פרוטוקול זה מתאר את ההליך לבידוד רשתית העכבר בהרכבה שלמה וביצוע immunostaining כדי לתייג את כל תאי גנגליון הרשתית (RGCs). התהליך מלווה בהדמיה וספירה אוטומטית של RGCs באמצעות תוכנה מבוססת בינה מלאכותית, המספקת שיטה פשוטה, מהירה ומדויקת לכימות RGCs בכל רשתית העכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Immunostaining בהר שלם וספירה אוטומטית של תאי גנגליון רשתית עכבר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
גלאוקומה היא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם, המאופיינת במנגנון פתוגני מורכב שהופך את שיקום הראייה למאתגר. עכברים משמשים כמודלים בעלי ערך בבעלי חיים לחקר הפתוגנזה והטיפול בגלאוקומה בשל הרקע הגנטי ההומוגני יחסית שלהם ותאי גנגליון רשתית (RGCs), הדומים מבחינה מבנית לאלה שבבני אדם. הערכה מדויקת של נזקי RGC ותוצאות הטיפול במודלים של גלאוקומה עכברית דורשת קביעת מספר RGC על פני הרשתית כולה. פרוטוקול זה מתווה שיטה מקיפה הכוללת בידוד של הרשתית כולה, תיוג RGCs עם נוגדנים ספציפיים, וספירה אוטומטית מהירה ומדויקת של RGCs באמצעות תוכנה מבוססת AI. הגישה היעילה מאפשרת כימות יעיל ומדויק של מספרי RGC ברשתית העכבר, ומקלה על הערכת ניוון RGC והתערבויות טיפוליות פוטנציאליות. בכך שהוא מאפשר לחוקרים להעריך את היקף הנזק ל-RGC, פרוטוקול זה תורם להבנה עמוקה יותר של פתוגנזה של גלאוקומה ומסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול יעילות לניהול ומניעת אובדן ראייה.
מבוא
גלאוקומה מאופיינת במוות מתקדם של תאי גנגליון המהווה אתגר משמעותי לשיקום ראייה 1,2. מחלה זו היא מוקד מרכזי של מחקר עיניים בשל שכיחותה והשפעתה על ראייה3. מודלים עכבר הם הכרחיים DrDeramus
מחקר בשל הרקע הגנטי ההומוגני שלהם, יכולת הרבייה הגבוהה שלהם, ואת הדמיון של תכונות תאי גנגליון שלהם לבני אדם4. המטרה העיקרית של שיטה זו היא לכמת במדויק תאי גנגליון רשתית (RGCs) במודלים של עכברים, דבר חיוני להבנת הפתוגנזה של גלאוקומה ופיתוח טיפולים רלוונטיים.
הרציונל מאחורי פיתוח טכניקה זו נובע מהצורך בשיטה אמינה ויעילה להערכת ניוון RGC במודלים של עכברים. שיטות מסורתיות, כגון תיוג RGCs במקטעי רשתית, מספקות לעתים קרובות תוצאות לא אמינות בשל הפיזור הלא אחיד של RGCs ברשתית5. כימות RGCs על פני הרשתית כולה משקף טוב יותר שינויים במספרם והוא חיוני להערכת התקדמות המחלה והתערבויות טיפוליות.
שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני טכניקות חלופיות. לדוגמה, ספירה ידנית של תאי גנגליון רשתית (RGCs) ברשתית רגילה של עכבר בוגר, המכילה 40,000 עד 60,000 RGCs, יכולה לגזול זמן רב ונוטה לשגיאות 6,7,8. התוכנה לספירת RGC אוטומטית שפיתחנו מאפשרת ספירה מדויקת בפחות מ-3 דקות, מה שעשוי לחסוך לחוקרים כמות משמעותית של זמן. בנוסף, התוכנה מבוססת הבינה המלאכותית המשמשת לספירה אוטומטית ממזערת את ההטיה ומשפרת את יכולת השחזור.
יתר על כן, טכניקה זו מספקת גישה סטנדרטית להערכת ניוון RGC על פני מודלים שונים של עכברים ותנאי ניסוי, ותורמת נתונים יקרי ערך לתחום מחקר הגלאוקומה. השיטה מתיישרת עם מחקרים אחרים המדגישים את החשיבות של ניתוח רשתית שלמה להבנת שינויים ברשתית במחלות9.
כדי לעזור לקוראים לקבוע אם שיטה זו מתאימה ליישום שלהם, חשוב לציין כי טכניקה זו מועילה במיוחד עבור חוקרים החוקרים ניוון תאי גנגליון רשתית (RGC) במודלים עכבריים של גלאוקומה או מחלות רשתית אחרות. השיטה ניתנת להתאמה למערכי ניסוי שונים ומציעה רמה גבוהה של דיוק ויעילות בספירת RGC, מה שהופך אותה לאידיאלית למחקרים בקנה מידה קטן ובקנה מידה גדול. בנוסף, העיצוב הפשוט של הפרוטוקול והזמינות של תוכנה ידידותית למשתמש הופכים אותו לנגיש לחוקרים עם רמות שונות של מומחיות בניתוח רשתית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הנוהל תואם את הנחיות האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים לשימוש בבעלי חיים במחקר ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים העממי המחוזי של סצ'ואן. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57Bl/6J (בני חודשיים). איור 1 ממחיש את התהליך הכולל המתואר כאן. פרטי הריאגנטים והציוד בהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.
1. בידוד של רשתיות שלמות
- הקרבת בעלי חיים
- הקריבו את העכברים באמצעות פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסד) (איור 2A). לפני פריקת צוואר הרחם,
מרדימים את העכברים על ידי שאיפת איזופלורן (3%-5% בחמצן) או על ידי הזרקה תוך צפקית של תערובת קטמין/קסילזין.
- הקריבו את העכברים באמצעות פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסד) (איור 2A). לפני פריקת צוואר הרחם,
- חינוך ועיבוד גלגל העין
- סמן את קצה הקרנית בצד הגבי של גלגל העין בטוש כחול כדי לזכור את הכיוון במהלך הדיסקציה הבאה.
- הסר רקמות שריר שיורית המחוברות לגלגל העין עם מספריים. העבירו את גלגל העין לצינור מיקרוצנטריפוגה עגול בנפח 2 מ"ל מלא ב-PBS 1x לשטיפה קצרה (איור 2C).
- קיבוע
- העבירו את גלגל העין לצינור מיקרוצנטריפוגה נוסף בעל תחתית עגולה בנפח 2 מ"ל המכיל 4% פרפורמלדהיד (PFA) טרי לקיבוע ב-4°C למשך 10 דקות (איור 2D).
- בצע חתך קטן (כ 1-2 מ"מ) על הקרנית באמצעות מספריים עדינים תחת מיקרוסקופ נתיחה.
- הניחו את גלגל העין בחזרה לתוך הקיבוע לקיבוע נוסף בטמפרטורה של 4°C למשך 3 שעות כדי לשמר את המורפולוגיה של הרקמה (איור 2D).
- הסרת קרנית ועדשה 1,9
- בצע חתך קטן של כ 1 מ"מ סביב לימבוס הקרנית, הגבול בין הקרנית לבין sclera, באמצעות מספריים כירורגיים עדינים.
- בזהירות לחתוך סביב היקף הקרנית, לכרות אותו לחלוטין כדי לחשוף את המבנים הבסיסיים.
- השתמש במלקחיים עדינים כדי לתפוס בעדינות ולהרים בזהירות את העדשה מהרקמות שמסביב כדי למנוע נזק לרשתית. לשמור על שלמות מבנית של הרשתית עם פעולה עדינה.
- מעבירים את העין לצינור מיקרוצנטריפוגה להמשך עיבוד.
הערה: הבלו על הקרנית וחלצו את העדשה בצורה יעילה יותר באמצעות טכניקת "חתך צולב"10. צרו שני חריצים ניצבים לרוחב הקרנית והשתמשו במלקחיים כדי לחלץ את העדשה.
- חתך סקלרלי
- חתכו חריץ מדויק בלובן העין בעזרת מספריים אופתלמיים עדינים כדי להקל על שלבי הדיסקציה הבאים (איור 2J).
- היפרדות רשתית
- הכנס מלקחיים עם שיניים לתוך החתך בין לובן העין לרשתית. אחזו בעדינות בקצה הסקלרה, הימנעו מכוח מופרז כדי למנוע קריעת הרקמה.
- הגדילו בהדרגה את החתך על ידי הזזת המלקחיים לאורך הגבול שבין לובן העין לרשתית בתנועות ידיים איטיות ויציבות. השתמשו בחלק השיניים של המלקחיים כדי להפריד בזהירות את לובן העין מהרשתית, וודאו שהרשתית לא נפגעת (איור 2J).
- חיתוך רשתית
- מחלקים את הרשתית לארבעה דשים בערך שווים בגודלם בעזרת מספריים חדים. ודא שהחתכים נמצאים בערך באמצע הדרך לכיוון עצב הראייה ומכוונים ב-90° אחד מהשני.
- ניקוי רשתית
- פתחו בעדינות את הרשתית המנותחת באמצעות מברשת בעלת סיבים רכים, והסירו בקפידה לכלוך מפני השטח שלה (איור 2K).
- קיבוע סופי
- מעבירים את הרשתית המבודדת לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 4% PFA טרי באמצעות פיפטה חד פעמית של פסטר. אפשר קיבוע על קרח למשך 5 שעות נוספות למשך הלילה לשימור רקמות.
2. Immunostaining
- כביסה
- שטפו את הרשתית המבודדת ב-1x PBS בתסיסה עדינה במשך 5 דקות. בטל את פתרון PBS. חזור על תהליך זה פעמיים כדי להסיר שאריות קיבוע ולכלוך.
- חסימת
- טבלו את הרשתית שטופה בתמיסת חיץ חוסמת (1x PBS עם 4% סרום חמור רגיל (NDS) ו-0.2% Triton X-100) למשך 30 דקות כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים ולשפר את החדירות (איור 3A).
- דגירה ראשונית של נוגדנים
- החלף את מאגר החסימה בנוגדן ראשוני BRN3A (מדולל 1:200 במאגר החסימה). דגרו על הרשתית למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר קשירת נוגדנים ספציפיים לאנטיגן (איור 3B).
- כביסה
- שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם PBS אחד במשך 5 דקות כל אחת כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים ולהפחית את כתמי הרקע (איור 3C).
- דגירה משנית של נוגדנים
- דגרו על הרשתית עם נוגדן משני מצומד נגד ארנבים Alexa594 או Alexa488 (מדולל 1:300) במשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי להמחיש אנטיגני מטרה (איור 3D).
- כביסה
- בצע שלוש שטיפות רצופות עם PBS אחד במשך 5 דקות כל אחת כדי להסיר נוגדנים משניים עודפים ולמזער קשירה לא ספציפית.
- הרכבה
- העבירו בעדינות את הרשתית המוכתמת חיסונית למגלשת מיקרוסקופ זכוכית, שטחו אותה בזהירות כדי למזער קיפול או עיוות.
- יש למרוח טיפה קטנה של אמצעי הרכבה נגד דהייה על מרכז הרשתית, כדי להבטיח פיזור אחיד על פני הרקמה.
- מקמו בזהירות את הכיסוי מעל הרשתית המורכבת, והימנעו מבועות אוויר (איור 3E,F).
3. עיבוד תמונה
הערה: ייבא את התמונה לתוכנת הספירה האוטומטית RGC והתחל לספור. ניתן לקבל את מספר התאים החיוביים BRN3A עבור הרשתית כולה תוך דקות. הורד את תוכנת AutoCount מ- GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). בצע את שלבי ההתקנה המפורטים עבור התוכנה להלן:
- הורד את הקוד מהקישור GitHub . אחד יקבל קובץ בשם "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". חלץ קובץ זה.
- הורד את הקבצים הדרושים מהדיסק בענן (ראה רשימת חומרים) ופתח אותם. הקובץ שהורד נקרא "yolov5_cpu". חלץ חבילה זו לתיקיה הנוכחית כדי למנוע בעיות בלתי צפויות.
- אתר את קובץ התצורה משלב 1 ושנה את תוכנו כך שיצביע על הנתיב "yolov5_cpu".
הערה: לדוגמה, אם "yolov5_cpu" שהורדת ממוקם ב- "D:\1me\yolov5_cpu_", שנה את הקובץ "config.ini" בשלב 1 ל- "D:/1me/yolov5_cpu" (השתמש / במקום \). (איור 4A). - פתח את הממשק הגרפי על ידי לחיצה על userinterface.exe. הטעינה הראשונית עשויה להיות איטית (הפעל כמנהל) (איור 4B).
- לאחר פתיחת התוכנה, ודא אם קובץ המודל "pmse_plus.pt" נמצא בספריית הבסיס של כונן C. אם הוא אינו קיים, העתק אותו לספריה זו.
הערה: קובץ המודל "pmse_plus.pt" ממוקם בתיקיית המשקולות של התיקיה "yolov5", שנמצאת בתיקייה RGCs שחולצו באופן חכם (איור 4C). - הכינו את התמונות לזיהוי.
הערה: התוכנה מאפשרת לקרוא רק תמונה אחת או חמש בכל פעם. קריאה נוספת תגרום לשגיאה.
4. ספירת תאים אוטומטית
- פתחו את תוכנת הספירה (איור 5A).
- לחצו על OPEN IMAGE כדי לייבא את התמונה (איור 5B).
- לחצו על RUN כדי לאפשר לתוכנה לספור את התאים באופן אוטומטי (איור 5C).
הערה: התוכנה תסמן את התאים שנספרו בתיבה ריבועית אדומה ותציג את ספירת התאים בפינה השמאלית העליונה (איור 5D).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מפרט את המתודולוגיה להצבה חיסונית מלאה של רשתיות עכברים, ומבטיח הכנת רקמות קפדנית, דגירה מדויקת של נוגדנים וספירת תאים אוטומטית אמינה. ההליך מאפשר תיוג וכימות חזקים של תאי גנגליון רשתית (RGCs), ומאפשר הערכה מדויקת של אוכלוסיות תאים בהקשרים ניסיוניים שונים. השיטה שימשה לספירת RGCs בעכברים מסוג בר וגלאוקומה, והניבה תוצאות עקביות. תוצאה מייצגת מראה שמספר ה-RGCs בעכבר בוגר רגיל בגיל חודשיים הוא כ-45,000 (איור 6).
כדי להעריך אם תוכנת הבינה המלאכותית יכולה ל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מספק שיטה לקביעת כל תאי גנגליון הרשתית (RGCs) ברשתית עכבר, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחר התקדמות ניוון RGC במודלים עכבריים עבור מחקרי גלאוקומה. רשתית העכבר היא רקמת עצב עדינה5, ובידוד רשתית שלמות מעיני העכבר דורש תרגול חוזר. במהלך הניסויים, נמצא כי זמן הקיבוע משפיע באופן משמעותי על המורפולוגיה של הרשתית. עבור עכברים סביב גיל שבועיים, זמן קיבוע של 20 דקות מספיק כדי להשיג תוצאות טובות בשל sclera דק וחלש. עם זאת, עבור עכברים בוגרים מעל גיל חודשיים, 20...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
תודות
פרויקט מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82371059 (H.Z.)), המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן, סין (2023JDZH0002 (H.Z.)), לשכת המדע והטכנולוגיה של צ'נגדו (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)), ובית החולים העממי המחוזי של סצ'ואן (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 ופעמים; PBS | Servicebio | G4202 | |
| Alexa594 מצומד עיזים נגד ארנב IgG (H+L) | ThermoFisher | A-11012 | |
| נוגדן נגד BRN3A [EPR23257-285] | Abcam | ab245230 | |
| תוכנת | https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs | ||
| דיסק ענן | Google drive link | https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 | |
| דיסק ענן | Baidu link | קוד חילוץ: g44k | https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg |
| Marker | Sharpie | ||
| Normal Donkey Serum | Biosharp, Labgic | 25030081 | |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | |
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| Sucrose | BBI, Sangon | A610498 | |
| Triton X-100 | BioFroxx, neoFroxx | 1139ML100 |
מקורות
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
- Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
- Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
- Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
- Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
- Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
