מאמר שיטה

אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

29 בנובמבר 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

במאמר זה

סיכום

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

תקציר

טסיות דם פעילות מעודדות קרישה בעיקר על-ידי חשיפת פוספטידיל-סרין מעודד קרישה (PS) על פני השטח החיצוניים של הממברנה שלהן ושחרור מיקרו-שלפוחיות מבטאות PS השומרות על ארכיטקטורת הממברנה המקורית ועל המרכיבים הציטופלזמיים של התאים המקוריים שלהן. הנגישות של פוספטידיל-סרין מאפשרת קשירה של גורמי קרישה עיקריים, ומגבירה באופן משמעותי את היעילות הקטליטית של אנזימי קרישה, בעוד שחרור שלפוחית מיקרו פועל כמתווך מרכזי של איתות בין-תאי. טסיות הדם מעודדות קרישה ממלאות תפקיד מכריע בייצוב קריש הדם במהלך המוסטאזיס, ושיעורן המוגבר בזרם הדם נמצא בקורלציה עם סיכון מוגבר לפקקת. כמו כן הוכח כי מיקרובועיות טסיות עשירות בגורמי גדילה המקדמים ריפוי פצעים ומודולציה דלקתית. ניתוח החשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות באמצעות ציטומטריית זרימה מציב אתגרים משמעותיים בשל גודלם הקטן והמספר המוגבל של אירועים חיוביים לסמנים מעניינים. למרות התקדמות ניכרת בעשור האחרון, שיטות להערכת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות עדיין נמצאות בתהליך. למרבה הצער, לא קיים פרוטוקול אוניברסלי יחיד, ויש להעריך מספר גורמים כדי לקבוע את המתודולוגיה המתאימה ביותר עבור כל יישום ספציפי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד טסיות דם שטופות מדם אנושי, ולאחר מכן הפעלת קולגן ו/או תרומבין, כדי למדוד את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית המאפיינים טסיות מעודדות. פרוטוקול זה נועד להקל על ההכנה הראשונית של פלזמה עשירה בטסיות ובידוד של טסיות שטופות. לבסוף, חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מכומתים על-ידי ציטומטריית זרימה, מה שמאפשר זיהוי של טסיות דם מעודדות-קרישה.

מבוא

היווצרות מעודדי קרישה של טסיות הדם חיונית לשמירה על המוסטזיס 1,2,3. תהליך זה כרוך ביטוי אגוניסטי המושרה של פוספוליפידים על קרום טסיות הדם, אשר חיוני להרכבה של מתחמי טנאז ו prothrombinase 1,3,4. לאחר הפעלת טסיות, microvesicles טסיות משוחררים ברציפות 5,6. מיקרו-שלפוחיות (בקוטר 50 ננומטר עד יותר מ-1 מיקרומטר) עוטפות הן את מבנה הממברנה והן את המרכיבים הציטופלזמיים של התאים המקוריים 7,8. מיקרובסיקלים הם מתווכים חשובים של איתות בין-תאי 9,10 וגם מאגרים של גורמי גדילה המקדמים ריפוי פצעים ומודולציה דלקתית11,12. כמו כן, הוצע כי מיקרו-שלפוחיות הן פי 50 עד פי 100 יותר פרוקו-קרישה מאשר טסיות דם פעילות13. יש לציין כי עדויות עדכניות מצביעות על כך שטסיות הדם המאוחסנות מופעלות, מה שמוביל לייצור מיקרובועיות - יש לכך השלכות פוטנציאליות על הפרקטיקה של טיפול בעירוי טסיות. משך האחסון הממושך של המיקרו-שלפוחיות והפעילות המוגברת של גורמי הקרישה הופכים אותן לתחליף מבטיח לטסיות הדם ביישומי עירוי14.

חידושים מתודולוגיים נעשו כדי, במישרין ובעקיפין, להעריך היווצרות מעודדי קרישה של טסיות דם הן במצבי בריאות והן במצבי מחלה 4,14,15. הערכות של חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות באמצעות טסיות מטוהרות סיפקו נתונים חדשים על האופן שבו תגובות מעודדות קרישה של טסיות הדם מוטרדות במחלות אנושיות מגוונות 1,4. תחום מחקר הולך וגדל זה פותח גם אפיקים להתערבויות טיפוליות 1,4. עם זאת, בידוד וניתוח של טסיות מטוהרות מדם גוזלים זמן, דורשים ציוד מעבדה מיוחד, ולכן אינם ניתנים כיום להתאמה לאבחון קליני שגרתי16,17. ניתוח החשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מאתגר גם בשל גודלם הקטן ומספר האירועים החיוביים לסמנים מעניינים18,19.

ציטומטריית זרימה, הממנפת קשירת Annexin-V פלואורסצנטית, הייתה אבן פינה בהערכת ביטוי PS על טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מאז הקמתה לפני שני עשורים20. זה זכה להסכמה נרחבת בבדיקה של טסיות דם מעודדות ו microvesicles21,22. לכן, מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי שניתן להשתמש בו לבידוד טסיות מטוהרות מדגימות דם בטכניקה שפותחה על ידי קבוצתCazenave 23, ואפיון עוקב של חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית על ידי ציטומטריית זרימה לאחר הפעלת טסיות24. פרוטוקול זה יאפשר מחקר נוסף ואפיון מעמיק של טסיות דם מעודדות קרישה באוכלוסיות קליניות מעניינות.

פרוטוקול

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי של בורדו למחקר אנושי. דגימות דם נלקחו ממתנדבים בריאים שנתנו הסכמה מדעת, ודגימות אלה עובדו על פי פרוטוקולים מוסדיים. תורמים שנטלו חומרים שעלולים להשפיע על תפקוד טסיות הדם לא נכללו אם חומרים כאלה נלקחו בתוך 10 ימים שקדמו לניסויים. הסכמה מדעת התקבלה ממתנדבים בריאים לאסוף את דמם ולפרסם את נתונם. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. איסוף דם והכנת טסיות שטף

  1. יש לאסוף דם ורידי היקפי בצינורות איסוף המכילים את נוגד הקרישה הפעיל Tri-sodium Citrate עם חומצת לימון ודקסטרוז (ACD) לאחר השלכת 3 מ"ל הראשונים.
  2. לאחר האיסוף, הפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב את הדם עם ACD ולאפשר לתערובת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני הצנטריפוגה.
  3. ספירת טסיות באמצעות מונה תאים אוטומטי לפני הצנטריפוגה כדי לקבוע את המהירות הנכונה לצנטריפוגה (טבלה 1). הכן פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) על ידי צנטריפוגה במהירות של 250 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) מבלי להפעיל את הבלם כדי לייעל את התאוששות טסיות הדם.
    הערה: שלב זה ייצור שלוש שכבות בדגימה: השכבה העליונה המכילה פלזמה, טסיות דם וחלק קטן של תאי דם לבנים; שכבה אמצעית מועשרת בתאי דם לבנים; ושכבה תחתונה המורכבת מתאי דם אדומים. בזהירות להעביר את PRP מן השכבה העליונה לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל כדי למנוע זיהום עם תאי דם אדומים ולבנים.
  4. ל- PRP, הוסף 1 מ"ל של ACD-A (ראה טבלה 2) ו- 6.25 מיקרוליטר של אפיראז לכל 9 מ"ל.
    הערה: אפיראז, בריכוז של 0.02 U/mL, מפרק עקבות של ATP או ADP המופרשים על ידי טסיות הדם, ובכך מונע דה-סנסיטיזציה של קולטני ADP טסיות ושומר על צורת טסיות25. מעכב prostacyclin PGI2 (0.5 μM) יכול גם להיכלל עם apyrase כדי למנוע הפעלת טסיות.
  5. מכינים את גלולת הטסיות על ידי צנטריפוגה ב RT ב 1100 x גרם במשך 10 דקות. יש לשאוף את הסופרנאטנט המכיל Platelet Poor Plasma (PPP) בשיטה עדינה, כגון פיפטת פסטר, ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של חיץ כביסה (ראו טבלה 3 וטבלה 4). הומוגניזציה עדינה עם פיפטה, ולאחר מכן להוסיף 3-4 מ"ל נוספים של חיץ כביסה.
    הערה: רמת הסידן מופחתת כדי למנוע קרישה עם גורמי קריש הנמצאים בפלזמה. בשלב זה, הפלזמה הענייה בטסיות הוסרה לחלוטין, מה שמונע היווצרות קריש דם והפעלת טסיות על ידי ייצור טרומבין.
  6. צנטריפוגה שוב ב RT ב 1100 x גרם במשך 10 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של חיץ כביסה. העבר 150 μL של מתלה טסיות הדם לצינור 1.5 מ"ל לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה עם 3-4 מ"ל של חיץ כביסה.
  7. בצע צנטריפוגה סופית ב 1100 x גרם במשך 10 דקות (ב RT). יש לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת הטסיות בנפח של חיץ תגובה (ראה טבלה 5 וטבלה 6) כדי להגיע לריכוז סופי של 5 x 1011 טסיות/L.
  8. הניחו לטסיות השטופות לנוח לפחות 30 דקות לפני הניסויים כדי לאפשר לשאריות המעכבים להתפוגג ולטסיות להתאקלם לחיץ.

2. הכנת הבדיקה

  1. הכינו את כל האגוניסטים והפלואורוכרומים במאגר התגובה. הוסף 5 μL של טרומבין ל 45 μL של חיץ (דילול 1: 10) ו 5 μL של יונופור ל 495 μL של חיץ (דילול 1:500).
    1. עבור בדיקות פנימיות, יש להשוות טסיות לא פעילות לעומת אלו שטופלו באגוניסטים בודדים וכפולים. הוסיפו, באליציטוטים שונים, 100 μL של טסיות שטופות ב 50 x 109 טסיות / L אל: (i) 10 μL של חיץ תגובה, (ii) 3 μL של קולגן לא מדולל (ריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל), (iii) 10 μL של תרומבין מדולל מראש (0.5 IU / mL), (iv) 3 μL של קולגן לא מדולל + 10 μL של טרומבין מדולל מראש, ו (v) 10 μL של יונופור מדולל מראש (ריכוז סופי של 2 μM), אשר ידוע כמעלה באופן ישיר את רמות הסידן התוך-תאי כפי שצוין קודם לכן26.
      הערה: טיפול ביונופור סידן, כגון A23187 או יונומיצין, הוא קריטי מכיוון שהוא גורם לערבול נרחב של קרום פוספוליפידים ולהחצנת PS משופרת.
    2. יש לנער בעדינות כל aliquot ביד ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
      הערה: דגירה אגוניסטית ארוכה יותר (30 דקות) עשויה לאפשר הבחנה טובה יותר בין אוכלוסיות טסיות במהלך תהליך ניתוח ציטומטריית הזרימה.
  2. הוסף 5 μL של Annexin-V FITC לא מדולל לכל מיקרו-צינור ודגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
    הערה: נוגדן חד שבטי נגד אחד הקולטנים הספציפיים לטסיות, GPIX (CD42b) או אינטגרין αIIb (CD41, GPIIb), יכול להיכלל גם כדי לזהות טוב יותר תאי טסיות.
  3. הוסף 500 μL של מאגר תגובה כדי לעצור את התהליך ולהמשיך בניתוח הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה.

3. אפיון טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מעודדות על ידי ציטומטריית זרימה (FC)

הערה: לניתוח אמין של תפקוד טסיות הדם, השתמש במכשיר ציטומטריית זרימה (FC) המוגדר בהתאם לתקניםשנקבעו 27. המכשיר חייב להיות מסוגל לזהות פיזור קדמי (FSC) ולפחות אות פלואורסצנטי אחד. הגדר את גלאי פיזור האור והפלואורסצנטיות לרווח לוגריתמי. דלל את הדגימות בהתאם ל- FC כדי להבטיח שרק טסיות בודדות נספרות במהירות איסוף נתונים מופחתת.

  1. הגדר את ציטומטר הזרימה לקצב זרימה 'איטי' עם סף של לפחות 10,000 אירועי טסיות. נטר פליטת פלואורסצנטיות באמצעות מסנן מעבר עבור FITC.
  2. שער אוכלוסיית הטסיות באמצעות פיזור קדמי (FSC). לבחון טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות משוחררות בהתאם לגודלן. השתמש בחלקות צפיפות כדי לזהות טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות משוחררות הן לטסיות מנוחה והן לטסיות מגורות; לנתח כל אוכלוסייה מגודרת באופן עצמאי.
  3. להבחין טסיות מעודדות קרישה על פי ציר FL1. מקם את החתך השלילי בקצה הימני של אוכלוסיית הטסיות במצב מנוחה (כלומר, בנוכחות חיץ תגובה). לאחר הפעלת טסיות, יש לסווג את כל האירועים הממוקמים מימין לחתך זה כטסיות החושפות פוספטידיל-סרין.
  4. להבדיל microvesicles, להיות קטן יותר טסיות, על ידי תכונות פיזור האור הייחודי שלהם. הגדר את החתך בערך FSC הנמוך ביותר שנצפה באוכלוסיית טסיות המנוחה. לאחר ההפעלה, יש לסווג אירועים חיוביים לפוספטידיל-סרין הנמצאים מתחת לסף זה כמיקרו-שלפוחיות.
    הערה: קח בחשבון את השונות האינדיבידואלית בגודל טסיות הדם על-ידי התאמת החיתוך במידת הצורך. ודא כי פחות מ 1% של microvesicles נמצאים במצב מנוחה.

תוצאות

כימות של טסיות דם ומיקרו-שלפוחיות מעודדות מושג באמצעות צביעת Annexin-V, עם לפחות 50,000 אירועים שתועדו בכל דגימה. כפי שצוין בשלב 2.2, מדידות טסיות בסיסיות נלקחו מדגימות מודגרות עם חיץ תגובה, כפי שמתואר באיור 1A. גודל טסיות הדם נמדד באמצעות ערך הפיזור הקדמי החציוני (FSC). בעוד FSC מושפע מגורמים שונים, הוא נשאר פרוקסי נפוץ להערכת גודל התא, כולל זה של טסיות. חלקות צפיפות של שטח (איור 1A) שימשו לזיהוי ולשער של טסיות נחה ומיקרו-שלפוחיות משוחררות.

במקרה של טסיות לא פעילות, פחות מ-2.9% הציגו פוספטידיל-סרין (PS) כפי שנקבע על ידי צביעת Annexin-V. עם הפעלת טסיות דם שטופות עם קולגן בלבד או בשילוב עם טרומבין או סידן יונופור, נצפתה עלייה בחשיפה ל-PS. קולגן לבדו גרם לעלייה של 26.7% בטסיות חיוביות ל-PS. לתרומבין הייתה השפעה מינימלית על החשיפה ל-PS (9.1%), אבל כאשר הוא נקשר לקולגן הוא הגדיל את אחוז טסיות הדם שחושפות PS ל-36.2%. לשם השוואה, טיפול ביונופור 2 מיקרומטר הביא לכך ש-49.6% מהטסיות הפכו לחומר קרישה.

איור 1 ממחיש כי שיעור המיקרו-בועיות הבסיסיות מטסיות הדם שנשטפו אצל אדם בריא היה מינימלי (0.3%). בעוד תרומבין וקולגן הגבירו באופן מזערי את היווצרות המיקרו-שלפוחיות, רק עם השילוב של קולגן ותרומבין היווצרות המיקרו-שלפוחיות גדלה באופן משמעותי (איור 1D; 11.4%). הוספת 2 מיקרומטר יונופור הביאה לכך ש-44.0% מהמיקרו-שלפוחיות שנוצרו על ידי טסיות הבקרה היו חשופות PS.

איור 2 מספק מידע לגבי השונות, החזרתיות ויכולת השחזור שיש לצפות להן מהתהליך הזה.

figure-results-1
איור 1: חשיפה ל-PS והיווצרות מיקרו-שלפוחית בטסיות בקרה מונחות ומופעלות. טסיות הדם הופעלו או לא הופעלו (מנוחה) (A), עם 30 מיקרוגרם/מ"ל קולגן (B), עם תרומבין 0.5 U/מ"ל (C), עם שילובים של קולגן ותרומבין (D) עם 2 מיקרומטר יונופור. תרשימי נקודות מייצגים מציגים גודל טסיות (פיזור קדימה (יומן FSC)) לעומת כריכת Annexin-V. קווים אופקיים ואנכיים (E) תוחמים את אוכלוסיית טסיות הדם השליליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: חזרתיות ושחזור של חשיפה ל-PS והיווצרות מיקרו-שלפוחית לאחר דגירה עם יונופור. ניתוח של חשיפה ל-PS והיווצרות מיקרו-שלפוחית לאחר דגירה עם יונופור של 2 מיקרומטר או 5 מיקרומטר בטסיות שטופות, מטופלות או לא מטופלות בציטראט (כלטור סידן): (A) מ-4 בקרות בריאות שונות; (B) מביקורת בריאה אחת החוזרת על עצמה 5 פעמים; ו-(ג) משני פקדים בריאים שהוכנו על ידי שני טכנאים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ספירת טסיות בדם שלם (109 למ"ל)כוחות צנטריפוגליים יחסיים (g)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

טבלה 1: כוחות צנטריפוגליים יחסיים להכנת פלזמה עשירה בטסיות ביחס לספירת טסיות הדם בדם שלם.

מגיבכמות
חומצת לימון מונוהידראט (C6H8O7. גובה2O, 38 מילימול)8 גרם
טריסודיום ציטראט דיהידרט (Na3C6H5O7.2 H2O, 61 mM)180 גרם
גלוקוז (C6H12O6, 136 mM)24.6 גרם
אין להתאים את ה- pH של הפתרון. שמור את התמיסה על 4 ° C.

טבלה 2: הכנת תמיסה מימית בנפח 1 ליטר של חומצה-ציטראט-דקסטרוז (ACD).

מגיבכמות
מונוהידרט חומצת לימון (C6H8O7. גובה2O, 36 מילימול)7.56 גרם
NaCl (103 מילימול)6 גרם
נאוה4 גרם
MgCl2.6H 2O (1 mM)0.203 גרם
כוונן את ה- pH ב- 6.5. שמור את התמיסה על 4 ° C.

טבלה 3: הכנת תמיסת מלאי של חיץ כביסה.

מגיבכמות
30% אלבומין בסרום בקר (BSA)583 מיקרוליטר
CaCl2, 0.25 מטר400 מיקרוליטר
גלוקוז40 מ"ג
אפיראז31.5 מיקרוליטר

טבלה 4: הכנת תמיסה זמנית של 50 מ"ל של חיץ כביסה מתמיסת המלאי.

מגיבכמות
NaCl (137 מילימול)8 גרם
KCl (2.7 mM)0.2 גרם
MgCl2.6H 2O (1 mM)0.203 גרם
HEPES (5 מ"מ)1.19 גרם
NaHCO3 (12 mM)1 גרם
NaH2PO4.2H 2O; 0.3 מ"מ0.05 גרם
כוונן את ה- pH ב- 7.4. שמור את התמיסה על 4 ° C.

טבלה 5: הכנת תמיסת מלאי של Reaction Buffer.

מגיבכמות
30% אלבומין בסרום בקר (BSA)167 מיקרוליטר
CaCl2, 0.25 מטר400 מיקרוליטר
גלוקוז50 מ"ג

טבלה 6: הכנת תמיסה זמנית של 50 מ"ל של חיץ תגובה מתמיסת המלאי.

דיון

מחקרים אחרונים על טסיות דם מעודדות קרישה הדגישו את השינויים שלהם במהלך מספר מחלות 1,28,29, והדגישו את חשיבות הניתוח והאפיון המפורט שלהם 30,31,32. בעוד שהבדיקות הקליניות הנוכחיות להערכת היווצרות מעודדי קרישה של טסיות הדם מוגבלות, חלה עלייה משמעותית בעניין הקליני בשני העשורים האחרונים. לדוגמה, TMEM16F סקרמבלאז תלויי סידן (ANO6) מעורב בחשיפה לפוספטידיל-סרין (PS)33. גרסאות של TMEM16F קשורות לתסמונת סקוט 33,34,35, הפרעת דימום נדירה המאופיינת בערבול פוספוליפידים לקוי וייצור תרומבין מופחת בטסיות דם פעילות36. יתר על כן, רמות גבוהות של טסיות דם מעודדות קרישה קשורות לשבץ טרומבוטי ולמחלת עורקים כליליים, מה שמעורר עניין בטיפולים לריסון פעילות מעודדי הקרישה של טסיותהדם 37. מבין השיטות הקיימות כיום להערכת היווצרות טסיות דם מעודדות, הערכת החשיפה ל-PS על ידי קשירת Annexin-V ושחרור מיקרו-שלפוחית היא אחת הנפוצות ביותר38,39.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בידוד טסיות מטוהרות על ידי בני אדם ואפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה ל-PS ושחרור מיקרו-שלפוחית באמצעות ציטומטריית זרימה. חשוב לייעץ למתנדבים בריאים להימנע מתרופות שעלולות להשפיע על תפקוד טסיות הדם לפחות 10 ימים לפני דגימת הדם. איסוף דם דורש טיפול כדי למנוע טראומה ורידים או זרימה איטית מדי, כמו אלה יכולים לגרום ליצירת טרומבין והפעלת טסיות. דם נוגד קרישה של נתרן ציטראט אינו מומלץ להכנת טסיות דם שטופות, שכן שאריות סידן יכולות לאפשר ייצור טרומבין והפעלת טסיות דם במהלך צנטריפוגה17. לדם ACD נוגד קרישה יש pH של 6.5 וריכוז ציטראט גבוה יותר של 22 mmol / L בהשוואה ל- pH של דם נוגד קרישה ציטראט של 7.5 ו 13 mmol / L ציטראטריכוז 17. ה- pH החומצי וריכוז הסידן החוץ תאי הנמוך בדם ACD נוגד קרישה מונעים צבירת טסיות24. צמצום ייצור התרומבין בתהליך האיסוף הוא חיוני. מומלץ לבצע ניקור לא טראומטי באמצעות מחט 21 גרם לפחות כדי למנוע קיפאון ורידי או לחץ מוגזם. בנוסף, כמה מיליליטר הראשונים של הדם צריך להיות מושלך כדי למנוע זיהום עם גורמי רקמות כמויות זעירות של תרומבין17. צמצום הזמן בין ניקור לעיבוד הדגימה חיוני גם הוא, שכן אחסון דם ממושך עלול להוביל להפעלת טסיות הדם, ובכך להגדיל את החשיפה ל-PS ואת שחרור המיקרו-שלפוחית40. יש להקדיש תשומת לב ספציפית במהלך כל הליך הכנת הטסיות כדי למנוע הפעלה מוקדמת ספונטנית של טסיות, אשר יכולה להתרחש במהלך תהליך ההכנה עצמו41,17. יתר על כן, בידוד טסיות מטוהרות מחייב הימנעות זהירה מזיהום על ידי תאי דם אחרים17. זה כרוך בשאיפה יסודית של הסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה של טסיות הדם כדי להבטיח הכנה נקייה. מכיוון שהגלולה נראית בדרך כלל ונצמדת היטב לדופן הצינור, ניתן לשאוף את הסופרנאטנט בקלות באמצעות קצה פיפטה.

במהלך שלבי שטיפת הצנטריפוגה, טסיות הדם מושעות מחדש בחיץ המדמה תנאים פיזיולוגיים. שימוש בטסיות דם שטופות בחיץ פיזיולוגי מבודד אותן מנוגדי קרישה ופלזמה, ובכך מונע ממצאים בתיווך טרומבין. בעוד פלזמה עשירה בטסיות (PRP) היא שיטה מהירה להשגת ריכוזי טסיות גבוהים, השימוש בה למחקרים פונקציונליים מוגבל על ידי שינויי pH הנגרמים על ידי נוגדי קרישה ותכולת הסידן והחלבון החוץ תאית של הפלזמה, אשר יכולים להשפיע על הפעלת טסיותהדם 17. יתר על כן, רמות גבוהות של PS שנוצרו במהלך הפעלת טסיות הדם יספיקו כדי לקדם את ההרכבה של מתחמי קרישת פלזמה, התפרצות טרומבין לאחר מכן, והיווצרות קריש ב- PRP, מה שהופך את תוצאות הניסוי לבלתי ניתנות לפענוח. לעומת זאת, השעיה בחיץ המכיל אפיראז מומלצת כדי לשמור על פונקציונליות טסיות הדם על ידי מניעת דה-סנסיטיזציה של קולטנים פורינרגיים באמצעות השפלה של ATP ו-ADP 42,43. למרות שצעדי צנטריפוגה ושטיפה חוזרים ונשנים דורשים זמן רב יותר, מתלים של טסיות דם שטופות שהוכנו בשיטה זו מציעים את היתרון של יציבות רבה יותר (5-8 שעות) בהשוואה לתכשירי PRP ציטרים, היציבים לא יותר מ 1-3 שעות23.

מחקר זה מדגים את ההיתכנות והפשטות של כימות מיקרו-שלפוחיות לפי ציטומטריית זרימה. עם זאת, ייצור שלפוחית יכול ללכת לאיבוד בפסולת וברעש של המכונה. לכן, קריטי לוודא כי ציטומטר הזרימה עבר ניקוי נרחב וכי המאגרים בהם נעשה שימוש אינם מכילים חלקיקים מזהמים שעלולים להוביל לרקע גבוה במהלך ניתוח ציטומטריית זרימה. לחלופין, ניתן להשתמש בציטומטרים מיוחדים של זרימה עם יכולות זיהוי חלקיקים קטנים כדי לזהות היווצרות מיקרו-שלפוחית. כמו כן נחקרה קשירת Annexin-V עם תווית פלואורסצאין כפונקציה של תכולת PS בממברנה, והדגישה את התפקיד הקריטי של ריכוזי סידן מספיקים בחיץ עבור קשירת Annexin-V ותגובת טסיות מעודדות קרישה44.

נתונים התומכים ביציבות דגימות טסיות לאורך זמן הם כיום נדירים. מספר מעבדות טיפלו בבעיה זו על ידי ייצוב דגימות באמצעות הוספת תמיסה מקבעת, כגון חיץ המכיל פורמלדהיד. להוספת קיבוע לדגימות טסיות טריות שנאספו יש יתרון של שימור דגימות לניתוח מאוחר יותר. עם זאת, קיבוע פורמלדהיד עלול לגרום לקשירת Annexin-V מוגברת באופן מלאכותי. רוצ'ט ועמיתיו הראו כי קיבוע טסיות עם תמיסת פורמלדהיד נטולת סידן בריכוז נמוך אינו משנה את שיעור טסיות הדם החיוביות של Annexin-V45. עם זאת, חוקרים הדורשים קיבוע צריכים לייעל את הפרוטוקול הספציפי שלהם כדי להבטיח שהוא אינו גורם לתוצאות שהשתנו באופן מלאכותי. אחרת, יש לעבד דגימות באופן מיידי.

מסלול נוסף שעשוי להוביל גם לחשיפה ל-PS כרוך באפופטוזיס פנימי, תהליך הידוע כמווסת את תוחלת החיים של טסיות הדם במחזורהדם 46. הפעלת חלבוני BAK ו-BAX פרו-אפופטוטיים גורמת להפעלת קספאז, המקדמת החצנה של PS, מה שמוביל לסילוק In vivo של טסיות הדם. לאחרונה, הוצע להשתמש בסמן נוסף של פני טסיות, P-selectin/CD62P, בנוסף ל- Annexin-V, כדי להבחין בין חומרים מקרישים לבין טסיות אפופטוטיות47. טסיות דם פרוקופלונטיות צפויות להיות חיוביות הן עבור סמנים PS והן עבור P-selectin, בעוד טסיות אפופטוטיות חיוביות עבור Annexin-V אך שליליות עבור P-selectin. עם זאת, הזמן הוא גם גורם מבדיל בין טסיות קרישה ואפופטוטיות47. יצירת טסיות דם מעודדות קרישה במבחנה היא תהליך מהיר, בעוד אפופטוזיס פנימי הוא תהליך איטי יותר, לוקח שעות48. בהקשר זה, אין צורך להשתמש בסמנים נוספים להערכת טסיות דם מעודדות, מה שמפשט את השיטה. עליות מתמשכות בהיווצרות טסיות דם תוך-תאיות Ca2+ ופרו-קרישה מתרחשות תוך מספר דקות עם אגוניסטים חזקים מאוד, כגון יונופור או הפעלה משולבת עם קולגן ותרומבין, בעוד שמעכב BCL-XL (או BH3 מימטי) מעורר היווצרות טסיות אפופטוטיות על ידי הפעלת BAK פרו-אפופטוטי ו- BAX, גורם לחדירות קרום חיצוני מיטוכונדריאלי, שחרור ציטוכרום C, והפעלת קספז49.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בידוד של טסיות מטוהרות ואפיונן לאחר מכן לפעילות מעודדת קרישה באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וציטומטריית זרימה. הליך זה סולל את הדרך למחקר עתידי על טסיות דם של קרישה בדגימות דם של מטופלים, עם יישומים פוטנציאליים בפרקטיקה הקלינית, כגון אבחנה של תסמונת סקוטהנדירה 50.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(CD42b, GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A צינורות איסוף דםBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
סרום בקר אלבומין 30%Sigma-AldrichA9576
CaCl2, 0.25Mסיגמא-אולדריץ'C3881
חומצת לימון מונוהידרטMerck5949-29-1
קולגן סטגו86924
גלוקוז סיגמא-אולדריץ'G8270
Hepes סיגמא-אולדריץ'H3375
יונופור Calbiochem/VWR100105
KCl Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
NaOH Merck1.06498
נתרן מימן פחמתיMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
טריסודיום ציטראט דיהידרט Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α IIb אינטגרין (CD41, GPIIb) PC7בקמן קולטר6607115

מקורות

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים