מאמר שיטה

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66954

⸱

31 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

תקציר

אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בגוף, כולל צמיחת הגידול או מחלת עיניים ניאו-וסקולרית. הבנה מפורטת של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים ומודלי סינון אמינים חיוניים למיקוד יעיל של מחלות ולפיתוח אפשרויות טיפוליות חדשות. מספר בדיקות במבחנה פותחו כדי למדל אנגיוגנזה, תוך ניצול ההזדמנויות שסביבה מבוקרת מספקת כדי להבהיר מניעים אנגיוגניים ברמה המולקולרית ולסנן מטרות טיפוליות.

מחקר זה מציג תהליכי עבודה לחקר אנגיוגנזה במבחנה באמצעות תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). אנו מפרטים בדיקת נדידת פצעי שריטה באמצעות מערכת הדמיה של תאים חיים המודדת נדידת תאי אנדותל בסביבה דו-ממדית ובדיקת הנבטת ספרואיד המעריכה הנבטת תאי אנדותל בסביבה תלת-ממדית המסופקת על ידי מטריצת קולגן. בנוסף, אנו מתווים אסטרטגיות להכנת דגימות כדי לאפשר ניתוחים מולקולריים נוספים כגון תעתוק, במיוחד בסביבה התלת-ממדית, כולל מיצוי RNA וכן אימונוציטוכימיה. בסך הכל, מסגרת זו מציעה למדענים ערכת כלים אמינה ורב-תכליתית כדי להמשיך את החקירות המדעיות שלהם בבדיקות אנגיוגנזה חוץ גופית .

מבוא

אנגיוגנזה, המתייחסת להיווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים1, היא תהליך מכריע במהלך התפתחות פיזיולוגית ומצבים פתולוגיים. זה הכרחי למתן אנרגיה לרקמות פעילות מטבולית מאוד כגון הרשתית2 או מערכת העצבים המרכזית המתפתחת3 ובמהלך הריפוי של רקמה פגומה4. אנגיוגנזה חריגה, לעומת זאת, היא הבסיס למחלות רבות. גידולים מוצקים, כגון סרטן המעי הגס או סרטן ריאות תאים שאינם קטנים, להקל על הצמיחה שלהם ואת אספקת האנרגיה הדרושה על ידי קידום אנגיוגנזה5. מלבד סרטן, מחלות ניאו-וסקולריות של העין כמו רטינופתיה סוכרתית או ניוון מקולרי הקשור לגיל, המייצגות גורמים מובילים לעיוורון בעולם המפותח, נובעות מצמיחת כלי דם חריגה 6,7. הבנה מפורטת של המנגנון הבסיסי היא חיונית כדי להבין כיצד ניתן לשפר אנגיוגנזה פיזיולוגית, למשל, בריפוי פצעים תוך שליטה טובה יותר במצבים פתולוגיים כגון מחלות עיניים vasoproliferative.

ברמה התאית, תאי אנדותל וסקולריים מופעלים על ידי מולקולות איתות שונות באנגיוגנזה, מה שגורם להתרבות תאים ונדידתם8. התאים מתארגנים לאחר מכן בהיררכיה, כאשר תאי קצה שאינם מתרבים יוצרים פילופודיה בקצה המוביל של ענף כלי הדם המתפתח8. לצידם, תאי גבעול המתרבים במהירות נגררים אחר תאי הקצה, ותורמים להיווצרות הכלי המגיח. לאחר מכן, סוגי תאים אחרים, כגון פריציטים או תאי שריר חלק, מגויסים כדי לייצב עוד יותר את ענף9 המתהווה.

כדי לחקור תהליכים מולקולריים ברמת תאי האנדותל של כלי הדם, פותחו פרוטוקולים רבים במבחנה ונסקרו לאחרונה10. בדיקות אלה מתחלקות בדרך כלל לשתי קטגוריות: גישות דו-ממדיות פשטניות יותר אך ניתנות להרחבה ופרוטוקולים תלת-ממדיים מורכבים יותר. בפרויקט שנערך לאחרונה, ערכנו ניתוח השוואתי מקיף בין בדיקת נדידת פצעי שריטה דו-ממדית לבין בדיקת הנבטת ספרואיד תלת-ממדית11 כדי להעריך את מידת ההבדלים ביניהם ואת יכולתם למדל היבטים שונים של אנגיוגנזה12.

בעוד ששניהם מציעים את היתרונות של היותם אמינים וקלים ליישום, ברמה המולקולרית, בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית הייתה חיובית בטיפול בהיבטים מרכזיים של אנגיוגנזה בהשוואה לנתונים in vivo, כגון מתגים מטבוליים או אינטראקציות בין מטריצת תאים. מכיוון שמבחני אנגיוגנזה חוץ גופית משמשים להערכת הפוטנציאל האנגיומודולטורי של מסלולי איתות13 ולסינון סוכנים טיפוליים, יכולת העברה של תוצאות במבחנה להגדרות in vivo היא חיונית. יתר על כן, ההזדמנות לניתוחים מבוססי אומיקס על רמות הרנ"א והחלבון לאפיין את השינויים המולקולריים בתגובה לאפנון ממוקד של תהליכים אנגיוגניים בתנאים מבוקרים נותרה יתרון חשוב בהשוואה להגדרות in vivo 14,15.

בפרסום זה, אנו מציגים מבחני מפתח לחקר שאלות הקשורות לאנגיוגנזה באמצעות שימוש בבדיקת נדידת הדמיה של תאים חיים ובדיקת הנבטת ספרואידים, כולל ניתוחים מולקולריים עוקבים כמו ריצוף RNA לניתוח שעתוק ואימונוהיסטוכימיה ברמת החלבון.

פרוטוקול

1. תרבית תאי HUVEC

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

  1. הרחבת HUVECs
    1. עבור שתי בדיקות אנגיוגנזה, השתמש בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) או בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים (HMVECs).
    2. טפחו את התאים עד שהם מגיעים למפגש של 90% בבקבוק T75 לא מצופה עם מדיום גידול תאי אנדותל (EGM) לפני ביצוע פיצול. בצע שינוי בינוני 3 פעמים בשבוע.
      הערה: כדי לזרז את הצמיחה, ניתן לשנות את המדיום מדי יום. אין להשתמש ב-HUVECs מעבר למעבר למעבר השישי. המחקר קיבל את התוצאות העקביות ביותר כאשר הריץ את כל הניסויים עם HUVECs של אותו מעבר.
  2. פיצול HUVECs
    1. כאשר HUVECs מגיעים למפגש הרצוי בצלוחית T75, שטפו אותם פעם אחת עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן דגרו את התאים עם 0.5% טריפסין במשך 2 דקות באינקובטור.
      הערה: חשיפה ממושכת לטריפסין עלולה לפגוע בתפקוד HUVEC.
    2. נתק בעדינות את התאים על ידי הקשה על הצלוחית. אשר ניתוק מוצלח תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה.
    3. מוסיפים 8 מ"ל של EGM, מעבירים את התמיסה לצינור, ומטילים את התאים בצנטריפוגה ב 250 x גרם למשך 3 דקות.
    4. אם יש צורך בספירת תאים, השהה מחדש את התאים ב -5 מ"ל של EGM והשתמש בתא נויבאואר. אחרת, הוסיפו 40 מ"ל של EGM והפיצו אותו על 4 צלוחיות תרבית תאי T75 טריות.

2. בדיקת נדידת פצע שריטה

הערה: בדיקת נדידת פצע השריטה דורשת משך זמן של 3 ימים להשלמתה (איור 1). בצע את כל השלבים הבאים בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

  1. ציפוי והרעבת תאים (יום 1)
    1. באמצעות צלחת מיוחדת של 96 בארות להדמיית תאים חיים, זרעו 20,000 HUVECs ב-100 מיקרוליטר של EGM לכל באר. מאפשרים לתאים להסתפק 6 שעות באינקובטור.
      הערה: מומלץ למטב את מספרי התאים בהתחשב במהירות המשתנה של צמיחת תאי אנדותל כלי דם בין ספקים ומעבדות. המטרה היא להשיג מונושכבה מושלמת למחרת לפני תחילת השריטה. בארות מאוכלסות יתר על המידה יכולות לשנות את התנהגות תאי האנדותל, למשל, על ידי עיכוב מגע16, בעוד מונושכבה לא שלמה מעכבת את הניתוח באופן דרסטי.
    2. הרעיבו את כל הבארות למשך הלילה עם 100 μL של EBM לכל באר בתוספת 2% FBS.
      הערה: היזהר שלא לפגוע בחד-שכבה של התא, במיוחד בעת שימוש בפיפט רב-ערוצי.
  2. הכנת פתרונות גירוי (יום 2)
    1. לדלל את החומרים הרצויים ולבקרות במדיום הבסיסי של צמיחת תאי אנדותל (EBM) בתוספת FBS של 2%. עבור כל באר, להשתמש 100 μL של פתרון.
      הערה: EBM בתוספת FBS של 2% משמש כבקרה שלילית, בעוד שגורם גדילה רקומביננטי של אנדותל כלי הדם האנושי (VEGF) ב -25 ננוגרם/מ"ל יכול לשמש כבקרה חיובית. באמצעות לוחות 96 בארות, מומלץ לתכנן את הניסויים עם מינימום של העתקים טכניים (4 בארות עם תנאים זהים), אם כי מוצע כי 8 ישמשו לתוצאות אופטימליות. שאפו למזער אפקטים פוטנציאליים של קצה או פינה בעת תכנון הפריסה.
  3. יצירת השריטה (יום 2)
    1. בדוק תאים תחת מיקרוסקופ כדי לאמת חד-שכבה של תאים ויכולת קיום של תאים. מקם את צלחת 96 הבארות בכלי לייצור פצעים 96 בארות וצור את השריטה על ידי לחיצה על הידית של המכשיר. יש להסיר בזהירות את מכסה הכלי ליצירת פצעים לפני שחרור הידית למניעת שריטות כפולות.
    2. לשטוף את כל הבארות פעמיים באמצעות 200 μL של EBM לכל באר בתוספת 2% FBS. אשרו תחת מיקרוסקופ שהפסולת הוסרה בהצלחה.
  4. גירוי תאים (יום 2)
    1. הוסף 100 μL של פתרונות גירוי או בקרה מוכנים לכל באר.
  5. הדמיה (ימים 2-3)
    1. קבל תמונות פעם בשעה לתקופה של עד 24 שעות באמצעות לוח זמנים אוטומטי המסופק על ידי מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים.
      הערה: כדי להבטיח איכות תמונה טובה, סרוק כל באר מיד לאחר העברתה לאינקובטור המאכלס את מערכת ההדמיה של תאים חיים. זמן התאקלמות של 30 דקות באינקובטור עוזר לקבל איכות תמונה טובה יותר. תוכנת המיקרוסקופ מתוכנתת לקבל תמונה אחת בשעה לכל באר בקו האמצע של השריטה המוגדרת.
  6. בהיעדר כלי ליצירת פצעים ומכשיר לצילום תאים חיים, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. השתמשו בקצה פיפטה בצלחת של 24 בארות כדי לגרום לשריטה. צלם תמונות עם מיקרוסקופ תרבית תאים קלאסי במרווחי זמן ספציפיים. לשם כך יש להשתמש במיקרוסקופ ממונע המצויד ביכולות מעקב מדויקות של x ו-y. הדבר מאפשר מיקום אוטומטי, ומבטיח לכידת תמונה עקבית במיקומים מוגדרים מראש.
      הערה: כאשר יש צורך בהדמיה ידנית, זוהי אפשרות מעשית לצלם רק T0 וכן נקודת זמן אחת 'x' שעות לאחר הטיפול. בפרוטוקול המתואר באמצעות HUVECs, נקודת הזמן T12 (12 שעות לאחר הגירוי) הייתה נקודת זמן אטרקטיבית עם הפרדה ברורה בין שליטה חיובית שלילית לבין שליטה חיובית מגורה VEGF. עם זאת, מומלץ לבצע ניסויי קורס זמן ראשוניים עם הדמיה כל שעתיים או שעה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית עבור הגדרות הניסוי הספציפיות בכל מעבדה.
  7. ניתוח (יום 3)
    1. תוכנת מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים עשויה לאפשר ניתוח ישיר של התמונות שנרכשו. הגדירו מסכות התוחמות את מדשאות התא, השריטה הראשונית ואזורי צפיפות הפצע היחסית. קבע גבולות תא בהתבסס על הבדלי ניגודיות.
      הערה: התאמת סגמנטציה של 1.6, קובץ חור של 500 מיקרומטר2, גודל מותאם של 1 פיקסל, שטח >500 מיקרומטר ואקסצנטריות >0.6 שימשו לניסויים שנערכו עם HUVECs. בדיקה חזותית יסודית של פרמטרי זיהוי התא ביחס לתמונות בפועל היא חיונית. עם תצורות ממוטבות, התוכנה מחשבת צפיפות פצע יחסית (RWD) לאורך זמן באופן אוטומטי ומייצרת גרפים זמניים תואמים עם סטיית התקן (SD) של העותקים הטכניים. לאחר מכן ניתן להשתמש בנתונים אלה לניתוח סטטיסטי.

3. מיצוי RNA עם תאים מתורבתים דו-ממדיים

הערה: בצע את כל השלבים הבאים עד לשלב 3.3 בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

  1. ציפוי תאים (יום 1)
    1. נתק HUVECs לפי שלב 1.2 של פרוטוקול תרבית התאים HUVEC.
    2. זרעו 50,000 תאים לבאר בצלחת של 12 בארות עם 2 מ"ל של EGM לכל באר.
    3. שנה את התווך לאחר 6 שעות ל- EBM המכיל 2% FBS (מדיה מורעבת) לרעב בן לילה.
  2. טיפול בתאים (יום 2)
    1. סוכני עניין מדוללים ב- EBM בתוספת FBS של 2%. מחליפים את המדיה הרעבה בדילול המוכן ודוגרים על תאים לזמן הרצוי באינקובטור.
  3. מיצוי RNA (יום 2-3)
    1. לפרוס את התאים עם 750 μL של Trizol לכל באר לדגור במשך 10 דקות על שייקר מסלולי.
    2. להשעות את הדגימות עם פיפטה 1000 μL כמה פעמים ולאחר מכן לאחסן אותם צינורות RNA ספציפיים קישור נמוך (נפח 1.5 מ"ל). יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.

4. אימונוציטוכימיה עם תאים מתורבתים דו-ממדיים

הערה: בצע את כל השלבים הבאים עד לשלב 4.4 בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

  1. הכנת כיסויים
    1. יש לדגור על 100 כיסויים בקוטר של 12 מ"מ ב-5% אשלגן הידרוקסיד במתנול בצינור של 50 מ"ל למשך 30 דקות תוך כדי ניעור התמיסה המרוחנת.
      הערה: זהו צעד חשוב מאוד בפירוק פני השטח של החלקות הכיסוי ושיפור תנאי הציפוי והתרבות. בשלב זה, מומלץ מאוד לוודא שהכיסויים מפוזרים היטב בתוך המדיום ולא מתייבשים ומודבקים זה לזה.
    2. שטפו את הכיסויים במשך 30 דקות 4 פעמים במים נטולי מינרלים.
    3. לאחר הכביסה, להעביר אותם לתוך פתרון איזופרופיל 70% לאחסון.
  2. ציפוי של כיסויים
    1. השענו את הכיסויים בנפרד על דופן צלחת פטרי מרובעת כדי לאפשר אידוי של איזופרופיל אלכוהול.
    2. לאחר 5 דקות מעבירים את הכיסויים לצלחת של 24 בארות (מכסה אחד לכל באר). יש למרוח 1 מ"ל של תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל קולגן I ב-PBS על כל באר ולדגור במשך 60 דקות ב-37°C.
    3. לאחר מכן, שטפו את הכיסויים 4-5 פעמים במשך 5 דקות עם PBS.
  3. טיפוח תאים
    1. נתק HUVECs בהתאם לנהלים המתוארים בשלב 1.2 של פרוטוקול תרבית התאים HUVEC.
    2. זרעו 50,000 תאים לבאר בצלחת של 24 בארות עם 2 מ"ל של EGM לכל באר.
    3. לאחר 6 שעות, שנו את המדיום ל-EBM המכיל 2% FBS כדי לאפשר לתאים להיצמד לבאר ולהרעיב את התאים למשך הלילה.
    4. למחרת, סוכני עניין מדוללים ב- EBM השלימו 2% FBS. להחליף את תמיסת הרעב בבארות בדילול המוכן ולדגור על תאים לזמן הרצוי באינקובטור.
  4. קיבוע וחסימה
    1. לטפח את התאים במשך הזמן הרצוי, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות.
    2. תקן את התאים עם 2% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. יש לשטוף עם PBS 3-4 פעמים במשך 5 דקות.
    4. דגימות דגירה עם חיץ חוסם המכיל 5% סרום עיזים רגיל (NGS), 0.1% Triton-X-100 ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT.
      הערה: בשלב זה, חשוב לשטוף את הדגימות כדי להבטיח ש- PFA יוסר לחלוטין. בחר את המינים של הסרום מבוסס על מקור הנוגדן המשני.
  5. צביעה
    1. יש לדגור על הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במאגר החוסם עם הנוגדן הראשוני.
    2. למחרת, כדי להסיר כל נוגדן ראשוני לא קשור, לשטוף את הדגימות 3-4 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    3. לאחר מכן, לדגור על הדגימות במשך שעה אחת ב- RT עם הנוגדן המשני המתאים ו- Phalloidin-FITC, מדוללים יחד במאגר החסימה.
    4. יש לשטוף 3-4 פעמים נוספות.
    5. הפכו את הכיסויים על מגלשות בעזרת טיפה קטנה של אמצעי הרכבה המכילים DAPI, הניחו לייבוש בחושך ואטמו עם לק. יש לאחסן דגימות בחושך בטמפרטורה של 4°C.

5. בדיקת הנבטה ספרואידית

הערה: בדיקת הנבטת הספרואיד דורשת 3 ימים להשלמתה (איור 2). בצע את כל השלבים הבאים עד לשלב 5.7 בתנאי עבודה סטריליים (ספסל עבודה סטרילי).

  1. יצירת ספרואידים בטיפות תלויות (יום 1)
    1. נתק HUVECs בהתאם לנהלים המתוארים בשלב 1.2 של פרוטוקול תרבית התאים HUVEC.
    2. שלבו 200,000 תאים עם 8 מ"ל EGM ו-2 מ"ל של תמיסת מלאי מתוקל, מה שמבטיח ערבוב יסודי. יש לעיין בקובץ משלים 1 לקבלת הוראות להכנת תמיסת מלאי המתוקל.
    3. יש לפזר 25 μL טיפות של התמיסה על פני השטח הפנימיים ההפוכים של צלחת פטרי גדולה בריבוע. סובבו בעדינות את המכסה ב-180° ומקמו אותו בתחתית כלי תרבית התא כך שהטיפות תלויות. הניחו את הכלי באינקובטור תרבית תאים למשך הלילה.
  2. הכינו את ג'ל הקולגן (יום 2)
    1. יש לערבב היטב 2.3 מ"ל של קולגן זנב חולדה מסוג I עם 0.280 מ"ל של 10x Medium 199 עד לקבלת גוון צהוב אחיד באופן עקבי. שמרו את התערובת על קרח לאורך כל התהליך.
  3. טיטרט את ג'ל הקולגן (יום 2)
    1. טיטרט את התערובת כדי להשיג pH פיזיולוגי, מסומן על ידי צבע כתום, באמצעות NaOH (2 N).
    2. הוסף 50 μL של חיץ HEPES למוצר הסופי.
      הערה: כדי להבטיח טווח דינמי אופטימלי לבדיקה, חובה להתקרב ככל האפשר ל- pH פיזיולוגי. אצוות שונות של קולגן עשויות לדרוש כמויות שונות של NaOH. שמרו את התערובת אך ורק על קרח לאורך כל התהליך וערבבו אותה בצורה הומוגנית כל הזמן.
  4. קצירת ספרואידים (יום 2)
    1. יש לשטוף טיפות תלויות ממכסי תרביות תאים עם 20 מ"ל PBS.
    2. צנטריפוגה את הפתרון במשך 7 דקות ב 250 x גרם. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הספרואידים ב-0.1 מ"ל של FBS ו-0.4 מ"ל של EGM על ידי הקשה עדינה על הצינור.
    3. מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת ציר מתוקל ומערבבים היטב. השתמש פיפטה עם קיבולת מינימלית של 5 מ"ל כדי למנוע נזק spheroids.
  5. הוספת ספרואידים למטריצת הקולגן התלת-ממדית (יום 2)
    1. הוסיפו 2 מ"ל מתערובת הקולגן המוכנה לכדורים המרחפים וערבבו היטב.
    2. מוציאים 0.5 מ"ל מהתערובת המתקבלת לבארות של צלחת 24 בארות ודגרים באינקובטור תאים למשך 30 דקות.
  6. גירוי ספרואידים במטריצת קולגן תלת-ממדית (יום 2)
    1. הכינו דילול של החומרים הרצויים ב-EBM. עבור כל באר, להשתמש 100 μL של פתרון.
      הערה: EBM משמש כבקרה שלילית, בעוד גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) ב 25 ng/mL (ריכוז סופי ב 500 μL של מטריצת קולגן ו 100 μL EBM שכבה) יכול לשמש כבקרה חיובית.
    2. לדגור על הזמן הרצוי.
      הערה: בבדיקה סטנדרטית, מומלץ 18-24 שעות, אך יש למטב את התזמון בזהירות בכל מעבדה.
  7. הדמיה ספרואידים (יום 3)
    1. השתמש במיקרוסקופ הפוך ובפלטפורמת הדמיה כדי לצלם תמונות של כל הספרואידים שאינם באים במגע עם שפת הבאר, זה עם זה, או מראים סימני נזק. שמור על הגדרות עקביות ורמות זום בכל התנאים.
  8. ניתוח (יום 3)
    1. השתמש בכלי המדידה ב- ImageJ Fiji כדי לוודא את אורך כל הנבטים מכל ספרואיד בכל תמונה.
      הערה: השתמש בתוסף המסופק בקובץ משלים 2, שהופך את הניתוח ליעיל יותר ומייצר קובץ .txt פלט.
    2. יבא את הנתונים לגיליון אלקטרוני, R או כל תוכנה מועדפת אחרת, והשתמש באורך המצטבר הממוצע של כל הנבטים לכל ספרואיד כקריאה עבור כל תנאי.
      הערה: לא ניתן לשלב תוצאות מג'לים שונים בצורה של אורכי הנבטה מוחלטים. יש לנרמל נתונים מכל קבוצת טיפול לקבוצת הבקרה EBM או VEGF (אורך הנבטה יחסי) לפני שניתן יהיה למזג נתונים.

6. מיצוי RNA עם תאים מתורבתים 3D

  1. בדיקת הנבטה ספרואידית
    1. בצע את בדיקת הנבטת הספרואיד כמתואר בסעיף 5.
  2. ליזה של ג'ל קולגן
    1. לשטוף ג'ל spheroid עם PBS חם במשך 5 דקות.
    2. חותכים את ג'ל הספרואיד לרבעים ומעבירים את כל 4 הרבעים לתוך צינור 50 מ"ל. השתמש אזמל עבור דיסקציה מכנית של הג'לים.
    3. יש לטפל בדגימות ג'ל בתמיסת ליזה (המכילה 2 מ"ג/מ"ל Collagenase D ב-PBS) ולדגור במשך 45 דקות ב-37°C על שייקר.
    4. יש לשטוף ג'לים בעדינות עם PBS בתוספת 2 mM EDTA כדי לעצור את התגובה של מאגר הליזיס.
  3. מיצוי RNA
    1. יש להשהות מחדש את הג'לים הליזים ב-750 מיקרוליטר של טריזול ולדגור למשך 10 דקות כדי להבטיח מיצוי RNA מספק כמתואר בשלב 3.3.
    2. השהה מחדש את הדגימות עם פיפטה של 1000 μL מספר פעמים והעבר דגימות לצינורות RNA ספציפיים בעלי קישור נמוך (נפח 1.5 מ"ל). יש לאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80°C.

7. אימונוציטוכימיה של ספרואידים במטריצת קולגן תלת ממדית

  1. בדיקת הנבטה ספרואידית
    1. בצע את בדיקת הנבטת הספרואיד כמתואר בסעיף 5.
  2. קיבוע וחסימה
    1. תקן את הג'לים עם 4% PFA ב- PBS למשך שעה אחת.
      הערה: כדי להבטיח קיבוע טוב של התאים בג'ל, יש לנתק בזהירות את הג'לים בצידי הבארות בעזרת אזמל ופינצטה לאחר שטיפה עם PBS.
    2. לשטוף ג'לים בעדינות 3-4 פעמים עם PBS ולאחר מכן לנתק אותם לחלוטין מפני השטח של הבארות ולהעביר אותם לתוך צלחות חדשות 24 בארות.
    3. דגרו ג'לים במשך שעה אחת ב-RT עם תמיסת החסימה (המכילה 5% NGS ו-0.1% Triton-X-100 ב-PBS) על שייקר מסלולי.
  3. צביעה
    1. יש לדגור על הדגימות במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי כאשר הנוגדן הראשוני מדולל בחיץ חוסם.
      הערה: סיבוב הג'לים במהלך דגירה זו לא שיפר את איכות הצביעה.
    2. למחרת, שטפו את הג'לים בעדינות 4-5 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    3. לדגור על הנוגדן המשני המתאים, מדולל עם Phalloidin-FITC בחסימת חיץ לילה ב 4 ° C על שייקר מסלולי.
    4. בצעו 4-5 שלבי כביסה נוספים עם PBS.
    5. העבירו את הג'לים לשקופיות מיקרוסקופ והרכיבו אותם בשתי טיפות של אמצעי הרכבה המכיל DAPI על גבי כיסוי המונח על כל ג'ל. הניחו לדגימות להתייבש לפני האיטום בלק ואחסנו אותן בחושך בטמפרטורה של 4°C.
  4. מיקרוסקופ
    1. דמיינו את כל הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש במטרה של פי 20 והתמקד באזור העניין. קבל תמונות כערימות Z, כמו גם תמונות בודדות של מישור מוקד.
      הערה: השגת תמונות מחסנית Z ומישור מוקד במקטעים מרובים לאורך הדגימה התלת-ממדית חיונית ללכידת הייצוג המלא, במיוחד עבור דגימות תלת-ממד עבות.

8. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית (HRMVECs)

הערה: כל השלבים המתוארים יכולים להתבצע גם עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, למשל, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית (HRMVECs). במקרה כזה, יש להחליף את המדיום למדיום ספציפי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) לגידול, כמו גם שלבים ספציפיים בכל בדיקה. הבדלים ספציפיים ל- HRMVEC לפרוטוקולי הבדיקה מתוארים להלן:

  1. בדיקת פצע שריטה
    1. לטפח תאים בתווך אנדותל מיקרו-וסקולרי 10% FBS במקום EGM.
    2. זרעו 20,000 תאים / באר.
    3. אין להרעיב את התאים בן לילה.
    4. לאחר ביצוע השריטה, שנה את המדיום למדיום תאי אנדותל בסיסיים המכיל 5% FBS במקום EBM עם 2% FBS.
  2. אימונוציטוכימיה של HRMVECs מתורבתים דו-ממדיים
    1. טפחו את התאים בתווך של 10% תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במקום ב-EGM.
    2. אין להרעיב את התאים בן לילה.
    3. שנה את המדיום ממש לפני הטיפול ל- EBM + 5% FBS במקום EBM + 2% FBS.
  3. בדיקת הנבטה ספרואידית
    1. זרעו את התאים כטיפות תלויות עם תווך תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המכילים 10% FBS במקום EGM.
  4. אימונוציטוכימיה של ספרואידים במטריצת קולגן תלת ממדית
    1. זרעו את התאים כטיפות תלויות עם תווך תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים המכילים 10% FBS במקום EGM.

תוצאות

עבור בדיקת הנדידה, חיוני לבחון ביסודיות את התמונות שצולמו בנקודת הזמן t = 0 h כדי להבטיח שהמערכת תזהה במדויק את נוכחותה של שכבה מונו-שכבתית של תאים במבנה מלא (איור 1B). נוסף על כך, יש לאשר את הבהירות והישירות של גבול הגירוד (איור 1B). האזור נטול התאים צריך להיות ברובו נקי מפסולת. בסוף הבדיקה, קבוצה שגורה עם, למשל, 25 ננוגרם/מ"ל VEGF כביקורת חיובית אמורה להראות נדידה מוצלחת באזור השרוט המקורי (איור 1B). מופע של בעיות טכניות עשוי להתבטא כצמיחת תאים מטושטשת, גירוד כפול או כובד בגבולות השריטה (איור 1C). יתר על כן, חשוב לקבוע טווח דינמי משמעותי בין הבקרה השלילית (דגימות המעוררות EBM) לבין הבקרה החיובית (דגימות VEGF) (איור 1D). במערך הניסוי שלנו, אנו מחשיבים עלייה של 25% ב-RWD לאחר 12 שעות כטווח אופטימלי (איור 1D). בבדיקה טכנית בעייתית, בקרות חיוביות ושליליות אינן נפרדות כראוי, מה שמצביע על טווח דינמי נמוך (איור 1E).

צביעה אימונוציטוכימית של HUVECs על גבי כיסויים, מומחשת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת צביעה מוצלחת (איור 1F). חשוב לסקור את רוב התאים ולזהות אזור אופייני בשקופית. ספציפיות הצביעה מוערכת באמצעות שקופית בקרה שטופלה רק בנוגדן משני כדי לא לכלול קשירה לא ספציפית (איור 1F). אותות צביעה ספציפיים צריכים להיבדק באופן ביקורתי על פי הלוקליזציה התת-תאית הידועה של חלבון המטרה. אנו משתמשים בדפוסי לוקליזציה תת-תאיים יחד עם היעדר אות במדגם הבקרה כמדדים לפרוטוקול מוצלח של אימונוסטיישן.

באופן דומה, היבטים מסוימים חייבים להילקח בחשבון עבור בדיקות הנבטה ספרואידים באיכות גבוהה. האיכות צריכה, במקרה זה, להיות מוערכת בסוף הבדיקה ב, למשל, t = 24 שעות. מטריצת הקולגן שנצפתה במיקרוסקופ צריכה להפגין הומוגניות ולא צריכה להיראות פריכה או מחוספסת (איור 2B). ספרואידים שעוררו רק בתווך הבסיסי כבקרה שלילית וב-25 ננוגרם/מ"ל VEGF כבקרה חיובית צריכים להיות מובחנים בבירור (איור 2B). יתר על כן, ספרואידים צריכים לצוף בג'ל ולא ליפול לקרקע, שם הם מתפזרים, מה שמצביע על איכות נמוכה (איור 2C). הבעיה הזו נובעת לעתים קרובות מקירור לקוי של הקולגן במהלך טיטרציה של התערובת, או מטיטרציה מוגזמת או תת-טיטרציה של ה-pH (איור 2C). מינימום של 10 ספרואידים לכל באר צריך להיות ניתן להדמיה עבור כל באר. הבקרה השלילית (דגימות המעוררות EBM) אמורה להדגים קצב הנבטה בסיסי מתון, בעוד ש-VEGF, המשמש כבקרה החיובית, מכפיל באופן אידיאלי או רצוי משלש את ה-RSL בהשוואה לבקרות (איור 2D, גרף שמאלי). גם מספר הנבטים צריך להראות טווח דינמי דומה (איור 2D, גרף ימני). בדיקה טכנית תת-אופטימלית לא תציג את הטווח הדינמי הזה בין פקדים, ולכן עלולה להוביל לפרשנות שגויה של נתונים (איור 2E).

אנלוגי לכתמים דו-ממדיים, בחינת השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי והערכה ביקורתית של המבנים המוכתמים הם בעלי חשיבות רבה לצביעה מוצלחת (איור 2F). אם הלוקליזציה התאית של המבנים ועוצמת האות בהשוואה לבקרה מובנת, ניתן להניח כי הצביעה הצליחה.

figure-results-1
איור 1: בדיקת נדידת פצעי שריטה של הדמיה של תאים חיים. (A) סכימה של בדיקת נדידת פצע השריטה. (B) תמונות המציגות העתק טכני באיכות גבוהה ב- t = 0 שעות ו- t = 12 שעות. התאים עוררו עם 25 ננוגרם/מ"ל VEGF כדי לשמש כבקרה חיובית. (C) דוגמאות לשני שכפולים טכניים באיכות נמוכה ב- t = 0 שעות עקב גירוד לא תקין או גירוד כפול. (D) תוצאות של בדיקת נדידת פצע שריטה מוצלחת. ההפרדה הנכונה של שליטה חיובית עם 25 ng/mL VEGF ושליטה שלילית שטופלה רק עם מדיום בסיסי הודגמה עוד יותר על ידי עלילת כינור ב t = 12 שעות. הנתונים כוללים 7-8 עותקים טכניים משוכפלים לכל קבוצה. (E) תוצאות מופתיות המדגישות בדיקת נדידת פצע שריטה כושלת. הפרדה תת-אופטימלית של בקרה חיובית עם 25 ng/mL VEGF ובקרה שלילית שטופלה רק עם מדיום בסיסי הודגמה על ידי תרשים כינור ב t = 12 שעות. הנתונים כוללים 7-8 עותקים טכניים משוכפלים לכל קבוצה. (F) תמונות מופתיות של HUVECs שנזרעו על פתקי כיסוי ומוכתמים עבור DAPI, phalloidin ו-VEGF-R2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקת הנבטת הספרואידים. (A) תכנית בדיקת הנבטת הספרואידים. (B) תמונות המציגות את הבקרה השלילית (ספרואידים מעוררים בינוניים בסיסיים) ואת הבקרה החיובית (ספרואידים מעוררים VEGF 25 ng/mL) של בדיקה טכנית אידיאלית בסוף t = 24 שעות. (C) דוגמאות לשני ספרואידים באיכות נמוכה ב- t = 24 שעות. תמונות משמאל מציגות ספרואיד פגום שצנח לתחתית הצלחת, מה שגורם לגוף כדורי משוחרר ולקצב נביטה משופר באופן חריג. התמונה הנכונה ממחישה קולגן עם כתמי צבע בולטים, ויוצרת סביבה הטרוגנית מאוד שפוגעת משמעותית באיכות הבדיקה. (D) ניתוח RSL (גרף שמאלי) ומספר הנבטים (גרף ימני) של בדיקה מוצלחת עם טווח דינמי טוב בין בקרה שלילית לחיובית. הנתונים מוצגים באופן חזותי באמצעות תרשים כינור וכוללים 10-25 ספרואידים לכל קבוצה. (E) ניתוח RSL (גרף שמאלי) ומספר הנבטים (גרף ימני) של בדיקה טכנית בעייתית עם טווח דינמי תת-אופטימלי בין בקרה שלילית לחיובית. הנתונים מוצגים באופן חזותי באמצעות תרשים כינור וכוללים 10-25 ספרואידים לכל קבוצה. (F) תמונות מופתיות של HUVECs מבדיקת הנבטת הספרואיד מוכתמות עבור DAPI, phalloidin ו-VEGF-R2.c

קובץ משלים 1: הוראות להכנת תמיסת מלאי המתוקל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: תוסף SpheroidCount.ijm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

בדו"ח זה, הצגנו ספקטרום של טכניקות עם קריאות פונקציונליות ומולקולריות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

בדיקת ההגירה מייצגת טכניקה מבוססת היטב המשמשת בכל תחומי עבודת המעבדה הרטובה. בחרנו בגישת ההדמיה המסחרית של תאים חיים כדי לנצל את פורמט 96 הבארות המתאים לניסויי סינון ותגובת מינון, את גודל הפצע הסטנדרטי והניתן לשחזור שנוצר על ידי הכלי WoundMaker, את ההזדמנות לצפות בנדידה קינטית באמצעות הדמיה בהילוך מהיר במשך עד 24 שעות, כמו גם את תוכנת כימות התמונה האוטומטית. עם זאת, יש צורך בנוכחות של מערכת דימות תאי חיים המצוידת בתוכנה לניתוח אנגיוגנזה במעבדה או במתקן הליבה. הוקמו מערכי ניסוי חלופיים רבים שאינם מצריכים מיקרוסקופים ספציפיים של הדמיה של תאים חיים או ציוד מיוחד אחר10.

בהתבסס על הניסיון שלנו, חיוני לייעל את הגדרות האנלייזר, מכיוון ש- HUVECs וסוגים אחרים של תאי אנדותל וסקולריים יכולים לספק ניגודיות גרועה, ובכך לעכב את הקריאה האוטומטית על ידי תוכנת המיקרוסקופ. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן להציג שלב צביעה פלואורסצנטי נוסף (למשל, צביעה של תאים חיים). מערכות הדמיה של תאים חיים תומכות בצביעה כזו ואפילו בצביעה מרובת צבעים למעקב אחר חלבון מעניין. מגבלה עיקרית אחת של הבדיקה היא שההבחנה בין נדידת תאים והתפשטות אינה תמיד פשוטה וכי תוצאות הבדיקה מייצגות שילוב של שני התהליכים. פתרון הדמיה של תאים חיים המשמש במחקר זה מנסה להתמודד עם בעיה זו על ידי הצגת צפיפות הפצע היחסית (RWD). בניגוד למפגש המסורתי באזור השרוט, ה-RWD מעריך את המפגש בתוך האזור השרוט ביחס לאזור השרוט החיצוני. נדידה באזור השרוט מעלה את ה-RWD על ידי הגדלת המפגש בתוכו ובמקביל מפחיתה את המפגש מחוץ לאזור השרוט עקב נדידת תאים. לעומת זאת, התפשטות התאים גם מגבירה את המפגש מחוץ לאזור השרוט, ובכך מפחיתה את RWD. חשוב להכיר בכך כגישת ניתוח אסטרטגי רק כדי להפחית את השפעת ההתפשטות על הקריאה הסופית. ייתכן שיהיה צורך במבחני ריבוי משלימים כדי לטפל בבעיה זו. לחלופין, מעכבי מחזור התא כגון מיטומיצין C ניתן להוסיף לבדיקה כדי לחסום התפשטות. יישום פרוטוקולים עם מעכבים אלה צריך להיות מותאם בקפידה בכל מעבדה כדי להשיג את האפקט הרצוי מבלי להקטין את הטווח הדינמי של הבדיקה. יתר על כן, על ידי הגדלת תדירות הסריקה של כל באר, הגדרה זו מציעה הזדמנות קלה ליישום לעקוב במדויק אחר תאים נעים ברמה האישית אם מעקב מפורט כזה מעניין במיוחד.

בעוד שבדיקת נדידת ההדמיה של תאים חיים מדגימה את היתרון של מדרגיות וניתוחים אוטומטיים ובלתי מוטים, המחקר הקודם שלנו הדגיש את יכולתו של ניסוי הנבטת הספרואיד ללכוד פרטים מורכבים יותר של אנגיוגנזה. זה כולל היבטים בסיסיים כמו היווצרות תאי קצה וגבעול, אינטראקציה בין תא למטריצה ומתג גליקוליטי12. כדי להבטיח את יכולת השחזור של הבדיקה, חוקר חייב להיות מנוסה בהכנת מטריצת הקולגן, שכן שינויים ב- pH ובטמפרטורה במהלך תהליך זה יכולים להשפיע על התוצאות. יתר על כן, הניתוח מתבצע באופן ידני. ניתוח תמונה גוזל זמן ומכיל את הסיכון להטייה. מיסוך נכון של תנאים במהלך הניתוח הוא חיוני כדי למנוע את כניסתה של הטיה. כדי להתמודד עם חשש זה, הצענו לאחרונה גישה מבוססת רשת עצבית לזיהוי והפחתת הטיה פוטנציאלית בניתוח מבחני הנבטה, שניתן ליישם בקלות17. לסיכום, הגישה הטובה ביותר לאמת תוצאות היא לשלב את שני המבחנים. עם זאת, חשוב להכיר בכך שהבדלים עשויים להתעורר בשל האופי הייחודי של הגדרות דו-ממדיות ותלת-ממדיות12.

מכיוון שיש מבחר רחב של בדיקות אנגיוגנזה דו-ממדית ותלת-ממדית במבחנה , חשוב לשקול את היתרונות והחסרונות של הבדיקות המוצגות בהשוואה לשיטות אחרות. בדיקת פצע השריטה, למשל, מתמקדת בנדידה אופקית דו-ממדית על צלחת פלסטיק, ואילו בדיקת תא בוידן מאפיינת נדידה אנכית דרך רשת עם כימואטרקטנט ב"תא החיצוני". בהתבסס על ההגדרה והקריאה הפשוטות שלו, בדיקת פצע השריטה מאפשרת ניסויים בתפוקה גבוהה, במיוחד בפורמט 96 בארות שלה, ומספקת יכולת שחזור גבוהה, כמו גם את האפשרות לדמיין את הניסוי ולבצע קיטוע זמן. למרבה הצער, החסרונות של בדיקת פצע השריטה הם הקושי להבדיל בין התרבות לנדידה, הצורך בתאים דבקים, ובהיעדר כלי ליצירת פצעים, שונות גבוהה יותר עקב שריטות לא שוויוניות. לקריאה של Boyden Chamber Assay יש יתרון במדידת ההשפעה הכימוטקטית של חומרים מסיסים על תאים תנועתיים18 והיא מדגישה הן פלישה והן הגירה. למרבה הצער, החסרונות הם יכולת השחזור הירודה והשונות הגבוהה של הבדיקה, חוסר היכולת לדמיין את תנועת התאים, המספר הגבוה של תאים נודדים הדרושים לקבלת אות, ההתקנה והקריאה הארוכות והמורכבות למדי, כמו גם היעדר ההזדמנות להגדרת קיטועי זמן19.

בדיקת הנבטת הספרואיד מכמתת את הנבטת תאי האנדותל למטריצת ג'ל תלת ממדית, ואילו בדיקת היווצרות הצינור מאפיינת היווצרות צינורות תאיים על פני השטח של מטריצת ג'ל20. לבדיקת הנבטה יש יתרון באפיון פלישת תאים למטריצה וכן התפשטות ונדידה. החסרונות הם השונות הגבוהה יותר של ג'ל הקולגן הטיטרטי, ועל בסיס זה, איכות הספרואידים. היתרון של בדיקת היווצרות הצינור הוא היווצרות צינורות כלי הדם לאחר פרק זמן ברור (תלוי בציטוקין) וגישה קלה. החסרונות הם חוסר פלישה של תאים ואת ההשפעה של Matrigel עצמו על היווצרות צינור21.

כל הניסויים שהוצגו בוצעו עם HUVECs. ידוע כי קיימים הבדלים משמעותיים בהתנהגות של תאי אנדותל וסקולריים ממקורות שונים (למשל, מאקרו-וסקולריים לעומת מיקרו-וסקולריים)22,23. לכן ייתכן שיהיה צורך לאמת את תוצאות הניסוי עם קווי תאי אנדותל וסקולריים אחרים. הגדרות הניסוי היו ניתנות להעברה עבור אנדותל מיקרו-כלי דם ברשתית אנושית (HRMVECS), למעט העובדה ש- HRMVECs דורשים ריכוזי FBS גבוהים יותר. מצד שני, לא ניתן היה להשתמש בקו תאי האנדותל של אבי העורקים הבקר (BAECs) הנפוץ בבדיקת הנבטת הספרואיד עקב קצב הנבטה בסיסי מוגזם.

שתי הבדיקות המוצגות חולקות את המגבלה שהן מוגבלות לסוג תא יחיד. בהתחשב בכך שאנגיוגנזה in vivo היא תהליך רב-תאי מורכב, היבט חיוני זה אינו נלכד במדויק על ידי אף אחד מהמבחנים. פותחו וריאציות של תרבית משותפת עבור שתי הבדיקות, עם דגש מיוחד על בדיקת הנבטת הספרואידים, ולאחרונה דנו10,24. לחלופין, אימות הנתונים ישירות במודלים רלוונטיים של אנגיוגנזה in vivo מייצג אפשרות מעשית. בדיקות מבוססות למטרה זו כוללות את מודל העכבר עבור רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR)25, את הניאו-וסקולריזציה הכורואידית המושרה בלייזר (לייזר-CNV) מודל26, ואת מבחן תקע27.

בסך הכל, הן בדיקת נדידת ההדמיה הדו-ממדית של תאים חיים והן בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית, בשילוב עם כלי הניתוח המולקולרי המוצגים, מציעים פלטפורמה חזקה לחקר אנגיוגנזה ומוכרים באופן נרחב בקהילת האנגיוגנזה. שילוב בדיקות אלה עם ניתוחי in vivo עוקבים כדי לאמת את הממצאים מספק בסיס מוצק לחקירת שאלות ספציפיות הקשורות לאנגיוגנזה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בפרויקט זה.

תודות

המחברים מודים לסופי קרוגר וגבריאלה פרינץ על תמיכתן הטכנית המצוינת. אנו מודים לסבסטיאן מאייר על פיתוח תוסף ImageJ לכימות נבטי ספרואידים ולמתקן Lighthouse Core, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), המחלקה לרפואה I, בית החולים האוניברסיטאי פרייבורג על השימוש במערכת IncuCyte. הגרפיקה נוצרה עם biorender.com. עבודה זו נתמכה על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 to F.B], Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Berta-Ottenstein-Program for Clinician Scientists and Advanced Clinician Scientists to F.B.], Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 to F.B.], הקונסורציום הגרמני לסרטן [מלגת CORTEX למדענים קליניים ל-J.R.] וקרן פולקר הומאן [ל-J.N.+F.B.] ו-"Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg ה.ו." [לפ"ל]

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x בינוני 199סיגמא-אולדריץ'M0650
Alexa Fluor 647 מצומד AffiniPure F(ab)' 2-פרגמנטג'קסון IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK מערכות
קולגן סוג 1 זנב עכברושקורנינג354236
קולגנאז DRoche 
תאי אנדותל בסיסי בינוניLonzaCC-3156EBM
גידול תאי אנדותל בינוניLonzaCC-3162EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid Serva11290.02EDTA
סרום בקר עובריBio& למכורS 0615FBS
תאי אנדותל וריד טבורי אנושי, מאגרLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96 בארות צלחות  Sartorius4379
Incucyte S3 מערכת ניתוח תאים חייםSartorius
MethocelSigmam-0512
מדיום תאי אנדותל מיקרו-וסקולרי עם 10% FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
פלואידין-פלואורסצאין איזותיוציאנט מסומן (0.5 מ"ג/מ"ל מתנול)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
פוספט חוצץמלח תרמו פישר Scientfic14190-094PBS
מערכותתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים ברשתיתACBRI 181
ProLong זכוכית אנטי-דהייה עם NucBlueInvitrogen מאת ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN79306
גורם גדילה אנדותל כלי דם אנושי רקומביננטיPeproTech100-20VEGF
צלחת פטרי מרובעתגריינר688102
TrizolQiagen79306
טריפסיןPAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (חד שבטי)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493
אופטיות11088858001

מקורות

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Gariano, R. F., Gardner, T. W. Retinal angiogenesis in development and disease. Nature. 438 (7070), 960-966 (2005).
  3. Mancuso, M. R., Kuhnert, F., Kuo, C. J. Developmental angiogenesis of the central nervous system. Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 173-180 (2008).
  4. Tonnesen, M. G., Feng, X., Clark, R. A. Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 40-46 (2000).
  5. Folkman, J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol. 29, 6 Suppl 16 15-18 (2002).
  6. Crawford, T. N., Alfaro, D. V., Kerrison, J. B., Jablon, E. P. Diabetic retinopathy and angiogenesis. Curr Diabetes Rev. 5 (1), 8-13 (2009).
  7. Ng, E. W., Adamis, A. P. Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration. Can J Ophthalmol. 40 (3), 352-368 (2005).
  8. Blanco, R., Gerhardt, H. Vegf and notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), 006569(2013).
  9. Hellström, M., Kalén, M., Lindahl, P., Abramsson, A., Betsholtz, C. Role of PDGF-B and PDGFR-β in recruitment of vascular smooth muscle cells and pericytes during embryonic blood vessel formation in the mouse. Development. 126 (14), 3047-3055 (1999).
  10. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  11. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J Cell Sci. 112, Pt 19 3249-3258 (1999).
  12. Rapp, J., et al. 2D and 3D in vitro angiogenesis assays highlight different aspects of angiogenesis. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1870 (3), 167028(2024).
  13. Rapp, J., et al. STAT3 signaling induced by the IL-6 family of cytokines modulates angiogenesis. J Cell Sci. 136 (1), 260182(2023).
  14. Heiss, M., et al. Endothelial cell spheroids as a versatile tool to study angiogenesis in vitro. FASEB J. 29 (7), 3076-3084 (2015).
  15. Rapp, J., et al. Oncostatin m reduces pathological neovascularization in the retina through müller cell activation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (1), 22(2024).
  16. Fagotto, F., Gumbiner, B. M. Cell contact-dependent signaling. Dev Biol. 180 (2), 445-454 (1996).
  17. Rapp, J., et al. Addressing bias in manual segmentation of spheroid sprouting assays with U-Net. Mol Vis. 29, 197-205 (2023).
  18. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  19. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the Boyden chamber assay. J Vis Exp. (129), e56337(2017).
  20. Decicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  21. Vernon, R. B., Angello, J. C., Iruela-Arispe, M. L., Lane, T. F., Sage, E. H. Reorganization of basement membrane matrices by cellular traction promotes the formation of cellular networks in vitro. Lab Invest. 66 (5), 536-547 (1992).
  22. Craig, L. E., Spelman, J. P., Strandberg, J. D., Zink, M. C. Endothelial cells from diverse tissues exhibit differences in growth and morphology. Microvasc Res. 55 (1), 65-76 (1998).
  23. Müller, A. M., Hermanns, M. I., Cronen, C., Kirkpatrick, C. J. Comparative study of adhesion molecule expression in cultured human macro-and microvascular endothelial cells. Exp Mol Pathol. 73 (3), 171-180 (2002).
  24. Chiew, G. G. Y., Wei, N., Sultania, S., Lim, S., Luo, K. Q. Bioengineered three-dimensional co-culture of cancer cells and endothelial cells: A model system for dual analysis of tumor growth and angiogenesis. Biotechnol Bioeng. 114 (8), 1865-1877 (2017).
  25. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (1), 101-111 (1994).
  26. Lambert, V., et al. Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice. Nat Protoc. 8 (11), 2197-2211 (2013).
  27. Kastana, P., et al. Matrigel plug assay for in vivo evaluation of angiogenesis. Methods Mol Biol. 1952, 219-232 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים