מאמר שיטה

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח ציטומטרי זרימה

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66945

⸱

26 ביולי 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקולים להכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח זרימה ציטומטרי

.

תקציר

תאי אפיתל תימיים (TECs) ממלאים תפקיד חיוני בקידום ההתפתחות והבחירה הרפרטוארית של תאי T. TECs קליפת המוח (cTECs) בקליפת המוח התימית גורמים להתפתחות מוקדמת של תאי T וברירה חיובית של תימוציטים בקליפת המוח. לעומת זאת, TECs מדולריים (mTECs) במדולה התימית מושכים תימוציטים שנבחרו באופן חיובי מקליפת המוח ויוצרים סובלנות עצמית בתאי T. מגוון מולקולות, כולל DLL4 ו-beta5t המתבטאות ב-cTECs, כמו גם Aire ו-CCL21 המתבטאות ב-mTECs, תורמות לתפקוד התימוס התומך בהתפתחות וברירה של תאי T. ניתוח זרימה ציטומטרי של מולקולות רלוונטיות מבחינה תפקודית ב-cTECs ו-mTECs שימושי לשיפור ההבנה שלנו את הביולוגיה של TECs, למרות שהשיטות הנוכחיות להכנת תרחיפים חד-תאיים של TECs יכולות לאחזר רק חלק קטן של TECs (כ-1% עבור cTECs וכ-10% עבור mTECs) מבלוטת התימוס של עכברים בוגרים צעירים. מכיוון שרבות מהמולקולות הרלוונטיות מבחינה תפקודית ב-TECs ממוקמות בתוך התאים, אנו מתארים את הפרוטוקולים שלנו להכנת תרחיף תא בודד של TECs של עכברים וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח זרימה ציטומטרי.

מבוא

התימוס הוא איבר מזנכימלי אפיתל המקדם את ההתפתחות והבחירה הרפרטוארית של לימפוציטים מסוג T. במיקרו-סביבות קליפת המוח והמדולריות בתוך התימוס, תאי אפיתל תימוס (TECs) ממלאים תפקיד מכריע בהכוונת התפתחות וברירה של תאי T. מקובל היטב כי TECs קליפת המוח (cTECs) בקליפת המוח התימית תורמים בעיקר לאינדוקציה של התפתחות מוקדמת של תאי T ובחירה חיובית של תימוציטים המבטאים קולטני אנטיגן של תאי T (TCR) שנוצרו לאחרונה. לעומת זאת, TECs מדולריים (mTECs) במדולה התימית חיוניים למשיכה של תימוציטים שנבחרו באופן חיובי מקליפת המוח ולביסוס סובלנות עצמית מרכזית על ידי סילוק תאי T מגיבים עצמיים ועל ידי יצירת תאי T רגולטוריים1,2. פונקציות אלה של TECs בתמיכה בהתפתחות וברירה של תאי T מתווכות באמצעות מגוון מולקולות המתבטאות ב-cTECs ו-mTECs.

אלה כוללים ליגנד דמוי דלתא 4 (DLL4), חשוב למפרט שושלת תאי T של אבות לימפואידים)3,4, beta5t (ידוע גם בשם Psmb11, חשוב לבחירה חיובית של תאי CD8 T)5,6, ו-Prss16 (הידוע גם כפרוטאז סרין ספציפי לבלוטת התימוס, או TSSP, חשוב לבחירה חיובית של תאי CD4 T)7,8 מבוטא ב-cTECs, ומווסת אוטואימוני (Aire, חשוב לביטוי מופקר של גנים עצמיים)9,10, אצבע אבץ ממשפחת פז 2 (Fezf2, חשוב לביטוי מופקר של גנים עצמיים בלתי תלויים ב-Aire ויצירת תאי ציצית תימית)11,12,13,14וליגנד כימוקין מוטיב C-C 21 (CCL21, חשוב לנדידה מדולרית והצטברות של תימוציטים שנבחרו באופן חיובי)14,15,16 מבוטא ב-mTECs., זרימה ציטומטרית מספקת אמצעי לזיהוי כמותי של מולקולות משמעותיות מבחינה תפקודית ב-TECs, מה שמקל על הערכת ההתפתחות והתפקוד של cTECs ו-mTECs. מכיוון שרבות מהמולקולות ב-TECs מתבטאות בעיקר בתוך התאים, כגון בציטופלזמה (למשל, רכיב הפרוטאזום beta5t) ובגרעין (למשל, מווסת השעתוק Aire), יש יתרון לנתח כמותית מולקולות תוך-תאיות ב-cTECs ו-mTECs באמצעות ציטומטריית זרימה.

TECs נדירים בתימוס. לעכברה נקבה בגיל 5 שבועות יש כ-1 ×-106 cTECs וכ-2.5 ×-106 mTECs, בעוד שקליפת המוח התימית מכילה כ-3 ×10 8 תימוציטים CD4+CD8+ והמדולה התימית מכילה כ-5 ×-107 CD4+CD8- ו-CD4-CD8+ thymocytes17. לכן, הרוב המכריע (>99%) של התאים בבלוטת התימוס הם תאים המטופויאטיים, כולל תימוציטים, ולא TECs, בעכברים בוגרים צעירים. יתר על כן, TECs קשורים קשר הדוק לתאים שכנים (למשל, תימוציטים) ולרכיבים חוץ-תאיים אדריכליים (למשל, קולגן) בתוך התימוס, כך ששחרור TECs לתרחיף תאים דורש עיכול פרוטאז של התימוס. שיטות קונבנציונליות לעיכול אנזימטי מניבות רק חלק קטן מ-TECs; כ-1% (1 × 104) ו-10% (2 × 105) עבור cTECs ו-mTECs, בהתאמה, מ-Thymus17,18,19. היעילות הנמוכה של שחרור TEC מהתימוס נובעת ככל הנראה מהרגישות של TECs לאנזימים פרוטאוליטיים ולחץ מכני והקשר ההדוק של TECs עם תאים שכנים, במיוחד בין cTECs ו-CD4+CD8+ thymocytes20. בהקשר זה, התוצאות של ניתוח תא בודד של TECs של עכברים, כולל ניתוח זרימה ציטומטרי וניתוח ריצוף RNA של תא בודד, המבוססים על שיטות הכנת תאים בתיווך עיכול אנזימטי הנוכחיות מייצגות רק חלק קטן מה-TECs ולכן רחוקות מלהיות מקיפות . עם זאת, למרות מגבלות כאלה באחזור האנזימטי של TECs, ניתוח זרימה ציטומטרי של TECs של עכברים בתרחיף תא בודד עדיין שימושי לניתוח כמותי של מולקולות רלוונטיות מבחינה תפקודית ב-cTECs ו-mTECs. בתרחיף תאים, TECs הוגדרו כתאים חיוביים למולקולת פני השטח האפיתל EpCAM (CD326) ושליליים למולקולת פני השטח ההמטופויאטית CD45. בתוך EpCAM+CD45-TECs, רמות ביטוי פני התא של מולקולות Ly51 (הידועות גם בשם BP-1 ו-CD249) ויכולת הקישור של Ulex Europaeus agglutinin I (UEA1) (בעיקר קשירה לגליקופרוטאינים וגליקוליפידים המכילים פוקוז מקושר α) שימשו לסימון פנוטיפי של cTECs (Ly51גבוהUEA1נמוך) ו-mTECs (Ly51נמוךUEA1גבוה). כאן אנו מתארים את פרוטוקולי הניסוי שלנו להכנה קונבנציונלית של תרחיף תא בודד של TECs של עכברים וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח זרימה ציטומטרי, תוך התמקדות בניתוח כמותי של מולקולות תוך-תאיות beta5t, CCL21 ו-Aire ב-TECs של עכברים טריים.

פרוטוקול

כל הניסויים בעכברים בוצעו באישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לסרטן (ASP21-431, ASP21-432 ו-EIB-076-3).

1. הכנת תרחיף תאי תימוס

הערה: אונטוגניה של עכבר משפיעה על יעילות השחרור האנזימטי של TECs מבלוטת התימוס. שלוש שיטות בהתאם לגיל העכבר מתוארות כדלקמן.

  1. לעכברים לאחר לידה מעל גיל 3 שבועות
    1. קצרו את התימוס (שתי אונות תימוס) מעכבר אחד. מניחים את בלוטת התימוס ב-5 מ"ל של RPMI1640 המכילים 10 מ"מ HEPES בכלי פלסטיק 60 מ"מ על קרח.
    2. הסר דם, רקמות שאינן בלוטת התימוס ושומן בעזרת פינצטה מעוקלת עם קצה דק תחת מיקרוסקופ מנתח. חותכים את בלוטת התימוס לחתיכות קטנות (בגודל של כ-1-2 מ"מ) בעזרת מספריים לניתוח.
    3. העבירו את חתיכות התימוס לתוך שפופרת חרוטית של 15 מ"ל המכילה 3 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז/דיספאז, ותמיסת U/mL DNase 1 ב-RPMI1640 המכילה 2% סרום בקר עוברי (FBS). יש לדגור באמבט מים או בבלוק חום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    4. מערבבים בעדינות בעזרת פיפט העברה מפלסטיק בנפח 3 מ"ל. דגירה למשך 20 דקות נוספות למקרה ששברי הרקמה עדיין נראים לעין.
    5. מערבבים בעדינות בעזרת פיפט העברה מפלסטיק בנפח 3 מ"ל. דגירה למשך 10 דקות נוספות למקרה ששברי הרקמה עדיין נראים לעין.
    6. מערבבים בעדינות בעזרת פיפט העברה מפלסטיק בנפח 3 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של 5 מ"מ EDTA ב-1x HBSS המכיל 1% FBS.
    7. סנן את מתלה התא דרך רשת ניילון של 60 מיקרומטר ולתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. צנטריפוגה את מתלה התא ב-350 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    8. השעו מחדש את כדור התא ב-10 מ"ל של מאגר FACS (1x HBSS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר [BSA] ו-0.1% NaN3).
    9. אחסן את התאים על קרח וקבע את מספרי התאים באמצעות מונה תאים.
  2. לעכברים יילודים בין גיל שבוע לשבועיים
    1. בצע את שלב 1.1.1.
    2. הסר רקמות דם ורקמות שאינן בלוטת התימוס בעזרת פינצטה מנותחת תחת מיקרוסקופ מנתח. העבירו את בלוטת התימוס לצינור פלסטיק בנפח 1.5 מ"ל המכיל 200 מיקרוליטר RPMI1640 עם HEPES של 10 מ"מ וחתכו את בלוטת התימוס לחתיכות קטנות (בגודל של כ-1-2 מ"מ) בעזרת מספריים לניתוח.
    3. אפשר לשברי התימוס להתיישב בתחתית הצינור, ואז הסר בעדינות את המתלה בעזרת מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר.
    4. העבירו את חתיכות התימוס לתוך צינור תחתון עגול מפוליפרופילן בנפח 5 מ"ל המכיל 2 מ"ל של 0.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז/דיספאז ותמיסת U/mL DNase אחת RPMI1640 המכילה 2% FBS. יש לדגור באמבט מים או בבלוק חום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    5. מערבבים בעדינות באמצעות צינור העברה מפלסטיק של 3 מ"ל ולאחר מכן, עם מיקרופיפטה של 1 מ"ל המצוידת בקצה פלסטיק להומוגניזציה נוספת.
    6. הוסף 2 מ"ל של 5 מ"מ EDTA ב-1x HBSS המכיל 1% FBS. סנן את מתלה התא דרך רשת ניילון של 60 מיקרומטר ולתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. הוסף 16 מ"ל RPMI1640 המכיל 10 מ"מ HEPES.
    7. צנטריפוגה את תרחיף התא 350 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    8. אחסן תאים על קרח וקבע את מספרי התאים באמצעות מונה תאים.
  3. לעכברים עובריים ועכברים יילודים עד גיל שבוע
    1. קצרו את התימוס (שתי אונות תימוס) מעכבר אחד. הניחו את בלוטת התימוס בכלי פלסטיק בקוטר 60 מ"מ והסירו דם, רקמות שאינן בלוטת התימוס ושומן בעזרת פינצטה מעוקלת עם קצה דק תחת מיקרוסקופ מנתח.
    2. מניחים את התימוס ב-0.2 מ"ל של RPMI1640 המכיל 10 מ"מ HEPES בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השליכו את הנוזל בעזרת מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר.
    3. הוסף 0.5 מ"ל של 0.5 מ"ג/מ"ל קולגנאז/דיספאז ותמיסת U/mL DNase 1 RPMI1640 המכילה 2% FBS. יש לדגור באמבט מים או בבלוק חום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבבים בעדינות בעזרת מיקרופיפטה של 1 מ"ל עם קצה פלסטיק.
    4. הוסף 0.5 מ"ל של 5 מ"מ EDTA ב-1x HBSS המכיל 1% FBS. סנן את מתלה התא דרך רשת ניילון של 60 מיקרומטר ולתוך צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. הוסף 9 מ"ל של RPMI1640 המכיל 10 מ"מ HEPES.
    5. צנטריפוגה את תרחיף התא ב-350 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. אחסן תאים על קרח וקבע את מספרי התאים באמצעות מונה תאים.
  4. שיטה חלופית: עיכול ליבראז
    1. בצע את שלבים 1.1.1 ו- 1.1.2.
    2. הניחו לשברי התימוס להתיישב בתחתית הצינור; ואז הסירו בעדינות את המתלה בעזרת מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר. העבירו את חלקי התימוס לתוך שפופרת של 5 מ"ל המכילה 1 מ"ל של 0.5 U/mL Liberase ו-1 U/mL DNase ב-RPMI1640 המכילה 10 מ"מ HEPES. דגירה באמבט מים או בלוק חום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    3. מערבבים בעדינות בעזרת מיקרופיפטה של 1 מ"ל עם קצה פלסטיק. דגירה למשך 15 דקות נוספות למקרה ששברי הרקמה עדיין נראים לעין.
    4. מערבבים בעדינות בעזרת מיקרופיפטה של 1 מ"ל עם קצה פלסטיק. הוסף 1 מ"ל של 5 מ"מ EDTA ב-1x HBSS המכיל 1% FBS.
    5. סנן את מתלה התא דרך רשת ניילון של 60 מיקרומטר ולתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. הוסף 18 מ"ל RPMI1640 המכיל 10 מ"מ HEPES.
    6. צנטריפוגה את תרחיף התא ב-350 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השעו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של מאגר FACS (1x HBSS המכיל 1% BSA ו-0.1% NaN3).
    7. אחסן תאים על קרח וקבע את מספרי התאים באמצעות מונה תאים.

2. צביעת נוגדנים של תאי תימוס

  1. מניחים 16 × 106 תאים בצינור תחתון עגול מפוליסטירן בנפח 5 מ"ל. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 350 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  2. הוסף 10 מיקרוליטר של ריכוז עבודה של נוגדן חד שבטי לקולטן נגד Fc (mAb, שיבוט 2.4G2) במאגר FACS כדי לחסום קשירה לא ספציפית של IgG מכתים לקולטן Fc על פני התא. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. הוסף 40 מיקרוליטר כל אחד מריכוזי העבודה של אנטי-CD45 mAb (ספציפי לתא המטופויאטי (למשל, מסומן BV421), אנטי-EpCAM mAb (ספציפי לתאי אפיתל; למשל, מסומן PE-Cy7), אנטי-Ly51 mAb (מזהה cTEC; למשל, מסומן AF647) ו-Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1) (זיהוי mTEC; למשל, מסומן AF594) במאגר FACS. במקביל, הכינו צינורות לתאים מוכתמים בצבע יחיד ותאים לא מוכתמים להקמת ציטומטר זרימה.
  4. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לערבב היטב כל 10 דקות. להוסיף 2 מ"ל של מאגר FACS.
  5. תאי צנטריפוגה 350 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  6. הוסף 1 מיקרוליטר של Ghost Dye Violet 510 (כדי להבחין בין תאים ברי קיימא לתאים מתים בניתוח ציטומטרי זרימה של תאים קבועים וחדירים). השתמש במגיב Ghost Dye לא מדולל; מערבבים היטב. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; מערבבים היטב כל 10 דקות.
  7. הוסף 2 מ"ל של מאגר FACS. תאי צנטריפוגה 350 × גרם ב -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  8. תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 2% פרפורמלדהיד (PFA) ב- PBS ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  9. הוסף 3.5 מ"ל PBS לתאי הצינור והצנטריפוגה 700 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
  10. לחלחל את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר קיבוע/חדירות תוך תאי ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  11. צנטריפוגה של התאים 700 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
  12. הוסף 1 מ"ל של מאגר חדירות 1x. צנטריפוגה את התאים ב-700 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  13. הוסף 100 מיקרוליטר כל אחד מריכוזי עבודה של נוגדן אנטי-בטא-5t או נוגדן אנטי-CCL21, או 40 מיקרוליטר של ריכוזים פעילים של נוגדן אנטי-אייר (למשל, מסומן AF488), במאגר חדירות פי 1, ערבב היטב ודגר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. הוסף 1 מ"ל של מאגר חדירות 1x. צנטריפוגה את התאים ב-700 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  15. חזור על שלב 2.14.
  16. הוסף 100 מיקרוליטר של ריכוזי עבודה של IgG נגד ארנב (למשל, מסומן AF555) ודגר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. הוסף 1 מ"ל של מאגר חדירות 1x. צנטריפוגה את התאים ב-700 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
  18. השעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS וערבבו היטב.
  19. אחסן את התאים בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לניתוח ציטומטרי של זרימה.
  20. סנן תאים דרך רשת ניילון של 60 מיקרומטר לפני ניתוח ציטומטרי זרימה.

תוצאות

הניתוח דורש ציטומטר זרימה המאפשר זיהוי של לפחות שישה ערוצי פלואורסצנציה (עבור CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye, וכן beta5t, CCL21, ו/או Aire), כמו גם פרמטרים של פיזור קדמי וצידי (forward and side scatter). פרופילים ציטומטריים מייצגים של תאי תימוס שעברו עיכול באמצעות Collagenase/Dispase מעכברים בני 0 ימים ועכברים בני שבועיים מוצגים באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. בשתי הדמויות, תרשים הנקודות (dot plot) בפאנל A מראה את עוצמת הפיזור הקדמי (FSC) ועוצמת הפלואורסצנציה של Ghost Dye Violet 510 עבור כלל האותות החלקיקיים. יותר מ-90% מהאותות החלקיקיים מייצגים תאים חיים, כפי שנקבע על פי צביעה שלילית של ריאגנט ה-Ghost Dye ועל פי פיזור קדמי המשקף את גודל התא. פאנל B מראה אותי פלואורסצנציה על פני השטח של תאי תימוס חיים עבור CD45, מולקולה המובעת על ידי תאים המטופואטיים, ו-EpCAM, מולקולה המובעת על ידי תאים אפיתליאליים. אוכלוסיית תאים קטנה אך מובחנת היא CD45- EpCAM+, ולכן היא מייצגת TECs.

ניתוח פלוויטומטרי (Flow cytometry), EpCAM-PE-Cy7, CD45-BV421, אוכלוסיות תאים, cTECs, mTECs, ויזואליזציה של נתונים.
איור 1פרופילים מייצגים של ציטומטריה עם זרימה של תאי תימוס שעברו עיכול באמצעות קולגנאז/דיספז, מעכברים בני 0 ימים מרקע C57BL/6 מסוג פראי. (A) עוצמת פיזור קדימה (Forward scatter) ועוצמת פלואורסצנציה של Ghost Dye Violet 510 של אותות חלקיקים כוללים. המלבן האדום מצביע על אותות של תאים חיוניים. (B) אותות פלואורסצנציה של תאים חיים (מלבן אדום בלוח A) עבור CD45 ו-EpCAM. המربع האדום מציין CD45- EpCAM+ תאי אפיתל טובולרי (TECs). (Cאותות צביעה של Ly51 ו-UEA1 על פני השטח של תאי TECs (תיבה אדומה בלוח) Bחושפים שתי אוכלוסיות עיקריות: Ly51גבוה UEA1נמוך תאים מועשירים ב-cTECs וב-Ly51נמוך UEA1גבוה תאים המועשרים ב-mTECs. (ד-פגילוי של (D(beta5t, (ה') CCL21, ו-(FAire ב-cTECs (הפאנלים העליונים) וב-mTECs (הפאנלים התחתונים) כפי שהוגדרו בפאנל Cהיסטוגרמות באפור מציגות פרופילים של ביקורת שנצבעו ב- (ד',ה) נוגדן משני בלבד ו-(ז'נצבעו באמצעות תאים מעכברים חסרי Aire. קיצורים: FSC = פיזור קדימה (forward scatter); TECs = תאי אפיתל תימوسیים; cTECs = תאי אפיתל תימוסיים קורטיקליים; mTECs = תאי אפיתל תימוסיים מדולריים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח ציטומטריית זרימה, בחירת תאי TEC, CD45-BV421, EpCAM-PE-Cy7, תרשימי פיזור, היסטוגרמות.
איור 2: פרופילים מייצגים של ציטומטריית זרימה של תאי טימוס שעברו עיכול באמצעות Collagenase/Dispase מעכברים מסוג C57BL/6 wild-type בני שבועיים. (A) עוצמת פיזור קדמי (Forward scatter) ועוצמת פלואורסצנציה של Ghost Dye Violet 510 של סך אותות החלקיקים. המלבן האדום מציין את האותות של תאים חיים. (B) אותות פלואורסצנציה של תאים חיים (המלבן האדום בפאנל A) עבור CD45 ו-EpCAM. המלבן האדום מציין תאי TEC מסוג CD45- EpCAM+. (C) אותות צביעה של Ly51 ו-UEA1 על פני השטח של תאי TEC (המלבן האדום בפאנל B) חושפים שתי אוכלוסיות עיקריות: תאים מסוג Ly51high UEA1low המועשרים ב-cTECs, ותאים מסוג Ly51low UEA1high המועשרים ב-mTECs. (D-F) זיהוי של (D) beta5t, (E) CCL21, ו-(F) Aire ב-cTECs (פאנלים עליונים) וב-mTECs (פאנלים תחתונים) כפי שהוגדרו בפאנל C. היסטוגרמות אפורות מראות פרופילי ביקורת שנצבעו עם (D,E) נוגדן שני בלבד ונצבעו עם (F) IgG תואם-איזוטייפ המסומן ב-FITC. קיצורים: FSC = forward scatter; TECs = Thymic epithelial cells; cTECs = cortical TECs; mTECs = medullary TECs; FITC = fluorescein isothiocyanate. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

אותות צביעה של Ly51 ו-UEA1 על פני התאים כפי שמוצג בלוח (Panel) C חשיפה של שתי אוכלוסיות עיקריות ב-TECs; אוכלוסייה בעלת רמה גבוהה יחסית של Ly51 ורמה נמוכה של UEA1, העשירה ב-cTECs, ואוכלוסייה אחרת בעלת רמה נמוכה יחסית של Ly51 ורמה גבוהה של UEA1, העשירה ב-mTECs21,22,23,24,25במהלך שלבי העובר והיילוד, כולל ביום ה-0 לאחר הלידה, השכיחות של cTECs גבוהה מזו של mTECs. בשלבים שלאחר הלידה, שכיחות ה-mTECs היא הדומיננטית, בעיקר מכיוון שהיעילות של שחרור cTECs מהתימוס הופכת לנמוכה מאוד (ניתן לשחזר לסuspended single-cell כ-1% מה-cTECs ו-10% מה-mTECs).17.

קיבוע וחדירות של תאים מאפשרים את זיהוין של מולקולות תוך-תאיות בתוך TECs. פאנל D מראה ביטוי של beta5t שזוהה ברוב ה-cTECs אך לא ב-mTECs; פאנל E מראה זיהוי של CCL21 בחלק מה-mTECs אך לא ב-cTECs, ופאנל F מראה ביטוי של Aire בתת-אוכלוסייה של mTECs.

ניתן למצוא פרופילים ציטומטריים זורמים נוספים של מולקולות תוך-תאיות ב-TECs של עכבר במאמרים שפורסמו; עבור beta5t6,20, CCL2114,16,26, ו-Aire27,28, וכן עבור מולקולות תוך-תאיות נוספות, כולל keratin22,29 ו-Fezf211,30.

דיון

קולגנאז, עם או בלי Dispase, נמצא בשימוש נרחב לעיכול בלוטת התימוס של עכברים להכנת TECs 4,5,9,18,21. ליבראז, המכיל תערובת של פרוטאזות כולל קולגנאז, משמש גם לעיכול בלוטת התימוס להכנת TECs17,22. השימוש בקולגנאז וליבראז נותן למעשה תפוקות ואיכות שוות ערך של cTECs ו-mTECs מבלוטת התימוס של העכבר, אם כי הבדלים קלים עשויים להופיע בהתאם לאצווה המוצר של האנזימים. טריפסין משמש גם לעיכול יעיל של בלוטת התימוס21,23, אם כי הוכח כי מולקולות רבות על פני התא, כולל EpCAM ו-CD80 המתבטאות על ידי TECs, רגישות לעיכול טריפסין21. לעיכול אנזימטי של בלוטת התימוס, לעתים קרובות מוסיפים DNase כדי להפחית את הצמיגות עקב שחרור DNA מתאים פגומים17,21.

עיכול אנזימטי של בלוטת התימוס חיוני לשחרור TECs מבלוטת התימוס. יש לעכל את התימוס מספיק עד ששברי הרקמה הופכים לבלתי נראים ותרחיף התאים נראה הומוגני. עם זאת, אין להשאיר את העיכול זמן רב מדי מכיוון שטיפול אנזימטי מוגזם פוגע בתאים ומפחית את כדאיות התאים. בכל ניסוי, חשוב לשים לב היטב לתקופת הדגירה ולחוזק הפיפטינג במהלך עיכול התימוס. חשוב גם להיות מודעים לכך שטכנולוגיית העיכול האנזימטי הנוכחית מאפשרת שחרור של רק חלק קטן מה-TECs, כפי שפורט במבוא וכפי שדווח קודם לכן 17,18,19.

מכיוון ש-TECs נדירים בהשעיית תאי התימוס הכוללת, ניתוח זרימה ציטומטרי של TECs באמצעות תרחיף תאי תימוס כולל דורש צביעה של תאים רבים, בדרך כלל 8 ×10 6 עד 16 × 106 תאים למדידה.

ניתן להעשיר TECs שמקורם בתאי תימוס מעוכלים על ידי אנזימים באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-CD4522 ו/או צנטריפוגה של שיפוע צפיפות פרקול31. הליכי העשרה אלה חוסכים זמן במיוחד כאשר TECs מטוהרים לאחר מכן על ממיין תאים ציטומטרי זרימה. כמו כן, יש לציין כי העשרה נגד CD45 תסיר תת-אוכלוסייה של TECs הקשורים באופן הדוק לתימוציטים20 המבטאים CD45 וצנטריפוגת פרקול עשויה להסיר תת-אוכלוסייה צפופה באופן בלתי צפוי של TECs.

לגבי קיבוע TECs, ידוע כי טיפול PFA מכווץ תאים ומפחית את עוצמת הפיזור קדימה בניתוח ציטומטרי זרימה. פיפטינג עדין של תאים מיד לאחר הוספת 2% PFA והוספה לאחר מכן של PBS עשוי לסייע במניעת התכווצות יתר של התאים.

לניתוח ציטומטרי זרימה, בהתחשב בהופעה נדירה של TECs בתוך התימוס, תיחומם מחייב גישה מובחנת בהשוואה לתימוציטים או טחול. הסיווג הראשוני מבוסס על שימוש ב-CD45, סמן פאן-המטופויאטי הנפוץ בכל מקום על תימוציטים ותאים המטופויאטיים אחרים, כולל תאים דנדריטיים ומקרופאגים. לעומת זאת, TECs, בהיותם לא המטופויאטיים במקורם, חסרים ביטוי CD45. במקום זאת, TECs מבטאים EpCAM על פני השטח שלהם, ובכך מאפשרים אסטרטגיית שער פשוטה של CD45 שלילי ו-EpCAM חיובי להבחין ב-TECs. בניתוח הציטומטרי של הזרימה שלנו, אנו מתחילים בהגדרת אוכלוסייה זו ולאחר מכן מבטיחים קנה מידה מתאים של פרמטרים של פיזור קדימה וצדדית, בהתחשב בפער הגודל המשמעותי בין TECs לתימוציטים, ובהתחשב בגודל הגדול והאוטופלואורסצנטי הגבוה של TECs.

לאחר מכן, תשומת הלב מופנית להערכת סמני cTEC ו-mTEC בקרב האוכלוסייה החיובית ל-EPCAM שלילית CD45. בשל גודלה הזעיר של אוכלוסייה זו, שלב זה הופך להיות הכרחי לפיצוי cTECs ו-mTECs. בחינה של פאנל מוכתם לחלוטין (למשל, סמן cTEC Ly51 וסמן mTEC UEA-1 יחד עם CD45 ו-EpCAM המגדירים TEC) מבטיחה עוד יותר את נאותות קנה המידה של הפיזור. במהלך הגדרת הזרימה הציטומטרית, המטרה העיקרית שלנו סובבת סביב הבחנה בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות עבור כל נוגדן.

בצביעה משותפת של Aire, beta5t ו-CCL21, מזוהות אוכלוסיות נפרדות בתוך תת-קבוצות TEC. בהתחשב בביטוי הסלקטיבי של אייר על ידי mTECs, אנו מתמקדים בכתם ארבעת הצבעים של תאים CD45-שליליים/EPCAM-positive/UEA-1-חיוביים/Ly51-שליליים. כאן, תאים חיוביים ל-UEA-1 משמשים כדי לבסס את הבקרה השלילית עבור Aire, מה שמקל על זיהוי ברור של תאים חיוביים ל-Aire. גישה דומה מאומצת עבור CCL21, המתבטאת ב-mTECs. לעומת זאת, עבור beta5t, המתבטא אך ורק על ידי cTECs, מיושמת אסטרטגיית שער דומה, בדגש על תאים חיוביים ל-Ly51 בתוך הכתם בעל ארבעת הצבעים, כדי לברר את רמות הרקע של beta5t. ניתוח עוקב של דגימות צבועות ב-anti-beta5t מקל על זיהוי אוכלוסייה חיובית.

נוגדנים נגד beta5t ונוגדנים נגד CCL21 הם נוגדנים לארנב, ולכן אין לערבב נוגדנים אלה ללא תיוג פלואורסצנטי מוקדם. יש לקבוע מראש ריכוזי עבודה של נוגדנים על ידי ביצוע ניתוח זרימה ציטומטרי של תאי בקרה (למשל, TECs מעכברי בר ונוקאאוט) המוכתמים בדילולים סדרתיים של נוגדנים.

בניתוח זרימה ציטומטרי, cTECs ו-mTECs מוגדרים לעתים קרובות על ידי ביטוי פני התא של Ly51 או CD205 עבור cTECs ושל UEA1 ו-CD80 עבור mTECs. עם זאת, יש לזכור כי cTECs ו-mTECs חייבים להיות מוגדרים בסופו של דבר על ידי הלוקליזציה המיקרו-אנטומית שלהם בתימוס. בתימוס העוברי, ראיות מתפתחות מצביעות על כך שהביטוי של Ly51 ו-CD205 אינו מוגבל ל-cTECs אלא מתרחב לאוכלוסיות אחרות של TECs, כולל אבות דו-פוטנטיים cTEC/mTEC ו-mTECs לא בשלים32,33. בנוסף, ביטוי Ly51 ב-cTECs נשאר נמוך במהלך האמבריוגנזה ובתקופה סביב הלידה בהשוואה לתקופהשלאחר הלידה 33, כפי שמוצג גם באיור 1 ובאיור 2.

לסיכום, ניתוח זרימה ציטומטרי של תרחיף תא בודד משוחרר אנזימטית של TECs מציע טכניקה רבת עוצמה לניתוח כמותי של TECs ותת-האוכלוסיות שלהם ברזולוציה של תא בודד, למרות היעילות המוגבלת של שחרור TECs. בפרט, ניתוח זרימה ציטומטרי של מולקולות תוך-תאיות בתרחיף TEC חד-תאי שימושי לחקר הביטוי של מגוון מולקולות החשובות להתפתחות ותפקוד של TECs ותת-האוכלוסיות שלהם.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים לד"ר איזומי אוהיגאשי על קריאת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית ZIA BC 011806 המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסרטן והמרכז לחקר הסרטן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז/דיספאז Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / סט מאגר צביעה של גורם שעתוקeBioscience00-5523-00
צבע רפאים סגול 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 נוגדן חד שבטי CD45 נגד עכבר, שיבוט 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 נוגדן חד שבטי נגד עכבר Ly51, שיבוט 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 נוגדן חד שבטי EpCAM / CD326, שיבוט G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)וקטור מעבדותDL-1067-1
Alexa Fluor 488 נוגדן חד שבטי נגד עכבר, שיבוט 5H12eBioscience53-5934-82
נוגדן חד שבטי נגד עכבר Psmb11/beta5t, שיבוט CPTC-PSMB11 (עכבר)-1NIH NCICPTC-PSMB11 (עכבר)-1
https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal נוגדן נגד עכבר CCL21/exodus 2 נוגדן רב-שבטי ארנבBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 נגד ארנב IgG כבד שרשרת עז עז רקומביננטי נוגדןInvitrogenA27039
נגד עכבר CD32 / CD16 – מטוהר (Fc בלוק נוגדן)Leinco TechnologiesC247
ניילון רשת 60 מיקרוןאספקת רכיביםW31436
ציוד
ThermomixerEppendorfחום בלוק
תא תא אוטומטי 2000 תא כדאיות מונהNexcelomViable Cell Counting
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesFlow Cytometerחמישה לייזרים (355, 408, 488, 595 ו-637 ננומטר)
FACSDiva גרסת תוכנה 9.0.1BD BiosciencesFlow Cytometric Analysis
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesFlow
נוגדניםקצב דילול (ריכוז עבודה)מאגר
נגד עכבר CD32/CD16 – מטוהר (נוגדן בלוק FC)1:40FACS מאגר
BV421 נגד עכבר CD45 נוגדן חד שבטי1:25FACS מאגר
PE/Cy7 נגד עכבר EpCAM / CD326 נוגדן חד שבטי1:100FACS מאגר
Alexa Fluor 647 נגד עכבר Ly51 נוגדן חד שבטי1:100FACS Buffer
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)1:400FACS מאגר
אנטי עכבר CCL21 / exodus 2 ארנב נוגדן רב-שבטי1:2001x מאגר
נגד עכבר Psmb11 / beta5t נוגדן חד שבטי ארנב, שיבוט CPTC-PSMB11 (עכבר) -11:10001x מאגר
Alexa Fluor 555 אנטי ארנב IgG שרשרת כבדה עז עז נוגדן רקומביננטי1:4001x מאגר מאגר
RPMI1640 ייעודית
המכילה 10 מ"מ HEPES להכנת תאים
RPMI1640 המכילים 2% FBSלהכנת תאים
מאגר FACS (1x HBSS המכיל 1% BSA  ו-0.1% נתרן אזיד)להכנת תאים
1 מ"ג/מ"ל קולגנאז/דיספאז ו-1U/ml תמיסת DNase ב-RPMI1640 המכילה 2% FBSלעיכול
2% PFA ב-PBSלקיבוע
מאגר קיבוע/פרמביליזציה (חלק אחד של תרכיז קיבוע/פרמביליזציה עם 3 חלקים של מדלל קיבוע/פרמביליזציה)לקיבוע תאים
1x חוצץ פרמביליזציה (חלק אחד 10X מרוכז עם 9 חלקים מים מזוקקים)לצביעת נוגדנים בין-תאיים 
ניתוח נתונים ציטומטרייםדילולפרמביליזציהפרמביליזציהפרמיביליזציהוצביעה של נוגדניםאנזימיםתאים

מקורות

  1. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  2. Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diversity in thymic epithelial cells. Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).
  3. Hozumi, K., et al. Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development. J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).
  4. Koch, U., et al. Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment. J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).
  5. Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).
  6. Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t. Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).
  7. Gommeaux, J., et al. Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes. Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).
  8. Viret, C., et al. Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire. J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).
  9. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  10. Mathis, D., Benoist, C. Aire. Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).
  11. Takaba, H., et al. Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
  12. Takaba, H., Takayanagi, H. The mechanisms of T cell selection in the thymus. Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).
  13. Lammers, S., et al. Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development. Front Immunol. 14, 1277365(2024).
  14. Ushio, A., et al. Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance. Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).
  15. Kozai, M., et al. Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells. J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).
  16. Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells. J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).
  17. Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse. J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).
  18. Hirakawa, M., et al. Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse. Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).
  19. Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration. Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).
  20. Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).
  21. Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).
  22. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  23. Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).
  24. Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen. Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).
  25. Farr, A. G., Anderson, S. K. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells. J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).
  26. Wells, K. L., et al. Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells. eLife. 9, e60188(2020).
  27. Hubert, F. X., et al. A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery. J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).
  28. Nishikawa, Y., et al. Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program. J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).
  29. Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches. Blood. 109 (3), 954-960 (2007).
  30. Cosway, E. J., et al. Redefining thymus medulla specialization for central tolerance. J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).
  31. Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro. Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).
  32. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  33. Ohigashi, I., et al. Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium. eLife. 12, RP92552(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Cortical TECsMedullary TECsBeta5tCCL21
הכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח ציטומטרי זרימה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.