינות את מאגר הדה-צלולריזציה מבלי להפריע למטריצה התת-אנדותל המופרשת על ידי REC והוסף 0.5 מ"ל PBS לכל באר.
      הערה: כדי להבטיח שהמטריצה התת-אנדותלית לא תתנתק במהלך שלב זה ושלבי השטיפה הבאים, בצע שטיפה עדינה רק עם פיפטה P1000. אין לבצע שאיפת ואקום.
   4. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי לייצב את המטריצה המופרשת על ידי REC.
4. טיפול DNase במטריצה תת-אנדותל לסילוק פסולת תאית (יום 17)
   1. שטפו את המטריצה התת-אנדותל משלב 2.3.4 עם 800 מיקרוליטר של PBS/באר.
   2. הסר בעדינות את PBS ודגר על המטריצה עם 200 μL של DNase I נטול RNase (30 K יחידות) ב 37 ° C למשך 30 דקות כדי להסיר את כל עקבות הפסולת התאית. בדוק את יעילות הטיפול ב- DNase על ידי חיפוש זהיר אחר פסולת תאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
   3. הסר בעדינות את תמיסת DNase I ושטוף את המטריצה התת-אנדותל פעמיים עם 800 μL של PBS/well.
   4. בדקו שהמטריצה התת-אנדותל הסיבית בקנה מידה מאקרו נראית תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (הגדלה של פי 10). הדמיה של סיבי מטריצה ננומטריים עדינים יותר דורשת סריקה טופוגרפית AFM או הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של חלבוני מטריצה בעלי תווית חיסונית בהגדלה של פי 100.
   5. השתמש מיד במטריצה תת-אנדותל טרייה (לא קבועה) למדידת קשיחות AFM.
   6. לאחר מדידת AFM, יש לתקן דגימות מטריצה עם 1% (v/v) paraformaldehyde (15 דקות בטמפרטורת החדר) ולאחסן בטמפרטורה של 4°C לצורך תיוג חיסוני עם נוגדנים כנגד חלבוני מטריצה תת-אנדותליים ו/או אנזימי crosslinking.

3. מדידת קשיחות AFM

הערה: פרוטוקול זה, שהותאם ממדריך למשתמש סטנדרטי של AFM ודווח במחקרים אחרונים ^4,5, מפרט את הרכישה והניתוח של נתוני קשיחות מנימי הרשתית וממטריצה תת-אנדותלית באמצעות תוכנת AFM וניתוח נתונים. למרות שהשלבים המתוארים להלן מבוססים על מודל ספציפי של AFM (ראה טבלת חומרים), העקרונות הבסיסיים ישימים בדרך כלל לכל דגמי AFM.

1. בחירת בדיקה Cantilever
   הערה: דגימות ביולוגיות רכות דורשות מיכלים רכים שיכולים להתכופף עם כניסת הדגימה בזמן שמידות הבדיקה נבחרות כך שיתאימו למידות הדגימה.
   1. למדידת קשיחות של כלי רשתית עכבר בקוטר 5-8 מיקרומטר, השתמש בבדיקה מסוג 1 μm רדיוס cantilever עם קבוע קפיץ (k) של 0.2-0.3 N/m. למדידת קשיחות של מטריצה תת-אנדותל המורכבת מסיבים ננומטריים, השתמש בבדיקה של רדיוס 70 ננומטר עם קבוע קפיץ (k) של 0.06-0.1 N/m.
2. הרכבה של קנטיליבר
   1. במחשב ה-AFM, פתח את התוכנה השולטת ביחידת ה-AFM ואת המצלמה המחוברת למיקרוסקופ ניגודיות פאזה המשמש להמחשת המזנון והדגימה.
   2. קבע את מחזיק השען על מעמד ההחתלה והרכיב את המגן שנבחר על המחזיק באמצעות מלקחיים של שען תחת סטריאוסקופ מבלי לגרום נזק פיזי למחזן. הדקו את הבורג על המחזיק כדי לאבטח את המזנון.
   3. הניחו ונעלו את מחזיק המגן על ראש ה-AFM המונח על המעמד.
   4. באמצעות פונקציית מנוע השלבים בתוכנת AFM, משוך את ראש ה-AFM לנקודה הגבוהה ביותר והגדר מיקום זה כנקודת אפס בתוכנה. שלב זה מונע מכלי ה-AFM לפגוע בטעות בשלב הדגימה בעת הרכבת ראש ה-AFM (השלב הבא).
   5. הרימו בזהירות את ראש ה-AFM מהמעמד שלו והרכיבו אותו על במת הדגימה של AFM על ידי הנחת הרגליים בחריצים המתאימים.
3. יישור לייזר
   הערה: יישור הלייזר הראשוני מתבצע ללא כל דגימה (כלומר, במצב אוויר) מכיוון שהוא מבטיח יישור מדויק יותר של קרן הלייזר על קצה הלייזר (על ידי מניעת שבירת לייזר בנוזל). עם זאת, מכיוון שדגימות ביולוגיות שקועות בתווך בעל מקדם שבירה שונה מזה של האוויר, חשוב ליישר מחדש את הלייזר בתווך לפני מדידת הנוקשות.
   1. ליישור לייזר באוויר, מקם את ראש ה-AFM על במת הדגימה והשתמש במטרה של 10x ובמצלמה המחוברת כדי להציג את המגן על הצג במצב חי. לייזר אינפרא אדום מוסתר מעיני המשתמש אך גלוי עם מצלמת CCD.
   2. בחר את הפונקציה Contact Mode Force Spectroscopy בתוכנה ופתח את החלון שכותרתו יישור לייזר.
   3. באמצעות שני הברגים המסומנים כלייזר רוחבי על ראש ה-AFM, מקדו את קרן הלייזר על הפתח כך שערך ה-SUM בחלון יישור הלייזר הוא הגבוה ביותר. כדי להשיג זאת, מקדו את הלייזר במרכז הקנטיליבר או סביבו.
   4. באמצעות ברגי הכוונון של הגלאי, כוונן את הגלאי כך שנקודת הלייזר תהיה במרכז חלון יישור הלייזר.
   5. באמצעות בורג כוונון המראה, כוונן את המראה כדי להבטיח שערך SUM יהיה בערך הגבוה ביותר האפשרי.
      הערה: ערך SUM גבוה מבטיח הערכה רגישה ומדויקת של קשיחות המדגם. לפיכך, יש לבצע הן את שלבי יישור הלייזר והן את שלבי התאמת המראה כדי להשיג את ערך הסכום הגבוה ביותר.
   6. לאחר מכן, ליישור לייזר בנוזל, הוסיפו את מדיום התרבית הרצוי בצלחת והרכיבו אותו בחוזקה על הבמה כדי למנוע רטט או סחף, מה שיוצר ממצאי מדידה במהלך הזחת הדגימה.
   7. תוך כדי התבוננות בהזנת המצלמה החיה הממוקדת בקנטיליבר, הורידו אותו לתוך הנוזל באמצעות פונקציית מנוע השלבים.
   8. חזור על שלבים 3.3.4 ו- 3.3.5 כדי להבטיח שערך SUM יישאר הגבוה ביותר ושנקודת הלייזר תהיה במרכז חלון יישור הלייזר.
4. כיול קבוע קפיץ הקפיצים
   הערה: למרות שגשושיות Cantilever מגיעות עם קבוע קפיץ מכויל על-ידי היצרן (k), מומלץ לאמת באופן עצמאי את ערכו (בנוזל) לפני תחילת המדידה. השתמשו במשטח זכוכית נקי שממזער את האינטראקציות בין הגשושית לבין משטח הזכוכית.
   1. כוח הסטנקופוינט המופעל על ידי הקנטיל קובע את הסטת הלייזר המרבית מהקנטליבר המותרת לכניסת כוח. הגדר אותו בתחילה על 1.5 V. אם הקנטיל אינו מתקרב בכוח נתון זה, הגדל אותו בהדרגה עד שהוא יוזח פנימה את הדגימה ויוצר עקומת הזחת כוח.
   2. אורך Z מציין את המרחק המרבי שבו ה-z-piezo נסוג לאחר שהקנטיל הגיע לנקודת ההתחלה במהלך הזחת הדגימה. אורך Z צריך להיות לפחות מספיק כדי להבטיח שהבדיקה תיפרד בצורה נקייה מהדגימה. לכיול קבוע קפיץ על משטח זכוכית, קבעו את אורך Z על 1 מיקרומטר.
   3. מהירות Z מתייחסת למהירות שבה z-piezo מזיז את הקנטיל אנכית כלפי מטה לכיוון הדגימה במהלך הזחת כוח. זה צריך להיות אופטימלי כי מהירות נמוכה מאוד יהיה בעיקר ללכוד את ההתנהגות צמיג של הדגימה, בעוד מהירות גבוהה מאוד יהיה בעיקר ללכוד את ההתנהגות האלסטית. המהירות האופטימלית צפויה ללכוד את האופי הוויסקו-אלסטי האמיתי של דגימות ביולוגיות. הגדר את מהירות Z ל- 2 מיקרומטר לשנייה עבור הדגימות הביולוגיות הוויסקו-אלסטיות.
   4. גובה היעד בטווח Z מציין את המרחק המשוער מהמדגם שבו מונח z-piezo לאחר מדידת עקומת כוח ולפני מעבר למיקום אחר בדגימה. גובה היעד של טווח Z צריך להיות גדול מהגובה של תכונות הדגימה. הגדר גובה יעד בטווח Z של 7.5 מיקרומטר.
   5. באמצעות הפונקציה Step Motor , קרב את הקנטיל די קרוב למשטח הדגימה (אם לשפוט לפי המיקוד בתמונת ניגודיות הפאזה בהגדלה של 10x) לפני בחירת הפונקציה Approach בחלון ספקטרוסקופיית הכוח של מצב מגע כדי להוריד את הקנטליבר במרווחים קטנים יותר של 15 מיקרומטר.
   6. לחץ על Acquisition כדי ללכוד עקומת כוח.
   7. בחר את עקומת הכוח, פתח אותה בחלון מנהל הכיול ובחר מצב מבוסס איש קשר במקטע השיטה.
   8. בעזרת הפונקציה Select-fit Range , בחרו ב-Cantilever Retraction Curve להתאמת עקומה ליניארית. לאחר מכן, סמן את תיבת הסימון רגישות כדי להמיר את יחידת הכוח מ- V ל- N.
   9. הרימו את הנוזל ב-100-200 מיקרומטר ובחרו בפונקציית הרעש התרמי . שוב, באמצעות Select Fit Range, התאם את עקומת פעמון הרעש התרמי עם עקומת לורנץ. לאחר התאמת העקומה, בחר בתיבה קבוע קפיץ (k). ודא שקבוע הקפיץ (k) קרוב לערך היצרן ורשום אותו להתייחסות עתידית. לאחר הכיול, היחידה עבור setpoint תשתנה מ- mV ל- nN.
      הערה: רעש תרמי הוא התדר הטבעי של המזנון בטמפרטורה מסוימת. נדרש תיקון לרעש תרמי למדידה מדויקת של קבוע הקפיץ.
5. רכישת עקומות כוח-מרחק
   1. מקם את הדגימה המותקנת בשקופית (כלי דם ברשתית או מטריצה תת-אנדותלית) על במת AFM ובחר ספקטרוסקופיית כוח במצב מגע באזור הניסוי של התוכנה.
   2. הגדר את כוח נקודת המוצא על 0.5 nN ולחץ על גישה, שהוא גבוה משמעותית מהסטייה התרמית של בדיקות SAA-SPH 1 μm ו- PFQNM-LC-A 70 nm cantilever, מה שמבטיח גישה חלקה לכיוון הדגימה.
   3. לאחר שהקנטיליבר זיהה את פני השטח וחזר לגובה יעד המנוחה שלו, הגדר את נקודת הקבע על 0.2 nN עבור הגשושית הנוקשה יותר SAA-SPH 1 μm cantilever או 0.1 nN עבור הגשושית PFQNM-LC-A 70 nm cantilever הרכה יותר. כוונון נקודת הגדרה זה מבטיח שקצוות קשיחים ורכים כאחד יתכופפו בקלות במהלך כניסת הדגימה (עיין בסעיף 3.1).
   4. הגדר את אורך Z ב~2.5 מיקרומטר כדי להבטיח הפרדה נקייה של הגשושית מדגימות ביולוגיות במהלך נסיגה (עיין בשלב 3.4.2) ומהירות Z ב- 2 מיקרומטר לשנייה (עיין בשלב 3.4.3).
   5. באמצעות ברגי הבמה על במת AFM, מקם בזהירות את הגשושית במיקום הרצוי על הדגימה.
      הערה: מכיוון שנימים לא תמיד מתפשטים שטוחים על המגלשה, בטוח למשוך את המגן עוד 10-20 מיקרומטר מגובה יעד המנוחה שלו לפני הזזת הבמה.
   6. לחץ על גישה כדי לקרב תחילה את הקנטיל לדגימה ולאחר מכן לחץ על רכוש כדי ללכוד את עקומות הכוח עבור המיקומים הרצויים. שמור את כל עקומות הכוח לניתוח.
6. ניתוח נתונים
   1. פתח את עקומת הכוח בתוכנת עיבוד הנתונים.
   2. בחר את Retraction Force Curve לניתוח נתונים (בדומה לשלב 3.4.8).
   3. באמצעות פונקציית החלקת הנתונים, החלק את עקומת הכוח באמצעות מסנן גאוס כדי להסיר את הרעש הלא רצוי בנתונים שנרכשו.
   4. באמצעות פונקציית החיסור 'קו בסיס', התאם את ערך השיפוע והגודל של חלק הבסיס (ללא מגע) של עקומת הכוח לאפס.
   5. לחץ על הפונקציה Contact Point כדי להביא באופן אוטומטי את נקודת המגע של עקומת הכוח לקואורדינטות (0,0) בצירי X ו- Y.
   6. באמצעות הפונקציה Vertical Tip Position , חשב את המיקום האנכי בפועל של הקנטיל על ציר Y על-ידי תיקון עבור כל כניסת דגימה.
   7. בעקומת הכוח המעובד, החילו את פונקציית Elasticity Fit על ידי בחירת צורת הקצה והרדיוס (בהתבסס על הגשושית שנבחרה), ולאחר מכן התאמת עקומת כוח באמצעות מודל הרץ/סנדון.
      1. אם כניסת מטריצה ברדיוס של 70 ננומטר עולה על 70 ננומטר, כפי שקורה בדרך כלל, בחר את צורת קצה הפרבולואיד . למדידת קשיחות נימית, הזחת הדגימה על ידי בדיקת רדיוס 1 מיקרומטר לעולם אינה עולה על 1 מיקרומטר, לכן בחר את צורת קצה הכדור . יתר על כן, אם נקודת המגע של העקומה המותאמת אינה חופפת לנקודת המגע של עקומת הפסילה בפועל, בחר בתיבת הסימון הזזה עקומה .
   8. שים לב ושמור את הערך של מודולוס של יאנג (קשיחות).

Results

נימי רשתית עכבר
מדידת קשיחות AFM של נימי רשתית מבודדים כוללת שלבי טיפול בדגימה שעלולים לפגוע בשלמותם המכנוסטרוקטורלית. כדי למנוע זאת ובכך להבטיח את ההיתכנות, האמינות והשחזור של מדידות AFM, העיניים המצוירות קבועות ב-5% פורמלין למשך הלילה ב-4°C לפני בידוד כלי הדם. פרוטוקול קיבוע מתון זה עם ריכוז פורמלין מופחת, טמפרטורת קיבוע נמוכה, זמן קיבוע מוגבל וחוסר ניקוב בקרנית פותח כדי למזער כל ממצאים פוטנציאליים של קישור / התקשות הנגרמים על ידי קיבוע כימי. כפי שניתן לראות באיור 2B,C, הקיבוע המתון יחסית הזה מבטיח שכלי הדם ברשתית המבודדים יהיו חזקים מבחינה מבנית ועמידים מספיק למדידת AFM. לעומת זאת, כלי דם ברשתית שבודדו מעיניים לא מקובעות (בשיטה היפוטונית)⁴ או מעיניים מקובעות לזמן קצר (למשך 8 שעות) מתפצלים או קורסים, מה שהופך אותם ללא מתאימים למדידת AFM (איור 2B).

מטריצה תת-אנדותל ברשתית
נוקשות כלי הדם משקפת את הנוקשות המשולבת של תאי כלי הדם וקרום המרתף (מטריצה תת-אנדותלית)⁴. מאחר שתאים מסתגלים לנוקשות המטריקס על ידי כך שהם עוברים שינוי דומה בנוקשות שלהם, תהליך המכונה הדדיות מכנית⁹, קשיחות מטריצה תת-אנדותלית, הופך לגורם חשוב בנוקשות כלי הדם הכללית. למדידת קשיחות מטריצה, חשוב לקבל מטריצה תת-אנדותל צפופה הומוגנית. עבור ECs רשתית אנושיים שגדלו בתרבית בתוספת חומצה אסקורבית, זה בדרך כלל לוקח 10-15 ימים (איור 3A)^4,5,6. הבדל זה בתקופת התרבית עשוי לנבוע מהבדלים בין הרבה להרבה ב- ECs רשתית ראשוניים הזמינים מסחרית. יתר על כן, אנו מוצאים בדרך כלל כי ECs רשתית זמינים מסחרית מעכברי C57BL/6 מפקידים מטריצה צפופה יותר בהשוואה לתרבית EC רשתית אנושית ראשונית, ובכך מצביעים על הבדלים ספציפיים למין. כפי שניתן לראות באיור 3A, תמונות עם ניגודיות פאזה מספקות רק תצוגה גסה של המטריצה בקנה מידה של מאקרו. אולם המבנה הפיברילרי העדין יותר בקנה מידה ננו-מיקרו מתגלה בתמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות ברזולוציה גבוהה של המטריצה המסומנת בנוגדנים כנגד חלבונים מבניים של מטריצות קולגן IV ופיברונקטין (איור 3B). יש לציין כי חלבוני מטריצה אלה מספקים גם רמזים מאלפים לתאי אנדותל על ידי קשירה לקולטני אינטגרין ספציפיים⁹.

מדידת קשיחות AFM
בחירת קשיחות הקפיץ המתאימה (קבוע קפיץ, k) וממד הגשושית חיונית למדידות אמינות ורגישות. יש לבחור פרמטרים אלה כך שיתאימו לנוקשות ולמידות של הדגימה הביולוגית. לאחר התקנת המגן שנבחר על ה-AFM, קרן הלייזר האינפרא-אדומה חייבת להיות ממוקדת בקצה הקנטיליבר, ונקודת הלייזר המוחזרת חייבת להיות ממורכזת בגלאי האור. יישור לייזר זה מבטיח זיהוי מדויק ורגיש של סטיית הקשיחות וכתוצאה מכך מדידת קשיחות. מדידת קשיחות AFM מתחילה כאשר ה-z-piezo מזיז את המזנון אנכית כלפי מטה לכיוון הדגימה. בשלב זה אין סטייה של הקנטיליבר, מה שמייצר קו בסיס שטוח של עקומת הגישה (איור 4A). כאשר הגשושית יוצרת מגע עם הדגימה ונכנסת, הקנטיליבר מתכופף, מה שגורם להסטת לייזר על גלאי האור, המתוארת על ידי הסטייה האנכית של עקומת הגישה. לאחר החלת כוח כניסה מוגדר מראש (כוח נקודת הגדרה) על הדגימה, הקנטיל נסוג למצב ההתחלה (גובה יעד Z) הרחק מהדגימה. עקומת הפסילה המוטה מותאמת לאחר מכן למודל הרץ/סנדון כדי לחשב את מודולוס יאנג (קשיחות) של הדגימה.

ממדידת הזחת הכוח המייצג שמוצגת באיור 4, ברור שעקומות הגישה והנסיגה, המתקבלות מנימי רשתית שבודדו מעכבר סוכרתי (איור 4B), תלולות באופן משמעותי מאלה המתקבלות מעכבר שאינו סוכרתי (איור 4A). השיפוע התלול יותר של עקומות הזחת הכוח מצביע על סטייה גדולה יותר הנגרמת על ידי התנגדות מדגם גבוהה יותר להזחת כוח, המשקפת קשיחות מדגם גבוהה יותר¹³. ואכן, ניתוח נתונים מאוחר יותר של עקומות הזחת כוח מרובות גילה כי נימי רשתית עכבר הופכים נוקשים יותר באופן משמעותי בסוכרת⁴. כמו כן, יש לציין כי מגע בין הגשושית לבין דגימות ביולוגיות גורם לעיתים קרובות להידבקות משטח לא ספציפית, מה שמוביל לסטייה שלילית של הקנטיליבר במהלך הנסיגה, כפי שניתן לראות מהארכת עקומת הנסיגה מעבר לקו הבסיס (איור 4B). יתר על כן, דגימות ביולוגיות כמו תאים, מטריקס וכלי דם הן ויסקו-אלסטיות מטבען ולכן עשויות לעבור עיוות קבוע ו / או שינוי בנוקשות לכאורה בעקבות הזחת כוח. אם כן, הדבר יבוא לידי ביטוי בחוסר התאמה של עקומות הגישה והפסילה (היסטרזיס). ואכן, השוואת איור 4A ואיור 4B מאששת את המגמה הצפויה שבה הזחת כוח של נימים רכים יותר בעכברים שאינם סוכרתיים מייצרת היסטרזה גדולה יותר מזו שנצפתה אצל עמיתיהם הנוקשים יותר. כפי שדווח בעבר ^5,6, נוקשות (מודולוס יאנג) של מטריצות תת-אנדותל המתקבלות מתרביות EC ברשתית מחושבת גם היא באופן הנ"ל.

איור 1: המחשה סכמטית של חתך חתך שנעשה בעין עכבר לצורך בידוד רשתית. באמצעות פינצטה כדי להחזיק את עצב הראייה, אזמל משמש לביצוע חתך מלא אחורי ללימבוס כדי להפריד את רשתית העכבר מן העדשה ואת החדר הקדמי. הקו המקווקו הסגול מראה את מיקום החתך האנכי. סכמה זו צוירה באמצעות תוכנת תמונה ואיור מדעית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיטוב פרוטוקול לבידוד כלי דם שלמים ברשתית עכבר למדידת AFM. (A) התמונה הסטריאוסקופית מראה רשתית שלמה המבודדת מעין עכבר קבועה קלות לפני שלבי הבידוד הנימים. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (B) תמונות ניגודיות פאזה מייצגת בהגדלה של פי 4 מציגות כלי דם ברשתית של עכבר שהתקבלו בשיטות הבידוד השונות. בהשוואה בין השלמות המבנית והעמידות של כלי הדם המבודדים, נמצא כי עיכול טריפסין של רשתית מעיניים משוקעות בפורמלין 5% למשך 24 שעות ב-4°C (קופסה אדומה) מניב את כלי הדם ברשתית המתאימים ביותר למדידת קשיחות AFM. כלי רשתית שבודדו בשיטה זו הציגו רשת כלי דם ברורה שהתפשטה באופן אחיד לאורך משטח הזכוכית. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (C) תצוגה בהגדלה גבוהה (20x) של רשת נימי רשתית שלמה, בדומה לזו המוצגת ב-(B), מאשרת את השלמות המבנית הגבוהה של נימים המתקבלים מעיניים מקובעות קלות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נתון זה שונה^מ-4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מטריצות דה-תאיות שהתקבלו מתרביות REC ראשוניות של בני אדם ועכברים. (A) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות בהגדלה של 20x המציגות אגרגטים של מטריצות תת-אנדותל על כיסויי זכוכית לאחר דה-צלולריזציה של תרביות REC של בני אדם או עכברים בני 10 ימים (10 d) או 15 יום (15 d). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות מייצגות בהגדלה גבוהה (100x) של מטריצות דה-צלולריות שהתקבלו מתרביות REC אנושיות 15d ומסומנות בנוגדנים אנטי-קולגן IV ואנטי-פיברונקטין חושפות קולגן ננו-פיברילרי צפוף IV ומטריצת פיברונקטין (fibronectin). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: עקומות מרחק כוח ממדידת קשיחות AFM של נימי רשתית עכבר. תרשימים קוויים מציינים גישה מייצגת (צבע בהיר) ועקומת נסיגה (צבע כהה) ממדידת כניסת כוח יחיד במיקום אחד של נימי רשתית עכבר מבודדים מעכבר (A) שאינו סוכרתי או (B) סוכרתי. עקומות הכוח המתקבלות באמצעות גשושית SAA-SPH ברדיוס של 1 מיקרומטר, משרטטות את הקשר בין מרחק דגימת הקנטילבר (נשלט על ידי z-piezo) לבין הכוח האנכי המופעל הגורם להסטת קנטיליבר. (A) החץ הצהוב מציין את התקרבות הקנטיל המונעת על ידי z-piezo לכיוון הדגימה, החץ הלבן מציין את נקודת המגע שבה הגשושית יוצרת מגע עם הדגימה, והחץ הירוק מציין את הסטת הקנטליבר עד לכוח הזחה (שיא) (*). (B) הן עקומות הגישה והן עקומות הנסיגה המתקבלות מנימי רשתית שבודדו מעכברים סוכרתיים מציגות שיפוע תלול במידה ניכרת מאלה של עמיתיהם שאינם סוכרתיים (מוצג ב-A), מה שמצביע על נוקשות נימים גבוהה יותר בעכברים סוכרתיים. ראש החץ מציין ירידה בעקומת הנסיגה מתחת לקו הבסיס, המשקפת את הסטייה השלילית של הגשושית הנגרמת על ידי הידבקות בין הגשושית לדגימה במהלך הכניסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

AFM נמצא בשימוש נרחב כדי למדוד שינויים הקשורים למחלות בנוקשות של כלי דם גדולים יותר, כגון אבי העורקים ועורקים¹⁶. ממצאים אלה סייעו לבסס את תפקידה של מכנוביולוגיה אנדותל בסיבוכים קרדיווסקולריים כגון טרשת עורקים¹⁷. בהתבסס על ממצאים אלה, התחלנו לחקור את התפקיד שלא היה מוכר בעבר של מכנוביולוגיה אנדותל בהתפתחות נגעים מיקרו-וסקולריים ברשתית בתחילת DR. הצלחה במרדף זה, עם זאת, מסתמכת על מדידה מדויקת של שינויים הנגרמים על ידי סוכרת בנוקשות נימי הרשתית. מחקרים אחרונים גילו כי בדומה לכלי דם גדולים, קשיחות של נימי רשתית ומטריצת תת-אנדותל המופרשת EC ברשתית ניתנת גם למדידה ישירה, מדויקת ואמינה באמצעות AFM ^4,5,6.

גישה זו כוללת בידוד של נימי רשתית עכבר מעיניים מקובעות קלות באמצעות עיכול טריפסין. בהתבסס על ניסיון, שלב קיבוע מתון זה הכרחי מכיוון שנימים שבודדו מעיניים לא מקובעות (בשיטה ההיפוטונית) הם שבירים והופכים מקוטעים, מה שהופך אותם ללא מתאימים למדידת קשיחות AFM⁴. לעומת זאת, קיבוע חזק יותר והצורך בעיכול טריפסין נרחב, שדווח בפרוטוקול עיכול טריפסין ברשתית¹⁸, עלולים גם הם לפגוע בשלמות המבנית של הנימים, כפי שנשפט על ידי הפרעה בצמתים הדוקים. לפיכך, הקיבוע הקל של הנימים ועיכול הטריפסין העדין המשמש כאן מסייעים להפחית את הנוקשות הנובעת מקרוסלינקינג המושרה על ידי פורמלין יתר ולהבטיח את השלמות המבנית של הנימים למדידת קשיחות AFM אמינה.

כגישה חלופית, מחקר שנערך לאחרונה דיווח על מדידת קשיחות AFM של נימי רשתית מתושבות שטוחות רשתית קבועות קלות¹⁹. על ידי ביצוע הזחות כוח AFM על נימי הרשתית בתוך הרשתית השלמה, גישה זו מאפשרת מדידת קשיחות באתר . עם זאת, מדידות קשיחות נימיות אלה כוללות ככל הנראה את הנוקשות של הממברנה המגבילה הפנימית. יתר על כן, גישה זו מוגבלת למדידה של נימים שטחיים בלבד הנגישים על תושבת שטוחה ברשתית תוך השמטת מקלעת הנימים העמוקה יותר שמושפעת במיוחד בתחילת DR²⁰. ניתן לטפל בבעיות אלה באמצעות גישה זו, אשר מחלצת כלי דם בצורה נקייה (ללא רקמת רשתית שיורית) מכל שכבות הרשתית. אנו מבצעים כעת אופטימיזציה של פרוטוקול זה כדי לבודד כלי דם כורואידיים ממודלים של בעלי חיים של AMD מוקדם. עם זאת, אנו מבינים שקיבוע הפורמלין הקל המשמש בפרוטוקול עלול לגרום לקשיח הקשור לקרוסלינקינג במדידות AFM. לכן, יהיה זה נבון לפרש את ערכי נוקשות כלי הדם המתקבלים בגישה זו יותר במונחים של שינויים יחסיים בנוקשות (בין קבוצות ניסוי שונות) ולא נוקשות מוחלטת.

בניגוד לנימי רשתית הדורשים קיבוע קל, ניתן להעריך את המטריצה התת-אנדותלית המתקבלת מתרביות EC ברשתית ללא כל שינוי. זאת בעיקר בשל חוסנה של המטריצה השוקעת, הנובע משילוב של מספר גורמים, כולל תוספת של חומצה אסקורבית בתווך התרבית (המשפרת את סינתזת הקולגן¹⁵), שינוי כימי של כיסויי זכוכית המונע ניתוק מטריצה במהלך דה-צלולריזציה, ומשך תרבית ממושך (10-15 ימים). חשוב לציין, הראינו כי העלייה הנגרמת על ידי היפרגליקמיה בנוקשות מטריקס תת-אנדותל במבחנה עולה בקנה אחד עם העלייה הנגרמת על ידי סוכרת בנוקשות נימי הרשתית שנצפתה in vivo⁴. זה לא מפתיע מכיוון שעלייה בנוקשות המטריקס צפויה להגביר את הנוקשות של ECs רשתית (עקב הדדיות מכנית) אשר, יחד, מגבירים את קשיחות הנימים הכוללת. ואכן, לאחרונה הראינו כי ECs ברשתית נעשים נוקשים יותר כאשר הם גדלים בתנאי סוכרת⁴, ככל הנראה באמצעות עלייה במתח השלד של אקטין תלוי Rho/ROCK²¹. ממצאים אלה גם מרמזים כי התקשות EC כורואידי שנצפתה במודל קוף רזוס של AMD מוקדם משקפת את הנוקשות המוגברת של מטריצה תת-אנדותל כורואידי וכלי דם שלמים¹², רעיון שנבחן במחקרים מתמשכים. בסך הכל, העובדה ששינויים בנוקשות במטריצת הרשתית התת-אנדותל הבלתי קבועה וב-ECs משקפים את המגמה שנצפתה בכלי דם רשתית תקינים קבועים מעט, מעידה על תקפותה של גישת הקיבוע הקל.

מדידת נוקשות ישירה של נימי רשתית ממודלים של DR בבעלי חיים לא רק מסייעת לבסס את מכנוביולוגיה של האנדותל כיעד טיפולי חדשני לניהול DR, אלא היא גם מספקת רציונל חזק לפתח טכניקות הדמיה רגישות חדשות להערכה לא פולשנית של נוקשות נימי הרשתית בחולי DR בעתיד. טכניקות לא פולשניות כאלה עשויות לזהות שינויים עדינים בזרימת הדם שצפויים לנבוע מהתקשות נימית, בדומה לשינויים במהירות גלי הדופק העורקי המתגלים בדרך כלל במחלות לב וכלי דם הנגרמות מסוכרת. מדידות קשיחות AFM של נימי רשתית שבודדו מעיניים אנושיות לאחר המוות מתורמים סוכרתיים יספקו הוכחת היתכנות חשובה בהקשר זה. בהתחשב בכך שקשיחות נימי הרשתית עולה בשלב מוקדם במודל העכבר (סטרפטוזוטוצין) של סוכרת מסוג 1⁴, שימוש מוצלח ב- AFM באימות שיטות הדמיה למדידת נוקשות עשוי להוביל לזיהוי קשיחות נימי הרשתית כסמן ביולוגי קליני לפתוגנזה מוקדמת של DR.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>בידוד נימי רשתית
0.22 ומיקרו; m מסנן מזרק PVDF	Merck Millipore	SLGVM33RS	קושר חלבון נמוך Durapore
10X Dulbecco פוספט חוצץ מלח ללא % סידן	% מגנזיום קורנינג	20-031-CV	ריכוז סופי 1X, pH 7.4
צלחת 12 בארות	פלקון קורנינג	353043
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	קורנינג	430791	ללא רנאז-דנאז, לא פירוגני
20 מ"ל מזרק Luer-Lok TIP	BD	302830
5 3/4 אינץ' זכוכית בורוסיליקט חד פעמית / פיפטה פסטר לא סטרילית	FisherBrand	13-678-20A
60x15 מ"מ צלחת תרבית רקמות	פלקון קורנינג	353002
צלחת 6 בארות	פלקון קורנינג	353046
Aqua-Hold 2 פאפ - 13 מ"ל מעבדת	מכשירים מדעיים	עט 9804-02
מחזיק להב	X-ACTO
פלדת פחמן להב כירורגי #10	Bard-Parker	371110
שעווה דנטלית	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	50-949-027
מיקרוסקופ ניתוח	תמיסת פורמלין Am-scope
, ניטרלי חוצץ, 10%	Millipore Sigma	HT501128-4L	ריכוז סופי 5% (v/v)
Kimwipes - רקמת מגב	Kimtech Science	34133
מיקרו מרית	Fine Science	Tools 10089-11
Orbital Shaker	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 נירוסטה 115 מ"מ  פינצטה	טד פלה, בע"מ	5667
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה	Nikon TS2
מטהר לוגיקה + Class II, סוג A2 ארון בטיחות ביולוגית	Labconco	302380001
כספת נעילה מיקרוצנטריפוגה צינורות 2 מ"ל	Eppendorf	22363352
סטריאוסקופ	AmScope	SM-3 סדרת זום סטריאומיקרוסקופ טרינוקולרי 3.5X-90X
שקופית מיקרוסקופיה סופרפרוסט פלוס - לשונית לבנה - ניקוי מראש - 25x75x1.0 מ"מ	FisherBrand	1255015
Tris Buffer, תמיסת 0.1M, pH 7.4 - דרגת ביוטכנולוגיה	VWR	E553-500ML	pH 8 לתמיסת טריפסין
טריפסין 1:250 אבקת תרבית רקמות כיתה	VWR	VWRV0458-25G	10% (w/v) תמיסת טריפסין
מים ביולוגיה מולקולרית כיתה	קורנינג	46-000-CM
<חזקה>מטריצה תת-אנדותלית
10X PBS	קורנינג	20-031-CV
1X PBS עם סידן ומגנזיום	תרמו פישר סיינטיפיק	14040-117	pH 7.4
אמוניום הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	338818
חומצה אסקורבית	סיגמא-אולדריץ'	A4034
קולגן IV נוגדן	נובוס ביולוגי	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
אתנולמין	סיגמא-אולדריץ'	398136
נוגדן פיברונקטין	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
ג'לטין	סיגמא-אולדריץ'	G1890
כיסויי זכוכית (12 מ"מ)	פישר	12-541-000
גלוטרלדהיד	מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי	16220
תאי אנדותל רשתית אנושיים (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 בינוני	קורנינג	15-100-CV
תאי אנדותל רשתית עכבר (mREC)	Cell Biologics	C57-6065
טריטון X-100	תרמו פישר סיינטיפיק	BP151-100
טריפסין	גיבקו-תרמו פישר סיינטיפיק	25200-056
<חזק>מדידת AFM
1 ומיקרו; בדיקה m	Bruker	SAA-SPH-1UM	בדיקה חצי כדורית בגובה 19 מיקרון עם רדיוס קצה של 1 מיקרון, קבוע קפיץ 0.25N/m
70 ננומטר בדיקה LC	Bruker	PFQNM-LC-V2	בדיקה חצי כדורית בגובה 19 מיקרון עם רדיוס קצה של 70 ננומטר,   קבוע קפיץ 0.1N/m
	מצלמה משפחת XCAM	Toupcam	1080P
HDMI שולחן עבודה להפעלת המצלמה	Asus	שולחן עבודה	מעבד Intel i5-6600 , 8GB
RAM מחזיק צלחת לכיסוי	Cellvis	D29-14-1.5-N	צלחת תחתונה מזכוכית 29 מ"מ עם   מיקרו-באר 14 מ"מ
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	מיקרוסקופ כוח אטומי Bioscience המותקן על מיקרוסקופ אופטי למדידה רגישה של התכונות המכניות (קשיחות וטופוגרפיה) של דגימות ביולוגיות רכות
מיקרוסקופ ניגוד פאזה	Zeiss	Axiovert 200	מיקרוסקופ הפוך עם מטרה פי 10