Method Article

מודל In Vitro לחקר התמיינות ושינויים של מולטי-אומיקה בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של מורין המגורות באמצעות תמצית עשן סיגריות

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים מודל במבחנה לבידוד והתמיינות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, תוך התמקדות בהתאקלמותם לתמצית עשן סיגריות כרונית (CSE). ניתן להשתמש במודל כדי לאפיין באופן מקיף את ההשפעה הרב-אומית של CSE, מה שעשוי לספק תובנות לגבי התגובות התאיות תחת חשיפה כרונית לעשן.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) מיוחסת במידה רבה לחשיפה לעשן טבק. חקירת האופן שבו תאי אפיתל בדרכי הנשימה מסתגלים באופן פונקציונלי לעשן טבק חיונית להבנת הפתוגנזה של COPD. המחקר הנוכחי נועד להקים מודל במבחנה המשתמש בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה כדי לחקות את ההשפעה בחיים האמיתיים של עשן טבק. שלא כמו קווי תאים מבוססים, תאים ראשוניים שומרים יותר על תכונות דמויות vivo, כולל דפוסי גדילה, הזדקנות והתמיינות. תאים אלה מפגינים תגובה דלקתית רגישה והתמיינות יעילה, ובכך מייצגים באופן הדוק מצבים פיזיולוגיים. במודל זה, תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין גודלו בתרבית במשך 28 יום תחת ממשק אוויר-נוזל עם ריכוז אופטימלי של תמצית עשן סיגריות (CSE), מה שהוביל להפיכת שכבה אחת של תאים לא ממוינים לאפיתל עמודתי פסאודוסטרטי, המעיד על אקלום CSE. לאחר מכן יושמו ניתוחים מולטי-אומיים מקיפים כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם CSE משפיע על ההתמיינות של תאי דרכי הנשימה הבסיסיים. תובנות אלה מספקות הבנה עמוקה יותר של התהליכים התאיים העומדים בבסיס התקדמות COPD בתגובה לחשיפה לעשן טבק.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) היא מחלת ריאות הטרוגנית עם מאפיינים מורכבים, בעוד חולים עם COPD נוטים בהדרגה להיות צעיריםיותר 1. לעישון, גורם סיכון עיקרי ל- COPD2, יש השפעה עמוקה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה, המשמשים כמחסום הראשוני מפני עשן טבק. למרות הקשר הידוע הזה, המנגנונים המפורטים שבאמצעותם עשן טבק גורם לשינויים בתאי אפיתל בדרכי הנשימה עדיין לא נחקרו כראוי. הבנה מעמיקה של שינויים מולקולריים אלה חיונית לזיהוי סמנים אבחוניים מוקדמים ומטרות טיפוליות ל- COPD.

כדי להתמודד עם הפער הזה, פיתחנו מודל חדשני במבחנה באמצעות תאי אפיתל של דרכי הנשימה. תאים אלה היו נתונים לגירוי ארוך טווח באמצעות תמצית עשן סיגריות (CSE), מה שאיפשר לנו לעקוב אחר שינויים תאיים דינמיים ולחקור את השינויים בתאי אפיתל בדרכי הנשימה תחת גירוי טבק ארוך טווח והמנגנון הבסיסי. במודל זה, Transwell שימש כדי לספק את ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה, ותמצית עשן סיגריות היה מגורה בשלב המוקדם של התמיינות תאי אפיתל עד סוף התמיינות לאחר 28 ימים. מחקרים קודמים בדקו רק התמיינות וגירוי לטווח קצר של תאי אפיתל בדרכי הנשימה (דומיננטיות קו התא). הם הוגבלו למסלול רגולטורי יחיד 3,4,5,6. עם זאת, הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של עכברים ומייעל את תהליך מיצוי התאים לפעילות תאים טובה יותר מאשר שיטות קודמות של תרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה. מודל זה מתמקד בשינויים בהתמיינות התא לצד אנליזות שעתוק מקיפות, פרוטאומיות, מטבוליות ואפיגנומיות. תוך שימוש באימונופלואורסנציה ובטכניקות מולטי-אומיקה מתקדמות, מטרתנו הייתה להבהיר את התגובות התאיות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה לחשיפה כרונית לעשן טבק, ובכך לתרום להבנה עמוקה יותר של פתוגנזה של COPD. מודל זה יכול לשמש לחקר השינויים בדפוס התמיינות תאי אפיתל בדרכי הנשימה והמנגנון שלו הנגרם על ידי גירוי ארוך טווח של מזהמים שונים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הכולל דורש 44 ימים, כולל יום אחד להכנת תאי אפיתל בדרכי הנשימה שבודדו מקנה הנשימה של מורין, 15 יום להתרבות תאים, ו-28 ימים לגירוי CSE בממשק אוויר-נוזל. כל חיות הניסוי שוכנות בחדר בעלי החיים SPF Barrier של מרכז הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל ונבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים וחיות מעבדה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל (AEEI-2020-100) כדי לעמוד בדרישות הנחיות ARRIVE7.

1. בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של מורין מקנה הנשימה של מורין

  1. הכנה
    1. הכן מדיום הרחבה מלא על ידי שילוב של 1 מ"ל של תוסף 50x ו- 0.05 מ"ל של מלאי הידרוקורטיזון עם מדיום בסיס הרחבה של 48.95 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.
    2. להמיס 7.5 מ"ג של פרוטאינאז ו 5 מ"ג של deoxyribonuclease I ב 5 מ"ל של F-12 של Ham כדי להכין פתרון proteinase. יש לסנן אותו כדי לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.
    3. הכינו תמיסות אנטיביוטיות על ידי הוספת 0.05 מ"ל של 100x פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.01 מ"ל של 500x גנטמיצין/אמפוטריצין ל-5 מ"ל של תמיסת התפשטות מלאה, PBS ופרוטאינאז (100 U/mL פניצילין, 100 U/mL סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 4 שבועות.
    4. לעקר מכשירי ניתוח ולהכין את ארון הבטיחות הביולוגי לבידוד תאים. במקביל, ודא שהציוד הסטנדרטי לתרביות תאים מוכן לשימוש.
    5. הכינו כלים מצופים קולגן בזנב חולדה על ידי הוספת קולגן זנב חולדה (100 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.02 N חומצה אצטית) לצלחות תרבית בקוטר 100 מ"מ ולטרנסוולים בקוטר 24 מ"מ (0.05 מ"ל/ס"מ2). יש להשאיר פתוח למשך הלילה תחת אור UV לצורך עיקור.
  2. בידוד תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה
    1. יש להשתמש בעכברי C57BL/6 (בני 6-8 שבועות, זכרים, בעלי SPF) לבידוד תאי אפיתל קנה הנשימה. המתת חסד עם מנת יתר של תמיסת נתרן פנטוברביטלית 1% (כ-200 מ"ג/ק"ג). השתמש בחמישה עכברים לתפוקת תאים מספקת.
    2. לעקר את העכבר על ידי טבילה בתמיסת אתנול 75%, לא לטבול את האף והפה באלכוהול כדי למנוע אלכוהול לזרום לתוך קנה הנשימה.
    3. נתח את העכבר.
      1. השתמש להבים כירורגיים ומלקחיים, קבוצה אחת של מכשירים לחיתוך ופתיחת האפידרמיס מהלסת התחתונה לחלל הבטן של העכבר.
      2. השתמש קבוצה נוספת של כלי ניתוח כדי לקרוע את בלוטות התריס משני הצדדים ולהסיר את הקשרים בין קנה הנשימה, רקמת השריר שמסביב, ואת הוושט.
      3. לאחר מכן, בזהירות לחתוך לתוך החזה, להשתמש מלקחיים להתעמק לתוך חלל החזה, להוציא את הריאה כולה, ולמצוא את קצה קנה הנשימה.
    4. לעבד את קנה הנשימה.
      1. חותכים את קנה הנשימה מסחוס בלוטת התריס לענף קנה הנשימה-סימפונות ומכניסים אותו למדיום הרחבה טרום קר המכיל ארבע אנטיביוטיקה.
      2. נער את הצינור כדי לשטוף כמה שיותר דם מפני השטח של קנה הנשימה, לשמור אותו על קרח, ולאחר מכן להתחיל את הניתוח עבור העכבר הבא.
    5. העבירו את כל קנה הנשימה שנאספו למאגר PBS טרום קר המכיל ארבע תרופות אנטיביוטיות (200 U/mL פניצילין, 200 U/mL סטרפטומיצין, 20 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B) לטיפול מקדים לפני העיכול.
    6. השתמש קבוצה של כלי ניתוח כדי להסיר קרישי דם ורקמות אחרות מן פני השטח של קנה הנשימה, ולאחר מכן לחתוך אותם לתוך 1 ס"מ2 גודל.
    7. לדגור על רקמת קנה הנשימה בתמיסת פרוטאינאז בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.
    8. לאחר 40 דקות, נענעו את הצינור מספר פעמים והשתמשו במסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר את הרקמות הנותרות. שוטפים את קנה הנשימה הקצוץ על מסננת עם 5 מ"ל של תווך הרחבה, צנטריפוגות את תרחיף התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ומשליכים את supernatant.
    9. להשעות מחדש את התאים המתקבלים ב 8 מ"ל של מדיום הרחבה.
    10. ספור את התאים קיימא באמצעות כחול טריפאן המוציטומטר.
    11. תרחיף תאי צלחת P0 על צלחות 100 מ"מ (1 x 104 תאים חיים / ס"מ2) מצופה מראש בקולגן זנב חולדה, ותרבית את התאים באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2.

2. תרבית הרחבה ומעבר של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה

  1. החלף את המדיום עבור תרבית תאי P0 כל 3 ימים עד שהתאים מגיעים למפגש של 70%-80%, בדרך כלל תוך 6 ימים. בנקודה זו, תאי אפיתל קנה הנשימה יכולים ליצור שכבה חד-שכבתית שלמה עם מראה מרוצף אבן (איור 1A-D).
  2. חימום מראש של נפחים מספיקים של PBS, מדיום הרחבה מלא וערכת דיסוציאציה של תאים ללא רכיבים מן החי (ACF) ל-37°C.
  3. לשטוף בעדינות את התאים עם 3 מ"ל של PBS.
  4. בצע דיסוציאציה אנזימטית.
    1. הוסיפו 3 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית ACF לצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר הפיפט, יש לעקור את התאים בעדינות ולהעביר את תרחיף התא ל-3 מ"ל של תמיסת עיכוב אנזים ACF.
    2. חזור על תוספת של 3 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה אנזימטית ACF ודגור שוב במשך 5 דקות כדי להבטיח ניתוק תאים מרבי.
  5. סובב את מתלה התא ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
  6. להשעות את התאים ב 1 מ"ל של מדיום הרחבה.
  7. ספור את התאים קיימא באמצעות כחול טריפאן המוציטומטר.
  8. לוח P1 תרחיף תאים על מספר צלחות 100 מ"מ (5 x 104 תאים חיים / ס"מ2) מצופה מראש בקולגן זנב חולדה, ותרבית את התאים באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2.

3. התמיינות וגירוי CSE של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל

  1. אשר את סוג התא.
    1. אמת את מקור האפיתל של תאים מבודדים באמצעות בדיקת immunofluorescence (IFA) עם נוגדנים נגד cytokeratins. תאי זרעים על שקופיות זכוכית המצופים בקולגן זנב חולדה ומשתמשים בפרפורמלדהיד כדי לקבע אותם לפחות 12 שעות לאחר שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
    2. שטפו שקופיות 3 פעמים עם תמיסת PBS למשך 5 דקות ודגרו עליהן עם 3% BSA ו-0.1% טריטון X-100 בתמיסת PBS בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.
    3. יש לדגור על מגלשות לילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדן מסחרי נגד פאן ציטוקרטין בדילול של 1:500.
    4. למחרת, שטפו מחליקים 3 פעמים עם תמיסת PBS למשך 5 דקות ודגרו עליהם עם חיץ נוגדנים משני בדילול של 1:1000 ב- RT למשך שעתיים בחושך.
    5. לאחר הדגירה, יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים עם PBS (5 דקות לכל כביסה), ולהוסיף להן DAPI בדילול של 1:1000. לאחר הדגירה ב-RT במשך 15 דקות, שטפו את המגלשות פעם אחת עם PBS למשך 5 דקות.
    6. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי והשוו דפוסי ביטוי לבקרה חיובית (קו תאים A549) ולבקרה שלילית (קו תאים Raw264.7) (איור 2).
  2. זרעו את התאים להתמיינות.
    1. נתק וצנטריפוגה תאי P2 כפי שתואר קודם לכן, והשהה מחדש את כדורית התא בנפח מתאים של אמצעי התפשטות כדי להקל על ציפוי של 1 x 104 תאים חיים / ס"מ2.
    2. פיפטה 1 מ"ל של תרחיף התא על התא האפי של קרום פוליקרבונט transwell להחדיר. לתא הבסיסי של הטרנסוול, הוסף 1.5 מ"ל של אמצעי התפשטות.
  3. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C ולשנות באופן מלא את כל התווך בתאי הבסיס והאפיק כל 3 ימים באמצעות מדיום התפשטות עד למפגש ביניהם. פעולה זו נמשכת בדרך כלל 3-6 ימים.
  4. הכינו 50 מ"ל של מדיום בידול מלא על ידי הוספת 5 מ"ל של תוסף ALI 10x, 500 מיקרוליטר של תוסף תחזוקה ALI, 100 מיקרוליטר של תמיסת הפרין ו-250 מיקרוליטר של תמיסת מלאי הידרוקורטיזון ל-44.15 מ"ל של מדיום בסיסי ALI.
  5. הכינו CSE.
    1. מבעבעים סיגריה אחת דרך 12.5 מ"ל של מדיום בידול ולאחר מכן מסננים אותה דרך מסנן נקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי להכין CSE. כדי להבטיח סטנדרטיזציה בין ניסויים ואצוות של CSE, למדוד את הספיגה ב 320 ננומטר על ספקטרופוטומטר ולהגדיר צפיפות אופטית (OD) של 1 כמו 100%8.
  6. השתמש במדיום התמיינות המכיל ריכוז מתאים של CSE כדי לעורר תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה כדי לזהות השפעות על התמיינות התאים.
  7. לאפשר לתאים להתמיין במשך 28 ימים, שבמהלכם משתנה המדיה התאית הבסיסית, והצד האפי נשטף פעמיים בשבוע על ידי הסרת המדיה התאית האפיקלית והחלפת המדיה התאית הבסיסית במדיום ההתמיינות המכיל את הריכוז המתאים של CSE.
  8. נתח את התאים לאחר החשיפה.
    1. לאחר חשיפה למדיום התמיינות המכיל CSE, יש לקצור את התאים ואת הסופרנאטנטים של התרבית בכל נקודת זמן (כלומר, 0-28 ימים) לגילוי שינויים מורפולוגיים (כלומר, בדיקת אימונופלואורסנציה (IFA) או צביעת המטוקסילין-אאוסין (HE) או עבור הליכים אנליטיים ביואינפורמטיים (כלומר, תעתוק, פרוטאומיקה, מטבולומיקה וכו ').

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידול
תאי אפיתל של דרכי הנשימה התמינו בהצלחה לאחר תרבית בממשק אוויר-נוזל עם מדיום התמיינות במשך 28 ימים. נוכחותם של תאי ריסון וגביע הודגמה על ידי בדיקת אימונופלואורסנציה של סמן ריסונים אצטילאט α-טובולין (ירוק; איור 3A) וסמן תא הגביע Mucin5AC, בהתאמה6 (אדום; איור 3B).

קביעת ריכוז CSE להתמיינות תאים
לעורר את תאי אפיתל מבודדים עם ריכוזים שונים של CSE במשך 24 שעות. התוצאות הראו כי יכולת הקיום של תאי האפיתל ירדה כאשר ריכוז CSE היה גבוה מ-6% (p <0.05, איור 4A). על מנת לשמור על פעילות התא תחת גירוי ארוך טווח, נעשה שימוש באמצעי תרבית המכילים 2%, 4% ו-6% CSE כדי לעורר התמיינות של תאי אפיתל למשך 28 יום. יתר על כן, התוצאות הראו שעם העלייה בריכוז CSE לא היה מוות תאי משמעותי בתאי האפיתל (איור 4B), אולם היה שינוי הדרגתי במספר תאי ההתנגדות הבין-תאית לטרנסממברנה (TEER) (איור 4C) ותאי פילינג (איור 4D). נוסף על כך, נצפתה ירידה כללית בתאים ממוינים ובתאים ריסונים כאשר תרביות תאי אפיתל של דרכי הנשימה נחשפו באופן כרוני ל-CSE (איור 4E-H). לכן, מדיום ההתמיינות המכיל 6% CSE נבחר כדי לפרק את תפקוד מחסום האפיתל ולהפחית את מספר התאים המרוסנים ללא ירידה בכדאיות התא תוך התמיינות תאי אפיתל למשך 28 ימים.

ניתוח מולטי-אומיקס
שתי קבוצות של תאים שעוררו בתווך דיפרנציאלי המכיל 0% או 6% CSE במשך 28 ימים נקטפו. סה"כ mRNA הופק לצורך ניתוח תעתוק. לאחר הכנת הספרייה, ריצוף, בקרת איכות, מיפוי קריאות לגנום הייחוס וכימות ביטוי גנים, נותח הביטוי הדיפרנציאלי של גנים בין שתי הקבוצות. חבילת clusterProfiler R שימשה לביצוע ניתוח העשרה של אונטולוגיה גנטית (GO) עבור גנים שהציגו ביטוי דיפרנציאלי, עם התאמות שבוצעו כדי לקחת בחשבון פערים באורך הגנים (איור 5A). אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) משמשת כמסד נתונים מקיף המאפשר הבנה של תפקודים ותפקידים מורכבים של מערכות ביולוגיות ברמות שונות, כולל תאיים, אורגניזמים ואקולוגיים, על-ידי שילוב נתונים ברמה מולקולרית הנגזרים ממערכי נתונים נרחבים כגון אלה המיוצרים על-ידי ריצוף גנומי ומתודולוגיות ניסוייות בעלות תפוקה גבוהה (איור 5B). עבור פרוטאומיקה, סך כל החלבונים הופקו משתי קבוצות תאים לאחר 28 ימים לאחר תרביות עם מדיומים דיפרנציאליים המכילים 0% או 6% CSE. לאחר בדיקת איכות החלבון, הסרת מלחים, הידרוליזה אנזימטית של חלבונים, תיוג תגי מסה טנדם (TMT) של פפטידים, הפרדת שברים, ניתוח LC-MS, זיהוי חלבונים וכימות חלבונים, ניתן להגדיר חלבונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בין שתי קבוצות. ניתוח GO בוצע באמצעות התוכנית הבין-פרוסקנית כנגד מסד הנתונים של חלבונים לא מיותרים (איור 6A), ו-KEGG שימש לניתוח המסלול (איור 6B). עבור מטבולומיקה, הסופרנאטנטים של התרבית נאספו משתי קבוצות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה 28 ימים לאחר תרביות עם מדיום התמיינות המכיל 0% או 6% CSE. לאחר ניתוח HPLC-MS/MS, זיהוי וכימות של מטבוליטים, ניתן להגדיר את המטבוליטים הדיפרנציאליים בין שתי הקבוצות. מסד הנתונים KEGG (איור 7A), מסד הנתונים של חילוף החומרים האנושי (איור 7B) ומסד הנתונים של מפות שומנים (איור 7C) שימשו לביאור כל המטבוליטים. מסד הנתונים KEGG שימש לניתוח הפונקציות של מטבוליטים דיפרנציאליים ומסלולים מטבוליים אלה (איור 7D). עבור אפיגנומיקה, ATAC-seq בוצע כפי שדווח בעבר9. גרעינים הופקו משתי קבוצות תאים לאחר 28 ימים לאחר התרבית עם תווך דיפרנציאלי המכיל 0% או 6% CSE, וגלולת הגרעינים הושעתה מחדש בתערובת תגובת טרנספוזאז Tn5. תגובת הטרנספוזיציה הודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הוספת מתאם, הכנת ספרייה, הערכת איכות, אשכולות וריצוף, ניתן להגדיר אפיגנומיקה דיפרנציאלית בין שתי קבוצות. ניתוח העשרת GO של גנים הקשורים לשיא דיפרנציאלי משקף ישירות את התפלגות המספרים של גנים הקשורים לשיא דיפרנציאלי בפריטי GO המועשרים בתהליכים ביולוגיים, רכיבים תאיים ותפקוד מולקולרי (איור 8A). מסד הנתונים KEGG שימש לניתוח התפקודים של הגנים והמסלולים הדיפרנציאליים האלה (איור 8B).

גנים המקודדים חלבוני צומת הדוקים
נתוני שעתוק הראו שלאחר גירוי ארוך טווח של CSE, היה ביטוי מופחת של גנים רבים המקודדים חלבוני צומת הדוק, כולל Cgn, Cldn2, Cldn3, Cldn8, Cldn10, Cldn20, Cldn23, Jam2 ו-Ocln (איור 9A), שבהם ביטוי מופחת של Cldn3 ו-Ocln אושר עוד יותר על-ידי Western Blot ואימונוהיסטוכימיה (IHC) (איורים 9B-E). נתונים אלה מצביעים על כך שחשיפה ל- CSE מפחיתה באופן משמעותי את הביטוי של חלבוני צומת הדוקים של תאי אפיתל בדרכי הנשימה.

ביטוי ציטוקינים וכימוקינים
בנוסף להתמוטטות הקשרים ההדוקים, תעתיק הראה גם שלאחר גירוי ארוך טווח של CSE, הביטוי של כמה ציטוקינים וכימוקינים, כולל Cxcl5, Csf3, Il1a, Il34, Ccl20 ו-Il33 עלה, אך הביטוי של Ccl5 ירד (איור 10A). בדיקת לומינקס אישרה עוד כי היו ריכוזים גבוהים יותר של CXCL-5, CSF-3 ו-IL-1α (איור 10B-D), אך ירידה ב-CCL-5 (איור 10E) בסופרנאטנט של תאי אפיתל דרכי הנשימה של מורין. תוצאות אלה מצביעות על כך שחשיפה ל-CSE פועלת באופן סלקטיבי על ביטוי ציטוקינים וכימוקינים.

figure-results-1
איור 1: גדילה של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה. (A) תאים שבודדו לאחרונה נראים עגולים ושקופים. (B) ביום השני שלאחר הבידוד, תאים מורחבים נוצרו לאיים קטנים של תאים. (C) ביום הרביעי, היווצרות איי תאים גדולים יותר. (D) עד היום השישי, מעל 90% היתוך עם מורפולוגיה מרוצפת. (הגדלה פי 4; פסי קנה מידה: 250 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקת אימונופלואורסנציה של סמני תאי אפיתל. ביטוי ציטוקרטין בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה, A549 (בקרה חיובית) ו-Raw264.7 (בקרה שלילית). גרעינים מוכתמים ב-DAPI (הגדלה פי 63; פסי קנה מידה: 40 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: בדיקת אימונופלואורסנציה עבור סמנים של תאי ריסון וגביע. הסמנים ששימשו היו אצטילאט (A) α-טובולין ו-(B) מוצין 5AC לאישור תאי ריסונים ותאי גביע, בהתאמה (הגדלה של 100; פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר בלוח A ו-50 מיקרומטר בלוח B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: השפעת ריכוזי CSE על תאי אפיתל. (A) יכולת קיום התא ב-24 שעות בריכוזי CSE משתנים. (B) כדאיות התא לאחר 28 ימים. (ג) מדידת TEER. (D) ספירת התאים שעברו קילוף. (ה-ה) אימונופלואורסנציה לתאי ריסון (ירוק) וגביע (סגול) בריכוזי CSE של 0%, 2%, 4% ו-6% (הגדלה פי 20; פסי אבנית: 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG עבור ביטוי גנים. (A) משמעות מונח GO בתהליך ביולוגי מועשר, מרכיב תאי ותפקוד מולקולרי. (B) שיעור הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי במסלולי KEGG. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: ניתוח ביטוי חלבונים. (A) תרשים עמודות העשרה GO המציג ביטוי חלבון דיפרנציאלי. (B) ניתוח מסלול KEGG המבוסס על חלבונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: ניתוח מסלול KEGG מטבוליט. (A) ביאור כל המטבוליטים באמצעות מסד הנתונים של KEGG. (B) ביאור כל המטבוליטים באמצעות מסד הנתונים של חילוף החומרים האנושי. (C) ביאור כל המטבוליטים באמצעות מסד הנתונים Lipidmaps. (D) התפלגות מטבוליטים המבוטאים באופן דיפרנציאלי במסלולי KEGG שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: ניתוח ביטוי גנים הקשור לשיא דיפרנציאלי. (A) תרשים עמודות העשרה GO המציג ביטוי חלבון דיפרנציאלי. (B) ניתוח מסלול KEGG המבוסס על חלבונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: ביטוי של חלבון צומת הדוק בתאי אפיתל של דרכי הנשימה עם או בלי גירוי CSE. (A) מפת חום של ביטוי חלבון צומת הדוק בתעתיק (transcriptome). (ב-ה) רמות הביטוי של (B,C) Cldn3 ו-(D,E) Ocln בתאי אפיתל של דרכי הנשימה התגלו על ידי Western Blot ואימונוהיסטוכימיה עבור Cldn3 ו-Ocln (הגדלה של 80; פסי סולם: 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 10: ניתוח ביטוי ציטוקינים. (A) מפת חום תעתיק של ביטוי ציטוקינים. (ב-ה) בדיקת Luminex עבור רמות CXCL-5, CSF-3, IL-1α ו-CCL-5 בתאים עם/בלי גירוי CSE. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COPD היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה בדרכי הנשימה. חשיפה לעשן טבק מובילה לדלקת כרונית בדרכי הנשימה, לעיצוב מחדש של דרכי הנשימה ולהרס מבני של הריאות, שהוא תוצאה של אינטראקציה בין תאים מבניים שונים לבין תאי מערכת החיסון10. כקו הקדמי של מערכת החיסון המולדת בריאה, תאי אפיתל בדרכי הנשימה ממלאים תפקיד חשוב מאוד במהלך התפתחות המחלה11. מנקודת מבט זו, הבהרת האופן שבו תאי אפיתל משתנים ומווסתים את התאים במורד הזרם תחת גירוי של חומרים מזיקים היא בעיה מדעית שיש לפתור בדחיפות.

לאחרונה דווח על מספר מודלים של COPD בבעלי חיים שהתגברו על מגבלות מסוימות12. רמות מתונות של דלקת נויטרופילית בדרכי הנשימה, חתימה דלקתית Th1/Th17, ייצור יתר של ריר ניכר, עיצוב מחדש מוגבר של דרכי הנשימה, ירידה בתפקוד הריאות וחללי אוויר מוגדלים ניתן לראות במודלים אלה. למרות שמודלים אלה דורשים רק חודש אחד כדי לקבוע שינויים דמויי COPD, מה קרה בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות בתוך חודש אחד עדיין לא ברור. לשימוש בגירוי CSE ארוך טווח יש יתרון בכך שהוא מכויל בקלות רבה יותר, מה שאומר שתאי אפיתל בדרכי הנשימה יכולים להיחשף לגירוי סיגריות חמור ככל האפשר ללא מוות, בדיוק כמו תאי אפיתל בדרכי הנשימה אצל מעשנים. במקרה זה, ניטור שינויים פתולוגיים דינמיים המובילים לדלקת בדרכי הנשימה והיווצרות אמפיזמה הוא קריטי להבנה נוספת של הפתוגנזה של COPD הרלוונטית לעישון. לכן, הקמנו מודל במבחנה כדי לחקות את מצב העשן וניסינו לעקוב אחר שינויים דינמיים במהלך החשיפה של CSE לתאי אפיתל של דרכי הנשימה. יתר על כן, תאי אפיתל מטוהרים יחסית של דרכי הנשימה הופכים את המחקר הרב-אומי לקל יותר מזה של רקמות שלמות, מה שיכול לעזור לנו למצוא את התגובות המולקולריות והתאיות בחשיפה של תאי אפיתל בדרכי הנשימה ל- CSE ולזהות את מסלולי המפתח והמטרות הטיפוליות של COPD בתפוקה גבוהה.

כאן, הפרוטוקול המתאר את הבידוד של תאי אפיתל קנה הנשימה מורין מעובד מהפרוטוקולים של Hilaire et al.13, ו- You et al.14 עם כמה שינויים. בפרוטוקול ששימש במחקר זה, תאי אפיתל של דרכי הנשימה הופצו והתמיינו למבנה פסאודוסטרטי המכיל תאי ריסון וגביע באמצעות ממשק אוויר-נוזל ותווך המכיל CSE, ובכך ביססו מודל אקלום CSE כרוני. האירועים הבאים הם נקודות המפתח של המודל הנוכחי.

בהתחשב בכך שפריקת צוואר הרחם עלולה להעמיס באופן מכני על הצוואר ולפגוע פיזית בתאי האפיתל, והרדמה כלורלית הידרט עלולה להשפיע גם על דרכי הנשימה, נתרן פנטוברביטל שימש להמתת חסד15. במהלך הליכים כירורגיים בעכברים, טבילה רק של הצוואר והאזורים התחתונים כדי למנוע כניסת אלכוהול לאף יכולה להגדיל את הכדאיות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה16. נתונים ראשוניים מהמחקר הנוכחי הראו כי תאי אפיתל בדרכי הנשימה שהיו נתונים לאינטובציה בקנה הנשימה או לטבילה באלכוהול היו בעלי כדאיות נמוכה ולא הצליחו להתרחב. בנוסף, כדי לקבל תאי אפיתל בדרכי הנשימה ללא אריתרוציטים, יש להיזהר בהליכים כירורגיים כדי למנוע זיהום דם בעת בידוד דרכי הנשימה העיקריות.

אפילו בעכברים ספציפיים נטולי פתוגנים, דרכי הנשימה אכלסו חיידקים משמעותיים. הוספת אנטיביוטיקה מתאימה במדיום ההתפשטות של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה P0 חיונית למניעת זיהום מפתוגנים חיידקיים או פטרייתיים. תמיסת קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, אמפוטריצין B וגנטמיצין17 מבטיחה ביעילות את התרחבות תאי האפיתל של דרכי הנשימה P0 murine בסביבה סטרילית במבחנה . ניסויים ראשוניים הראו כי אם אין עיכוב יעיל של זיהום חיידקי, תאי אפיתל P0 murine דרכי הנשימה ימותו לפני המעבר הראשון.

בשיטות העיכול נבדקו הן 4 מעלות צלזיוס והן 37 מעלות צלזיוס. תוצאות מניסויים ראשוניים הצביעו על כך שעיכול ב-37°C השיג ביצועים טובים יותר מ-4°C במונחים של יעילות זמן, כדאיות התא ותפוקת התא.

לפני זריעת תאי אפיתל, קולגן זנב חולדה הומס בחומצה אצטית ושימש לציפוי צלחת תרבית לשיפור הידבקות תאי אפיתל18. עם זאת, צפיפות ציפוי הקולגן לא צריכה להיות גבוהה מדי או נמוכה מדי; צפיפות לא מספקת אינה מספקת תנאי הדבקה נאותים, בעוד צפיפות מוגזמת גורמת לשאריות גבישיות על פני התרבית.

צעד קריטי הוא לשמור על יותר תאי אפיתל בחיים ולהימנע מזיהום פיברובלסט. כדי להשיג זאת, אנו ממליצים כי 1) שימוש בערכת דיסוציאציה של תאים ללא רכיבים מן החי יכול לבודד בעדינות תאי אפיתל ולהפחית נזק תאי מיותר, 2) שימוש בתווך דיפרנציאלי המכיל הידרוקורטיזון יכול לעכב את הצמיחה של פיברובלסטים ולקדם את התפשטות תאי האפיתל.

תרביות חד-שכבתיות מסורתיות שקועות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה היו מצרך עיקרי במחקר נשימתי ובמחקרים טוקסיקולוגיים. עם זאת, שיטות אלה אינן מצליחות לשכפל במדויק את המאפיינים המובחנים של רקמות אפיתל דרכי הנשימה כפי שנמצאו in vivo. כדי להתמודד עם מגבלה זו, בחרנו במודל אפיתל חלופי של דרכי הנשימה. מודל זה מבוסס על טיפוח תאי דרכי נשימה ראשוניים על פיגומים מיקרו-נקבוביים, כגון אלה המסופקים על ידי מערכות טרנסוול, בממשק אוויר-נוזל19. חשיפת פני השטח האפיקליים לאוויר הסביבה במערך תרבית ALI זה מסייעת בטיפוח התמיינות תאית, ובכך מחקה באופן הדוק יותר את תנאי in vivo 20.

אם הבידול אינו יעיל, חיוני להעריך סיבות אפשריות. זה כולל את האפשרות כי תאי אפיתל דרכי הנשימה אולי עברו overaging מדי, אשר יכול לסכן את יכולת ההתמיינות שלהם. בנוסף, הכרחי להבטיח כי הצטברות ריר ונוזלים בתוך התא האפי יסולקו לחלוטין במהלך תהליך החלפת המדיה הדו-שבועי, שכן תוכן שיורי עלול לעכב את תהליך ההתמיינות.

בעוד מודל זה מציג מגבלות מסוימות, הוא נשאר כלי רב ערך למחקר. מגבלה אחת היא שהשימוש בתווך המכיל CSE כדי לעורר תאי אפיתל של דרכי הנשימה עשוי שלא לשכפל באופן מלא את תנאי in vivo שחווים תאי אפיתל דרכי הנשימה אצל מעשנים. בנוסף, הכדאיות של תאי אפיתל ממוינים במבחנה מוגבלת בדרך כלל לחודש. למרות אילוצים אלה, המודל משלב ביעילות מספר היבטים מרכזיים: הוא מאפשר מחקר של התמיינות תאי אפיתל בדרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל, הסתגלות ארוכת טווח ל- CSE, ויישום ניתוח מולטי-אומיקס על פני מסגרת זמן מסוימת. גישה מקיפה זו מציעה מסגרת מתוחכמת והוליסטית לחקירות עתידיות של המנגנונים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של תאי אפיתל בדרכי הנשימה. יתר על כן, הוא מסייע בזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומטרות טיפוליות למחלות דרכי הנשימה. אנו מקווים כי הניסיון שלנו יספק מידע שימושי עבור אלה המעוניינים להשתמש במודל זה עבור מחקרים רלוונטיים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82090013).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין 100xGibco15140122
24 מ"מ Transwell עם 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליאסטר קרום מוסיףBIOFILTCS016012
40 ומיקרו; מסננת תאיםm Falcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin SolutionGibcoR01510
אצטילציה α-טובוליןCST#5335
אצטיל-ואלפא;-טובולין (Lys40) (D20G3)XP ארנב mAb cellsignal#5335
ערכת דיסוציאציה של תאים חופשיים מרכיבים מן החיתא גזע05426
נוגדן ציטוקרטין נגד פאןabcamab7753
סיגריהמרלבורו
קלאודין3אימונווייYT0949
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקרסיגמא-אולדריץ'DN25
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקרסיגמאDN25
חזיר' s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin Solution Stemcell07980
Hydrocortisone Stock SolutionStemcell 07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludinproteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122
PneumaCult-ALI
תאי גזע בינוניים בזאליים		05002 
PneumaCult-ALI 10x תוסףתאי גזע05003 
PneumaCult-ALI תוסף תחזוקהתא גזע05006
PneumaCult-Ex Plus 50x תוסףגזע תא גזע05042
PneumaCult-Ex Plusתאי גזע בינוניים בסיסיים05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
קולגן זנב עכברושקורנינג354236
טריפן כחולתא גזע07050 
, סטרילי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
  12. Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Airway Epithelial CellsCigarette Smoke ExtractIn Vitro ModelMurine Airway CellsAir Liquid InterfaceCell DifferentiationMulti Omics AnalysisChronic Smoke ExposureImmunofluorescence AssayCOPD Pathogenesis

Related Articles