מאמר שיטה

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

DOI:

10.3791/66939

⸱

19 ביולי 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזיהוי והאפיון של תאי T ספציפיים לאנטיגן במהלך בריאות ומחלות נותר מפתח לשיפור הבנתנו את הפתופיזיולוגיה החיסונית. האתגרים הטכניים של מעקב אחר אוכלוסיות תאי T ספציפיים לאנטיגן ברפרטואר תאי T אנדוגניים התקדמו מאוד על ידי פיתוח ריאגנטים פפטידים:MHC טטראמרים. מולטימרים מסיסים אלה המסומנים באופן פלואורסצנטי של מולקולות MHC Class I או Class II המורכבות לאפיטופים פפטידים אנטיגניים נקשרים ישירות לתאי T בעלי ספציפיות מקבילה של קולטן תאי T (TCR) ולכן יכולים, לפיכך, לזהות אוכלוסיות תאי T ספציפיות לאנטיגן במצבן הטבעי ללא צורך בתגובה פונקציונלית המושרה על ידי ex vivo גירוי. עבור אוכלוסיות נדירות ביותר, תאי T הקשורים לטטרמר יכולים להיות מועשרים מגנטית כדי להגביר את הרגישות והאמינות של זיהוי.

ככל שהחקירה של חסינות תאי T שוכני רקמות מעמיקה, יש צורך דחוף לזהות תאי T ספציפיים לאנטיגן שעוברים אל רקמות שאינן לימפואידיות ושוכנות בהן. בפרוטוקול זה, אנו מציגים סדרה מפורטת של הוראות לבידוד ואפיון של תאי T ספציפיים לאנטיגן הנמצאים בריאות עכבר. זה כרוך בבידוד של תאי T מרקמת ריאה מעוכלת ואחריו שלב העשרה מגנטי כללי של תאי T וצביעת טטרמר לצורך ניתוח ומיון ציטומטריית זרימה. השלבים המודגשים בפרוטוקול זה משתמשים בטכניקות נפוצות ובריאגנטים זמינים, מה שהופך אותו לנגיש כמעט לכל חוקר העוסק באימונולוגיה של תאי T בעכברים, והם ניתנים להתאמה רבה למגוון ניתוחים במורד הזרם של כל אוכלוסיית תאי T ספציפיים לאנטיגן בתדר נמוך המתגוררת בריאות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלב מערכת החיסון הנרכשת נמצאת היכולת של תא T לזהות אנטיגן מסוים ולהגיב לו. מתי והיכן תא T מגיב לאנטיגן הקוגנטי שלו קובע את מאזן הזיהום והאוטואימוניות, הומאוסטזיס וסרטן, בריאות ומחלות1. מכאן נובע כי המחקר של תאי T בהקשר ספציפי של חסינות צריך להתמקד בתאים עם ספציפיות עבור אנטיגן רלוונטי של עניין. בין הפיתוחים הטכנולוגיים ששיפרו מאוד את היכולת לאפיין אוכלוסיות תאי T ספציפיים לאנטיגן ניתן למנות מולטימרים מסיסים (בדרך כלל טטרמרים) של מולקולות מסוג I או מדרגה II של קומפלקס היסטותאימות ראשוני (MHC) המורכבות לאפיטופים של פפטידים, הידועים יותר בשם "פפטיד MHC"2,3,4,5 . על ידי ייצוג הליגנדות הטבעיות של קולטני אנטיגן של תאי T (TCRs), פפטידים:MHC Class I ו- Class II טטרמרים מספקים אמצעי לזיהוי ישיר של תאי T ספציפיים לאנטיגן CD8+ ו- CD4+, בהתאמה, בתוך הרפרטואר האנדוגני של תאי T במערכת החיסון ללא דרישה לתגובה לגירוי אנטיגן בבדיקה. טטרמרים מייצגים גישה אלגנטית יותר לחקר תאי T ספציפיים לאנטיגן מאשר מודלים להעברת תאי T טרנסגנייםTCR 6, ונעשה בהם שימוש הולך וגובר לזיהוי אוכלוסיות תאי T זרים וספציפיים לאנטיגן עצמי הן במודלים ניסיוניים של עכברים והן במחלות אנושיות 4,5.

בעוד טטרמרים יכולים לזהות בקלות אוכלוסיות בתדר גבוה של תאי T שהתרחבו בתגובה לגירוי אנטיגן, השימוש בהם עבור תאי T נאיביים, ספציפיים לאנטיגן עצמי או זיכרון מוגבל על ידי התדרים הנמוכים מאוד של אוכלוסיות אלה7. הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו והפיצו אסטרטגיות העשרה מגנטית מבוססות טטרמר המגבירות את רגישות הזיהוי כדי לאפשר מחקרים של אוכלוסיות תאים אלה ברקמות הלימפה של עכברים 8,9,10,11.

הופעתם של תאי T שוכנים ברקמה בתחום שמה דגש מוגבר על פיתוח דרכים חדשות לחקור תאי T במרחב הלא-לימפואידי. כמו משטחים ריריים רבים אחרים, תאי T בריאות נתקלים במגוון אנטיגנים עצמיים וזרים שמקורם באפיתל של המאכסן, חיידקים קומנסליים וזיהומיים, וישויות סביבתיות, כולל אלרגנים. ניתוח שעתוק של תאי T שנקצרו מרקמה לא לימפואידית (NLT) מדגים פנוטיפ דמוי זיכרון הנושא גורל ותפקוד ייחודיים לרקמה, המכוונים לעתים קרובות לסחר ולהומאוסטזיס רקמות12. יתר על כן, תאי זיכרון T (Trms) שוכנים ברקמה נוטים להיות מוגבלים יותר מבחינה קלונית מאשר אלה במחזור13. קביעה כיצד ומדוע אנטיגנים מניעים את מיקום תאי T ב-NLT היא קריטית להבנת האופן שבו מערכת החיסון מתגוננת מפני זיהום, שומרת על הומאוסטזיס רקמות, ולפעמים מתדרדרת לאוטואימוניות. עם זאת, נראה שיש שחיקה גדולה יותר בקרב תאי T שוכני רקמות מהריאות בהשוואה לתאי NLT14 אחרים. בהתאם לכך, היכולת לזהות ולאפיין תאי T אנדוגניים של הריאה עם ספציפיות אנטיגן נתונה מוגבלת על ידי הנדירות הטבועה בהם.

על ידי שילוב של שימוש בטכניקות העשרת תאים מבוססות חרוזים מגנטיים וצביעת טטרמר פפטיד MHC, הצלחנו לאתר תאי T ספציפיים לאנטיגן עצמי מורחבים אך נדירים בריאות עכבר15,16. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול שביצענו אופטימיזציה כדי לבודד ולאפיין באופן אמין כל אוכלוסיית תאי T נדירה ספציפית לאנטיגן שנמצאת בריאות עכברים (איור 1). פרוטוקול זה משלב שלב צביעת נוגדנים in vivo כדי להבדיל בין תאי T שוכנים לתאי T וסקולריים17 ואחריו שתי שיטות שונות לעיבוד רקמת ריאה כדי להתאים לזמינות משאבים. לאחר מכן מתבצע שלב העשרה מגנטי כללי של תאי T, צביעת טטרמר וניתוח לפי ציטומטריית זרימה. כדאיות התא וצביעת טטרמר משופרת עוד יותר בפרוטוקול זה על ידי תוספת של אמינוגואנידין, אשר חוסם אפופטוזיס18 בתיווך תחמוצת החנקן המושרה על ידי סינתאז חנקן (iNOS) בתיווך תאי T המושרה על ידי הפעלת תאי T וDasatinib המגביל את הפחתת הרגולציה של TCR19. השלבים המודגשים בפרוטוקול זה משתמשים בטכניקות נפוצות ובריאגנטים זמינים, מה שהופך אותו לנגיש כמעט לכל חוקר העוסק באימונולוגיה של תאי T בעכבר והוא ניתן להתאמה גבוהה למגוון ניתוחים במורד הזרם. למרות שתאי T נאיביים אינם צפויים להימצא בריאות, אנו מאמינים שפרוטוקול זה יהיה מועיל במיוחד לחקר תאי T ספציפיים לאנטיגן עצמי ו- Trms בריאות.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה כללית של זרימת עבודה של פרוטוקול. ריאות נקצרות מעכברים ומנותקות לתאים בודדים. הדגימות מועשרות לאחר מכן עבור תאי T לפני צביעה עם פפטיד טטרמרים MHC ונוגדנים מסומנים פלואורסצנטית לניתוח ציטומטרי זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה מאושרים ומפותחים בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, תוכנית מוסמכת לניהול בעלי חיים של האגודה האמריקאית להסמכת טיפול בחיות מעבדה (AAALAC). ניסויים בוצעו על עכברים ונקבות זכרים ונקבות בני 8-12 שבועות על רקע גנטי C57BL/6 שגודלו ונשמרו במתקן בעלי החיים MGH בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים.

1. הכנת פתרונות מלאי

  1. הכן את חיץ HEPES על ידי המסת HEPES 10 mM, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 150 mM NaCl ו- 1 mM MgCl2, והתאם ל- pH 7.4.
  2. הכינו תמיסת מלאי ליבראז 10x על ידי המסת 700 מיקרוגרם/מ"ל של Liberase Thermolysin Medium (TM) (ראו טבלת חומרים) בתמיסת מלח מאוזנת של Hank עם Ca++ ו-Mg++ (ראו טבלת חומרים).
  3. הכינו 10x תמיסת ציר אמינוגואנידין על ידי המסת מלח המיסולפט 100 mM Aminoguanidine (ראו טבלת חומרים) בתמיסת מלח מאוזנת של Hank עם Ca++ ו- Mg++ (ראו טבלת חומרים).
  4. הכינו את מדיום חומצות האמינו של Eagle's Ham's Amino Acids (EHAA) על ידי ערבוב מדיום EHAA (ראו טבלת חומרים) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-55 מיקרומטר 2-מרקפטואתנול.
    הערה: ניתן להשתמש גם במדיה נפוצה אחרת של תאי T, כגון RPMI או DMEM.
  5. הכינו את מאגר הממיין על ידי ערבוב 1x PBS עם 2% FBS ו-0.05% נתרן אזיד.
  6. הכן בלוק Fc על ידי דילול נוגדן CD16/32 מטוהר נגד עכבר (ראה טבלת חומרים) בשעה 1:100 v/v במאגר המסדר.
  7. הכינו את תמיסת העיכול Liberase TM/DNase על ידי הוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל Liberase TM ו-50 מיקרוגרם/מ"ל DNase I (ראו טבלת חומרים) במדיום RPMI 1640 ללא L-גלוטמין (ראו טבלת חומרים).
  8. הכינו תערובת קטמין/קסילזין על ידי הוספת 10 מ"ג/מ"ל קטמין (ראו טבלת חומרים) ו-1 מ"ג/מ"ל קסילזין (ראו טבלת חומרים) במי מלח רגילים (0.9% NaCl) (ראו טבלת חומרים).

2. יצירת תרחיף חד-תאי מרקמת הריאה באמצעות דיסוצייאטור רקמות אוטומטי

  1. עבור כל עכבר, הכינו 4 מ"ל של חיץ HEPES קר כקרח בצינור דיסוציאטור רקמות מיוחד (ראו טבלת חומרים) ושמרו אותו על קרח.
  2. מרדימים עכברים על ידי הזרקה intraperitoneal של 150-200 μL של תערובת קטמין/xylazine. הזריקו 1-3 מיקרוגרם של נוגדן CD45 נגד עכבר מצומד פלואורופור (ראו טבלת חומרים) מדולל במי מלח רגילים של 100 מיקרוליטר תוך ורידי לכל עכבר מורדם. הרדימו את העכבר 3 דקות לאחר מתן נוגדנים עם הזרקה intraperitoneal של 500-600 μL של תערובת קטמין/xylazine.
  3. כרתו את הריאות והניחו אותן בצינור הדיסוציאטור הרקמתי המתאים להן מקורר על קרח. הניחו את הצינורות על מפיץ הרקמה האוטומטי (ראו טבלת חומרים) והריצו את התוכנית הראשונה (תוכנית מוגדרת מראש) לרקמת ריאה.
  4. הוסף 500 μL של תמיסת מלאי Liberase ו- 500 μL של תמיסת מלאי aminoguanidine לכל צינור המכיל את רקמת הריאה המנותקת. דוגרים על מיקסר אגוזים במשך 30 דקות בחום של 37°.
  5. הניחו את הצינורות בחזרה על הדיסוציאטור והריצו את התוכנית השנייה (תוכנית מוגדרת מראש) לרקמת הריאה.
  6. יוצקים את המתלה החד-תאי מצינור הדיסוציאטור של הרקמה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. שטפו את צינור הדיסוציאטור של הרקמה עם 5 מ"ל של EHAA מלא (או כל תווך תאי T שווה ערך) ועברו דרך המסננת לתוך צינור 50 מ"ל.
  7. הסר את המסננת והעלה את נפח תרחיף התא ל -50 מ"ל עם EHAA מלא. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר מאחור כ 100 μL של supernatant ו cell pellet.
  8. הוסף כ- 100 μL של תמיסת בלוק Fc כדי להביא את הנפח הכולל עד 200 μL ומערבול במרץ כדי להשעות מחדש את הכדור.

3. פרוטוקול חלופי: יצירת תרחיף חד תאי מרקמת הריאה באמצעות דיסוציאציה ידנית

  1. עבור כל עכבר, הכינו 1 מ"ל של EHAA מלא בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל ושמרו על קרח.
  2. מרדימים עכברים על ידי הזרקה intraperitoneal של 150-200 μL של תערובת קטמין/xylazine. הזריקו 1-3 מיקרוגרם של נוגדן CD45 נגד עכבר מצומד פלואורופור מדולל ב -100 מיקרוליטר של מלח רגיל תוך ורידי לכל עכבר מורדם. הרדימו את העכבר 3 דקות לאחר מתן נוגדנים עם הזרקה intraperitoneal של 500-600 μL של תערובת קטמין/xylazine.
  3. נתחו את הריאות והניחו אותן בצינור המיקרופוגה המתאים שלהן בנפח 1.5 מ"ל מקורר על קרח.
  4. לאחר שכל הריאות נקצרו, העבירו כל ריאה לצינור מיקרופוגה טרי ללא כל מדיה תאית.
  5. חותכים את הריאות לשברים קטנים (~ 2-3 מ"מ גושים) באמצעות מספריים בתוך צינור המיקרופוגה.
  6. יש להוסיף 1 מ"ל של קוקטייל העיכול Liberase TM/DNase I לכל צינור.
  7. יש לדגור במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים. החזירו את הדגימות לקרח לאחר מכן כדי למנוע עיכול יתר.
  8. יוצקים את הדגימה על מסננת תאים של 100 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל. מועכים את הרקמה כנגד הרשת עם קצה הגומי של הבוכנה ממזרק סטרילי של 1 מ"ל.
  9. שוטפים את המסננת עם חיץ סדרן קר, איסוף נפח סופי של 7 מ"ל בצינור. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כ 100 μL של supernatant ו cell pellet.
  10. הוסף 100 μL של תמיסת בלוק Fc כדי להביא את הנפח הכולל עד 200 μL ולערבל במרץ כדי להשעות מחדש את הכדור.

4. העשרת דגימת הריאה לתאי T באמצעות העשרת חרוזים מגנטיים

  1. הוסף 50 μL של מיקרו-כדוריות CD90.2 נגד עכבר (ראה טבלת חומרים). מערבלים ודגרים במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: CD90.2 מתאים לאלל המבוטא על ידי תאי T בעכברי C57BL/6. בדוק גנוטיפ אלל אם זנים אחרים של עכברים משמשים.
  2. בינתיים, הניחו עמודת הפרדת תאים פאראמגנטית (ראו טבלת חומרים) על מגנט הפרדת תאים בעל מיקום אחד או ארבעה (ראו טבלת חומרים). מקם צינור חרוטי פתוח של 15 מ"ל מתחת לכל עמוד כדי ללכוד את הזרימה דרכו. מקימים את העמוד עם 3 מ"ל של חיץ מיון קר, המאפשר לעמוד להתנקז על ידי כוח הכבידה לתוך הצינור החרוטי שמתחת.
  3. לאחר שהתאים דגרו עם המיקרו-כדוריות במשך 10 דקות, הוסיפו חיץ מיון קר לנפח של 1 מ"ל והעבירו דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר הממוקמת על גבי העמודה. אספו את זרימת העמוד לתוך צינור חרוטי טרי של 15 מ"ל הממוקם מתחת לעמודה.
  4. לאחר שמתלה התא התנקז לחלוטין דרך העמוד על ידי כוח הכבידה, שטפו את העמוד על ידי שטיפת הצינור המקורי עם 3 מ"ל נוספים של חיץ מיון קר והחלתו על העמוד דרך הרשת, ובכך שטפו את המסננת. הסירו את המסננת.
  5. כאשר הדגימה שוב התנקזה לחלוטין לתוך העמודה, ולא זרימה נוספת יוצאת מהעמודה, הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו על גבי צינור חרוטי טרי של 15 מ"ל.
  6. הוסף 5 מ"ל של מאגר סדרן קר לעמודה.
  7. נטרל מיד את התאים הקשורים לטור על ידי דחיפת בוכנה העמודה לחלק העליון בתנועה רציפה אחת ואילוץ מאגר הממיין מתחתית הטור לתוך הצינור החדש.
  8. צנטריפוגה את הדגימות המדוללות ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר מאחור כ 100 μL של supernatant ו cell pellet.
  9. הוסף 100 μL של חיץ מיון קר כדי להביא את הנפח הכולל עד 200 μL ומערבולת במרץ כדי להשהות מחדש את הכדורית.
  10. נתח את דוגמת הזרימה המכילה את מקטע התא הלא מאוגד, אם תרצה בכך.

5. צביעת תאי T ספציפיים לאנטיגן בפפטיד:MHC טטרמרים

  1. הוסיפו 1 μL של 10 μM Dasatinib (ראו טבלת חומרים) לכל דגימה, מערבולת, ודגרו במשך 5 דקות ב-RT.
  2. הוסף פפטיד מצומד PE או APC:MHC טטרמר לריכוז סופי של 10 ננומטר (או ריכוז ממוטב אמפירית עבור טטרמר נתון).
  3. מערבלים ודגרים בחושך במשך שעה אחת ב-RT (או ממוטבים אמפירית בזמן ובטמפרטורה).

6. ניתוח תאי T המסומנים בטטרמר על ידי ציטומטריית זרימה

  1. בזמן שהדגימה מוכתמת בטטרמרים פפטידים:MHC, הכינו תערובת אב של נוגדנים כדי להכתים את סמני פני השטח של התאים (טבלה 1).
    הערה: הימנע פלואורופורים המתנגשים עם נוגדן CD45 המנוהל תוך ורידי או טטרמרים.
  2. כשנותרו 15 דקות בתקופת הדגירה לצביעת טטרמר, יש להוסיף תערובת מאסטר נוגדנים למשטח ביחס של 1:100 (או ריכוז אופטימלי אמפירית) לכל דגימה.
  3. המשיכו לדגור בחושך ב-RT למשך שארית תקופת הדגירה של שעה אחת.
  4. הוסף 50,000 חרוזי ספירת ציטומטריה של זרימה (ראה טבלת חומרים) והוסף מאגר מיון קר לנפח סופי של כ- 5 מ"ל. צנטריפוגה את הדגימה המוכתמת ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט, והותירו מאחוריכם כ-100 מיקרוליטר של סופרנאטנט וגלולת תא/חרוז.
  5. השהה מחדש את הדגימה עם 200 μL נוספים של מאגר מיון והעבר את הדגימה לצינור מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) של 5 מ"ל.
  6. נתח את הדגימה על ציטומטר זרימה. אסוף תאים רבים ככל האפשר, עד למקסימום של 2,500,000 אירועים בסך הכל. ודא שנאספו לפחות 20,000 אירועי ספירת חרוזים. שמור על קצב רכישה של 5,000 אירועים לשנייה או פחות.
  7. שמור את כל הנתונים כקבצי FCS.

  

פלואורוכרוםנוגדן
BUV395CD90.2
כחול פסיפיקCD45 (נוסף מוקדם יותר על ידי הזרקת i.v)
פסיפיק אורנג'CD8
סגול מבריק 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5Dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PEpMHC טטרמר או סמן פנוטיפי
PE-Cy7סמן פנוטיפי (למשל CD44, PD-1, CD69 וכו ')
נגמ"שpMHC טטרמר או סמן פנוטיפי
AlexaFluor 700סמן פנוטיפי (למשל CD44, PD-1, CD69 וכו ')
APC-Cy7כתם חי/מת

טבלה 1: מטריצת צביעה לדוגמה. פאנל טיפוסי של נוגדני ציטומטריית זרימה מצומדת פלואורופורית המשמשים לזיהוי ואפיון תאי T ספציפיים לאנטיגן.

7. ניתוח נתונים

  1. נתח את קבצי הנתונים של FCS באמצעות תוכנת ציטומטריית זרימה מתאימה.
    1. הגדר רצף של שערי הכללה עוקבים כדי לזהות 1) דמוי לימפוציטים, 2) יחיד, 3) חי, 4) אקסטרה-וסקולרי, 5) שלילי dump, ו-6) אירועים חיוביים CD90.2 שהם חיוביים CD4 או CD8 חיוביים (איור 2).
    2. זהה את תאי T חיוביים לטטרמר בתוך אוכלוסיות אלה.
  2. קבע ספירת תאים חיובית מוחלטת של טטרמר על ידי חישוב היחס בין החרוזים שנוספו (50,000) למספר החרוזים שנאספו במהלך ריצת הדגימה והכפלת הערך עם המספר הכולל של תאים חיוביים לטטרמר שנאספו.
    figure-protocol-1

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מתאר את אסטרטגיית ה-gating המייצגת המשמשת לזיהוי תאי CD4+ T נדירים ספציפיים לאנטיגן בריאות עם טטרמרים מסוג PEPTIDE:MHC Class II. ניתן ליישם את אותו תהליך עבור תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן עם טטרמרים מסוג פפטיד MHC Class I (הנתונים אינם מוצגים).

בשל המספר הגבוה של תאים שאינם לימפואידים בריאות, זיהוי אמין של תאי T ספציפיים לאנטיגן נדירים על ידי טטרמר דורש צורה כלשהי של העשרה מוקדמת עבור תאי T המעוניינים לשפר את האות לרעש. איור 3 ממחיש את היעילות של העשרה מגנטית מבוססת נוגדנים CD90.2 של סך תאי T מרקמת הריאה שתיארנו בפרוטוקול זה. בממוצע, אנו משחזרים יותר מ 99% מכל תאי CD90.2+ T מהריאות עם טוהר של יותר מ -90% באמצעות תהליך העשרה זה. איור 4 מדגים את הזיהוי המשופר של תאי CD4+ T נדירים חיוביים לטטרמר כתוצאה מהעשרה זו, לעומת היעדר העשרה או אסטרטגיית העשרה ישירה של תאים מבוססי טטרמר.

איור 5 מדגים את התיוג המשופר של תאי T ספציפיים לאנטיגן שטופלו בדסטיניב, במיוחד באוכלוסיות נדירות.

figure-results-1
איור 2: אסטרטגיית Gating לניתוח ציטומטריית זרימה. שערי הכללה והרחקה רציפים המשמשים לזיהוי תאי CD4+ T נדירים ספציפיים לאנטיגן עצמי המצטברים בריאות לאחר פגיעה חריפה ברקמות. ניתן לזהות חרוזי ספירה ישירות על סמך הפלואורסצנטיות שלהם לאורך ערוץ FITC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 3: העשרה מגנטית מבוססת נוגדנים CD90.2 של סך תאי T בריאות. חלקות ציטומטריה של זרימה מייצגת מוצגות עבור השברים הלא מאוגדים (משמאל) והמאוגדים (מימין) של דגימת ריאה לאחר העשרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 4: השוואה בין אסטרטגיות להעשרת תאים כדי לסייע בזיהוי תאי T נדירים הספציפיים לאנטיגן בריאות. שלושה עכברים המבטאים מודל של אנטיגן עצמי באפיתל הריאה חוסנו תת עורית באפיטופ פפטידי מהאנטיגן העצמי המתחלב באדג'ובנט של פרוינד מלא (CFA). לאחר 7 ימים, ריאות עכברים נקצרו, אוחדו ופוצלו לשלוש דגימות שוות להכתמת טטרמר לאחר ללא העשרת תאים (משמאל), העשרת תאים מבוססת נוגדנים CD90.2 (במרכז), או העשרת תאים מבוססי טטרמר (מימין). הדגימות נותחו על ידי ציטומטריית זרימה עבור לא יותר מ -1,500,000 אירועים בסך הכל (אירועים מגודרים CD4+ מוצגים). מספרים של אירועים חיוביים לטטרמר מצוינים בשחור, בעוד שהמספרים הכוללים המחושבים של תאי T ספציפיים לאנטיגן בדגימות הריאה מסומנים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 5: טיפול בדסאטיניב משפר את הכתמת הטטרמר. עכברי בר (משמאל) או עכברים המבטאים מודל אנטיגן עצמי באפיתל הריאה (מימין) חוסנו תת עורית באפיטופ פפטידי מהאנטיגן העצמי המתחלב ב- CFA. הטחול ואיברי הלימפה מהעכברים נקצרו, שולבו ופוצלו לשתי דגימות שוות לתיוג עם טטרמרים מסוג MHC Class II עם או בלי טיפול מקדים בדסטיניב. היסטוגרמות של צביעת טטרמר הן שכבות על, השוואת דגימות שטופלו עם (אדום) וללא (כחול) dasatinib. עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית של כל דגימה מסומנת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיונים קודמים של תאי T ספציפיים לאנטיגן מהריאות נהנו מהמספרים החזקים של תאי T ספציפיים לאנטיגן המתרחבים לאחר אירוע ראשוני חריף כגון חיסון תוך אפי או זיהום 20,21,22. עם זאת, אוכלוסיות נדירות יותר של תאי T בריאות, כגון תאי T ספציפיים לאנטיגן עצמי או תאי T של זיכרון שוכני רקמות, קשות לזיהוי ללא צורה כלשהי של העשרת דגימות עבור תאי T המעניינים 15,16,23. השגנו מטרה זו על ידי שילוב טכניקות דיסוציאציה של רקמת ריאה שתוארו קודם לכן כדי להניב אחוז גבוה של לימפוציטים קיימא24,25 עם אסטרטגיה להבחין בין תאי T תוך וסקולריים לבין תאי T פרנכימליים ותהליך העשרה כללי מבוסס תאי T ואחריו צביעת טטרמר17. באמצעות פרוטוקול זה, הדגמנו את היכולת לזהות ולאפיין תאי T נדירים ספציפיים כנגד אנטיגנים עצמיים בריאה המתעוררים בתגובה לחיסון ישיר בפפטיד אקסוגני או הפעלה עקיפה משחרור אנטיגן במהלך נזק לרקמות15,16. מספר שיקולים נעשו בפיתוח פרוטוקול זה.

תיארנו שני פרוטוקולים שונים לעיבוד רקמת ריאה שעבדו היטב. האחד כרוך בשימוש במכשיר דיסוציאציה אוטומטי של רקמות, ואילו השני מסתמך על תהליך ידני. חשוב לציין ששתי השיטות משתמשות ב-Liberase TM, תערובת של collagenase I ו-II המכילה גם תרמוליזין metalloprotease. הודגם כי תערובת אנזימים זו מגבירה את פעילות העיכול על פני קוקטייל קולגנאז יחיד, והודגם כי היא פועלת היטב עם התאוששות של לויקוציטים מרקמת ריאה26.

פרוטוקול דיסוציאציה אוטומטי של רקמות דורש עלות גבוהה מראש עבור המכונה וצינורות דיסוציאציה מיוחדים של רקמות, אך ניתן לשטוף את הצינורות ולעשות בהם שימוש חוזר יחד עם מסננות תאים, שגם הן בדרך כלל ניתנות לשימוש חוזר. פרוטוקול הדיסוציאציה הידני אינו כרוך בעלות מראש של ציוד מיוחד, אך הוא דורש עבודה רבה ומאריך את הקציר מכיוון שכל דגימה נחתכת בנפרד. ישנם הבדלים אחרים בין הפרוטוקולים הנוגעים לשימוש באמינוגואנידין או DNase I להגבלת מוות תאי והצטברות תאים, אך לא השווינו בזהירות את ההשפעה של תוספים אלה. ההחלטה להשתמש בכל אחד מהפרוטוקולים צריכה להיות תלויה בניסיון האישי בסוג המחקר המבוצע, כמו גם בזמינותו של מכשיר דיסוציאציה אוטומטי של רקמות, אשר יהווה את הגורם הגדול ביותר בעלות. ואכן, ניתן לערבב ולהתאים אלמנטים של שני הפרוטוקולים כדי לספק את הביצועים הטובים ביותר לצרכים הספציפיים של המחקר.

הפרוטוקול שהוזכר לעיל אינו כולל באופן בולט את השימוש בשיפוע צפיפות כדי לבודד לימפוציטים מהמתלה החד-תאי שהוכן מדיסוציאציה של רקמות. מצאנו כי שלב העשרת תאי T מגנטיים הדרוש לזיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מייתר שלב זה. עם זאת, במקרים בהם תדרי תאי T ספציפיים לאנטיגן גבוהים מספיק כדי לבטל לחלוטין את הצורך בשלב העשרת תאי T, מומלץ שיפוע צפיפות מכיוון שהוא יספק כמות משמעותית של העשרת תאי מטרה על ידי הסרת מספר רב של תאים שאינם לימפואידים. בנוסף, אם התכשירים החד-תאיים של הריאה גדולים במיוחד ו/או מבולגנים, ניתן להשתמש בשלב שיפוע צפיפות לפני העשרה מגנטית כדי להסיר פסולת תאים עודפת שעלולה מאוחר יותר לסתום את העמודות (שלבים 4.4-4.7).

בחרנו בהעשרה כללית של כל תאי T בהתבסס על סמן תאי T מחבת CD90 (CD90.2 עבור האלל המתבטא בעכברי C57BL/6) במקום אסטרטגיית העשרת תאים ישירה יותר המבוססת על טטרמר. זה מציע מספר יתרונות. (1) העשרה מבוססת CD90 מביאה למספר גבוה יותר של אירועים ספציפיים לאנטיגן שזוהו בציטומטריית זרימה מאשר דגימות העשרה לא מועשרות או מבוססות טטרמר (איור 4). הדבר תורם להערכות טובות יותר של תדרי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מבלי להזדקק לאיסוף מספרים מופרזים של סך האירועים (>2,500,000), מה שמאריך את זמני איסוף הדגימות ומחמיר את רזולוציית האות לרעש. (2) שלא כמו העשרה מבוססת טטרמר, העשרה מבוססת CD90 מאפשרת הערכה של כל תא תאי T של הריאה, כולל תאי T CD4+ ו- CD8+ , תאי T תוך וסקולריים לעומת חוץ-וסקולריים, וספציפי לאנטיגן לעומת אנטיגן לא ספציפי, הכל בדגימה אחת (איור 2). (3) מכיוון ששלב ההעשרה מבוסס CD90 מתרחש לפני צביעת הטטרמר, הוא ממזער את הזמן לפני ניתוח תאים המסומנים בטטרמר על ציטומטר הזרימה, ובכך מגביל את אובדן האות הפוטנציאלי מניתוק טטרמר.

תהליך העשרת תאי T בפרוטוקול זה מבוסס על ברירה חיובית עם חרוזים מגנטיים CD90.2, אך ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות אסטרטגיות ברירה שלילית המסופקות על ידי ערכות בידוד תאי CD4, CD8 או Pan T. אנו מתארים את השימוש במותג מסוים של מיקרו-כדוריות, עמודים ומגנטים, אך גם מערכות העשרה מגנטיות אחרות אמורות לעבוד. שוב, החלטות צריכות להתבסס על הביצועים במחקר הספציפי המבוצע, כמו גם על עלויות כוללות, אשר יכול להיות משמעותי. מניסיוננו עם פרוטוקולי העשרה, יש פשרה כללית בין תפוקת תאי המטרה לבין טוהר, ולצורך איתור מספר מוגבל ביותר של תאי T ספציפיים לאנטיגן, התשואה מקבלת עדיפות.

בעוד שהתוצאות המייצגות מתארות ניסויים הכוללים תאי T CD4+ וטטרמרים פפטידים:MHC Class II, פרוטוקול זה יעיל באותה מידה עבור תאי T CD8+ וטטרמרים מסוג פפטיד MHC Class I. במקרים כאלה, יש לקחת בחשבון את התנאים השונים האפשריים הנדרשים על ידי צביעת טטרמר סוג I (ריכוז, זמן, טמפרטורה). יתר על כן, איננו רואים כל סיבה המונעת את השימוש בו למחקרים ספציפיים לתאי B עם ריאגנטים מתאימים של תאי B המסומנים בפלואורוכרום27.

לבסוף, הפרוטוקול המתואר כאן כולל את הוספת מעכב החלבון קינאז Dasatinib לדגימה לפני צביעת טטרמר. Dasatinib חוסם איתות והפנמה של TCR, אשר משפר את תיוג הטטרמר של תאי T תוך הפחתת מוות תאי T הנגרם על ידי טטרמר19. מצאנו את היתרון של הטיפול בדסאטיניב בצורה הבולטת ביותר בזיהוי האוכלוסייה הנדירה יותר הספציפית לאנטיגן עצמי. זה כנראה נובע מהעובדה שתאי T ספציפיים לאנטיגן עצמי מבטאים זיקה נמוכה יותר TCR בשל ההשפעות של ברירה שלילית במהלך סבילות מרכזית 28,29,30,31.

הפרוטוקול המשמש כאן שולב בהצלחה עם פרוטוקולי צביעה תוך-תאיים לניתוח גורם שעתוק וביטוי ציטוקינים בתאי T ספציפיים לאנטיגן נדירים השוכנים בריאה. כמו כן, מיינו בהצלחה את האוכלוסיות הנדירות הללו לניתוחים במורד הזרם, כולל תעתיק חד-תאי וריצוף TCR. המשך השימוש והפיתוח של פרוטוקול זה אמור להועיל מאוד למחקרים על חסינות נרכשת בפתופיזיולוגיה של הריאות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל- L. Kuhn על הסיוע הטכני בעיבוד רקמות וייצור טטרמר. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AI107020 ו-P01 AI165072 ל-J.J.M., T32 AI007512 ל-D.S.S.), קונסורציום מסצ'וסטס למוכנות לפתוגנים (J.J.M) והוועד המנהל של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס למחקר (J.J.M).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסננת תאים 100 מ"מפישר סיינטיפיק22-363-549
10x PBS ללא Ca++ או Mg++Corning46-013-CM
1x PBS ללא Ca++ או Mg++corning21-031-CV
AccuCheck ספירת חרוזיםInvitrogenPCB100
אמינוגואנידין המיסולפט מלחסיגמא-אולדריץ'A7009
CD90.2 מיקרו-חרוזים, עכברMiltenyi130-121-278
מגנט הפרדת תאים (מפריד MidiMACS)Miltenyi130-042-302בודדת LS
מגנט הפרדת תאים (מפריד QuadroMACS)Miltenyi130-090-976מחזיק 4 עמודות LS
Dasatinibסיגמא-אולדריץ'CDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle' s Ham' s חומצות אמינו בינוניותSigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235מפרק רקמות אוטומטי
עדיןMACS C TubesMiltenyi130-093-237צינורות דיסוציאטור רקמות אוטומטיים
תמיסת מלח מאוזנת של האנק עם Ca++ או Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KetamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue נוגדן CD45 נגד עכבר (שיבוט: 30-F11)Biolegend103126
עמודות הפרדת תאים פרמגנטיות (עמודות LS)Miltenyi130-042-401מגיע עם בוכנה
מטוהר נגד עכבר נוגדן CD16/32 (שיבוט: 93)Biolegend101302
RPMI 1640 בינוני ללא L-גלוטמיןקורנינג15-040-CM
נתרן כלורי 0.9% (מי מלח רגילים)CytivaZ1376
קסילזיןPivetalNDC 466066-750-02
מחזיק עמודה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  3. Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
  4. Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
  5. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  6. Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
  7. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  8. Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  9. Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
  10. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  11. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. (68), e4420(2012).
  12. Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), 9673(2019).
  13. Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
  14. Zheng, M. Z. M., Wakim, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
  15. Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
  16. Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839(2023).
  17. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
  18. Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
  19. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  20. Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
  21. Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
  22. Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
  23. Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
  24. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  25. Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
  26. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
  27. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  28. Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
  29. Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
  30. Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
  31. Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Peptide MHCTTT

מאמרים קשורים