מאמר שיטה

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

DOI:

10.3791/66969

⸱

14 ביוני 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Artios Pharma Ltd, Cambridge, 2The Francis Crick Institute, London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיקון שברים כפולי גדיל של DNA (DSBs) חיוני לשמירה על יציבות הגנום ועל כדאיות התא. תיקון DSB (DSBR) בתאים מתווך באמצעות מספר מנגנונים: רקומבינציה הומולוגית (HR), הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ) וחישול גדיל יחיד (SSA). בדיקות תאיות חיוניות למדידת המיומנות והאפנון של מסלולים אלה בתגובה לגירויים שונים.

כאן, אנו מציגים חבילה של מבחני כתב חוץ-כרומוזומליים שכל אחד מהם מודד את המבנה מחדש של גן כתב ננולוציפראז על ידי אחד מארבעת מסלולי DSBR העיקריים בתאים. עם טרנספקציה חולפת לתאים בעלי עניין, ניתן למדוד תיקון של מצעי כתב ספציפיים למסלול תוך פחות מ-24 שעות על ידי זיהוי של לומינסנציה של ננולוציפראז (NanoLuc).

בדיקות חזקות אלה הן כמותיות, רגישות, ניתנות לטיטרציה וניתנות להתאמה לפורמט סינון בתפוקה גבוהה. תכונות אלה מספקות יישומים נרחבים במחקר תיקון DNA וגילוי תרופות, ומשלימות את ערכת הכלים הקיימת כיום של בדיקות DSBR תאי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שברי גדיל כפול של דנ"א (DSB) מייצגים סוג רעיל במיוחד של נזק לדנ"א1 שבגללו תאים פיתחו מסלולי תיקון DSB מרובים (DSBR) כדי לתקן נגעים אלה. ארבעת מנגנוני DSBR העיקריים הם רקומבינציה הומולוגית (HR), הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ), וחישול גדיל יחיד (SSA)2,3. מסלולי DSBR תורמים לשמירה על התפתחות רקמות בריאות ופיזיולוגיה ומגנים מפני מחלות כגון סרטן. יתר על כן, מנגנוני תיקון אלה טומנים בחובם פוטנציאל טיפולי לפיתוח מודולטורים של מולקולות קטנות באונקולוגיה מדויקת. לדוגמה, התמקדות בדנ"א פולימראז θ (Polθ), אנזים מרכזי במסלול תיקון MMEJ, משכה עניין בשל הקטלניות הסינתטית שלו עם מחסור ב-HR בסרטן4.

להבנת DSBR יש אפוא השלכות קליניות רחבות ויש צורך בבדיקות תאיות פונקציונליות המסוגלות למדוד את הפעילות של כל מסלולי DSBR העיקריים5. הבדיקות חייבות להיות מתאימות הן לחקירה גנטית והן לחקירה פרמקולוגית וניתנות לפריסה על פני מודלים תאיים בעלי עניין. כדי לתמוך במאמצי גילוי תרופות של מולקולות קטנות, הבדיקות חייבות להיות רגישות מאוד, ניתנות לטיטרציה, בעלות תפנית מהירה וניתנות להרחבה לפורמטים בעלי תפוקה גבוהה המתאימים לסינון מורכבים.

באופן כללי, DSBR נמדד בעבר באמצעות מערכות בדיקת כתב מבוססות פלואורסצנטיות המשולבות ביציבות בגנום התא6. עם זאת, בעוד ששחזור פיזיולוגי של DSBR כרומוזומלי הוא יתרון מובהק, בדיקות כאלה מוגבלות למודל מארח שבו הכתב משולב, משתמשות בהכנת דגימות עתירות עבודה וניתוח לפי ציטומטריית זרימה, ויש להן תפוקה, זמן אספקה, חוסן ורגישות מוגבלים, כל התכונות החיוניות הדרושות למאמצי גילוי תרופות.

כאן אנו מתארים חבילה של מבחני כתבי DSBR המאפשרים הערכה של ארבעת מסלולי DSBR העיקריים. חבילת מצעי בדיקת הכתבים מתוארת באיור 1 ומתוארת עוד יותרבפרסום 7 שפורסם לאחרונה. הם חוץ-כרומוזומליים, המאפשרים את הכנסתם לתאים על ידי טרנספקציה חולפת פשוטה, ושילוב של גן כתב ננולוציפראז8, אשר חייב להיות משוחזר על ידי מעורבות עם מנגנוני DSBR ספציפיים, מוליד רגישות, חוסן ומדרגיות. גרסאות המצע הבאות של כתב DSBR כלולות בפרוטוקול (איור 1):

MMEJ בלתי תלוי כריתה: מצע ליניארי זה מורכב מאזור ליבה של דנ"א דו-גדילי (dsDNA) עם דנ"א חד-גדילי (ssDNA) מעל, המחקה את קצוות הדנ"א המנותחים9. ארבע מיקרוהומולוגיות נוקלאוטידים בקצה של אזורי ssDNA מקודדות את קודון ההתחלה של הגן המדווח. תיקון מצע זה באמצעות MMEJ משחזר את מסגרת הקריאה הפתוחה של גן המדווח (ORF).

MMEJ תלוי כריתה: הגן אקסון N-terminal reporter מופרע על ידי קטע המכיל קודון עצירה, אשר משני צדדיו 8 מיקרוהומולוגיות של זוג בסיסים (bp). כריתת קצה נוקלאוליטית נדרשת לפני תיקון בתיווך MMEJ כדי לשחזר את גן המדווח השלם.

NHEJ בוטה: גן הכתב מחולק למקטעים N ו- C טרמינליים, שהאחרון ממוקם במעלה הזרם של המקדם. ה- DSB מיוצר באמצעות EcoRV והוא דורש קשירה ישירה (ללא עיבוד סופי) על ידי NHEJ כדי ששני חלקי הגן המדווח יחוברו מחדש וה- ORF המדווח ישוחזר.

NHEJ לא בוטה: ה- DSB ממוקם בתוך אינטרון ויהיו לו קצוות מלוכדים או לא מגובשים בהתאם לבחירת אנזים ההגבלה. תיקון מצע זה על ידי NHEJ דורש קשירה שקודמת לעיבוד סופי.

תבנית ארוכה HR: האקסון N-terminal של הגן המדווח נקטע על ידי מקטע DNA המכיל אתרי הגבלה, אשר מחליפים 22 bp של רצף הגן המדווח המקורי. כדי לשחזר רצף זה, תיקון על-ידי HR משתמש בתבנית ההומולוגיה של 2.5 קילו-בסיס (kb) הממוקמת במורד הזרם של אקסון מסוף C.

תבנית קצרה HR: אתר ההגבלה הדרוש ליצירת DSB מחליף חלק מרצף הגן המקורי של המדווח ומציג קודון עצירה בתוך מסגרת. בדומה לגרסת התבנית הארוכה, מצע HR זה דורש את תבנית ההומולוגיה במורד הזרם (360 bp) לתיקון ושחזור מדויקים של ORF המדווח.

SSA: מצע זה מכיל קודון עצירה מוקדמת הממוקם בתוך אקסון N-terminal של הגן reporter. הסרת קודון עצירה זה והחזרת רצף הגן המדווח השלם דורשת תיקון על ידי SSA, הכולל כריתה דו-כיוונית לטווח ארוך לפני יישור ההומולוגיות.

עבור יצירת DSB, חלק ממצעי הכתב יכולים להיות מעוכלים באמצעות I-SceI (איור 1). זה ייצור מצע ליניארי עם קצוות לא מגובשים בכתבי MMEJ תלויי כריתה, NHEJ לא בוטה, תבנית ארוכה HR וכתבי SSA, שיש להם אתרי I-SceI בכיוונים הפוכים. בתבנית הקצרה מצע כתב משאבי אנוש, העיכול של אתר I-SceI היחיד ייצור קצוות מגובשים. ניתן לעכל גם את הפלסמידים הלא קהים של NHEJ, MMEJ תלוי כריתה, תבנית ארוכה HR ו- SSA עם HindIII, אשר יפיקו קצוות מלוכדים משלימים.

אנו מספקים פרוטוקולים ליצירת מצעי בדיקת הכתב ומתארים כיצד ניתן לבצע את הבדיקות, מספקים פרטים על האופן שבו ניתן להשתמש בהם כדי לכמת DSBR, כולל תגובות titratable למולקולות קטנות, הערכת עוצמה תאית, פעילות על המטרה וסלקטיביות מסלול.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה ובקרת איכות (QC) של מצעי כתב

הערה: הפלסמידים המקודדים את מצעי הכתב ניתנים להפצה בזני Escherichia coli סטנדרטיים (למשל, DH5α ונגזרות) ומוחזרים על ידי בידוד פלסמיד. פרטי פלסמיד (גודל ועמידות לאנטיביוטיקה) מתוארים בטבלה 1 ובאיור 1.

figure-protocol-1
איור 1: סכמות של מבחני כתב DSBR חוץ-כרומוזומליים מבוססי NanoLuc. ייצוג סכמטי של מצעי כתב DSBR, כולל מיקומם בתוך כל פלסמיד מקור, תכונות הרצף הראשי והפריסה הסופית לאחר תיקון ספציפי למסלול. ליבת מצע MMEJ שאינה תלויה בכריתה מוסרת מפלסמיד המקור על ידי עיכול עם XhoI/HindIII, ולאחר מכן יש לקשור את הכובעים לשני הקצוות כדי לייצר את המצע עבור MMEJ. מצע כתב NHEJ קהה נוצר על ידי כריתה מפלסמיד המקור עם EcoRV. מצעי MMEJ תלויי כריתה, NHEJ לא קהה, תבנית ארוכה HR וכתב SSA נוצרים על ידי ליניאריזציה של פלסמידים המקור באמצעות I-SceI (המייצר קצוות לא מלוכדים) או הינדIII (המייצר קצוות מלוכדים). מצע כתב משאבי אנוש בתבנית קצרה נוצר על ידי ליניאריזציה של פלסמיד המקור באמצעות I-SceI (המייצר קצוות מלוכדים). תיקון כל מצע כתב על ידי מסלול DSBR המטרה יוצר מחדש ננולוציפראז ORF שלם המקודד NanoLuc פונקציונלי. נתון זה נלקח מ Rajendra et al.7. קיצורים: DSBR = תיקון שבר גדיל כפול; NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; HR = רקומבינציה הומולוגית; SSA = חישול גדיל יחיד; ORF = מסגרת קריאה פתוחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הכנת מצע כתב MMEJ בלתי תלוי בכריתה (תרשים 1 ו איור 2A-ג)
    1. הכנת כובעי ssDNA/dsDNA (איור 2A)
      1. השהה מחדש את ארבעת האוליגונוקלאוטידים המפורטים בטבלה 2 בנפרד בחיץ חישול (20 mM Tris pH 7.5, 50 mM NaCl במים בדרגת ביולוגיה מולקולרית) כדי ליצור תמיסת מלאי ב- 100 μM.
      2. חישול כובעי ss/dsDNA
        1. יש לערבב 50 μL כל אחד מהאוליגונוקלאוטידים הארוכים והקצרים (תמיסת מלאי של 100 מיקרומטר) עבור המכסה השמאלי משלב 1.1.1.1 בצינור של 0.2 מ"ל.
        2. חזור על הפעולה עבור אוליגונוקלאוטידים בעלי כובע ימני.
        3. באמצעות thermocycler, לדגור על כל תערובת אוליגונוקלאוטיד ב 99 ° C במשך 5 דקות ולאחר מכן לעלות עד 10 ° C ב 1 ° C / דקה.
          הערה: פעולה זו תפיק את הכובעים השמאלי והימני המחושלים.
      3. (QC, אופציונלי) אימות חישול אוליגונוקלאוטיד על ידי אלקטרופורזה
        1. אלקטרופורזה 100 ננוגרם של כל מוצר משלב 1.1.1.2 לצד אוליגונוקלאוטידים בודדים משלב 1.1.1.1 וסולם DNA במשקל מולקולרי נמוך בג'ל 20% אקרילאמיד-טריס-בוראט-EDTA (TBE) במתח של 200 וולט למשך 80 דקות.
        2. הכתימו את הג'ל עם חיץ ריצה TBE המכיל צבע DNA פלואורסצנטי מתאים להדמיה של ssDNA ו- dsDNA למשך 10-15 דקות לפחות.
        3. דמיינו פלואורסצנטיות על מערכת תיעוד ג'ל (איור 2A).
          הערה: שלבים 1.1.1.3.1 עד 1.1.1.3.3 משמשים כדי לוודא שאותיות גדולות עברו חישול תקין. הגדלים הנראים לעין עבור הכובע השמאלי והכובע הימני צריכים להיות ~ 120 bp ו- ~ 175 bp, בהתאמה.
    2. טיהור ליבת מצע הכתב (איור 2B)
      1. ערבבו 100 מיקרוגרם של פלסמיד ליבת הכתב עם 4 מיקרוליטר של הינדIII ו-4 מיקרוליטר של XhoI (4 U/μg פלסמיד לכל אנזים) ו-20 מיקרוליטר של חיץ 10x. הביאו את הנפח הכולל ל-200 מיקרוליטר עם מים מזוקקים פעמיים (ddH2O) ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים עד לילה כדי לעכל פלסמיד.
        הערה: לעיכול של כמויות גדולות או קטנות יותר, שנה את קנה המידה של התגובה באופן פרופורציונלי.
      2. יש לדגור על תגובת העיכול בטמפרטורה של 80°C למשך 20 דקות כדי לחמם אנזימי הגבלה מושבתים.
      3. הוסף 40 μL של phosphatase אלקליין (2 U/μg פלסמיד) ו 27 μL של חיץ 10x לתערובת התגובה משלב 1.1.2.2. לדגור ב 37 ° C במשך 2 שעות כדי dephosphorylate פלסמיד.
        הערה: שנה את קנה המידה של התגובה למעלה או למטה לפי הצורך.
      4. הוסף 60 μL של צבע העמסה 6x לתגובה משלב 1.1.2.3. אלקטרופורזה לצד סולם DNA במשקל מולקולרי גבוה בג'ל agarose-Tris-Acetate-EDTA (TAE) של 1.5% (w/v) המכיל כתם dsDNA פלואורסצנטי במתח של 120 וולט למשך 2.5 שעות או עד שהרצועות נפתרות מספיק.
      5. דמיינו פלואורסצנטיות על מערכת תיעוד ג'ל (איור 2B).
      6. הבלו את קטע ליבת הכתב (~ 1.5 קילובייט) מהג'ל באמצעות אזמל נקי, תוך הקפדה שלא לזהם בעמוד השדרה הווקטורי (~ 2.5 קילובייט).
      7. חלץ את מקטע ליבת הכתב באמצעות ערכת מיצוי ג'ל, בהתאם להוראות היצרן.
      8. למדוד את ריכוז ואיכות הדנ"א (A260/280) באמצעות ספקטרופוטומטריה.
    3. קשירת ליבת מצע הכתב עם מכסי ssDNA/dsDNA וטיהור מצע הכתב הסופי (איור 2C)
      1. ערבבו 30 מיקרוגרם של מקטע ליבת הכתב משלב 1.1.2.7 עם 3.85 מיקרוליטר של כל כובע שמאלי וימין מחושל משלב 1.1.2 (יחס מולארי של כ-6:1 של cap:core DNA), 30 μL של 10x מאגר ליגאז, ו-1.5 μL של T4 DNA ligase (20 U/μg DNA). הביאו את הנפח הכולל של התגובה ל-300 μL עם ddH2O ודגרו למשך הלילה ב-16°C כדי לקשור מכסים למקטע ליבת הכתב.
        הערה: שנה את קנה המידה של התגובה למעלה או למטה כנדרש.
      2. (QC, אופציונלי) אלקטרופורזה 200 ננוגרם של המוצר המתקבל משלב 1.1.3.1 לצד ליבת מצע הכתב וסולם DNA במשקל מולקולרי גבוה בג'ל agarose-TAE 0.7% (w/v) המכיל כתם dsDNA פלואורסצנטי במתח של 120 וולט למשך 1.5 שעות לפחות. ודא שהרצועה המתאימה למכפלה הקשורה נודדת בקצב מעט איטי יותר מליבת מצע הדיווח שאינו קשור (איור 2C).
        הערה: שלב QC זה נועד לוודא שקשירת האותיות למקטע הליבה של המדווח בוצעה כראוי.
      3. לטהר את הדנ"א מתגובת העיכול בשלב 1.3.1. שימוש בשיטה המועדפת (למשל, שיטה מבוססת חרוזים או מבוססת עמודות), בהתאם להוראות היצרן.
        הערה: שלב הטיהור 1.1.3.3 מפחית באופן משמעותי את נוכחותם של מכסים לא קשורים.
    4. למדוד ריכוז ואיכות DNA (A260/280) על ידי ספקטרופוטומטריה.
  2. הכנת מצע כתב NHEJ קהה (איור 1 ואיור 2D,E)
    1. ערבבו 100 מיקרוגרם של פלסמיד ליבת הכתב עם 5 μL של EcoRV (5 U/μg פלסמיד) ו-20 μL של חיץ 10x. הביאו את הנפח הכולל ל-200 מיקרוליטר עם ddH2O ודגרו ב-37°C למשך שעתיים עד לילה כדי לעכל פלסמיד.
      הערה: לעיכול של כמויות גדולות או קטנות יותר, שנה את קנה המידה של התגובה באופן פרופורציונלי.
    2. לדגור על תגובת העיכול ב 65 ° C במשך 20 דקות כדי לחמם אנזים הגבלה מושבת.
    3. הוסף 50 μL של צבע העמסה 6x לתגובה משלב 1.2.2. אלקטרופורזה לצד סולם DNA במשקל מולקולרי גבוה בג'ל agarose-TAE 1.5% (w/v) המכיל כתם dsDNA פלואורסצנטי במתח של 120 וולט למשך שעתיים או עד שהרצועות נפתרות מספיק.
    4. דמיינו פלואורסצנטיות על מערכת תיעוד ג'ל (איור 2D).
    5. הבלו את מצע הכתב (~ 1.7 קילובייט) מהג'ל באמצעות אזמל נקי, תוך הקפדה שלא לזהם את עמוד השדרה הווקטורי (~ 2.6 קילובייט).
    6. חלצו את מקטע ליבת הכתב באמצעות ערכת מיצוי ג'ל, בהתאם להוראות היצרן (איור 2E).
    7. למדוד את ריכוז ואיכות הדנ"א (A260/280) באמצעות ספקטרופוטומטריה.
  3. הכנת מצעי כתב מבוססי I-SceI (איור 1)
    הערה: מצעים אלה כוללים MMEJ תלוי כריתה (איור 2F), NHEJ לא קהה (איור 2G), HR תבנית ארוכה (איור 2H), HR תבנית קצרה (איור 2I) ו- SSA (איור 2J).
    1. ערבבו 100 מיקרוגרם של פלסמיד ליבת הכתב עם 50 μL של I-SceI (פלסמיד 5 U/μg) ו-60 μL של חיץ 10x. הביאו את הנפח הכולל ל-600 מיקרוליטר עם ddH2O ודגרו ב-37°C למשך שעתיים עד לילה כדי לעכל פלסמיד.
      הערה: לעיכול של כמויות גדולות או קטנות יותר, שנה את קנה המידה של התגובה באופן פרופורציונלי. NHEJ לא קהה, MMEJ תלוי כריתה, תבנית ארוכה HR ופלסמידים SSA ניתן לעכל גם עם HindIII, אשר ייצור קצוות מלוכדים משלימים.
    2. יש לדגור על תגובת העיכול ב-65°C למשך 20 דקות כדי לחמם את I-SceI. כוונו את הטמפרטורה ל-80°C במהלך שלב זה אם HindIII שימש לעיכול במקום.
    3. לטהר DNA מתגובת העיכול הבלתי פעילה בשלב 1.3.2 באמצעות השיטה המועדפת (למשל, שיטה מבוססת חרוזים או עמודה), בהתאם להוראות היצרן.
    4. למדוד את ריכוז הדנ"א ואת טוהר A260/280) על ידי ספקטרופוטומטריה.
  4. בקרת איכות של מצעי הכתב
    1. אלקטרופורזה 200 ננוגרם של מצע הכתב לצד סולם DNA במשקל מולקולרי גבוה בג'ל agarose-TAE של 0.7% (w/v) המכיל כתם dsDNA פלואורסצנטי במתח של 120 וולט למשך שעתיים או עד לפענוח מספיק של הפסים. טען את פלסמיד הכתב המקורי שלא נחתך לצד כבקרה.
    2. ודא שהרצועות המוגדרות בגודל הנכון נצפות עבור כל מצע דיווח (עיין בטבלה 1 ובאיור 2F-J).

figure-protocol-2
איור 2: ניתוחים אלקטרופורטיים בג'ל של יצירת מצע כתב DSBR. (א-ג) תמונות מייצגות מניתוח אלקטרופורטי ג'ל של מתווכים ומבנה סופי הנדרש ליצירת מצע כתב MMEJ בלתי תלוי בכריתה. התמונות הסמוכות בחלוניות (A) ו-(C) הן מאותם ג'לים; נתיבים לא רלוונטיים הושמטו. (ד,ה) תמונות מייצגות מניתוח אלקטרופורטי בג'ל עבור פלסמיד מקור, מוצרים מעוכלים באמצעות EcoRV, ומבנה סופי המופק מג'ל הדרושים ליצירת מצע כתב NHEJ קהה. (פ-י) תמונות מייצגות מניתוח אלקטרופורטי בג'ל של פלסמידים מקור ומבני DSBR ליניאריים עבור מצעי כתב I-SceI-digested: MMEJ תלוי כריתה, NHEJ לא קהה, HR תבנית ארוכה, תבנית קצרה HR, SSA. קיצורים: DSBR = תיקון שבר גדיל כפול; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; HR = רקומבינציה הומולוגית; SSA = חישול גדיל יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. טרנספקציה חולפת של מצעי כתב DSBR

הערה: סקירה כללית של זרימת העבודה הניסיונית של בדיקות וכמה תמורות פוטנציאליות מתוארות באיור 3. הפרוטוקול שלהלן מתאר ניסוי באמצעות תאי HEK-293, כאשר אלה מועתקים לאחור עם מצע הכתב. ניתן להגדיל או להקטין את המספרים להלן בהתאם למספר הבארות שישמשו בכל צלחת. השלבים הבאים מחושבים עבור בדיקה המבוצעת בלוח אחד של 96 בארות; ראו דיון לשיקולים נוספים.

figure-protocol-3
איור 3: זרימת עבודה ניסיונית עבור מבחני כתב DSBR. תאים מעניינים נגועים במצע DSBR ליניארי (קידוד עבור NanoLuc ORF שצריך להיות מתוקן באמצעות אירוע תיקון DNA ספציפי) ופלסמיד Firefly (בקרת טרנספקציה). לאחר מכן, 6-24 שעות לאחר הטרנספקציה, ניתן לקרוא את לומינסנציה Firefly ואת לומינסנציה NanoLuc ברצף בעקבות הוספת ריאגנטים Nano-Glo Dual-Luciferase. ניתן להשתמש בתמורות לדוגמה לשלבי הליבה (המוצגות בתוך קופסאות בצבע תכלת) כדי לבדוק כיצד אפנון גנטי (נוקאאוט, הפלה או ביטוי יתר) או טיפול תרופתי משפיע על מיומנות מסלול DSBR בתאים. קיצורים: DSBR = תיקון שבר גדיל כפול; NanoLuc = Nanoluciferase; WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. (אופציונלי) אם מעריכים את ההשפעה של תרכובות על מבחן המדווח, יש לפזר תרכובות המומסות ברכב (למשל, דימתיל סולפוקסיד [DMSO]) לתוך בארות של צלחת 96 בארות על פי מערך ניסוי מוגדר מראש. נרמל את ריכוז כלי הרכב בכל הבארות.
    הערה: מומלץ לבצע שכפולים טכניים. כלול בארות בקרה (למשל, לרכב בלבד).
  2. בצינור של 1.5 מ"ל, פלסמיד בקרת Firefly מדולל (בקרת luciferase) ומצע כתב NanoLuc DSBR (reporter luciferase) שנוצר בשלבים 1.1, 1.2 או 1.3, ב-500 μL של מאגר טרנספקציה. השתמש 0.66 מיקרוגרם של פלסמיד לוציפראז בקרה לכל 1 × 106 תאים. ראה טבלה 3 עבור כמויות מצע הכתב NanoLuc DSBR לשימוש.
    הערה: ניתן להשתמש בפלסמיד בקרה חיובי המבטא באופן מכונן את לוציפראז המדווח כדי לאמת את הגדרת המכשיר ואת תנאי הטרנספקציה או כדי לבדוק השפעות לא ספציפיות על לוציפראז המדווח עצמו. כנקודת התחלה, אנו ממליצים על 0.1 מיקרוגרם של פלסמיד לוציפראז כתב ו 0.66 מיקרוגרם של פלסמיד לוציפראז בקרה לכל 1 × 106 תאים.
  3. הוסף מגיב טרנספקציה מבוסס שומנים לדנ"א המדולל משלב 2.2 ביחס המומלץ על ידי היצרן (למשל, 1:2, מגיב μg DNA:μL עבור מגיב המתואר בטבלת החומרים), ערבב היטב על ידי מערבולות קצרות, ודגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. קצרו תאים על ידי טריפסיניזציה, השעו אותם מחדש בתווך טרי המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), וספרו אותם.
  5. העבר 3 × 106 תאים לתוך צינור 15 מ"ל ו resuspend ב 8.5 מ"ל של בינוני.
  6. הוסף את תערובת הטרנספקציה של ה- DNA משלב 2.3 לתרחיף התא וערבב מספר פעמים בהיפוך.
  7. צלחת 80 μL של תרחיף תאים (כ 2.7 × 104 תאים) לכל באר.
    הערה: ניתן לחלק את המתלה המכיל תאים ותערובת טרנספקציה של DNA על הצלחת על ידי צנרת ידנית או באמצעות מטפל אוטומטי בנוזלים לניסויים בעלי תפוקה גבוהה יותר.
  8. יש לדגור ב-37°C/5% CO2 למשך 24 שעות.

3. זיהוי של luminescence

  1. הכנת ריאגנטים
    1. עקוב אחר הוראות היצרן להכנה והוספה של ריאגנטים לוציפראז כתב (NanoLuc) ובקרה (Firefly), המספקים את המצע עבור שני luciferases (Furimazine ו- 5'-Fluoroluciferin, בהתאמה):
    2. הכן מגיב לוציפראז שליטה. ליצור מחדש על פי הוראות היצרן ולערבב על ידי היפוך עד מצע luciferase מומס היטב.
    3. הכן מגיב עיתונאי לוציפראז טרי על פי הוראות היצרן. חשב את כמות המגיב הדרושה כדי להוסיף 80 μL / באר ולהוסיף מצע לנפח מתאים של מאגר הבדיקה ביחס של 1:100 (מצע luciferase:buffer). עבור צלחת אחת של 96 בארות, לדלל 88 μL של מצע luciferase לתוך 8,800 μL של חיץ ולערבב על ידי היפוך.
      הערה: כמויות אלה כוללות עודף של כ-10%. לאחר שחזור מחדש, מגיב לוציפראז הבקרה ניתן לאחסן על פי הוראות היצרן לשימוש עתידי. מגיב הכתב luciferase חייב להיות מוכן טרי לכל שימוש.
  2. זיהוי סדרתי של לומינסנציה מבקרת וכתב luciferases (צלחת 96-well)
    1. אפשר צלחת ריאגנטים luciferase להגיע לטמפרטורת החדר.
    2. הוסף 80 μL של מגיב לוציפראז שליטה לכל באר.
    3. נערו את הצלחת במשך 3 דקות על שייקר מסלול ב-450 סל"ד.
    4. מדוד את אות ההארה של לוציפראז הבקרה באמצעות קורא לוחות הארה.
      הערה: יש לקרוא את הפליטה ב-580 ננומטר (מסנן פס פס של 80 ננומטר) או את עוצמת האור הכוללת לכל באר. לומינסנציה זו משמשת כמדד ליעילות הטרנספקציה וצפיפות התא ויכולה גם ליידע על רעילות התא הנגרמת על ידי טיפולי הבדיקה.
    5. הוסף 80 μL של מגיב luciferase כתב לכל באר.
      הערה: מגיב זה יעכב את לוציפראז הבקרה; הוא מכיל גם את המצע עבור הכתב Luciferase.
    6. נערו את הצלחת במשך 3 דקות על שייקר מסלול ב-450 סל"ד.
    7. השאירו את הצלחת לנוח במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. מדוד את אות ההארה של הכתב luciferase באמצעות קורא לוחות הארה.
      הערה: קריאת פליטה ב-470 ננומטר (מסנן פס פס של 80 ננומטר) או, לחילופין, עוצמת אור כוללת לכל באר. זוהר זה נותן מידע על כמות מצע הכתב שתוקן על ידי מסלול העניין של DSBR.
    9. יצא קריאות זוהר לניתוח במורד הזרם.

4. ניתוח נתונים

  1. חלק את אות ההארה של הכתב luciferase (NanoLuc) על ידי אות ההארה של הבקרה luciferase (Firefly) שמקורו באותה באר כדי לחשב את אות המבחן. החל חישוב זה על כל הבארות כפי שמוצג במשוואה (1).
    figure-protocol-4(1)
  2. חשב את הממוצע של אותות הבדיקה עבור בארות הבקרה (למשל, רכב בלבד).
  3. נרמל את אותות הבדיקה עבור בארות בדיקה לממוצע באר הבקרה באמצעות משוואה (2) כדי לחשב תיקון (%) לכל באר.
    figure-protocol-5 (2)
  4. (אופציונלי, התאמת קימור) אם אתם בודקים מינונים מורכבים מרובים, התוו את התיקון המחושב (%) כנגד ריכוז התרכובת והתאימו עקומת מנה-תגובה באמצעות מודל רגרסיה לא ליניארית. השתמש בעקומה זו לאינטרפולציה עוקבת של EC50 .

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיקון של כל אחד ממבחני הכתב ניתן לאתר ולכמת באמצעות אותו הליך. תיקון נכון של מצע על ידי מסלול התיקון הקוגנטי שלו בתאים יהווה מחדש ORF שלם ופונקציונלי המקודד NanoLuc. ניתן לזהות אות זוהר זה באמצעות קורא לוחות.

co-transfection עם פלסמיד שלם קידוד Firefly luciferase משמש בקרת transfection. בקרה זו משרתת שתי מטרות. ראשית, הוא מספק תקן לנרמל את אות NanoLuc, כפי שהוא צריך להיות מופרע על ידי אפנון של DSBR באמצעים גנטיים או פרמקולוגיים. שנית, הוא יכול לספק אינדיקציה להפרעות תאיות מחוץ למטרה המשפיעות על אות הלוציפראז, כגון אפנון מחזור התא, השפעות על שעתוק / תרגום, או רעילות כללית.

היחס בין NanoLuc ל-Firefly משמש כתחליף לתיקון. ניתן לייצא ולנתח ערכי Luminescence על ידי נרמול שני אותות לוציפראז מתוך אותה באר. במקרה של מחקרי הפרעה גנטית (למשל, השוואת סוג פראי ו- KO או non-targeting ו- siRNA מטרה), התיקון בדרך כלל מנורמל לדגימת ההורים (תאים מסוג בר או תאים שטופלו ב- siRNA בקרה שאינו ממוקד). במקרה של אפנון פרמקולוגי, ערכים ממדגם שטופל בתרכובת מנורמלים לערך המיוצר על ידי טיפול ברכב.

אימות מלא של חבילת הכתבים המתוארת פורסם לאחרונה7. נתונים המדגימים אפיון אפנון גנטי ופרמקולוגי של DSBR מוצגים באיור 4 (מותאם מ-7). Polθ הוא המתווך העיקרי של MMEJ ואובדן או עיכוב של אנזים זה צפוי לעבד באופן ספציפי MMEJתאי 3,10. באמצעות קו תאים שבו POLQ, הגן המקודד Polθ, הושמד11, בדיקת כתב MMEJ שאינה תלויה בכריתה מראה כי MMEJ אכן מדוכא כמעט לחלוטין. הערכה של אותות ההארה של הרכיב NanoLuc ו-Firefly מראה שפגם התיקון שנצפה מונע על-ידי הפחתה באות ה-NanoLuc (המקודד על-ידי מצע הכתב) בעוד שאות ה-Firefly (בקרה) אינו מוטרד (איור 4A-C). לעומת זאת, הערכת מיומנות NHEJ באמצעות כתב NHEJ בקצה הבוטה מראה כי נוקאאוט POLQ אינו מעכב את תיקון מצע הכתב (איור 4D-F). יחד, נתונים גנטיים אלה תומכים בתפקיד הספציפי של Polθ בתיקון בתיווך MMEJ. התצפיות האלה משוחזרות באופן פרמקולוגי מלא עם ART55812,13, מעכב חזק מאוד וספציפי שדווח לאחרונה של תחום הפולימראז של Polθ (איור 4G), שבו נצפה עיכוב טיטראטיבי של MMEJ, אשר נובע מירידה ספציפית בננולוק ולא באות הגחלילית (איור 4H). יתר על כן, ובהסכמה עם נתונים גנטיים, אין השפעה על NHEJ (איור 4I,J). יחד, נתונים אלה מדגישים כיצד ניתן להשתמש בכתבים אלה כדי לאפיין את המודולציה הגנטית של מסלולי DSBR ולהראות עוצמה תאית וספציפיות מטרה/מסלול של מולקולות קטנות.

figure-results-1
איור 4: השפעות של נוקאאוט גנטי ועיכוב פרמקולוגי של Polθ על אותות כתב MMEJ ו-NHEJ. תאי eHAP1 WT ו-POLQ(-) הודבקו בפלסמיד בקרת Firefly ועם (A-C) כתב MMEJ שאינו תלוי בכריתה או (D-F) כתב NHEJ קהה. אחוז תיקון MMEJ או NHEJ הוא היחס בין לומינסנציה של NanoLuc על פני לומינסנציה של Firefly, מנורמל לבקרה שטופלה ב- DMSO, 24 שעות לאחר הטרנספקציה. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של שלושה משכפלים ביולוגיים, כל אחד בממוצע 8 משכפלים טכניים. תאי HEK-293 הודבקו בפלסמיד בקרת Firefly ו-(G,H) בכתב MMEJ שאינו תלוי בכריתה או בכתב NHEJ בקצה הקהה (I,J) וטופלו במעכב Polθ polymerase ART558. אחוז התיקון הוא היחס בין לומינסנציה של NanoLuc על פני לומינסנציה של Firefly, מנורמל לבקרה שטופלה ב- DMSO, 24 שעות לאחר הטרנספקציה. אחוז עיכוב של אותות ההארה הבודדים ב-(G) ו-(I) חושב ביחס לבקרה שטופלה ב-DMSO והוצג בהתאמה ב-(H) וב-(J). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של 2 משכפלים ביולוגיים, כל אחד בממוצע 4 משכפלים טכניים. נתון זה נלקח מ Rajendra et al.7. קיצורים: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 5: עיכוב אות כתב HR על-ידי מעכב RAD51 CAM833. (A) תאי HEK-293 הודבקו במצע כתב HR בתבנית ארוכה, פלסמיד בקרת Firefly luciferase, וטופלו במעכב RAD51 CAM83314. NanoLuc ו- Firefly luminescence נקראו 16 שעות לאחר הטרנספקציה. אחוז תיקון HR הוא היחס בין זוהר NanoLuc על פני לומינסנציה של Firefly, מנורמל לבקרה שטופלה ב- DMSO. קווים מקווקווים מדגישים אחוז עיכוב HR וריכוז CAM833 בעקומה EC50. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של 2 משכפלים ביולוגיים, כל אחד בממוצע 4 משכפלים טכניים. (B) אחוז עיכוב של אותות ההארה הבודדים ב-(A) חושב ביחס לבקרות שטופלו ב-DMSO. קווים מקווקווים מדגישים את אחוז עיכוב NanoLuc ו-Firefly ב-3.33 מיקרומטר CAM833 (EC50). הירידה באות הגחלילית בריכוזי CAM833 ≥-10 מיקרומטר מעידה על רעילות תרכובות במינונים גבוהים; עם זאת, הפחתת אות NanoLuc נצפית בריכוזים שבהם אות Firefly אינו מושפע, דבר המצביע על כך ש- CAM833 גורם לעיכוב HR על המטרה. נתון זה נלקח מ Rajendra et al.7. קיצורים: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = רקומבינציה הומולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מצע כתבפלסמיד מקור
(גודל ב- KB, התנגדות)		דור DSBגודל צפוי של מצע הכתב הסופי (kb)
MMEJ שאינו תלוי בכריתה4.0, קאןכריתת זנבות 3 אינץ' באמצעות קשירת כובעים1.6
MMEJ תלוי כריתה6.5, כאןI-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)6.5
NHEJ בוטה4.3, כאןקהה מסתיים בכריתה מפלסמיד על ידי EcoRV1.7
NHEJ לא בוטה6.7, כאןI-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)6.5
תבנית ארוכה HR9.2, כאןI-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)9.2
תבנית קצרה HR9.3, אמפרI-SceI (מגובש)9.3
SSA9.5, כאןI-SceI (לא מגובש), HindIII (מלוכד)9.5

טבלה 1: פלסמידים של מצע כתב. קיצורים: DSB = שבר גדיל כפול; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; HR = רקומבינציה הומולוגית; SSA = חישול גדיל יחיד; קאן = קנמיצין; אמפר = אמפיצילין.

רצף (5'-3')הספקטיהורפונקציה
5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT
GTAGCCGGCTGTGTCGCCAGTCC
CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT		סיגמאדףכובע שמאלי, אוליגונוקלאוטיד ארוך
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCסיגמאדףכובע שמאלי, אוליגונוקלאוטיד קצר
5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA
CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG
GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC
GGTGTGTTGGTAAAGCCACCATGG		סיגמאדףכובע ימני, אוליגונוקלאוטיד ארוך
5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA
GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA		סיגמאדףכובע ימני, אוליגונוקלאוטיד קצר

טבלה 2: אוליגונוקלאוטידים למכסות ליצירת מצע כתב MMEJ בלתי תלוי בכריתה. קיצורים: ssDNA = DNA חד-גדילי; dsDNA = DNA דו-גדילי; MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; PAGE = אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד. מיקרוהומולוגיות מסומנות בקו תחתון.

בדיקת כתבכתב NanoLuc מצע DNA (מיקרוגרם DNA/1x106 תאים)פלסמיד לוציפראז בקרת גחליליות (מיקרוגרם DNA/1x106 תאים)
MMEJ שאינו תלוי בכריתה0.50.66
MMEJ תלוי כריתה10.66
NHEJ בוטה0.50.66
NHEJ לא בוטה0.50.66
תבנית ארוכה HR10.66
תבנית קצרה HR20.66
SSA10.66

טבלה 3: כמויות DNA עבור טרנספקציה חולפת של מצעי כתב NanoLuc ופלסמיד לוציפראז בקרת Firefly (HEK-293, פורמט צלחת 96 באר). קיצורים: MMEJ = חיבור קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה; NHEJ = צירוף קצה לא הומולוגי; HR = רקומבינציה הומולוגית; SSA = חישול גדיל יחיד.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, תיארנו פרוטוקולים ליצירה ויישום של חבילה של כתבים מבוססי לומינסנציה חוץ-כרומוזומלית למדידת המיומנות התאית של ארבעת מסלולי DSBR העיקריים (HR, NHEJ, MMEJ ו-SSA)7. ניתן להחדיר מצעי כתב לתאים על ידי טרנספקציה חולפת ולהשתמש בהם כדי להעריך את פעילות DSBR באמצעות קריאה רגישה וחזקה מבוססת לוחות של זוהר NanoLuc, אשר משוחזרת עם מעורבות עם מסלולי DSBR תאיים קוגניטיביים.

מספר שלבים של יצירת מצע כתב, טרנספקציה של המצע לתאים ופירוש נתונים הם קריטיים לביצוע מוצלח של בדיקות אלה. למרות שטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות משמשות ליצירת מצעי הכתב, הדמיה של התהליך על ידי אלקטרופורזה בג'ל מבטיחה את האיכות והטוהר הגבוהים ביותר של המצעים לפני ההעברה. מכיוון שבדיקות אלה מסתמכות על טרנספקציה חולפת, חלים שיקולים משותפים לשיטות אלה. אלה כוללים אופטימיזציה של צפיפות הזריעה, תנאי טרנספקציה (כולל ריאגנטים וכמויות DNA), והערכת התאמה בפורמטים של טרנספקציה קדימה ואחורה. בדיקות כתבים אלה בוצעו בהצלחה עם מגוון פרוטוקולים של אלקטרופורציה וליפופקציה, ויש לבחון אפשרויות במלואן לפני ביצוע בדיקות אלה. כמו כן, יש להקפיד לבדוק את הרכיבים NanoLuc ואותות Firefly ולא רק את אות התיקון המרוכב הנגזר על ידי נרמול אות NanoLuc (מצע כתב) לאות Firefly (בקרה). ממצאים יכולים לנבוע מהיחס המונע על ידי שינויים באות הגחלילית. לדוגמה, הערכת עיכוב במצב מנה-תגובה באמצעות תרכובת ספציפית מאוד אמורה לדכא את אות ה-NanoLuc באופן טיטרטיבי מבלי להפריע לאות הגחלילית, שאמור להישאר יציב (איור 4G,H). אולם במקרים שבהם אותות הגחלילית מוטרדים, עדיין ניתן לקבוע השפעות שימושיות על התיקון על-ידי זיהוי חלון מינון שבו אות הגחלילית אינו מושפע (איור 5).

בהשוואה למבחני כתב DSBR הנפוצים ביותר, למבחני כתב חוץ-כרומוזומליים אלה המבוססים על לומינסנציה יש כמה יתרונות ברורים. מכיוון שמסלולי DSBR נשמרים מאוד, גם אם המנגנון התאי משתנה בין מודלים תאיים, הבדיקות עדיין יכולות לדווח על מיומנות DSBR ובחירת מסלולים. זה פותח את ההערכה של DSBR לכל מודל של עניין למשתמש, כל עוד תנאי transfection ארעיים אופטימליים נקבעים מראש.

השימוש בננולוציפראז כגן המדווח מציע גם יתרונות על פני אפשרויות פלואורסצנטיות, אשר שימשו באופן מסורתי במבחני כתב DSBR. NanoLuc מתבגר במהירות וזוהה ברגישות גבוהה באמצעות קורא לוחות8. יחד עם מהירות תיקון המצע (כאשר מצעי הכתב מועתקים לתאים עם קצוות DSB מוכנים לתיקון), פורמט זה של בדיקת כתב DSBR אידיאלי עבור התפנית המהירה והחוסן הכמותי הדרושים לסינון מולקולות קטנות כחלק ממפל גילוי תרופות תעשייתי. ואכן, לאחרונה תיארנו את יישום בדיקת כתב MMEJ הבלתי תלויה בכריתה במפל הגילוי המשמש לזיהוי מעכבי מולקולות קטנות בתחום Polθ polymerase13.

קיימת גם גמישות ביישום מבחני הכתב כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי הפרעות גנטיות ופרמקולוגיות של DSBR (איור 3). לדוגמה, לפני הטרנספקציה של מצעי הכתב, תאים יכולים להיות נגועים ב- siRNA כנגד גן מעניין למשך 48-72 שעות. לחלופין, ניתן לבדוק את ההשפעות של ביטוי יתר של גנים על מסלולי DSBR על ידי ביצוע טרנספקציית פלסמיד 24-48 שעות לפני הטרנספקציה של מצעים מדווחים. עבור מחקרים פרמקולוגיים, הפרוטוקול הנוכחי כבר מתאר כיצד ניתן לשלב את השימוש במולקולות קטנות בתהליך העבודה הסטנדרטי, אך פורמטים חלופיים עשויים לכלול שינויים במשטרי טיפול מורכבים, כגון טרום דגירות או שטיפות.

המדרגיות של טרנספקציה חולפת יכולה גם לתמוך בגישות סינון בקנה מידה גדול שבהן טרנספקציה אצווה של מצעי כתב מבוצעת לפני הסינון. יתר על כן, משך הבדיקה מטרנספקציה לקריאה יכול גם להיות מגוון. למרות משכי זמן סטנדרטיים עשויים להיות 16-24 שעות, כמה בדיקות ניתן לקרוא רק 6 שעות7. חששות לגבי רעילות ממולקולות קטנות או siRNA שיכולים לפגוע בכדאיות התא צריכים להילקח בחשבון גם בקביעת משך הבדיקה.

לסיכום, הבדיקות המתוארות במחקר זה ומתוארות במלואן בפרסום7 שפורסם לאחרונה מספקות הערכה מהירה וחזקה של מיומנות DSBR תאית. הם רגישים מאוד וניתנים לטיטרציה, מה שהופך אותם למקובלים על מחקרים גנטיים ופרמקולוגיים כאחד. באופן מכריע, מכיוון שניתן להכניס את מצעי הכתב לתאים על ידי טרנספקציה חולפת, יש להם פוטנציאל להיות מנוצלים בכל מודל תא טרנספקטיבי של עניין, במקום להיות מוגבלים לקווי תאים ספציפיים על ידי אינטגרציה יציבה כמו במקרה של כתבי DSBR כרומוזומליים. עם זאת, מגבלה ברורה של בדיקות חוץ-כרומוזומליות אלה היא שחוסר האינטגרציה בגנום עשוי שלא לשחזר באופן מלא את ההקשר הפיזיולוגי, הכרומטיני, של תיקון הדנ"א ואת רמזי הבקרה והתזמור הקשורים אליו15. לשם כך, מבחני כתב חוץ-כרומוזומליים משלימים את השיטות הקיימות להערכת DSBR ומרחיבים את ארגז הכלים של המשאבים המתאימים הן למחקר בסיסי והן לגילוי תרופות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S ו-H.M.R.R. הם כולם עובדים ובעלי מניות של Artios Pharma Ltd. G.C.M.S היא בעלת מניות של AstraZeneca PLC. S.J.B. היא מדענית מייסדת ובעלת מניות של Artios Pharma Ltd. פטנט הוגש על חלק מהכתבים המתוארים במחקר זה (WO 2021/001647). Promega הוא המקור של טכנולוגיית NanoLuc® ואת polynucleotides NanoLuc® שונה. Artios Pharma אושרה על ידי Promega לייצר את הפולינוקלאוטידים NanoLuc® מותאמים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל העבודה מומנה על-ידי Artios Pharma Ltd. איור 1 ואיור 3 נוצרו עם Biorender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x TBE bufferThermo FisherAM9863
20% TBE-אקרילאמיד ג'לInvitrogenEC6315BOX
50x מאגר TAEFisher ScientificBP13321
6x צבע טעינת ג'ל, סגולNEBB7024S
96 בארות צלחת לבנה (עם תחתית ומכסה שקופים)Porvair204012
AgaroseCleaver ScientificCSL-AG500
AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63881לטיהור מבוסס חרוזים של DNA
פוספטאז אנטארקטי ומאגר 10XNEBM0289L
CLARIOstarBMG Labtech430-101קורא צלחות
Countess II מונה תאים אוטומטיThermo FisherAMQAX1000מונה תאים
אוליגונוקלאוטידים מותאמים אישיתסיגמא-אולדריץ'הזמנה מותאמת אישיתלמצע MMEJ שאינו תלוי בכריתה. ראה טבלה 2.
D300eTecan30100152מתקן תרכובות מבוסס DMSO
D300e D4+ קלטתTecan30097371קלטת בנפח גבוה למתקן תרכובות D300e D300e
T8+ קלטתTecan30097370קלטת בנפח נמוך למתקן תרכובות D300e
דימתיל סולפוקסיד, רכבSigma-AldrichD2650-100MLתאים לתרכובות, בשימוש באיור 4 ואיור 5
מקור כתב DSBR פלסמידיםArtiosזמין לקהילה האקדמית על פי בקשה 
EcoRV-HF ו-10x CutSmart bufferNEBR3195M
אתנול מוחלטVWR20821.365
סרום בקר עובריPAN-BiotechP30-3031 
GeneRuler סולם DNA בטווח נמוך במיוחדThermo FisherSM1211סולם DNA במשקל מולקולרי נמוך
תאי HEK-293 ATCCCRL-1573קו תאים לדוגמה המשמש בפרוטוקול
HindIII-HF ו-10x CutSmart bufferNEBR3104M
HyClone ביולוגיה מולקולרית כיתה מיםפישר Scientific10275262
I-SceI ו-10x Tango BufferInvitrogenER1771
איזופרופנולVWR20842.33
מגיב ומאגר JetPRIMEPolyPlus114-15מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים
MegaStar 1.6VWR521-1749צנטריפוגה לצינורות 15 או 50 מ"ל
MEM EaglePAN-BiotechP04-08056מדיום תרבית לתאי HEK-293
Microplate שייקרפישרברנד15504070שייקר מסלולי מיקרופלייט
MicroStar 17RVWR521-1647צנטריפוגה לצינורות 1.5 או 2 מ"ל
MultiDropThermo Fisher5840300תא או מתקן ריאגנט על בסיס מים
MultiDrop קלטת סטנדרטיתתרמו פישר24072670קלטת למתקן ריאגנטים MultiDrop
NanoDLR Stop & מגיב Glo Buffer ו-SubstratePromegaN1630 או N1650Reporter luciferase (NanoLuc) כדי להרוות את זוהר הגחלילית ולזהות זוהר NanoLuc. חלק מערכת הבדיקה של Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter
System ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and SubstratePromegaN1630 או N1650Control luciferase (Firefly) Assay Reagent לזיהוי Firefly. חלק מערכת הבדיקה של Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay
System PBS (ללא סידן או מגנזיום)PAN-BiotechP04-36500
pGL4 Firefly פלסמיד (או דומה)PromegaE1310 (או שווה ערך)פלסמיד בקרת Firefly
pNL1.1 NanoLuc פלסמיד (או דומה)PromegaN1091 (או שווה ערך)פלסמיד בקרת NanoLuc, להתאמת הגדרות ציוד/ניסויי אופטימיזציה
ערכת מיצוי ג'ל QIAquickQiagen28706
טעינה מהירה סגול 1 kb סולם DNANEBN0552Sסולם DNA במשקל מולקולרי גבוה
נתרן אצטט (3 מ'), pH 5.5Thermo FisherAM9740להתאמת pH במהלך מיצוי ג'ל עם ערכת מיצוי ג'ל QIAquick
SYBR Gold (10,000x)InvitrogenS11494להדמיה של ssDNA ו-dsDNA
SYBR בטוח (10,000x)InvitrogenS33102להדמיה של dsDNA בלבד
T4 DNA Ligase ו-10x Ligase bufferNEBM0202L
Trypan Blue Stain 0.4%InvitrogenT10282למדידת כדאיות במהלך ספירת תאים
תמיסת Trypsin-EDTA; 0.25% טריפסין ו-0.53 מ"מ EDTASigma-AldrichT4049-100ML
XhoI ומאגר 10x CutSmartNEBR0146M
בדרגת תרבית Assay

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
  4. Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
  5. van de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832(2021).
  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
  7. Rajendra, E., et al. titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
  8. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  9. Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
  10. Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
  11. Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
  12. Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).
  13. Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
  14. Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).
  15. Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNADNAthroughputNanoLuc Luciferase

מאמרים קשורים