פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה ולא קטלנית לרכישת בלוטות יותרת התריס מחזירים. ההליך מורכב משלושה שלבים עיקריים: הכנת חזיר בהרדמה, אחזור תימוס חד צדדי וזיהוי ומיצוי ex vivo של בלוטת יותרת התריס התוך-תמית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רכישת בלוטות יותרת התריס מחזירים תורמים חיים וזיהוי ex vivo
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תת-פעילות של בלוטת התריס, הנובעת לעתים קרובות מסיבוכים כירורגיים, משבשת קשות את הומאוסטזיס הסידן, מה שמוביל לתסמינים משביתים. הטיפולים הנוכחיים מציעים הקלה מוגבלת, ומדגישים את הצורך בטיפולים אלטרנטיביים כמו השתלת בלוטת התריס. מחקר זה מציג שיטה פשוטה לרכישת בלוטת התריס מתורם חי מחזירים, עם יישומים פוטנציאליים במחקר השתלות, במיוחד בתחום ההשתלות. ההליך כולל שלושה שלבים עיקריים: הכנת חזיר בהרדמה, אחזור תימוס חד צדדי וזיהוי וחילוץ ex vivo של בלוטת יותרת התריס התוך-תימית. הפרוטוקול משתמש בחזירי לנדרייס עם נהלים המבטיחים טיפול אתי והחלמה לאחר הניתוח. הוצאנו בהצלחה בלוטות יותרת התריס, ואישרנו את כדאיותן ושלמותן באמצעות ניתוח עוקב. רמות ה-PTH ברקמות הסופרנטנט עלו על 1,000 pg/mL, וצביעה אימונופלואורסצנטית הבדילה בין בלוטות יותרת התריס לרקמת התימוס, מה שאישר את אמינות ההליך. פרוטוקול זה מציע שיטה מהירה, לא קטלנית ונכונה מבחינה אתית לרכישת בלוטות יותרת התריס מחזירים, תוך התייחסות להבדלים אנטומיים בין חזירים לבני אדם. הוא מציע גישה בת קיימא עם השלכות משמעותיות על מחקר תת-פעילות של בלוטת התריס והשתלת זרים.
מבוא
פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה ולא קטלנית לרכישת בלוטות יותרת התריס מחזירים. תת-פעילות של בלוטת התריס, המאופיינת בהפרשת parathormone לא מספקת, משבשת באופן קריטי הומאוסטזיס סידן1. מצב זה, בעיקר סיבוך כירורגי לאחר כריתת בלוטת התריס או כריתת בלוטת התריס, מתבטא בתסמינים כמו אסתניה, כאב כרוני, טכיקרדיה, התקפים ואפילו מחלת כליות סופנית2. לעיתים, זה נובע מהפרעות אוטואימוניות או גנטיות נדירות. הטיפולים הנוכחיים, בעיקר תוספי סידן וויטמין D דרך הפה או parathormone רקומביננטי, מספקים הקלה חלקית בלבד בתסמינים מערכתיים כמו עייפות ודיכאון 3,4. הצורך ההולך וגובר בהשתלת בלוטת התריס כתרופה פוטנציאלית לתת-פעילות חמורה של בלוטת התריס מדגיש את הצורך בהקמת פרוטוקולי השתלה אחידים 5,6,7,8,9. עם זאת, מחקרים פרה-קליניים על השתלת בלוטת התריס נותרו מוגבלים, ויש מחסור במודלים סטנדרטיים של בעלי חיים. יתר על כן, העלייה האחרונה בתחום ההשתלות10,11, מגבירה את העניין ביישומים קליניים של השתלת זרים, במיוחד בתחום הטיפול בתאים אנדוקריניים12,13. עם זאת, מודלים חזיריים של השתלת בלוטת התריס מאתגרים בשל המורכבות של זיהוי רקמת בלוטת התריס בחזירים. יש, אם כן, צורך לספק טכניקה ניתנת לשחזור, בת קיימא ואתית כדי לאחזר בלוטות יותרת התריס מחזירים כדי לפתח עוד יותר השתלת בלוטת התריס.
בניגוד לבני אדם, שבדרך כלל יש להם ארבע בלוטות יותרת התריס הממוקמות מאחורי בלוטת התריס, לחזירים יש לרוב, שתי בלוטות יותרת התריס, כל אחת ממוקמת בחלק הגולגולתי של בלוטת התימוס. מחקרים קודמים שמטרתם לאתר בלוטות יותרת התריס בחזירים הסתמכו על שיטות קטלניות לזיהוי ex vivo או טכניקות מבוססות פלואורופור, שעשויות להיות קשות ליישום בהשתלת זרים 14,15,16. אנו מציעים כאן טכניקה פשוטה ולא קטלנית, המתאימה להשתלת זרים, המבוססת על שני שלבים עיקריים: אחזור בלוטת התימוס החזירי וזיהוי ex vivo iשל בלוטת יותרת התריס באמצעות טרנסהאור. טכניקה זו עשויה להיות שימושית למחקר על פיזיולוגיה של בלוטת התריס, כמו גם להשתלה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית לבעלי חיים של אוניברסיטת ליל (הפניה #20491-20190219161313).
1. הרדמת חזיר
- יש לתת בופרנורפין (0.015 מ"ג/ק"ג, תוך שרירי) 30 דקות לפני החתך הראשון כדי לספק משככי כאבים לפני הניתוח.
- בצע הזרקה תוך שרירית של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (3 מ"ג/ק"ג) כדי לגרום להרגעה. יש לתת 5% איזופלורן בשאיפה למשך 3 עד 5 דקות כדי להעמיק את ההרדמה.
- העריכו את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס סגירת העפעפיים ורפלקס הבליעה. החדרו את החזיר והניחו אותו על שולחן הניתוחים. הפחת את ריכוז האיזופלורן ל-2% באמצעות שאיפה לתחזוקת הרדמה.
- ניטור רציף של קצב הלב וריווי החמצן באמצעות מוניטור וטרינרי נייד רב פרמטרים כדי להבטיח עומק הרדמה אופטימלי ויציבות פיזיולוגית לאורך כל ההליך.
2. הצגת תחום העניין
- לגלח ולנקות בקפידה את אזור צוואר הרחם, המשתרע מהאזור התת-לסת ועד עצם החזה.
- מרחו סבון חיטוי, ואחריו כלורהקסידין, כדי להבטיח שדה סטרילי. יבש היטב את כל האזור.
- מקם וילונות סטריליים כדי לבודד את אזור צוואר הרחם הקדמי להתערבות כירורגית.
3. חשיפה לבלוטת התימוס החזירית
- בצע חתך אנכי של 10 ס"מ לאורך קו צוואר הרחם הלבן באמצעות אזמל. נתחו בזהירות את האזור עם מספריים של מצנבאום כדי להפריד את שרירי בלוטת התריס, וליצור שדה כירורגי ברור.
- הנח מפסק שומר על עצמו בין שריר האומוהיואיד לסחוס בלוטת התריס כדי להקל על דיסקציה של רקמת החיבור ולחשוף את התימוס.
הערה: הימנע מלחץ מוגזם על קנה הנשימה כדי למנוע פציעה. - חשפו בהדרגה את החלק הגולגולתי של התימוס והפרידו אותו בזהירות ממעטפת הצוואר, המכילה את עצב הנרתיק, וריד הצוואר הפנימי ועורק הצוואר המשותף.
הערה: כדי למנוע פציעה, השתמש בקרישה חשמלית כדי להשיג המוסטזיס.
4. אחזור תימוס חזיר
- לאחר השחרור, חלץ את החלק הגולגולתי של התימוס, שגודלו בדרך כלל 5 - 8 ס"מ.
- שטפו את בלוטת התימוס שחולצה בתמיסת מלח איזוטונית כדי להקל על זיהוי בלוטת יותרת התריס.
הערה: שלב זה חיוני לשיפור ההדמיה והבידול של המרקם הייחודי של בלוטת יותרת התריס
5. זיהוי בלוטת יותרת התריס התוך-תימית ex vivo
- שטח בעדינות את רקמת התימוס כדי להקל על זיהוי בלוטת יותרת התריס.
הערה: בלוטת יותרת התריס מציגה מרקם ייחודי, במיוחד בהשוואה לרקמה שמסביב. הקפסולה הפיברוטית של בלוטת התריס מוצקה יותר ובגודל דומה לאפונה. - השתמש במקור אור כדי לזהות את בלוטת יותרת התריס באמצעות תאורה.
הערה: כלי הדם המקיפים את בלוטת התריס צריכים להיות גלויים בבירור, מה שמסייע בהתמיינות שלה. - יש להוציא בזהירות את הקפסולה ולחלץ את כל בלוטת יותרת התריס. שימוש במלקחיים של Debakey לטיפול עדין ומספריים של מצנבאום לדיסקציה מדויקת. בודד את הבלוטה מרקמת התימוס שמסביב.
- הנח את בלוטת יותרת התריס המבודדת בתמיסת אחסון קר ושמור אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על כדאיות שלה להליכים הבאים.
- הטמע את הרקמה בפרפין להמשך עיבוד.
6. סגירה והתעוררות כירורגית
- לאחר שליפת בלוטת יותרת התריס, סגור את אתר הניתוח בשכבות. לתפור שרירים ורקמות תת עוריות באמצעות תפרים נספגים. סגור את העור עם תפרים שאינם נספגים.
- גמלו את החזיר בהדרגה מההרדמה. עם החזרה להכרה, עקוב אחר החזיר לאיתור סיבוכים מיידיים לאחר הניתוח.
- יש לתת משככי כאבים ואנטיביוטיקה לפי הפרוטוקול שלאחר הניתוח (בופרנורפין 0.03 à 0.05 מ"ג/ק"ג וקלמוקסיל 15 מ"ג/ק"ג למשך 48 שעות). החזירו את החזירים למתקן הדיור שלהם להתאוששות תחת פיקוח וטרינרי.
7. פרוטוקול צביעה חיסונית
- בצע דה-פרפיניזציה והתייבשות מדגימות משובצות פרפין: קסילן למשך 5 דקות, קסילן למשך 10 דקות, 100% אתנול למשך 5 דקות, 90% אתנול למשך 7 דקות 30, 70% אתנול למשך 7 דקות 30, 50% אתנול למשך 5 דקות, מים מזוקקים למשך 5 דקות ופוספט-מאגר-מלח (PBS) למשך 5 דקות.
- בצע אחזור אנטיגן על ידי חימום הדגימות במיקרוגל במאגר ציטראט pH 6, ב-650 וואט למשך 9 דקות. הניחו לדגימות להתקרר במאגר למשך 20 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחת.
- דגרו את הדגימות, מוקפות בעט דקו, בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם תמיסת בלוק חלבון כדי לחסום קשירה לא ספציפית.
- דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם הנוגדן העיקרי (נוגדן PTH (H-7), Mouse IgG-α-human, sc-398856, 1:100) מדולל באלבומין סרום בקר 1% (BSA). יש לשטוף פעמיים עם PBS למשך 5 דקות כל אחת.
- דגירה למשך שעה ו-30 דקות בטמפרטורת החדר עם הנוגדן המשני (Alexa Fluor 488, goat-α-Mouse, A11001, 1:500) מדולל באלבומין סרום בקר 1%. יש לשטוף פעמיים עם PBS ופעם אחת עם מים מזוקקים כפולים למשך 5 דקות.
- הרכיבו את השקופיות עם תמיסת DAPI ואחסנו את השקופיות ב-4 מעלות צלזיוס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות העיקריות של מחקר זה כוללות מיצוי מוצלח של בלוטות יותרת התריס מחזירי לנדרז וניתוח לאחר מכן כדי לאשר את כדאיותן ושלמותן. התוצאות מסוכמות כדלקמן. זיהוי רקמת בלוטת התריס אושר תוך ניתוחי באמצעות טרנס-הארה (איור 1A). לאחר החילוץ נאספו שתי דגימות קטנות של הרקמה (כ-10% כל אחת). דגימה אחת נטחנה בצלחת צלחת ב-1 מ"ל של מדיום תרבית DMEM-F12. לאחר הטחינה, נאסף 1 מ"ל מהסופרנטנט, ורמות ה-PTH הוערכו באמצעות בדיקת PTH תוך ניתוחית מהירה (איור 1C). אם האופי של בלוט...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה ולא קטלנית לרכישת בלוטות יותרת התריס בחזירים. השלב המרכזי בפרוטוקול כולל מיקום בלוטת התימוס החזירית כדי להבטיח שליפה מלאה להמשך חקירה ex vivo . לאחר מיצוי בלוטת התימוס, ניתן לזהות בקלות את בלוטת יותרת התריס באמצעות תאורה.
אחד האתגרים העיקריים של טכניקה זו הוא הצורך להימנע מהסתמכות על הרגלים כירורגיים אנושיים הקשורים לכריתת בלוטת התריס, שכן הפרוטוקול שלנו עוקף את ההבדלים האנטומיים בין מיקומי PTG של חזירים ובני אדם. בניגוד לב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
ברצוננו להודות לאגודה הצרפתית לסוכרת ולקרן למחקר רפואי על התמיכה והמימון למחקר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ציוד | |||
| 22G קטטר היקפי קצר | סמיתס רפואי | 5060 | |
| סט בסיסי II, קרפ | הרטמן | 9389253 | |
| בופאק (bupré norphine) | Virbac | ||
| Clippers Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| אזמל חד פעמי | Swann-Morton | 0510 | |
| מרית אלקטרודה | Erbe | 21191-002 | |
| מחולל אלקטרו-כירורגיה BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS+ | MELAG | 10056 | |
| שסתום עירוי כבידה תלת כיווני עם קצה נעילת Luer נייד | Care Fusion | A64-3V | |
| ידית עם שני כפתורים לאלקטרודות Slim-Line | Erbe | 20190-065 | |
| Isoflurane Funnel Fill Vaporizer | Supera Anesthesia Innovations | VAP3000 | |
| Isorane (isoflurane) | Axience | ||
| Ketamidor (ké tamine) | Axience | ||
| Light Ceiling כפול | RIMSA | PENTA81+30E | |
| Medisorb פחמן דו חמצני סופג | Vyaire | 8570043 | |
| Mersutures 0 | Ethicon | F2520 | |
| Microtome | LEICA RM2255 | ||
| Miller Blade | Opticlar | 600.020 | |
| רכז חמצן | DeVilbiss | 525KS | |
| פקסמן (קסילזין) | Virbac | ||
| מוניטור וטרינרי נייד רב פרמטרים | Mindray | IPM 10 | |
| ידיות לרינגוסקופ לשימוש חוזר | Opticlar | 600.080 | |
| מאוורר הרדמה לבעלי חיים קטנים | Midmark | 91806001 | |
| הזרקת נתרן כלורי Viaflo | Baxter | ||
| מכשירים כירורגיים | Kohler medizintechnik | ||
| שולחן כירורגי | Vetinox | TA700005 | |
| צינור קנה הנשימה | Smiths רפואי | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| <חזק>חומרים וריאגנטים | |||
| DMEM F-12 בינוני | ThermoFischer | 11320033 | |
| Parathormone נוגדן | SantaCruz | sc-398856 | |
| בדיקת pth מהירה תוך ניתוחית | בקמן קולטר | A16972 |
מקורות
- Gafni, R. I., Collins, M. T. Hypoparathyroidism. N. Engl. J. Med. 380, 1738-1747 (2019).
- Gosmanova, E. O., Houillier, P., Rejnmark, L., Marelli, C., Bilezikian, J. P. Renal complications in patients with chronic hypoparathyroidism on conventional therapy: a systematic literature review: Renal disease in chronic hypoparathyroidism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 22, 297-316 (2021).
- Frey, S., et al. Impact of permanent post-thyroidectomy hypoparathyroidism on self-evaluation of quality of life and voice: results from the national qol-hypopara study. Ann. Surg. 274, 851-858 (2021).
- Büttner, M., Krogh, D., Siggelkow, H., Singer, S. What are predictors of impaired quality of life in patients with hypoparathyroidism. Clin. Endocrinol. (Oxf). 97, 268-275 (2022).
- Gadelha, D. D., Filho, W. A., Brandão, M. A. J., Montenegro, R. M. Is parathyroid allotransplantation a viable option in the treatment of permanent hypoparathyroidism? A review of the literature. Endocrine. 80 (2), 253-265 (2022).
- Sakane, E. N., Vieira, M. C. C., Vieira, G. M. M., Maeda, S. S. Treatment options in hypoparathyroidism. Arch. Endocrinol. Metab. 66, 651-657 (2022).
- Zhang, J. L. H., Appelman-Dijkstra, N. M., Schepers, A. Parathyroid allotransplantation: A systematic review. Med. Sci. 10, 19(2022).
- Goncu, B., et al. Graft survival effect of HLA-A allele matching parathyroid allotransplantation. J. Investig. Med. Off. Publ. Am. Fed. Clin. Res. 69, 785-788 (2021).
- Barczyński, M., Gołkowski, F., Nawrot, I. Parathyroid transplantation in thyroid surgery. Gland Surg. 6, 530-536 (2017).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. The Lancet. 402, 1158-1169 (2023).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Exp. Clin. Transplant. Off. J. Middle East Soc. Organ Transplant. 21, 901-912 (2023).
- Hasse, C., et al. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J. Surg. 24, 1361-1366 (2000).
- Oster, M., et al. Fast and reliable dissection of porcine parathyroid glands - A protocol for molecular and histological analyses. Ann. Anat. - Anat. Anz. 219, 76-81 (2018).
- Hyun, H., et al. Structure-inherent targeting of near-infrared fluorophores for parathyroid and thyroid gland imaging. Nat. Med. 21, 192-197 (2015).
- Klute, K. Contribution to the topography and histology of porcine parathyroid glands. , Justus Liebig University of Giessen. Beitrag zur Topographie und Histologie der Epithelkörperchen des Schweines. Ph.D. thesis. Justus Liebig-Universität zu Giessen (1959).
- Arndt, H. On the topography of epithelial cells in pigs with special consideration of the suitability of pigs for the production of organo-therapeutic epithelial cell preparations. Z. Anat. 81, (Zur Topographie der Epithelkörperchen beim Schwein mitbesonderer Berücksichtigung der Eignung des Schweines für die Gewinnungorgano-therapeutischer Epithelkörperchenpräparate) 191-197 (1926).
- Butylina, M., Föger-Samwald, U., Gelles, K., Pietschmann, P., Sipos, W. Challenges in establishing animal models for studying osteoimmunology of hypoparathyroidism. Front. Vet. Sci. 10, 1163903(2023).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
