הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 בנובמבר 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

במאמר זה

סיכום

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

תקציר

טסיות דם פעילות מעודדות קרישה בעיקר על-ידי חשיפת פוספטידיל-סרין מעודד קרישה (PS) על פני השטח החיצוניים של הממברנה שלהן ושחרור מיקרו-שלפוחיות מבטאות PS השומרות על ארכיטקטורת הממברנה המקורית ועל המרכיבים הציטופלזמיים של התאים המקוריים שלהן. הנגישות של פוספטידיל-סרין מאפשרת קשירה של גורמי קרישה עיקריים, ומגבירה באופן משמעותי את היעילות הקטליטית של אנזימי קרישה, בעוד שחרור שלפוחית מיקרו פועל כמתווך מרכזי של איתות בין-תאי. טסיות הדם מעודדות קרישה ממלאות תפקיד מכריע בייצוב קריש הדם במהלך המוסטאזיס, ושיעורן המוגבר בזרם הדם נמצא בקורלציה עם סיכון מוגבר לפקקת. כמו כן הוכח כי מיקרובועיות טסיות עשירות בגורמי גדילה המקדמים ריפוי פצעים ומודולציה דלקתית. ניתוח החשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות באמצעות ציטומטריית זרימה מציב אתגרים משמעותיים בשל גודלם הקטן והמספר המוגבל של אירועים חיוביים לסמנים מעניינים. למרות התקדמות ניכרת בעשור האחרון, שיטות להערכת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות עדיין נמצאות בתהליך. למרבה הצער, לא קיים פרוטוקול אוניברסלי יחיד, ויש להעריך מספר גורמים כדי לקבוע את המתודולוגיה המתאימה ביותר עבור כל יישום ספציפי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד טסיות דם שטופות מדם אנושי, ולאחר מכן הפעלת קולגן ו/או תרומבין, כדי למדוד את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית המאפיינים טסיות מעודדות. פרוטוקול זה נועד להקל על ההכנה הראשונית של פלזמה עשירה בטסיות ובידוד של טסיות שטופות. לבסוף, חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מכומתים על-ידי ציטומטריית זרימה, מה שמאפשר זיהוי של טסיות דם מעודדות-קרישה.

מבוא

היווצרות מעודדי קרישה של טסיות הדם חיונית לשמירה על המוסטזיס 1,2,3. תהליך זה כרוך ביטוי אגוניסטי המושרה של פוספוליפידים על קרום טסיות הדם, אשר חיוני להרכבה של מתחמי טנאז ו prothrombinase 1,3,4. לאחר הפעלת טסיות, microvesicles טסיות משוחררים ברציפות 5,6. מיקרו-שלפוחיות (בקוטר 50 ננומטר עד יותר מ-1 מיקרומטר) עוטפות הן את מבנה הממברנה והן את המרכיבים הציטופלזמיים של התאים המקוריים 7,8. מיקרובסיקלים הם מתווכים חשובים של איתות בין-תאי 9,10 וגם מאגרים של גורמי גדילה המקדמים ריפוי פצעים ומודולציה דלקתית11,12. כמו כן, הוצע כי מיקרו-שלפוחיות הן פי 50 עד פי 100 יותר פרוקו-קרישה מאשר טסיות דם פעילות13. יש לציין כי עדויות עדכניות מצביעות על כך שטסיות הדם המאוחסנות מופעלות, מה שמוביל לייצור מיקרובועיות - יש לכך השלכות פוטנציאליות על הפרקטיקה של טיפול בעירוי טסיות. משך האחסון הממושך של המיקרו-שלפוחיות והפעילות המוגברת של גורמי הקרישה הופכים אותן לתחליף מבטיח לטסיות הדם ביישומי עירוי14.

חידושים מתודולוגיים נעשו כדי, במישרין ובעקיפין, להעריך היווצרות מעודדי קרישה של טסיות דם הן במצבי בריאות והן במצבי מחלה 4,14,15. הערכות של חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות באמצעות טסיות מטוהרות סיפקו נתונים חדשים על האופן שבו תגובות מעודדות קרישה של טסיות הדם מוטרדות במחלות אנושיות מגוונות 1,4. תחום מחקר הולך וגדל זה פותח גם אפיקים להתערבויות טיפוליות 1,4. עם זאת, בידוד וניתוח של טסיות מטוהרות מדם גוזלים זמן, דורשים ציוד מעבדה מיוחד, ולכן אינם ניתנים כיום להתאמה לאבחון קליני שגרתי16,17. ניתוח החשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מאתגר גם בשל גודלם הקטן ומספר האירועים החיוביים לסמנים מעניינים18,19.

ציטומטריית זרימה, הממנפת קשירת Annexin-V פלואורסצנטית, הייתה אבן פינה בהערכת ביטוי PS על טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מאז הקמתה לפני שני עשורים20. זה זכה להסכמה נרחבת בבדיקה של טסיות דם מעודדות ו microvesicles21,22. לכן, מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי שניתן להשתמש בו לבידוד טסיות מטוהרות מדגימות דם בטכניקה שפותחה על ידי קבוצתCazenave 23, ואפיון עוקב של חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית על ידי ציטומטריית זרימה לאחר הפעלת טסיות24. פרוטוקול זה יאפשר מחקר נוסף ואפיון מעמיק של טסיות דם מעודדות קרישה באוכלוסיות קליניות מעניינות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי של בורדו למחקר אנושי. דגימות דם נלקחו ממתנדבים בריאים שנתנו הסכמה מדעת, ודגימות אלה עובדו על פי פרוטוקולים מוסדיים. תורמים שנטלו חומרים שעלולים להשפיע על תפקוד טסיות הדם לא נכללו אם חומרים כאלה נלקחו בתוך 10 ימים שקדמו לניסויים. הסכמה מדעת התקבלה ממתנדבים בריאים לאסוף את דמם ולפרסם את נתונם. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. איסוף דם והכנת טסיות שטף

  1. יש לאסוף דם ורידי היקפי בצינורות איסוף המכילים את נוגד הקרישה הפעיל Tri-sodium Citrate עם חומצת לימון ודקסטרוז (ACD) לאחר השלכת 3 מ"ל הראשונים.
  2. לאחר האיסוף, הפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב את הדם עם ACD ולאפשר לתערובת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני הצנטריפוגה.
  3. ספירת טסיות באמצעות מונה תאים אוטומטי לפני הצנטריפוגה כדי לקבוע את המהירות הנכונה לצנטריפוגה (טבלה 1). הכן פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) על ידי צנטריפוגה במהירות של 250 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) מבלי להפעיל את הבלם כדי לייעל את התאוששות טסיות הדם.
    הערה: שלב זה ייצור שלוש שכבות בדגימה: השכבה העליונה המכילה פלזמה, טסיות דם וחלק קטן של תאי דם לבנים; שכבה אמצעית מועשרת בתאי דם לבנים; ושכבה תחתונה המורכבת מתאי דם אדומים. בזהירות להעביר את PRP מן השכבה העליונה לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל כדי למנוע זיהום עם תאי דם אדומים ולבנים.
  4. ל- PRP, הוסף 1 מ"ל של ACD-A (ראה טבלה 2) ו- 6.25 מיקרוליטר של אפיראז לכל 9 מ"ל.
    הערה: אפיראז, בריכוז של 0.02 U/mL, מפרק עקבות של ATP או ADP המופרשים על ידי טסיות הדם, ובכך מונע דה-סנסיטיזציה של קולטני ADP טסיות ושומר על צורת טסיות25. מעכב prostacyclin PGI2 (0.5 μM) יכול גם להיכלל עם apyrase כדי למנוע הפעלת טסיות.
  5. מכינים את גלולת הטסיות על ידי צנטריפוגה ב RT ב 1100 x גרם במשך 10 דקות. יש לשאוף את הסופרנאטנט המכיל Platelet Poor Plasma (PPP) בשיטה עדינה, כגון פיפטת פסטר, ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של חיץ כביסה (ראו טבלה 3 וטבלה 4). הומוגניזציה עדינה עם פיפטה, ולאחר מכן להוסיף 3-4 מ"ל נוספים של חיץ כביסה.
    הערה: רמת הסידן מופחתת כדי למנוע קרישה עם גורמי קריש הנמצאים בפלזמה. בשלב זה, הפלזמה הענייה בטסיות הוסרה לחלוטין, מה שמונע היווצרות קריש דם והפעלת טסיות על ידי ייצור טרומבין.
  6. צנטריפוגה שוב ב RT ב 1100 x גרם במשך 10 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של חיץ כביסה. העבר 150 μL של מתלה טסיות הדם לצינור 1.5 מ"ל לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה עם 3-4 מ"ל של חיץ כביסה.
  7. בצע צנטריפוגה סופית ב 1100 x גרם במשך 10 דקות (ב RT). יש לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת הטסיות בנפח של חיץ תגובה (ראה טבלה 5 וטבלה 6) כדי להגיע לריכוז סופי של 5 x 1011 טסיות/L.
  8. הניחו לטסיות השטופות לנוח לפחות 30 דקות לפני הניסויים כדי לאפשר לשאריות המעכבים להתפוגג ולטסיות להתאקלם לחיץ.

2. הכנת הבדיקה

  1. הכינו את כל האגוניסטים והפלואורוכרומים במאגר התגובה. הוסף 5 μL של טרומבין ל 45 μL של חיץ (דילול 1: 10) ו 5 μL של יונופור ל 495 μL של חיץ (דילול 1:500).
    1. עבור בדיקות פנימיות, יש להשוות טסיות לא פעילות לעומת אלו שטופלו באגוניסטים בודדים וכפולים. הוסיפו, באליציטוטים שונים, 100 μL של טסיות שטופות ב 50 x 109 טסיות / L אל: (i) 10 μL של חיץ תגובה, (ii) 3 μL של קולגן לא מדולל (ריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל), (iii) 10 μL של תרומבין מדולל מראש (0.5 IU / mL), (iv) 3 μL של קולגן לא מדולל + 10 μL של טרומבין מדולל מראש, ו (v) 10 μL של יונופור מדולל מראש (ריכוז סופי של 2 μM), אשר ידוע כמעלה באופן ישיר את רמות הסידן התוך-תאי כפי שצוין קודם לכן26.
      הערה: טיפול ביונופור סידן, כגון A23187 או יונומיצין, הוא קריטי מכיוון שהוא גורם לערבול נרחב של קרום פוספוליפידים ולהחצנת PS משופרת.
    2. יש לנער בעדינות כל aliquot ביד ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
      הערה: דגירה אגוניסטית ארוכה יותר (30 דקות) עשויה לאפשר הבחנה טובה יותר בין אוכלוסיות טסיות במהלך תהליך ניתוח ציטומטריית הזרימה.
  2. הוסף 5 μL של Annexin-V FITC לא מדולל לכל מיקרו-צינור ודגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
    הערה: נוגדן חד שבטי נגד אחד הקולטנים הספציפיים לטסיות, GPIX (CD42b) או אינטגרין αIIb (CD41, GPIIb), יכול להיכלל גם כדי לזהות טוב יותר תאי טסיות.
  3. הוסף 500 μL של מאגר תגובה כדי לעצור את התהליך ולהמשיך בניתוח הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה.

3. אפיון טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מעודדות על ידי ציטומטריית זרימה (FC)

הערה: לניתוח אמין של תפקוד טסיות הדם, השתמש במכשיר ציטומטריית זרימה (FC) המוגדר בהתאם לתקניםשנקבעו 27. המכשיר חייב להיות מסוגל לזהות פיזור קדמי (FSC) ולפחות אות פלואורסצנטי אחד. הגדר את גלאי פיזור האור והפלואורסצנטיות לרווח לוגריתמי. דלל את הדגימות בהתאם ל- FC כדי להבטיח שרק טסיות בודדות נספרות במהירות איסוף נתונים מופחתת.

  1. הגדר את ציטומטר הזרימה לקצב זרימה 'איטי' עם סף של לפחות 10,000 אירועי טסיות. נטר פליטת פלואורסצנטיות באמצעות מסנן מעבר עבור FITC.
  2. שער אוכלוסיית הטסיות באמצעות פיזור קדמי (FSC). לבחון טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות משוחררות בהתאם לגודלן. השתמש בחלקות צפיפות כדי לזהות טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות משוחררות הן לטסיות מנוחה והן לטסיות מגורות; לנתח כל אוכלוסייה מגודרת באופן עצמאי.
  3. להבחין טסיות מעודדות קרישה על פי ציר FL1. מקם את החתך השלילי בקצה הימני של אוכלוסיית הטסיות במצב מנוחה (כלומר, בנוכחות חיץ תגובה). לאחר הפעלת טסיות, יש לסווג את כל האירועים הממוקמים מימין לחתך זה כטסיות החושפות פוספטידיל-סרין.
  4. להבדיל microvesicles, להיות קטן יותר טסיות, על ידי תכונות פיזור האור הייחודי שלהם. הגדר את החתך בערך FSC הנמוך ביותר שנצפה באוכלוסיית טסיות המנוחה. לאחר ההפעלה, יש לסווג אירועים חיוביים לפוספטידיל-סרין הנמצאים מתחת לסף זה כמיקרו-שלפוחיות.
    הערה: קח בחשבון את השונות האינדיבידואלית בגודל טסיות הדם על-ידי התאמת החיתוך במידת הצורך. ודא כי פחות מ 1% של microvesicles נמצאים במצב מנוחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כימות של טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מעודדות מושג באמצעות צביעת Annexin-V, עם לפחות 50,000 אירועים שתועדו בכל דגימה. כפי שצוין בשלב 2.2, מדידות טסיות בסיסיות נלקחו מדגימות מודגרות עם חיץ תגובה, כפי שמתואר באיור 1A. גודל טסיות הדם נמדד באמצעות ערך הפיזור הקדמי החציוני (FSC). בעוד FSC מושפע מגורמים שונים, הוא נשאר פרוקסי נפוץ להערכת גודל התא, כולל זה של טסיות. חלקות צפיפות של שטח (איור 1A) שימשו לזיהוי ולשער של טסיות נחה ומיקרו-שלפוחיות משוחררות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים אחרונים על טסיות דם מעודדות קרישה הדגישו את השינויים שלהם במהלך מספר מחלות 1,28,29, והדגישו את חשיבות הניתוח והאפיון המפורט שלהם 30,31,32. בעוד שהבדיקות הקליניות הנוכחיות להערכת היווצרות מעודדי קרישה של טסיות הדם מוגבלות, חלה עלייה משמעותית בעניין הקליני בשני העשורים האחרונים. לדוגמה, TMEM16F סקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A צינורות איסוף דםBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
סרום בקר אלבומין 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25Mסיגמא-אולדריץ'C3881
חומצת לימון מונוהידרטMerck5949-29-1
קולגן סטגו86924
גלוקוז סיגמא-אולדריץ'G8270
Hepes סיגמא-אולדריץ'H3375
יונופור Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
נתרן מימן פחמתיMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
טריסודיום ציטראט דיהידרט Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α IIb אינטגרין (CD41, GPIIb) PC7בקמן קולטר6607115

מקורות

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טבקיות פרוקואגולנטיותהפעלת טבקיותציטומטריה זרימהטבקיות שטופותפלזמה עשירה בטבקיותבידוד טבקיותהפעלה באמצעות קולגןהפעלה באמצעות תרומבין
אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.