מאמר שיטה

אופטימיזציה של איסוף דמעות בעכברים לצורך mRNA וניתוח חלבונים

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66955

⸱

19 ביולי 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

במאמר זה

סיכום

זיהוי סמנים ביולוגיים של RNA וחלבונים מדמעות במודלים של עכברים טומן בחובו הבטחה גדולה לאבחון מוקדם במחלות שונות. כתב יד זה מספק פרוטוקול מקיף למיטוב היעילות והיעילות של mRNA ובידוד חלבונים מדמעות עכברים.

תקציר

סרט הדמעות הוא נוזל ביולוגי דינמי ביותר המסוגל לשקף שינויים מולקולריים הקשורים לפתולוגיה, לא רק בפני השטח של העין אלא גם ברקמות ואיברים אחרים. ניתוח מולקולרי של נוזל ביולוגי זה מציע דרך לא פולשנית לאבחן או לפקח על מחלות, להעריך את יעילות הטיפול הרפואי ולזהות סמנים ביולוגיים אפשריים. בשל נפח הדגימה המוגבל, איסוף דגימות דמעות דורש מיומנויות ספציפיות וכלים מתאימים כדי להבטיח איכות גבוהה ויעילות מרבית. מתודולוגיות שונות של דגימת דמעות תוארו במחקרים בבני אדם. במאמר זה מוצג תיאור מקיף של פרוטוקול ממוטב, המותאם במיוחד לחילוץ מידע חלבוני הקשור לדמעות ממודלים ניסיוניים של בעלי חיים, במיוחד עכברים. שיטה זו כוללת גירוי תרופתי של ייצור דמעות בעכברים בני חודשיים, ולאחר מכן איסוף דגימות באמצעות רצועות Schirmer והערכת היעילות והיעילות של הפרוטוקול באמצעות הליכים סטנדרטיים, SDS-PAGE, qPCR ו- PCR דיגיטלי (dPCR). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר חתימת חלבון הדמעות במגוון פרדיגמות ניסיוניות. על ידי קביעת פרוטוקול דגימת דמעות במחיר סביר, סטנדרטי וממוטב עבור מודלים של בעלי חיים, המטרה הייתה לגשר על הפער בין מחקר בבני אדם למחקר בבעלי חיים, להקל על מחקרים תרגומיים ולהאיץ את ההתקדמות בתחום חקר מחלות עיניים ומחלות מערכתיות.

מבוא

דמעות נחשבות לאולטרה-פילטרט פלזמה ותוארו גם כנוזל ביניים בין סרום הפלזמה לנוזל השדרה בשל חפיפה משמעותית בביומולקולות שהן חולקות1. דווח כי דמעות אנושיות מכילות חלבונים, שומנים מדמעות, מטבוליטים ואלקטרוליטים2. לאחרונה זוהו גם ביומולקולות אחרות כגון mRNA, miRNA ושלפוחיות חוץ-תאיות 3,4,5,6,7.

בבני אדם, קרעים בזאליים ממוקמים בסרט הדמעות, המורכב משלוש שכבות: שכבת השומנים החיצונית, השומרת על משטח הדמעה חלק כדי לאפשר לנו לראות דרכו ולמנוע אידוי דמעות; השכבה המימית האמצעית, השומרת על לחות העין, דוחה חיידקים, מגנה על הקרנית ומהווה 90% מסרט הדמעות; ולבסוף, שכבת המוצין, משפחה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה הנמצאים במגע עם הקרנית ומאפשרים לדמעה להיצמד לעין8. פיזור הדמעות על פני משטח העין מתחיל בהפרשה מבלוטת הדמעות. נוזל זה מונחה דרך צינורות דמעות כדי לעבור מעל פני השטח של העין ולזרום לתוך תעלות ניקוז. כל מצמוץ מאפשר לדמעות להתפזר באופן שווה על פני כל העין, ושומר אותה לחה9.

סרט הדמעות הוא נוזל ביולוגי דינמי ביותר המסוגל לשקף שינויים מולקולריים המתרחשים לא רק על פני השטח של העין אלא גם ברקמות ואיברים אחרים. ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי בנוזל ביולוגי זה מייצג גישה מבטיחה לגילוי סמנים ביולוגיים במחלות אנושיות10,11. השימוש בסרט הדמעות כמקור לסמנים ביולוגיים לאבחון מוקדם בפאתולוגיות שונות הקל מאוד על ידי נוכחותן של שיטות איסוף לא פולשניות. השיטה הנפוצה ביותר לאיסוף קרעים במרפאות אנושיות ווטרינריות כוללת תמיכה מבוססת קרום (רצועת שירמר), הפועלת על עקרון הפעולה הנימית, ומאפשרת למים בקרעים לנוע לאורך רצועת בדיקה מנייר או צינורות נימים הממוקמים בשק הלחמית התחתון של הנבדק 12,13,14. למרות המגבלה המובנית של קבלת נפח דגימה קטן בשיטה זו, הניתוח הביוכימי של הרכב הדמעות באמצעות טכניקות רגישות שונות הקל על זיהוי מולקולות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים11,15. פרוטוקולים לאופטימיזציה והערכה של פליטת חלבוני דמעות מרצועות ונימים של שירמר בחולים אנושיים מתועדים היטב16,17. עם זאת, תיאורים מלאים של פרוטוקולים ממוטבים שתוכננו במיוחד כדי לחלץ מידע מולקולרי הקשור לדמעות ממודלים ניסיוניים של בעלי חיים זמינים אך נדירים. שיטות קיימות, כגון השראת דמעות באמצעות גירוי ישיר של בלוטת הדמעות18, תוך מתן אפשרות לאיסוף נפחים גדולים יותר, הן פולשניות ועלולות לגרום אי נוחות לבעלי החיים. שיטות לא פולשניות, כגון איסוף קרעים משטח העין, תוארו כדרך לבודד DNA ו- miRNA19,21.

פרוטוקול זה נועד לבסס שיטה חסכונית ואופטימלית לאיסוף ועיבוד דמעות בעכברים. השיטה נותנת עדיפות ללא-פולשניות תוך השגת נפחי דמעות מספיקים המתאימים לאנליזה מולקולרית באמצעות טכניקות כמו SDS-PAGE, qPCR ו-dPCR. לאחר מכן ניתן להשתמש במידע על תכולת החלבון וה-mRNA המופק כדי לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים במודלים ניסיוניים קיימים של מחלות.

פרוטוקול

כל הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). חיות המעבדה טופלו וטופלו בהתאם קפדני להנחיות השימוש בבעלי חיים של כתב העת ובהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. בריאות העין לפני ואחרי ההליכים הוערכה על ידי הערכת הפרשות עיניות, עפעפיים נפוחים, הפרעות עיניות ושינויים התנהגותיים.

1. בעלי חיים והכנת מגיבים

  1. השתמשו בשלושה עכברים זכרים C57BL/6 בני חודשיים לכל שכפול לצורך ההליך, עם משקל התחלתי של ~25 גרם (איור 1). עבד כל עכבר בנפרד והנח אותו על כרית חימום כדי לשמור על חום.
  2. כדי לגרום להפרשת דמעות, להכין תמיסת מלאי של פילוקרפין ב 20 מ"ג / מ"ל באמצעות מים סטריליים.
  3. חתכו את רצועות הבדיקה של שירמר לאורך של 5 מ"מ וכופפו כל רצועה בחריץ לזווית של 90°.
  4. להכין 250 μL של מים סטריליים עם מעכב פרוטאז (1 טבליה עבור 50 מ"ל, על פי הוראות היצרן).

2. גירוי ואיסוף ייצור דמעות

  1. שקול כל עכבר בנפרד כדי לחשב את המינון המתאים של הטיפולים.
  2. כדי לעורר ייצור דמעות, יש לתת 30 מ"ג/ק"ג של פילוקרפין תוך צפקית באמצעות מזרק אינסולין בקוטר 6 מ"מ (איור 1B). המתן 2 דקות לאחר הזרקת התרופה כדי שהשפעותיה יבואו לידי ביטוי.
    הערה: לא היתה אפשרות להשיג נתונים מבעלי חיים לא מגורים עקב הזמינות המוגבלת של נוזל דמעות.
  3. אספו את הדמעות על-ידי הנחת הקצה של כל קטע רצועת שירמר על מרכז העפעף התחתון בעזרת זוג פינצטות ושמרו אותו במקומו עד שהקרע יגיע לגבול הרצועה (איור 1C). לאחר מכן, החלף את הרצועה. מניחים ברצף 2 רצועות שירמר בכל עין, עם מרווח של 2 דקות בין רצועות לאיסוף. תהליך איסוף הדמעות דורש כארבעה שברי רצועה במשך 10 דקות לכל עכבר.
  4. הניחו את שברי רצועת שירמר בצינורות סטריליים על קרח כדי למנוע התפרקות של רכיבים. ברגע שהקולקציה מסתיימת, התחילו בעיבוד הדמעות.

3. בידוד חלבונים

  1. הניחו את שברי הרצועה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 600 μL המכיל 20 μL של מים סטריליים עם מעכב פרוטאז וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-600 x גרם ב-4°C, כפי שמוצג קודם לכן17 (איור 1D).
  2. צרו נקב באמצעות מחט מזרק נירוסטה בקוטר 7.5 ס"מ בקצה הצינור בגודל 600 μL שמכיל את הדגימה (איור 1E). לאחר מכן, העבירו את הצינור המנוקב הזה לצינור מעוקר חדש של 1.5 מ"ל וצנטריפוגו את הדגימות ב -12,000 x גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, כפי שדווח קודם לכן17, כדי לשחזר את נפח הדמעות המדוללות. נפח סרט הדמעות (סופרנטנט) יהיה בתחתית הצינור.
  3. יצירת מאגר חלבונים על ידי שילוב הסופרנאטנט שנאסף מכל הדגימות. בניסוי זה התקבל נפח כולל של כ-200 μL.
    הערה: ייצור הדמעות יכול להימשך יותר משעה. במהלך תקופה זו, עדיין ניתן לאסוף דמעות.
  4. כמת את תכולת החלבון הכוללת של בריכת הדמעות באמצעות שיטהסטנדרטית ברדפורד 22.

4. ניתוח SDS-PAGE

  1. חממו את דגימות החלבון בטמפרטורה של 99°C למשך 4 דקות כדי לנטרל את החלבונים. מערבלים את הדגימות בקצרה כדי לערבב את הרכיבים.
  2. טען 30 מיקרוגרם של תכולת חלבון מכומת מכל דגימה לג'ל SDS-PAGE 10% (טבלה 1) והפעל את הדגימות במתח של 90 וולט למשך שעתיים בשיטה סטנדרטית23.
  3. לאחר אלקטרופורזה, מכסים את הג'ל בתמיסת צביעה (טבלה 1) ודגרים במשך 30 דקות כדי להכתים את החלבונים.
  4. שוטפים את הג'ל בתמיסת העיכוב מספר פעמים עד שהרקע מתבהר ורצועות חלבון נראות לעין.
  5. לרכוש תמונות עם מערכת תיעוד ג'ל.

5. בידוד mRNA עבור qPCR ו- PCR דיגיטלי

  1. מניחים את הרצועות בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 600 μL המכיל 20 μL של מים סטריליים. עשו נקב בקצה הצינור שמכיל את הדגימה, הכניסו אותו לצינור מעוקר חדש של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה, כפי שדווח בעבר בדמעות אדם3, למשך 20 דקות ב-2,000 x גרם ב-4°C (איור 1E-H).
  2. צור מאגר מכל הדוגמאות. הנפח המשוחזר של ניסוי זה היה בערך 22 μL של supernatant עבור כל עכבר, כלומר, 66 μL של נפח כולל. הניחו את הצינורות על קרח יבש כדי למנוע התפרקות של ביומולקולות.
  3. הוסף 200 μL של תמיסה מונופאזית של פנול ו guanidinium isothiocyanate (מתקבל מסחרית) הומוגניזציה על ידי pipetting. תן לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, דגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C במשך מספר שבועות או -70 ° C במשך מספר חודשים.
  4. מוסיפים 40 μL של כלורופורם ומערבבים במערבולת במשך 15 שניות. תן לעמוד במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
  5. בזהירות להעביר את הפאזה המימית (מבלי לקחת את interphase) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
  6. יש להוסיף 0.5 מיקרוליטר גליקוגן (0.05 מק"ג/μL) ל-100 מיקרוליטר איזופרופנול ולערבב באמצעות פיפטינג. הגליקוגן מואץ יחד עם הרנ"א ואינו מפריע לשלבים הבאים.
  7. תן לעמוד במשך 10 דקות ב -20 ° C. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. מרוקנים במהירות את הסופר-נטנט.
  8. הוסף 200 μL של אתנול קר 75% והשהה מחדש את גלולת RNA על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
  9. דקנט את האתנול. מבלי להפוך את הצינור, תן לו להתייבש באוויר במשך 20-30 דקות. הוסף 20 μL של מים ללא RNase והשהה מחדש.
  10. המשך לקרוא את הצפיפות האופטית בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח ב- 260 ננומטר ו- 280 ננומטר כדי להעריך את טוהר ה- RNA. הדגימות חייבות להיות על קרח.
    הערה: לא ניתן לצפות ברצועות ריבוזומליות 28S ו-18S באמצעות ג'ל אגרוז בשל אופי הדגימה. נוכחותם של רנ"א אחרים, כגון miRNA או mRNAs, ניתנת לניתוח באמצעות ביואנלייזר, כפי שהוצג קודם לכן18.
  11. סנתז את cDNA מדמעות RNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    1. התחל עם RNA קלט בטווח של 10 ng-5000 ng; על פי הערכה בשימוש, לערבב אותו עם 1 μL של אוליגו (dT) ועד 12 μL של מים ללא RNase. סובבו אותו ב 500 x גרם במשך 30 שניות ודגרו ב 65 ° C במשך 5 דקות.
    2. הוסף לצינור הערבוב 4 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של מעכב RNase, 2 μL של תערובת dNTP, ו 1 μL של שעתוק הפוך.
    3. סובבו את הצינור ב 500 x גרם במשך 30 שניות כדי למשוך את התערובת. לאחר מכן, לדגור את הצינור ב 42 ° C במשך 60 דקות. סיים את התגובה על ידי דגירה של הצינור ב 70 ° C במשך 10 דקות.
  12. בשל הריכוז הנמוך של mRNA בדמעות, מומלץ להשתמש cDNA לא מדולל עבור qPCR24. עבור ניסוי זה, 150 ng של cDNA שימשו. בצע qPCR באמצעות פריימרים DNMT3a :
    קדימה: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA, הפוך: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA ופריימרים GAPDH :
    קדימה: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTGTTTA, הפוך: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC בהתאם להוראות היצרנים ונהלי הציוד.
    1. עבור מחזור qPCR, השתמש בתוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית: 95 ° C למשך 10 דקות ואחריה 45 מחזורים של C 95 ° C - 15 שניות, 60 ° C - 30 שניות ו- 72 ° C - 30 שניות, מסתיימים בהארכה סופית ב 72 ° C למשך 5 דקות.
    2. בצע ניתוח עקומת התכה כדי להעריך את נוכחותם של דימרים פריימרים או אמפליקונים לא ספציפיים בתגובה. רמפת הטמפרטורה החלה מ 50 ° C עד 99 ° C סופי, עם אחיזה ראשונית של 90 s עבור הצעד הראשון ואחיזה של 5 s בין כל צעד.
    3. עבור dPCR25, בצע דילולים סדרתיים כדי לייעל את כמות cDNA הנדרשת כדי לזהות את mRNA של עניין. בניסוי זה, השתמש בדילולים הבאים של cDNA במים נטולי נוקלאז: 150 ננוגרם, 75 ננוגרם, 37.5 ננוגרם ו-18.75 ננוגרם של cDNA. פריימרים עבור DNMT3a שהוזכרו קודם לכן שימשו. עבור מחזור dPCR, השתמש בתוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית: 95 ° C במשך 2 דקות ואחריו 40 מחזורים של 95 ° C - 15 s ו 60 ° C - 30 שניות.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מספק שיטה קלה ובמחיר סביר לקבלת מידע מולקולרי מנוזל דמעות באמצעות טכניקות הזמינות בדרך כלל ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית. יתר על כן, ניתן להרחיב את הפרוטוקול על ידי שימוש בטכניקות רגישות מאוד כגון ELISA לזיהוי פעילות אנזימטית.

לאחר ההליכים האלה, תפוקת החלבון הכוללת הייתה בערך 3-4 מק"ג/מיקרוליטר. ניתוח דף SDS מוכתם בקומאסי של סך תמציות החלבון מגלה דפוסים של ביטוי חלבונים בסך הרשתית והקרעים (איור 2A).

לרנ"א מבודד היה יחס ספיגת UV של 260/280 בין 1.9 ל-2.0. התפוקה הממוצעת הייתה 134.8 ננוגרם/מיקרוליטר. qPCR בוצע באמצעות ערכות פריימר עבור גן משק בית (גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז, GAPDH)3 וגן סמן ביולוגי משוער (DNA-methyl transferase 3a, DNMT3a)26. נעשה שימוש בדגימת cDNA לא מדוללת ביחס 1:1 (150 ננוגרם).

בוצע ניתוח עקומת התכה, ושיעורי Ct חושבו בתוכנת qPCR. כל הניסויים בוצעו בכפילות. הניתוח גילה ערכי Ct בין 20 ל-24, שהם טווח מתאים של כמות התחלתית של mRNA מטרה במדגם (איור 2B). עם זאת, ניתוח עקומת ההתכה באיור 2C מצביע על נוכחות נמוכה של mRNA מטרה. אף על פי כן, ג'ל אגרוז 2% אישר את נוכחותם של אמפליקונים בגודל הצפוי (איור 2D).

dPCR בוצע באמצעות אותו זוג ערכות פריימר עבור DNMT3a. דילול דגימות cDNA ששימשו היה 1:1 (150 ננוגרם), 1:2 (75 ננוגרם), 1:4 (37.5 ננוגרם), 1:8 (18.75 ננוגרם). כל הניסויים בוצעו בכפילות. dPCR הצליח לזהות מ-1.33 עותקים/μL במדגם הלא מדולל, ל-0.45 עותקים/μL במדגם המדולל פי 8 (איור 3A,3B). לפיכך, dPCR הראה רגישות מוגברת ל- mRNA המטרה הנוכח בדמעות בהשוואה ל- qPCR.

figure-results-1
איור 1: סכמה של פרוטוקול מיצוי הדמעות מעכברים. (א) איסוף דמעות. נעשה שימוש בשלושה עכברי C57BL/6J בני חודשיים. (B) ייצור הדמעות נגרם פרמקולוגית על ידי מתן תוך צפקי של פילוקרפין. תצלום הממחיש את מיקום רצועת שירמר. (C) עיבוד דמעות. לאחר מכן נאספו הדמעות באמצעות רצועות שירמר למשך 10 דקות והועברו לצינורות מיקרוצנטריפוגה. (D) קרעים שנאספו ברצועות שירמר צוננו באמצעות מים סטריליים ומעכבי פרוטאז או סתם מים סטריליים. (ה, ו) צינורות אלה נוקבו בתחתית ולאחר מכן הועברו לצינור מעוקר חדש של 1.5 מ"ל כדי להקל על חמקמק נוזלים. (ז, ח) הדמעות נאספות בצינור 1.5 מ"ל. (I) צילום מייצג של ההליך לאיסוף דמעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח במורד הזרם של סרט דמעות עבור יישומים מולקולריים. (A) SDS-PAGE של דמעות עכבר ותמצית חלבון רשתית. MW: סמן משקל מולקולרי.; נתיב 1: פרופילי חלבון של הרשתית (30 מיקרוגרם); נתיב 2: פרופילי חלבון של דמעות (30 מיקרוגרם). (B) qPCR עבור GAPDH ו-DNMT3a בדמעות עכברים. CT ו-ΔCT ממוצעים מוצגים בטבלה 2. (C) ניתוח עקומת התכה עבור מוצרי DNMT3a ו-GAPDH PCR. ציר ה-y מייצג את קצב השינוי של פלואורסצנטיות בתגובת ההגברה (dF/dT), וציר ה-x מייצג את הטמפרטורה ב-°C (D) אנליזה של אמפליקון PCR באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 2% המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד. נתיב M: 1 קילובייט פלוס סולם DNA. נתיב 1,2: מגבר PCR GAPDH ו - DNMT3a , בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: PCR דיגיטלי (dPCR) עבור ביטוי DNMT3a בדמעות עכברים. (A) תוצאות dPCR מוצגות כתרשים פיזור 1D המציג בנקודות כחולות את עותקי התמליל של DNMT3a . נקודות שחורות הן מחיצות ללא עותקי תעתיק DNMT3a קיימים. (B) סדרת דילול של cDNA נוצרה כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לכימות עותקי תעתיק DNMT3a . קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שם החומרתיאור
10% ג'ל SDSלג'ל הפרדה אחד: 3.8 מ"ל H2O מזוקק; 2.6 מ"ל טריס; pH 8.8; 1.5 מ '3.4 מ"ל אקרילאמיד; 100 μL 10% SDS; 100 μL 10% APS; 4 μL TEMED.
עבור ג'ל איסוף אחד: 2.72 מ"ל H2O מזוקק, 0.52 מ"ל טריס; pH 6.8; 1.5 מטר 0.68 מ"ל אקרילאמיד, 40 מיקרוליטר 10% SDS, 40 מיקרוליטר 10% APS 4 מיקרוליטר TEMED.
חיץ אלקטרופורזה250 mM בסיס טריס, 2 M גליצין, 1% SDS
פתרון צביעהלהמיס את הריאגנטים הבאים ב 43 מ"ל של מים (לאחסן בטמפרטורת החדר בבקבוק ענבר): קומאסי 0.25 גרם; חומצה אצטית 7 מ"ל; מתנול 50 מ"ל
פתרון השבחהלהמיס את הריאגנטים הבאים ב 63 מ"ל של מים (לאחסן בטמפרטורת החדר): חומצה אצטית 7 מ"ל; אתנול 30 מ"ל

טבלה 1. הגדר עבור SDS-Page.

שם גןCT1CT2ממוצע עם SDΔCT
GAPDH20.1420.7320.44±0.17
DNMT3a24.5924.9724.78±0.074.35

טבלה 2. ערכי Ct של DNMT3a ו - GAPDH בדמעות של עכברים.

דיון

נוזל הדמעות נגיש בקלות, וניתן להשתמש בקביעת סמנים ביולוגיים בדמעות כטכניקה משלימה מוצלחת לאבחון מוקדם של מחלות אנושיות שונות27. בעוד שהניתוח הביוכימי של הרכב הדמעות במודלים ניסיוניים של בעלי חיים משלים גישה זו ומבטיח התקדמות משמעותית בהבנת הבסיס המולקולרי של מחלות, קיים מחסור בנתונים ובפרוטוקולים זמינים, מה שהוביל אותנו לפתח אחד. השיטה המתוארת בדו"ח זה פשוטה מבחינה טכנית לביצוע ומאפשרת זיהוי ראשוני של ביטוי דיפרנציאלי של מולקולות מועמדות שונות הקשורות למחלה.

איסוף דמעות ניתן להשיג בשיטות שונות כגון צינורות נימים ורצועות שירמר 16,17, מקלונים28וספוגים29. שיטת רצועת שירמר הועדפה בשל קלות הגישה, יכולותיה הכמותיות, יכולת ההסתגלות במהלך איסוף הדגימות, עלותה ופשטותה בחילוץ רכיבי דמעות לעיבוד מעבדה. בנוסף, שיטה זו חסכונית, זעיר פולשנית, ואינה מהווה סיכון לפציעה או נזק לקרנית, הודות להרכב רצועת מסנן הנייר16,17. שלבים קריטיים של פרוטוקול זה כוללים את הצורך בגירוי תרופתי של ייצור הדמעות באמצעות פילוקרפין ובחירת חיץ אלוציה מתאים.

פילוקרפין הוא אגוניסט כולינרגי הנקשר לקולטני M3 מוסקריניים ויכול לגרום לגירוי תרופתי של בלוטות אקסוקריניות, שיפור ייצור הדמעות, הפרשת רוק והטלת שתן. למרות שמחקרים בבני אדם הראו כי גירוי הדמעות אינו משנה את האוסמולריות של הנוזל שנאסף30, הוא משפיע בבירור על פרופילי חלבונים31. השימוש בפילוקרפין כממריץ תרופתי כולינרגי של בלוטות אקסוקריניות ומשפר הפרשת דמעות דווח בהצלחה בארנבים ובעכברים 19,32,33, אך השפעת הגירוי על תכולת החלבון לא הוערכה. כדי להימנע ממגבלה זו ולאפשר השוואה מדויקת של פרופילי הדמעות בין תנאי הניסוי, חשוב לקחת בחשבון את הגדרות האיסוף הספציפיות. באופן דומה, הכנסת שלב שטיפה לפני איסוף הדמעות יכולה להועיל כדי למנוע זיהום קודם של פני העין. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בריכוז של 30 מ"ג/ק"ג פילוקרפין13. מכיוון שהעכברים נותרו חסרי תנועה ורגועים לאחר הזרקת התרופה, הדמעות נאספו ללא כל הרדמה, מה שהפך את איסוף הדגימות לקל.

הבחירה בחיץ אלוציה מתאים קשורה קשר הדוק לשיטה שנבחרה לניתוח ההרכב הביוכימי של דגימת דמעה וקצב ההחלמה של חומר ביולוגי מהרצועה. לדוגמה, במחקר השוואתי שהתמקד בשימור חלבונים מרצועות שירמר בחולים, נקבע כי חיץ המכיל 100 מילימטר אמוניום ביקרבונט יחד עם 0.25% Nonidet P40 (NP40) הניב תוצאות טובות יותר עבור יישומי ניתוח פרוטאומיקה או מולטיפלקס ELISA17. בידינו, השימוש במים סטריליים הוכיח את עצמו כמספיק כדי לדמיין את סך תמציות החלבון ב- SDS-PAGE ולזהות את ה- mRNA של הגנים המעניינים על ידי PCR.

כדי להעריך את הנוכחות של DNMT3a ו-GAPDH mRNA בדמעות עכברים, השווינו את הביצועים של qPCR ו-dPCR. נוכחותם של דימרים ראשוניים שנצפתה בעקומת ההתכה qPCR מיוחסת לשפע הנמוך של תעתיק DNMT3a . כפי שהוכח, ל-dPCR רגישות ויעילות גבוהות משמעותית באיתור mRNA המטרה בדגימות אלו בדגימות לא מדוללות ומדוללות. יכולת זיהוי מדויקת זו הופכת את dPCR לשיטה המועדפת לניתוח דמעות בעכברים, ומציעה לחוקרים ולקלינאים כלי אמין למחקרים עתידיים וליישומים קליניים פוטנציאליים.

פיתוח פרוטוקול סטנדרטי לאיסוף דגימות דמעות במודלים של בעלי חיים מהווה התקדמות משמעותית במחקר. פרוטוקול זה לא רק מאפשר איסוף שיטתי ומדויק של דגימות דמעות, אלא גם פותח מגוון רחב של אפשרויות ליישומן בתחומי מחקר שונים. היכולת לקבל דגימות דמעות ממודלים של בעלי חיים מאפשרת לחקור ספקטרום רחב של מחלות ותנאים, כמו גם לחקור סמנים ביולוגיים חדשים וטיפולים פוטנציאליים. יתר על כן, על ידי קביעת פרוטוקול סטנדרטי, מקודמת יכולת השחזור של תוצאות במחקרים ובמעבדות שונות, ובכך תורמת לתוקף ולאמינות המחקר. בסופו של דבר, להתקדמות זו במתודולוגיית איסוף דגימות הדמעות במודלים של בעלי חיים יש פוטנציאל להניע תגליות חשובות ולשפר את ההבנה של הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות, ולפתוח דרכים חדשות לאבחון, טיפול ומניעה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי VELUX STIFTUNG [פרויקט 1852] ל- M.L. ומענקי מלגות לתארים מתקדמים מ- CONAHCYT ל- M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) ו- A.M.F (CVU 1317418). תודה כנה לכל חברי המעבדה, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, ו- Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) על תרומתם לדיונים המעוררים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולג'יבקו1985023
2x מאגר Laemmliביו-ראד16-0737
חומצה אצטיתקימיקה מאייר64-19-7
אקרילאמידסיגמא-אולדריץ'א4058
ריאגנט ברדפורדסיגמא-אולדריץ'B6916
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'1003045143
קולאסי כחול R 250ביולוגי בארה"ב6104-59-2
אתנולקימיקה ריקה64-17-5
GeneRuler 1kb בתוספת סולם DNAתרמופישר מדעיSM1331
גליצרולביולוגי בארה"בG8145
גליציןסנטה קרוזSC- 29096
גליקוגןרוש10901393001
HClקימיקה ריקה7647-01-0
איזופרופיל אלכוהולקימיקה ריקה67-63-0
מתנולקימיקה מאייר67-56-1
שפופרות מיקרו 1.5 מ"לאקסיג'ןMCT-150-C
צינורות מיקרו 600 ומיקרו; lאקסיג'ןMCT-060-C
NaClסיגמא-אולדריץ'S3014
צינורות PCR & רצועותנובאסביוPCR 0104
פילוקרפיןסיגמא-אולדריץ'P6503-10 גרם
מעכב פרוטאזרוש11873580001
ערכת QIAcuity EvaGreen PCR (5 מ"ל)קיגן250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24 בארות (10)קיגן250001
qPlus אמיתי 2x מאסטר מיקס ירוקAmpliqonA323402
ערכת סינתזת cDNA של RevertAid First Stradתרמופישר מדעיK1622
רצועות הבדיקה של שירמרמעבדת סנטגרSANT1553
SDSסיגמא-אולדריץ'L3771
תמדסיגמא אולדריץ'102560430
מגיב TRIסיגמא-אולדריץ'T9424-200 מ"לתמיסה מונופאזית של פנול וגואנידיניום איזותיוציאנט
טריסביולוגי בארה"בT8650
בסיס טריסצ'ם קרוזSC-3715A

מקורות

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

mRNASchirmer StripsSDS PAGEPCR

מאמרים קשורים