הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העברת ננו-חלקיקים של מטען אוליגונוקלאוטיד במודל בעלי חיים רב-צורניים מסוג גליובלסטומה

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66986

⸱

27 בספטמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University, 3Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 5Henry Ford Health, 6Transcode Therapeutics Inc.

במאמר זה

סיכום

מחסום הדם-מוח הוא משוכה משמעותית במתן טיפולים לגליובלסטומה, מחלה שאין לה תרופה. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמת ננו טיפולית של תחמוצת ברזל מונחית תמונה in vivo שיכולה לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר בגידול.

תקציר

גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM) היא הצורה הנפוצה והאגרסיבית ביותר של ממאירות מוחית ראשונית שאין לה תרופה. מחסום הדם-מוח הוא מכשול משמעותי במתן טיפולים לגליובלסטומה. כאן מדווחת פלטפורמת ננו טיפולית מונחית תמונה, מבוססת תחמוצת ברזל, המסוגלת לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר באזור הגידול ולספק את המטען שלו. פלטפורמת ננו 25 ננומטר זו מורכבת מננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מצולבים המצופים דקסטרן המסומנים בצבע פלואורסצנטי Cy5.5 ומכילים אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס כמטען. ליבת תחמוצת הברזל המגנטית מאפשרת מעקב אחר ננו-חלקיקים באמצעות דימות תהודה מגנטית in vivo , בעוד שצבע Cy5.5 מאפשר מעקב באמצעות הדמיה אופטית. דו"ח זה מפרט את ניטור ההצטברות של פלטפורמת ננו-חלקיקים זו (המכונה MN-anti-miR10b) בגידולי גליובלסטומה מושתלים אורתוטופית לאחר הזרקה תוך ורידית. בנוסף, הוא מספק תובנה לגבי אספקת in vivo של אוליגונוקלאוטידים RNA, בעיה שהקשתה על התרגום של טיפולי RNA למרפאה.

מבוא

Glioblastoma multiforme (GBM) הוא הדרגה הגבוהה ביותר של אסטרוציטומה אשר אין כמעט תרופה. כ -15,000 אנשים מאובחנים עם גליובלסטומה מדי שנה, שיש לה הישרדות חציונית עגומה של כ -15 חודשים ושיעור הישרדות של 5 שנים של 5%1. בעשורים האחרונים חל שיפור שולי בפרוגנוזה למרות מאמצים מרובים לקדם אפשרויות טיפוליות. סטנדרט הטיפול הנוכחי בגליובלסטומה כולל כריתה כירורגית מקסימלית, במידת האפשר, ואחריה הקרנות וכימותרפיה2. טמוזולומיד (TMZ), הכימותרפיה המועדפת, הייתה הטיפול האחרון בגליובלסטומה שהתגלה כמראה יעילות קלינית בולטת; עם זאת, לפחות 50% מגידולי GBM מראים עמידותל-TMZ 3. למרות משטר טיפולי קפדני זה, עדיין קיים צורך קליני משמעותי בטיפול משופר בגליובלסטומה.

הפיתוח של טיפולים עבור GBM ומחלות אחרות הקשורות למוח מעוכב באופן משמעותי על ידי האופי הסלקטיבי של מחסום הדם-מוח (BBB). מחסום BBB הוא מחסום פיזיולוגי המורכב מתאי אנדותל, פריציטים וקצות רגליים אסטרוציטים, אשר יוצר את הקרום החדיר למחצה בין מערכת הדם למוח, ומגביל את המעבר החופשי של מולקולות ותאים למוח4. בעוד שהוא מגן בפיזיולוגיה נורמלית וקריטי להומאוסטזיס של המוח, מחסום הדם-מוח מונע מטיפולים רבים להגיע למוח, מה שמסבך את הטיפול בגליובלסטומה. מאמצים לשפר את מתן התרופות לגליובלסטומה הובילו לפיתוח רכבי משלוח מבוססי ננו-חלקיקים, שיפור ממוקד במתן תרופות באולטרסאונד ואספקת תרופות בתיווך קולטן 5,6.

ננו-חלקיקים התגלו כמדיום מבטיח לפיתוח תרופות למספר עצום של מחלות, כולל סרטן. היישום של ננו-חלקיקים למטרות הדמיה וטיפול בגליובלסטומה נוסה באמצעות מבנים שונים של ננו-חלקיקים 7,8. עם התמקדות בהעברת תרופות לגליובלסטומה בשילוב עם הדמיה in vivo של הלידה, הגישה המוצעת משתמשת בננו-חלקיקים מגנטיים (MN) המורכבים מליבת תחמוצת ברזל ומכוסים על ידי דקסטרן ליציבות. התכונות המגנטיות של ננו-חלקיקים אלה מאפשרות את זיהויים באמצעות דימות תהודה מגנטית (MR), בעוד שכימיית הצמידות הפשוטה לציפוי דקסטרן האמין מאפשרת צימוד של מויאטים טיפוליים כגון מולקולות RNA, מוייטי מטרה נוספים, או מויטי הדמיה (כגון צבע אופטי Cy5.5 קרוב לאינפרא אדום)9,10. בנוסף ליכולות ההדמיה, פלטפורמת הננו מסוגלת להאריך את זמן מחצית החיים של טיפולי RNA על ידי הגנה על האוליגונוקלאוטיד מפני נוקלאזות אנדוגניות, ובכך לשפר את האספקה הטיפולית. כאן מוצג היישום של פלטפורמת ננו זו להעברת in vivo של אוליגונוקלאוטידים טיפוליים (המכונים MN-anti-miR10b) לגליובלסטומה, המנוטרת על ידי הדמיה in vivo. בעבר, היכולת של פלטפורמת ננו זו להצטבר הודגמה בתאי GBM במבחנה, מה שגרם לאובדן משמעותי של הכדאיות של תאי הגידול11. לפני ביצוע מחקרי Therapeutic in vivo, יש צורך להדגים in vivo משלוח של פלטפורמת ננו זו לגידולי GBM במודלים של בעלי חיים. כדי להשיג זאת, מודלים אורתוטופיים של GBM בבעלי חיים הופקו, וניהול תוך ורידי של המבנה בוצע ואחריו הדמיה in vivo. להלן הפרוטוקולים של מחקרים אלה המראים הצטברות באזור הגידול שאושרה על ידי הדמיה in vivo ומיקרוסקופ ex vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן (IACUC). נקבות עכברים עירומים אתמיים נרכשו ממעבדות ג'קסון (זן #007850) בגיל 7 שבועות והורשו להתאקלם במשך שבוע לפני ניתוח ההשתלה. עכברים היו בערך 21-25 גרם בזמן השתל. תאי U251 המבטאים לוציפראז גחלילית נוצרו וסופקו על ידי ד"ר אנה דה-קרבליו12.

1. תרבית תאים והכנה להשתלה

  1. תרבית תאי גליובלסטומה אנושיים עם תווית לוציפראז, U251 בתווך הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו המכיל D-גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37°C עם 5% CO2.
  2. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%, טריפסינזה עם 0.25% טריפסין/EDTA למשך 1-2 דקות ב-37°C. השתמש ב- 2-4 מ"ל עבור צלוחיות T-75, או 4-6 מ"ל עבור צלוחיות T-175.
  3. לאחר שהתאים התנתקו מהצלוחית, הרוו את התגובה ביחס של 2:1 של תוספת DMEM וערבבו בעדינות על ידי פיפטציה כדי לנתק תאים לתרחיף חד-תאי. מעבירים את התאים לצינור חרוטי ומטילים את התאים בצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות.
  4. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS). ספרו את התאים עם המוציטומטר באמצעות צביעה כחולה טריפאן כדי להוציא תאים מתים ולחשב את המספר הכולל של תאים חיים. גלול את התאים שוב, כפי שתואר לעיל.
  5. השהה מחדש את גלולת התא לריכוז של 1 x 108 תאים/מ"ל ב- PBS ואחסן את תרחיף התא על קרח להשתלה תוך גולגולתית.

2. השתלת גידול אורתוטופי ביד חופשית

הערה: פרוטוקול זה נלקח מ- Irtenkauf et al. (ההליך של ד"ר אנה דה קרבליו; Henry Ford Health Hermelin Brain Tumor Center)12. כל הצעדים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית כדי להבטיח בטיחות הן לנבדקים והן לחוקרים. שיטת ההשתלה ביד חופשית מאפשרת הליך מהיר יותר להשגת דגימות גדולות יותר תוך שמירה על איכות ההשתלה התוך גולגולתית. לחלופין, ניתן להשתמש במכשיר סטריאוטקסי כדי להשתיל את הגידול באותן קואורדינטות המתוארות להלן.

  1. לשקול את העכבר העירום, athymic ולתת פתרון הרדמה של קטמין/xylazine (100 מ"ג / ק"ג / 10 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal עם מזרק 28G. הניחו את העכבר בכלוב התאוששות על גבי כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. ודא את ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה.
  2. יש למרוח משחת עיניים אופתלמית, לתת קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית עם מזרק 28G, ולתת אגרופים מזהים באוזן.
  3. יש לעקר את אתר הניתוח בחלק העליון של הראש עם 70% אתנול ולאחר מכן לשפשף בטאדין ולחזור על הפעולה 3x. לאחר מכן, בצע חתך 5-7 מ"מ עם מספריים כירורגיים קטנים מימין לקו האמצע של הראש ולמשוך את העור עם מלקחיים עדינים כדי לחשוף את הגולגולת ואת קווי התפר של הגולגולת.
  4. לשפשף את הגולגולת עם צמר גפן כדי להסיר את periosteum, המאפשר גישה לעצם. יש למרוח תמיסה של 3% מי חמצן באמצעות צמר גפן חדש לייבוש העצם. בעזרת צמר גפן חדש, נגבו את עודפי מי החמצן וכל קצף שעלול להיווצר. חזור על שלב זה 3x עד שהברגמה נראית על הגולגולת והעצם יבשה מספיק לקידוח. גולגולת יבשה מספיק תהיה בעלת קווי תפר מולבנים לחלוטין ואדמומיות מופחתת מהמראה ההתחלתי.
  5. ביחס לברגמה, יש למדוד -2.5 מ"מ מדיאלי/לטרלי ו-1- מ"מ קדמי/אחורי עם סרגל ולסמן את אתר הקידוח בטוש. יש למדוד שוב לפני הקידוח כדי לוודא שהסימן נמצא במיקום הנכון.
  6. קח מקדח מיקרו-כירורגיה חשמלי (11,000 סל"ד) עם בור מקדח 0.5 מ"מ ועשה בזהירות חור בגולגולת היכן שסומן קודם לכן. יש לספוג כל דם או נוזל שעלול להצטבר באתר הקידוח בעזרת צמר גפן טרי.
  7. הכינו מזרק מיקרוליטר 33 גרם המצויד בשרוול מחט עד אורך מחט חשופה של 3 מ"מ. צייר 5 μL של השעיית תאים 1 x 108 תאים / מ"ל שהוכנה קודם לכן לאחר השעיה קצרה עם פיפטה וודא שאין בועות בתמיסת ההזרקה. נגבו בזהירות את עודפי מתלי התאים שנותרו בחלק החיצוני של המחט ושרוול המחט עם מגבון איזופרופנול 70%.
  8. הכנס את המחט אנכית לאתר המקדחה עד ששרוול המחט יפסיק את החדרת המחט נוספת. בזהירות למשוך את המחט כ 0.5 מ"מ כדי ליצור מקום עבור התאים המוזרקים להצטבר.
  9. הזריקו באיטיות את תרחיף התא למשך דקה. לאחר הזרקת הנפח המלא, החזק את המחט בעומק למשך דקה נוספת כדי להפחית את שטף תמיסת ההזרקה. לאחר מכן, משוך את המחט בזהירות.
  10. בעזרת צמר גפן נקי, נגבו כל נוזל שהצטבר באתר ההזרקה ולאחר מכן מרחו שעוות עצם כדי לאטום את החור.
  11. סוגרים את החתך עם קשר וטרינרי ומניחים לו להתייבש. עם צמר גפן נקי, להחיל לידוקאין מקומי כמו משכך כאבים.
  12. עקוב אחר העכבר עד להתאוששות מלאה ואמבולטורית. מתן קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית במשך יומיים לאחר ההשתלה לטיפול בכאב.

3. סינתזת פלטפורמת ננו-חלקיקים

  1. לסנתז ולהצמיד את הננו-חלקיקים עם Cy5.5 ואוליגונוקלאוטיד (anti-miR10b) כפי שתואר קודם11.

4. ניהול MN-anti-miR10b

הערה: במחקר זה, הזריקות נעשו פעם בשבוע במשך 6 שבועות החל מ-7 ימים לאחר ההשתלה, אך ניתן להשתמש באותו פרוטוקול בתדרי הזרקה שונים.

  1. שקול את העכבר וחשב את נפח MN-anti-miR10b לנהל לעכבר. מינונים של MN-anti-miR10b ניתנים ב 20 מ"ג Fe / kg במודלים GBM murine. לדוגמה, עכבר של 20 גרם מקבל מינון של 80 μL של 5 מ"ג Fe/mL MN-anti-miR10b. עכברי ביקורת מקבלים נפח שווה של PBS בהתאם לסכמת מינון זו.
  2. הכינו מזרק 28G עם המינון של MN-anti-miR10b וודאו שאין בועות בתמיסת ההזרקה.
  3. יש להרדים את העכבר מתחת ל-2%-4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1.5%-2% לתחזוקה עם קצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה בקופסת אינדוקציה. העבר את העכבר לקונוס אף והמשך בהרדמה. בדקו את עומק ההרדמה ומרחו משחה וטרינרית.
  4. יש לעקר את הזנב עם מגבון איזופרופנול 70% ולאפשר לעודף אלכוהול להתייבש.
  5. סובב את הזנב כדי למקם את הוורידים הקאודליים הרוחביים לחלק העליון של הזנב. לאחר מכן, מכוון לווריד, הכנס את המחט לזנב וצור ואקום על ידי משיכת הבוכנה לאחור.
  6. הכנס את המחט עד שהדם נכנס למזרק, המציין כניסה מוצלחת לווריד.
  7. הזריקו באיטיות MN-anti-miR10b ומשכו את המחט לאחר הלידה המלאה. החל לחץ על אתר ההזרקה עם גזה עד הדימום מפסיק.
  8. הסר את העכבר מחרוט האף. עקוב אחר העכבר עד להתאוששות מלאה ואמבולטורית.
    הערה: מתן בולוס של ננו-חלקיקים עלול לגרום למצוקה נשימתית. בזהירות לפקח על העכבר ומיד להחיל לחיצות חזה קל אם יש סימנים של מצוקה נשימתית.

5. ביולומינסנציה In vivo והדמיית פלואורסצנטיות

הערה: ביולומינסנציה In vivo והדמיה פלואורסצנטית מבוצעות במערכת ההדמיה In Vivo (IVIS) לפני ו-24 שעות אחרי הזרקת הננו-חלקיק.

  1. הכינו D-לוציפרין מסונן סטרילי בריכוז של 30 מ"ג/מ"ל ב-PBS ללא Mg2+ ו-Ca2+.
  2. פתח את תוכנת הפעולה IVIS והתחל באתחול כדי להכין את המכונה. במהלך אתחול המערכת, בחרו תיקייה לשמירת תמונות באמצעות בחירה באפשרות 'רכישה' >'שמירה אוטומטית ל ' והגדירו את התיקייה לשמירת הקבצים.
  3. בנקודות זמן הדמיה, לשקול את העכבר ולחשב את נפח D-luciferin לתת עבור מינון של 150 מ"ג / ק"ג. הכינו מזרק 28G עם הנפח, המגן על התמיסה מפני אור ישיר. מחקר זה כלל הדמיה יומיים לאחר ניתוח ההשתלה כדי לאשר את הזריעה, וההדמיה השבועית החלה ביום השביעי לאחר ההשתלה מיד לפני הטיפולים השבועיים.
  4. מרדימים את העכבר מתחת ל-2%-4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1.5%-2% לתחזוקה עם קצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה בתא אינדוקציה. לאחר הרדמה, בעדינות לשפשף את העכבר כדי למנוע פגיעה נוספת באתר הניתוח להזריק את המינון של D-luciferin intraperitoneally. אפשר לעכבר להתאושש והמתן 10 דקות לפני ההדמיה כדי לאפשר לאות הביולומינסנציה להתפתח ולהתייצב.
  5. בזמן שהאות הביולומינסנציה מתפתח, הכינו את סורק IVIS להדמיית ביולומינסנציה. הניחו את משטח הפלואורסצנטיות הנמוך השחור על במת ההדמיה והגדירו את מערך חרוטי האף למספר הנושאים שיש לצלם.
  6. בתוכנה, לחץ על אשף ההדמיה. בחר Bioluminescence Imaging ולאחר מכן בחר Open Filter. במסך הבא, בחר נושא הדמיה ושדה ראייה. ה- IVIS מוגדר כעת להדמיית ביולומינסנציה.
  7. 3 דקות לפני ההדמיה, התחל להכין את קופסת האינדוקציה על ידי מתן אפשרות לתערובת איזופלורן/חמצן למלא את הקופסה. 2 דקות לפני ההדמיה, הכניסו עכברים לקופסת האינדוקציה לצורך הרדמה.
  8. לאחר ההרדמה, העבירו את העכברים מקופסת האינדוקציה לאינפוזיה לצורך הדמיה והניחו כל אחד מהם במצב נוטה. לספק הרדמה תחזוקתית באמצעות 2% isoflurane במהלך ההדמיה.
  9. לאחר שהעכברים הוכנסו לסורק IVIS, לחצו על 'רכוש רצף'. צלם תמונה באמצעות הגדרות חשיפה אוטומטית עם סף אות מינימלי של 3,000 ספירות. הדמיה ביולומינסנציה מדמיינת את הלוקליזציה של תאי גליובלסטומה U251 המסומנים בלוציפראז. חשיפה אוטומטית תלכוד תמונה עם אורך חשיפה המחושב בהתבסס על האות הבהיר ביותר בתצוגה עד לאורך המרבי שהוגדר על-ידי המשתמש של 5 דקות.
    הערה: כלוב עכברים טיפוסי דורש תמונה אחת, מכיוון שהזריעה היא בדרך כלל אחידה. במקרים של עכבר בהיר אחד או יותר, ניתן להסיר עכברים, וניתן לבצע רכישה חוזרת כדי ללכוד טוב יותר אותות מעכברים עמומים.
  10. לאחר הדמיית ביולומינסצנציה, שנה את הגדרות IVIS כדי להכין דימות אפי-פלואורסצנטי ולבצע סריקות פלואורסצנטיות.
    1. באשף ההדמיה, בחר Fluorescence > Filtered Pair with Epi-Illumination. במסך הבא, בחר את הבדיקות לצילום, כגון Cy5.5. בחר את נושא ההדמיה ואת שדה הראייה. סורק IVIS מוגדר כעת להדמיית פלואורסצנטיות של הגשושיות שנבחרו במסך הקודם.
  11. צלם תמונה באמצעות הגדרות חשיפה אוטומטית עם סף אות מינימלי של 6,000 ספירות. Cy5.5 הדמיה פלואורסצנטית מדמיינת את הלוקליזציה של MN-anti-miR10b. חשיפה אוטומטית תלכוד תמונה עם אורך חשיפה המחושב בהתבסס על האות הבהיר ביותר בתצוגה עד לאורך המרבי שהוגדר על-ידי המשתמש של 5 דקות.
    הערה: הדמיה פלואורסצנטית נמשכת לעתים רחוקות יותר מדקה אחת של חשיפות, אפילו בעכברי ביקורת שהזריקו PBS. תמונה אחת תמיד מספיקה מכיוון שסטיית האות בין עכברים מטופלים קטנה.
  12. הסר את העכבר מה- IVIS לאחר ההדמיה. יש לעקוב עד להחלמה מלאה מהרדמה ואמבולטורית.

6. הדמיית תהודה מגנטית In vivo

הערה: הדמיית MR מבוצעת לפני ו-24 שעות לאחר הזרקת ננו-חלקיקים וניתן לבצעה באותם בעלי חיים שעוברים הדמיה אופטית וביו-לומינסנציה.

  1. מרדימים את העכבר הנבדק בקופסת אינדוקציה מתחת ל-2%-4% איזופלורן לאינדוקציה ו-1.5%-2% לתחזוקה עם קצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה. לאחר ההרדמה, הניחו את העכבר הנוטה למיטת MRI על גבי בלון ניטור הנשימה. התאימו את חרוט האף בצורה צמודה לחוטם כדי לספק הרדמה במהלך ההדמיה ומרחו משחת עיניים אופתלמית.
  2. יש לשתק ולמקם את הראש לסריקה באמצעות מוט נשיכה ומוטות אוזניים.
  3. התקן את בדיקת הטמפרטורה הרקטלית המשומנת וודא שניטור הנשימה והטמפרטורה מתפקדים. מקם את סליל המוח של העכבר מעל הראש על ידי התאמת היתדות על מיטת העכבר לתוך החורים בסליל והדביק את הסליל למקומו כדי להפחית את התנועה במהלך הסריקה.
  4. הניחו משטח קטן למחזור מים חמים על חלקו העליון של העכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בזמן הרדמה. דאגו לאפשר מרחק מסוים בין הסליל לשמיכת החימום כדי להגביל את עיוות התמונה על ידי הפרעות מים.
  5. הזז את העכבר ואת מיטת ההדמיה למקומם לסריקה.
  6. כוונן והתאם את סלילי ה- MRI על ידי התחלת שלב הגדרת Wobble בתוכנת הרכישה. בסוף השירות של ה- MRI, השתמש בידיות ההתאמה והכוונון שעל הסליל כדי לוודא שהעקבה ממורכזת (מכווננת) ועמוקה ככל האפשר (התאמה).
  7. רכשו סריקת לוקלייזר תלת-מישורית והתאימו את מצע ההדמיה כך שימקם את המוח במרכז האיזו-סנטר של המגנט, במידת הצורך.
  8. רכוש סריקות משוקללות 2D T2 כדי לזהות את הסוכן המוזרק בגידול עם הפרמטרים הבאים: זמן חזרה (TR) = 2500 ms, זמן הד (TE) = 25 ms, שדה הראייה (FOV) 20 x 20 מ"מ, 18 פרוסות העטרה, מרווח פרוסה 0.2 מ"מ, רזולוציה של 150 x 150 מיקרומטר במישור, עובי פרוסה 0.5 מ"מ.
  9. רכוש מפת B0 של המוח כולו כדי לחשב shim מקומי באמצעות כלי השירות Mapshim. לאחר מכן, השתמש בתמונות משוקללות 3D T2 כדי להמחיש את הננו-חלקיקים עם TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 מ"מ, רזולוציה 100 מיקרומטר איזוטרופי.
  10. רכוש מפת T2* להדמיית ננו-חלקיקים נוספת באמצעות התמונה המשוקללת הדו-ממדית T2 כהפניה לסריקת מיקום מעל הגידול. השתמש ב- TR = 800 אלפיות השנייה, TE = 3.5 אלפיות השנייה. FOV 20 x 20 מ"מ, 5 פרוסות קורונליות, ללא רווח פרוסות. רזולוציה במישור 100 מיקרומטר במישור. קבל 10 תמונות הד חיובי עם מרווח זמן הד של 5 אלפיות השנייה.
  11. עקוב אחר הנשימה וטמפרטורת הגוף לאורך רצפי ההדמיה והתאם את טמפרטורת האיזופלורן והמים במידת הצורך.
  12. לאחר ההדמיה, הוציאו את העכבר מסורק ה-MRI והניחו אותו בכלוב התאוששות מחומם. עקוב אחר העכבר עד שהוא מתאושש לחלוטין מהרדמה ואמבולטורי.

7. ביולומינסנציה Ex vivo והדמיית פלואורסצנטיות

  1. בצע הדמיה ביולומינסנציה ופלואורסנציה ex vivo ב- IVIS, בדומה להדמיית in vivo . בצע את אתחול IVIS וסרוק שלבים כמתואר לעיל.
  2. בנקודת הסיום של הניסוי, לשקול את העכבר ולחשב את נפח D-luciferin לתת עבור מינון של 150 מ"ג / ק"ג. להזריק את המינון של D-luciferin ולבצע הדמיה חיה 10 דקות לאחר ההזרקה, כפי שתואר קודם לכן.
  3. לאחר ביולומינסנציה סופית in vivo והדמיה פלואורסצנטית, הרדימו במהירות את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם בעודו תחת הרדמה, נתחו את העכבר ואספו את האיברים העיקריים, כולל המוח, על צלחת פטרי.
  4. מקם את צלחת הפטרי עם איברים שנכרתו בסורק IVIS וצלם את האיברים עם שיטות ביולומינסנציה ופלואורסנציה באמצעות אותן הגדרות רכישה כמו הדמיה in vivo .
  5. הבזק מקפיא את כל האיברים הדרושים לניתוח נוסף ב-OCT על ידי הורדה איטית של הקריומולד עם הדגימה ב-OCT לתוך בריכה רדודה של חנקן נוזלי עם מלקחיים ארוכים עד שה-OCT הופך לבן לחלוטין. אין לאפשר לחנקן נוזלי לגעת בנוזל OCT או להוריד את התבנית מהר מדי, מכיוון שתתרחש בעבוע של ה-OCT. יש לאחסן דגימות קפואות בטמפרטורה של -80°C.
  6. לאחסן את המוח המכיל את הגידול ב OCT ולהקפיא הבזק עבור cryosectioning. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לצורך בניתוח.

8. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. הכינו את הקריוסטט להקפאה. הגדר את טמפרטורת ראש התא והדגימה בין -15 ° C ו -20 ° C.
  2. הוציאו את המוח הקפוא בהבזק ב-OCT מאחסון של -80°C והניחו אותו בתוך תא ההקפאה. אפשר לדגימות להתחמם לטמפרטורת החדר (-20 מעלות צלזיוס) לפני החיתוך.
  3. באמצעות סכין גילוח בעל קצה יחיד חתכו את המוח באופן קורונלי באתר ההזרקה. זה נראה בדרך כלל כמו גומה על פני השטח של המוח. הרכיבו את הדגימה על דיסק הדגימה באמצעות כמות קטנה של OCT כדי למקם את הצד החתוך של המוח שיש לחתך. הפעילו לחץ רב עם המשקל המצונן בתוך התא כדי להבטיח הרכבה יציבה של הדגימה.
  4. העבר את הדגימה המותקנת ואת דיסק הדגימה על ראש הדגימה כהכנה לחתך. חתוך את הרקמה לעומק הרצוי על ידי לקיחת חתכים של 20 מיקרומטר, התאמת זווית הדגימה כדי לחתוך את הרקמה קרוב ככל האפשר לרמה עם הרקמה.
  5. לאחר שהושג עומק הרקמה הרצוי, התאם את הקריוסטט כך שייקח 5 - 7 מקטעים של הדגימה. הרכיבו את המקטעים על שקופיות זכוכית המסומנות מראש עם תיאורים כגון מזהה עכבר, מקטע רקמות ומספר שקופית על-ידי הורדה מהירה של הצד הטעון של שקופית המיקרוסקופ אל המקטע.
  6. הכינו 4% פרפורמלדהיד טרי (PFA). השקיעו את השקופית עם הרקמה בתמיסת PFA למשך 15 דקות כדי לתקן את הרקמה. שטוף את השקופית עם DPBS 3x לאחר הקיבוע.
  7. לחלק הרקמה הקבוע כעת בשקופית הזכוכית, הוסף טיפה של 40 μL של אמצעי הרכבה המכיל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), אשר מכתים גרעיני תאים. הניחו בזהירות כיסוי זכוכית בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ על גבי אמצעי ההרכבה וודאו שהרקמה כולה עטופה באמצעי ההרכבה.
  8. דמיינו את הרקמה באמצעות DAPI (פליטה (em) ב-359 ננומטר, עירור (excitation) ב-457 ננומטר) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

MN-anti-miR10b סונתז ואופיין, כפי שתואר קודם לכן11. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת של MN-anti-miR10b מראה את המורפולוגיה והפיזור הפולי-פיזור של פלטפורמת הננו (איור 1B). לפלטפורמת ננו זו יש גודל ממוצע של 25.12 ± 0.34 ננומטר עם פוטנציאל zeta של 13.18 ± 1.47 mV (איור 1C,D). במחקרים אלה, עכברים אתימיים עירומים הושתלו באופן אורתוטופי עם תאי גליובלסטומה אנושיים U251 בהתאם לפרוטוקול שתואר לעיל. זריקות תוך ורידי סיסט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר שלבים קריטיים בשיטות השונות לאימות הצטברות הננו-חלקיקים על פני BBB יכולים להיות מכריעים להצלחת הפרוטוקול. החל מההשתלה האורתוטופית של תאי GBM, חשוב לוודא כי קווי התפרים של הגולגולת נראים לאחר ייבוש העצם; זה מסייע במיקום מדויק של תאי הגידול. עבור קידוח דרך הגולגולת, עדיף להפעיל לחץ קל על אתר הקידוח ולהתחיל לקדוח כדי לעשות רושם רדוד בעצם. לאחר ביצוע הסימון הראשוני ובמיקום הנכון, קל יותר לקדוח עם החלקה מינימלית של מקדחה. מיד להפסיק לקדוח לאחר פריצת הגולגולת כדי למזער את הנזק למוח. במהלך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ז.מ. וא.מ. הם מייסדים משותפים ובעלי מניות של TransCode Therapeutics Inc. . לשאר המחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המימון למחקר זה ניתן בחלקו על ידי המענק של Henry Ford Health Systems Michigan State University Health Sciences Alliance ל-A.M. ו-A.dC. אנו מודים לד"ר דניאל פרגוסון על הפיקוח על מחקרים בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן סטייט ועל אישור סרטון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברים עירומים אתימיים "J:NU"מעבדת ג'קסוןRRID:IMSR_JAX:007850דגם עכבר מדוכא חיסון
0.25% טריפסיןגיבקו25200-056מגיב תרבית תאים
לצינור מיקרוצנטריפוגה U251 1.7 מ"לDOT ScientificRN1700-GMTלאיסוף רקמות
10 ומיקרו; L, מזרק נוירוס, דגם 1701 RN, מד 33, מזרק פוינט סטייל 4המילטון65460-06להשתלה תוך גולגולתית של תאי גידול
3M Vetbond3M1469SBדבק רקמות לסגירת אתר כירורגי
4% פרפורמלדהיד Thermo ScientificJ199943-K2תמיסת קיבוע רקמות
70% איזופרופואיל אלכוהול מגבוןקרדינלMW-APLמגבון חיטוי מקומי להשתלת גידול והזרקת וריד זנב
Aperio VersaLeicaלסריקת שקופיות חתך רקמות מוכתמות
Betadine Scrub Purdue6761815101חיטוי מקומי להשתלת גידול
BioSpec 70/30Brukerסורק הדמיית תהודה מגנטית
שעוות עצםMedlineDYNJBW25שעוות עצם לאיטום אתר השתלה
קוצים למקדחה מיקרוFST19007-05מקדחה ששימשה ליצירת חור בגולגולת להשתלת גידול
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20אמצעי הרכבה לרקמות המכיל כתם DAPI
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11995-065מדיה לתרבית תאים עבור U251
מלקחיים עדינים במיוחד של GraefeFST11150-10כלי סוגי להשתלת גידול
סרום בקר עובריקורנינג35-010-CVתוסף מדיה לתרבית תאים למספריים
עדינים U251 - שארפ 10.5 ס"מFST14060-10כלי סוגי להשתלת גידול
גלידו (לידוקאין)סוכן673-76משכך כאבים מקומי לאתר כירורגי
מקדחה מיקרו אידיאליתCellPoint Scientific67-1200Aמקדחה המשמשת ליצירת חור בגולגולת להשתלת גידול
מזרק אינסולין 1CC 29G X 1/2"Becton, Dickinson324704מזרק להזרקת D-לוציפרין והזרקת וריד זנב של ננו-חלקיקים
IsofluraneCovetrus11695067772Anethesia
Isoflurane וופורייזרSOMNI ScientificVS6002מכשיר הרדמה
IVIS SpectrumCT In Vivo מערכת הדמיהPerkinElmer/Revvity128201סורק הדמיה ביולומינסנציה ופלואורסצנטי
IVISbrite D-Luciferin אשלגן מלחPerkinElmer/Revvity122799-100MGמצע להדמיית ביולומינסנציה
קטסט (קטמין)Zoetis10004027הרדמה לניתוח השתלת גידול
קטופן (קטופרופן)Zoetis10004031משכך כאבים לניתוח השתלת גידול
Leica CM1950LeicaCM1950לקיפאון של דגימות משובצות OCT
PBSGibco14190-144מגיב תרבית תאים ותמיסת תרחיף תאים להשתלת U251
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122אנטיביוטיקה לאמצעי תרבית תאים
למשחה וטרינרית U251 PuralubeMWI וטרינרית27505משחת עיניים אופטלמית להגנה במהלך השתלת גידול
Ruler FST18000-30משמש למדידת אתר קידוח להטמעה
Tissue-Tek Cryomold  תבנית איסוף ביניים 15 x 15 x 5 מ"מסאקורה4566לאיסוף דגימות רקמות
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתסאקורה4583תרכובת הקפאה לאיסוף דגימות רקמה
U-251 MG קו תאים אנושיMillapore Sigma9063001קו תאי גליובלסטומה אנושי
תמיסת הזרקה קסילזין, 100 מ"ג/מ"לCovetrus1XYL006משותק לניתוח השתלת גידול

מקורות

  1. Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J Clin. 70 (4), 299-312 (2020).
  2. Cihoric, N., et al. Current status and perspectives of interventional clinical trials for glioblastoma - analysis of clinicaltrials.Gov. Radiat Oncol. 12 (1), 1(2017).
  3. Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis. 3 (3), 198-210 (2016).
  4. Dong, X. Current strategies for brain drug delivery. Theranostics. 8 (6), 1481-1493 (2018).
  5. Teleanu, D. M., Chircov, C., Grumezescu, A. M., Volceanov, A., Teleanu, R. I. Blood-brain delivery methods using nanotechnology. Pharmaceutics. 10 (4), 268(2018).
  6. Ohta, S., et al. Investigating the optimum size of nanoparticles for their delivery into the brain assisted by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Sci Rep. 10 (1), 18220(2020).
  7. Teplyuk, N. M., et al. Therapeutic potential of targeting microrna-10b in established intracranial glioblastoma: First steps toward the clinic. EMBO Mol Med. 8 (3), 268-287 (2016).
  8. Dube, T., Kumar, N., Bishnoi, M., Panda, J. J. Dual blood-brain barrier-glioma targeting peptide-poly(levodopamine) hybrid nanoplatforms as potential near infrared phototheranostic agents in glioblastoma. Bioconjug Chem. 32 (9), 2014-2031 (2021).
  9. Yoo, B., et al. Design of nanodrugs for mirna targeting in tumor cells. J Biomed Nanotechnol. 10 (6), 1114-1122 (2014).
  10. Medarova, Z., Pham, W., Farrar, C., Petkova, V., Moore, A. In vivo imaging of sirna delivery and silencing in tumors. Nature Medicine. 13 (3), 372-377 (2007).
  11. Chen, M., et al. Co-administration of temozolomide (tmz) and the experimental therapeutic targeting mir-10b, profoundly affects the tumorigenic phenotype of human glioblastoma cells. Front Mol Biosci. 10, 1179343(2023).
  12. Irtenkauf, S. M., et al. Optimization of glioblastoma mouse orthotopic xenograft models for translational research. Compar Med. 67 (4), 300-300 (2017).
  13. Moore, A., Marecos, E., Bogdanov, A., Weissleder, R. Tumoral distribution of iron oxide nanoparticles in a rodent model. Radiology. 214 (2), 568-574 (2000).
  14. Moore, A., Medarova, Z., Potthast, A., Dai, G. In vivo targeting of underglycosylated muc-1 tumor antigen using a multimodal imaging probe. Cancer Res. 64 (5), 1821-1827 (2004).
  15. Yoo, B., et al. Therapy targeted to the metastatic niche is effective in a model of stage iv breast cancer. Sci Rep. 7, 45060(2017).
  16. Dadfar, S. M., et al. Iron oxide nanoparticles: Diagnostic, therapeutic and theranostic applications. Adv Drug Deliv Rev. 138, 302-325 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מחסום דם-מוחננוחלקיקי תחמוצת ברזלדימות בתהודה מגנטית (MRI)דימות פלואורסצנטיתדימות ביולומינצנציההצטברות בגידול
העברת ננו-חלקיקים של מטען אוליגונוקלאוטיד במודל בעלי חיים רב-צורניים מסוג גליובלסטומה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.