המחקר מציג את Zebra II, מערכת מתקדמת לרכישה וניתוח ממושך של א.ק.ג בדגי זברה. מערכת זו כוללת מערכת זלוף עצמאית ואלקטרודות מרובות נקודות לטיפול בדגים מרובים בסביבות מבוקרות. ההשפעות החריפות של אמיודרון הוערכו ונותחו עם דג זברה מסוג בר.
מאמר שיטה
זברה II כמערכת חדשה להקלטת אותות אלקטרופיזיולוגיים בדג זברה
במאמר זה
סיכום
תקציר
דג הזברה והקווים המוטנטיים שלהם שימשו באופן נרחב בחקירות ביו-רפואיות, מחקרים קרדיווסקולריים וסינון תרופות. במחקר הנוכחי מוצגת הגרסה המסחרית של המערכת החדשנית, זברה II. הפרוטוקול מדגים רכישה וניתוח של אלקטרוקרדיוגרמה (ECG) מדגי זברה מרובים בסביבות עבודה הניתנות לשליטה. המכשיר מורכב ממערכת זלוף חיצונית ועצמאית, אלקטרודה בעלת 4 נקודות, חיישני טמפרטורה ומערכת אלקטרונית משובצת. במחקרים קודמים, אב הטיפוס של המכשיר עבר אימות מול מערכת iWORX המבוססת באמצעות מספר בדיקות, והדגים איכות נתונים דומה ותגובת א.ק.ג להתערבויות תרופתיות. לאחר מכן, המחקר התעמק בבחינת ההשפעה של תרופות הרדמה ותנודות טמפרטורה על א.ק.ג של דג הזברה, מה שהצריך הערכת נתונים מיידית. הודות ליכולתו של המנגנון לספק באופן עקבי חומרי הרדמה ותרופות, ניתן היה להאריך את איסוף נתוני האק"ג עד שעה אחת, זמן ארוך משמעותית ממשך 5 הדקות הנתמך על ידי המערכות הנוכחיות. מאמר זה מציג ניתוח אוטומטי חלוצי מבוסס ענן המשתמש בנתונים מארבעה דגי זברה, ומציע שיטה יעילה לביצוע ניסויים משולבים ולהפחתת זמן ומאמץ באופן משמעותי. המערכת הוכיחה את עצמה כיעילה בלכידת וניתוח א.ק.ג, במיוחד באיתור הפרעות קצב הנגרמות על ידי תרופות בדגי זברה מסוג בר. בנוסף, היכולת לאסוף נתונים על פני מספר ערוצים הקלה על ביצוע ניסויים מבוקרים אקראיים עם מודלים של דגי זברה. מערכת האק"ג שפותחה מתגברת על המגבלות הקיימות, ומראה את הפוטנציאל להאיץ מאוד את גילוי התרופות ומחקר הלב וכלי הדם הכוללים דג זברה.
מבוא
מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה ברחבי העולם. על פי דוח עדכון AHA לשנת 2024, כ-2552 אנשים מתים מדי יום ממחלות לב וכלי דם בארה"ב, והעלות הישירה והעקיפה הממוצעת של CVD הוערכה ב-378.0 מיליארד דולר בשנים 2017-20181. פרפור פרוזדורים (AF) הוא אחד מהפרעות קצב הלב השכיחות ביותר בארה"ב 2 והוא קשור לפרוגנוזה שלילית, מה שמגדיל את הסיכון לשבץ מוחי ומוות הן בתרחישים של מחלות לב וכלי דם והן בתרחישים של מחלות לב וכלי דם, מה שמוביל לסיכון מוגבר לתוצאות שליליות3. סוג זה של הפרעות קצב נבדל על ידי פעילותו החשמלית המהירה והלא סדירה בפרוזדורים, מה שבדרך כלל מביא ל<קצב חדרי מהיר ולא סדיר class="xref">4. יתר על כן, בהתחשב באירועים האחרונים של COVID-19, יש מספר מוגבר של מחקרים וראיות המראים הופעה מוגברת של הפרעות קצב ביחס ל-COVID-19, בעיקר לסינוסים ברדיקרדיה5. בצד הנגדי של AF, ברדיקרדיה בסינוסים מציגה קצב לב נמוך ואיטי יותר, עם קצב לב נמוך מ-60 פעימות לדקה (bpm). אבחנה זו דורשת אלקטרוקרדיוגרמה (ECG) המציגה קצב סינוסים תקין בקצב נמוך מ-60 פעימות לדקה.
דג הזברה, Danio rerio, הוכיח את עצמו כמודל אידיאלי למחקרי לב וכלי דם ופיתוח תרופות בגלל ההומולוגיה שלו לבני אדם הן במורפולוגיה, פיזיולוגיה והן בגנטיקה6,7. למרות שיש לו רק שני חדרים שניתן להבחין בהם בהשוואה ללב בעל ארבעת החדרים בבני אדם, לדג הזברה יש מבנה התכווצות דומה עם מערכת הולכה אנלוגית8,9. לפיכך, מודל דג הזברה מתאים לחקר הפרעות קצב לב ולחקר הקשר בין מסלולים גנטיים קשורים למאפיינים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות ניתוח א.ק.ג. לגבי תכנון החיישן להקלטת א.ק.ג בדג זברה, אלקטרודות מחט קונבנציונליות משמשות בדרך כלל10. מחקרים אחרים הציגו חלופות למחטים קונבנציונליות על ידי תכנון סוג אחר של מחט העשויה מחומרים שונים11, אלה שילבו חומרים כגון חוט טונגסטן, נירוסטה וחוט כסף כדי להעריך את איכות הנתונים המוקלטים. יחד עם ערכת האק"ג הניידת, הם ביקשו להקים פלטפורמה אוניברסלית הן למעבדות מחקר והן למעבדות חינוכיות.
מערכת המחטים נפרסה גם במחקרים אחרים11,12,13,14 לביצוע מחקר על השפעות ביולוגיות ו/או הנגרמות על ידי תרופות, שבו היא הראתה תוצאות מעודדות. עם זאת, כדי להשיג אותות אופטימליים, היה צורך להכניס בזהירות את המחטים דרך הדרמיס של דג הזברה. הליך פולשני זה עלול לגרום לפגיעה בלב הדג עקב חדות המחטים, ובכך לשנות את מורפולוגיה האות13. יתר על כן, הנחת האלקטרודה במדויק על הלב הקטן מבלי לגרום נזק כדי להבטיח לכידת א.ק.ג ברורה מציגה עקומת למידה משמעותית. כתוצאה מכך, הוצגו מערכות בדיקה חלופיות שונות, כגון מערכי מיקרואלקטרודות (MEA) וחיישנים מודפסים בתלת מימד. גם הצוות שלנו וגם חוקרים אחרים השתמשו בהצלחה ב-MEA לרכישת נתונים, והשיגו נתונים המציעים יחס אות לרעש (SNR) טוב יחד עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה15,16,17. לדוגמה, הצגנו MEA שעוטף את לב הדג, ומאפשר ללכוד אותות א.ק.ג ספציפיים לאתר15,16. לעומת זאת, צוות אחר פיתח סוג אחר של MEA המבוסס על לוח מעגלים מודפסים גמיש (FPCB) שנוצר מסרט פולימיד שמטרתו להקליט אלקטרואנצפלוגרמות מרובות (EEGs) עבור מחקר אפילפסיה18. בעוד ש-MEAs מאפשרים הקלטה של אותות רבים, הם מוגבלים על ידי היכולת להעריך רק דג אחד בכל פעם בשל המספר המוגבל של תעלות האלקטרודות. בתגובה למגבלה זו, הצגנו לאחרונה מערכת מתקדמת המסוגלת להקליט א.ק.ג בו זמנית ממספר fish19. מערכת זו משתמשת בשתי אלקטרודות, כל אחת בעובי של 125 מיקרומטר ועשויות מפולימיד, כאשר אלקטרודות מרוססות זהב ממוקמות בתחתית הבית שלהן כדי להקל על רכישת נתונים. עם זאת, הכללת משאבת זרימת מים הכניסה רעש, והשפיעה על איכות יחס האות לרעש (SNR) של אותות האק"ג. בנוסף, היה צורך בשימוש בכלי איסוף נתונים מגושמים ויקרים, שדרשו חיבור קווי למחשב. בשוק, מערכות כמו iWORX מציעות ניידות משופרת באמצעות מגבר קומפקטי, אך הן מתמודדות עם בעיות לא פתורות: (i) זמן ההקלטה שלהן קצר מדי (3-5 דקות) לניסויים הדורשים משכי זמן ארוכים יותר, כגון אלה הכוללים השפעות חריפות של תרופות; (2) הדרישה להרדמת בעלי החיים, מה שעלול להלחיץ אותם ולהטות נתונים אלקטרופיזיולוגיים מולדים של הלב; (3) מדידות ידניות עוקבות מעכבות מחקר עם מספר גדול של דגים; ו-(iv) הצורך בעיבוד נתוני א.ק.ג לא מקוון ועתיר עבודה. חשוב לציין, עדיין לא הופיעו מערכות בעלות תפוקה גבוהה המשלבות מיקרו-אלקטרוניקה לניתוח פנוטיפים מוטנטיים. לכן, יצירת מערכות בעלות תפוקה גבוהה המאפשרות רישום א.ק.ג מורחב היא חיונית לחשיפת קשרים בין פנוטיפים של הפרעות קצב וגנוטיפים מוטנטיים, זיהוי פנוטיפים מרובים של הפרעות קצב הקשורים לגנוטיפים מוטנטיים בודדים, ובדיקת יעילותן של תרופות לב באמצעות מודל דג הזברה. כתוצאה מכך, הצגנו, בשנת 2022, את אב הטיפוס פורץ הדרך של מערכת Zebra II. מערכת חדשנית זו מצוידת בביצוע הקלטות א.ק.ג מורחבות ממספר דגים בו זמנית. כדי להשיג זאת, נוצרה מערכת אלקטרונית פנימית, המשתמשת בטכנולוגיית האינטרנט של הדברים (IoT) להעברת נתונים אלחוטית ומאפשרת ניתוח נתונים באמצעות אפליקציה סלולרית. הכללת טכנולוגיית ה-IoT לא רק חיזקה את הגמישות והניידות של המערכת, אלא גם הקלה על שיתופי פעולה מרחוק למחקר על דגמי דג הזברה. במחקר קודם, אימתנו את יעילות המערכת באמצעות בדיקות נרחבות, שהראינו את יכולתה 1) לרכוש נתוני א.ק.ג בו זמנית מארבעה דגים; 2) לבצע הקלטות א.ק.ג רציפות עד שעה, העולה משמעותית על הקיבולת של מערכות קיימות הלוכדות רק כמה דקות; 3) למזער את ההשפעות המבלבלות של ההרדמה על ידי שימוש בריכוז מופחת של 50% של טריקאין. יתר על כן, המערכת הדגימה יכולת חזקה להקלטות א.ק.ג ממושכות בניסויים שונים, כגון אלה הכוללים חסימת סינו-פרוזדורים המושרה על ידי נתרן (SA), שינויי קצב המושרים על ידי טמפרטורה והפרעות קצב הנגרמות על ידי תרופות הן בדגים מוטנטיים Tg (SCN5A-D1275N) והן בדגים מסוג בר בתנאי ניסוי מבוקרים. אימוץ המערכת של תעלות אלקטרודות מרובות לרישום א.ק.ג מורחב מאפשר ביצוע ניסויים אקראיים מבוקרים, המאפשרים לחקור שני דגים לכל קבוצת ניסוי בתנאים זהים20. במאמר זה, אנו מציגים את הגרסה המשודרגת של המערכת, הכוללת אלקטרודה בעלת 4 נקודות. שיפור זה מאפשר למשתמשים ללכוד קריאות א.ק.ג ממקומות שונים על הדג, מה שמפחית משמעותית את הסיכוי לקבל אותות א.ק.ג באיכות נמוכה. יתר על כן, איטרציה זו מתבססת על רוב הפונקציות שתוארו במחקר קודם19. מערכת א.ק.ג מפותחת זו מראה הבטחה גדולה בהתמודדות עם המגבלות הקיימות, ובכך מקלה באופן משמעותי על ניתוח פנוטיפים של הפרעות קצב וסינון תרופות בדגי זברה. התוספת החדשנית של האלקטרודה בעלת 4 הנקודות נבדקה בקפדנות באמצעות מחקר קצר על הפרעות קצב הנגרמות על ידי תרופות בדגי זברה מסוג בר, מה שאישר עוד יותר את יעילותה.
פרוטוקול
הקפדה על הנחיות אתיות מבטיחה רווחה וטיפול הולם בדג הזברה המעורב בניסויים שלנו. כל פעילויות הניסוי נערכו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). הניסויים והממצאים המפורטים כאן בוצעו באישור IACUC תחת הפרוטוקול המורשה AUP-21-066.
1. הכנה ואחסון של פתרונות מלאי
זהירות: הכן את תמיסת מלאי הטריקאין במכסה אדים, תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE).
- מדוד 400 מ"ג אבקת טריקאין והמיס אותה ב-97.9 מ"ל מים נטולי יונים (DI). הכניסו מערבל מגנטי למיכל וערבבו בהדרגה את התמיסה.
- התאם את ה-pH על ידי הוספה הדרגתית של פחות מ-17 מ"ל של תמיסת NaOH. המשיכו להוסיף טיפות NaOH עד שה-pH מגיע לטווח של 6.8.-7.2.
- קבע את הריכוז הסופי של תמיסת טריקאין, תוך התחשבות בתוספת NaOH הדרושה להתאמת ה-pH והאחסון.
הערה: תמיסת טריקאין רגישה לאור ויש לאחסן אותה במיכל בצבע ענבר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כאשר אינה בשימוש. - מדוד 258.13 מ"ג אמיודרון והמיס אותו ב-1 ליטר מים DI. הכניסו מערבל מגנטי למיכל וערבבו מספר דקות עד שהתמיסה נמסה לחלוטין ונקייה מכל אבקה. אחסן את התמיסה בתוך מקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כאשר אינה בשימוש.
הערה: יש להכין אמיודרון בתוך קולט אדים ולאחסן בתוך מקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ללבוש תמיד את ה-PPE המתאים.
2. גידול דגים
- שמור את הדגים במיכלים בודדים המחוברים למערכת מים במחזור, תוך שמירה על הטמפרטורה בין 28-29 מעלות צלזיוס.
- הקפידו על ניטור רציף של איכות המים והקפידו על מחזור יום-לילה של 14 שעות/10 שעות.
- חלקו את 40 הדגים לארבע קבוצות, כל אחת מורכבת מ-10 דגים, ושיכנו אותם במיכלים נפרדים.
3. הגדרת המכשיר
הערה: יש לבצע את ההליך המתואר בשלב 3.2 עבור כל תא של המכשיר (איור 1). אמנם ניתן להגדיר כל תא בצורה שונה, אך לעקביות בניסוי, רצוי לשמור על הגדרות אחידות בכל החדרים.
- חבר את המכשיר למקור חשמל והתחל פעולה על ידי לחיצה על הכפתור האדום הממוקם בלוח הקדמי.
- נווט במסך המגע של המכשיר כדי לבחור את החדר שיש להגדיר.
- כוונן את הגדרת מסנן המעבר הנמוך ל-0.1 הרץ ואת הגדרת המסנן הגבוה ל-500 הרץ. כוונן את הגדרת ההגבר ל-10,000.
- הרם את המכסה הקדמי כדי לגשת לארבעת התאים. לפני תחילת הניסוי, טבלו את הספוג של כל תא (ספוג תאית סטנדרטי) בתמיסת טריקאין, ולאחר מכן סחטו את כל הנוזלים העודפים.
- סובב את מערך ארבע האלקטרודות כדי להבטיח שהספוג נגיש לפני הכנסת הדג.
4. טיפול באמיודרון
הערה: נצלו את המים ממיכלי הדגים (מי דגים) להכנת תמיסות מדוללות של אמיודרון וטריקאין. יש לחזור על שלבים 4.3 ו-4.4 עבור כל קבוצה שהופרדה בשלב 2.3 עבור כל פתרון שהוכן בשלב 4.1.
- בצע את השלבים המתוארים להלן כדי לדלל את תמיסת המלאי של Amiodarone.
- יש לדלל 8.75 מ"ל של תמיסת מלאי ל-41.25 מ"ל מי דגים כדי להגיע לריכוז של 70 מיקרומטר.
- יש לדלל 12.5 מ"ל של תמיסת מלאי ל-37.5 מ"ל מי דגים כדי להגיע לריכוז של 100 מיקרומטר.
- יש לדלל 25 מ"ל של תמיסת מלאי ל-25 מ"ל מי דגים כדי להגיע לריכוז של 200 מיקרומטר.
- הכן את תמיסת ההרדמה על ידי דילול 4 מ"ל של תמיסת מלאי טריקאין ל-100 מ"ל מי דגים, וכתוצאה מכך ריכוז טריקאין של 0.16 מ"ג/מ"ל
- טבלו כל דג בנפרד בתמיסת Amiodarone המוכנה למשך 5 דקות. השתמשו בטיימרים כדי לנטר במדויק את משך הטבילה.
- מעבירים את הדג לתמיסת טריקאין למשך 2-3 דקות להרדמה. ודא שהטיפול אינו גורם למוות של הדג. אם דג מפגין התנהגות חריגה, כגון אובדן צבע או ירידה משמעותית בתנועת הזימים, הסר אותו מיד מהתמיסה והחזיר אותו למי דגים נקיים.
5. איסוף נתוני א.ק.ג
הערה: עקוב אחר הוראות אלה מיד לאחר השלמת שלב 4.4. חזור על התהליך עבור כל תא לפני איטום המכשיר. התאים נועדו להכיל דגים ברוחב של 4-10 מ"מ ואורך של 25-50 מ"מ.
- הרם את הדג מתמיסת הטריקאין והנח אותו על הספוג, וודא שצד הגחון שלו פונה כלפי מעלה.
- מקמו את מערך האלקטרודות בצורת מעוין מעל אזור החזה של הדג כדי ללכוד אותות א.ק.ג מארבע נקודות שונות בו-זמנית (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2A,B). הקפידו להתאים כל אלקטרודה בזהירות כך שכל סיכה תיצור מגע עם עור הדג.
- סובב כל אלקטרודה, הורד את הסיכה עד שהיא יוצרת מגע עם החלק התחתון של הדג. אם הסיכה גבוהה מדי, סובב את בורג האגודל המתאים בכיוון השעון כדי להוריד אותו עד שהוא נוגע בדג.
- בצע את ההתאמה שתוארה לעיל עבור האלקטרודות בכל החדרים.
- סגור את מכסה התאים לאחר שכל מערכי האלקטרודות ממוקמים כהלכה מעל הדגים בתאי התפעול.
- סמן כל תא להקלטה על ידי בחירתו במסך המגע, ולאחר מכן התחל את ההקלטה על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה על המסך.
- לחץ על תפסיק כפתור לאחר 2 דקות ולאחר מכן לחץ על שמור כפתור מחלונות ההנחיה שצצים על המסך לאחר העצירה. שמור את המידע בדיסק או בענן, בהתאם לצרכי המחקר הספציפיים.
6. פתרון בעיות במערכת מיקום מערך ארבע האלקטרודות
הערה: לעיתים, אלקטרודה אחת או כמה עלולות להיכשל בלכידת אות א.ק.ג ברור, מה שמחייב מיקום מחדש. השתמש בשלבים הבאים כדי לפתור בעיות במערך האלקטרודות בעת הצורך.
- לחץ על כפתור העצירה בממשק המכשיר כדי לעצור את תהליך ההקלטה ולזהות את הערוץ או הערוצים עם אותות לא עקביים.
- הרם את המכסה הקדמי לגישה לתאי האלקטרודות. זהה אילו תאים ואלקטרודות ספציפיות גורמים לבעיות.
- סובב את בורג האגודל העליון בכיוון השעון כדי לכוונן את קרבת האלקטרודה לדג. פעולה זו תוריד את האלקטרודה קרוב יותר לדג.
- חזור על שלב 6.3 לפי הצורך. אם רק התקרבות לא פותרת את הבעיה, סובב את האלקטרודה לנקודה אחרת בדג עד להשגת אות משביע רצון.
7. חילוץ וניתוח נתונים
הערה: כל ניתוח הנתונים הבסיסי המוצג במאמר זה משתמש בטכניקת Wavelet21 כדי להפחית סוגים שונים של רעש וסטיית תקן של פעימות סינוס תקינות (SDNN) כדי לחשב את שונות הפעימות של HR בקטעים של דקה אחת.
- לאחר שמירת הנתונים בדיסק או בענן, אחזר אותם לניתוח או שלח אותם ישירות לשרת ענן להמשך עיבוד.
- נווט אל הנתונים השמורים על-ידי לחיצה על לחצן עיון במסך ובחר את ערכות הנתונים לשימוש.
- בחר בלחצן חלץ באפשרויות שעל המסך וחבר כונן USB לחלק האחורי של המכשיר כדי לחלץ את הנתונים.
- עקוב אחר הנחיות המכשיר כדי לשמור את ערכות הנתונים שנבחרו בכונן החיצוני לצורך אחזור וניתוח לאחר מכן.
תוצאות
היכולת להקליט בו-זמנית אותות ECG ממספר דגים מבדילה משמעותית מכשיר זה, ומספקת יתרון ניכר בצמצום הזמן הנדרש למחקרים על תרופות או מחקרים קרדיאלגיים בדגי זברפיש או במינים דומים אחרים (איור 1). הקלטה מדויקת של אותות ECG עלולה להיות מאתגרת בשל השונות האנטומית בין הדגים, במיוחד בכל הנוגע למיקום האלקטרודות. באופן מסורתי, השגת אות ECG ברור כרוכה במיקום האלקטרודה הפעילה מעל הלב כדי להימנע מקליטת פעימות מכניות או ארטיפקטים של תנועה, כאשר אלקטרודת הייחוס ממוקמת לכיוון הבטן התחתונה. עם זאת, איתור מיקומו המדויק של הלב עלול להיות קשה בשל עומקו בתוך הרקמה או בשל פני השטח הבלתי אחידים של הדג. לעיתים, יש להניע את האלקטרודות באמצעות מיקרו-מניפולטורים כדי להבטיח מיקום מדויק, דבר שעשוי לדרוש מספר ניסיונות לפני קליטת אות באיכות גבוהה.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, המערכת מציגה גישה חדשנית המשתמשת בתצורה של ארבעה אלקטרודות במקום אלקטרודות עבודה בודדות קונבנציונליות. כל אלקטרודה פועלת באופן עצמאי, מה שמאפשר התאמות בשלושה ממדים - למעלה ולמטה (heave), הטיה קדימה ואחורה (pitch), וסיבוב סביב הציר האנכי (roll). גמישות זו מתגלה כמועילה במיוחד בעבודה עם דגים בעלי צורות שונות, שכן היא מאפשרת מיקום מדויק של האלקטרודות כדי ללכוד את אות ה-ECG האופטימלי או לבחון כיצד קריאות ה-ECG משתנות בנקודות מגע שונות על גוף הדג.
תכונה זו לא רק משפרת את היעילות של מחקרי לב ותרופות, אלא גם מרחיבה את האפשרויות עבור ECG ואפילו עבור טכניקות להקלטת ECG. בהתחשב בכך ששיטות אלו טרם עברו סטנדרטיזציה ולעתים קרובות מותאמות אישית כדי להתאים לתנאים הספציפיים של הנבדק בניסוי, מכשיר זה פותח נתיבים חדשים למחקר, ומציע שיטות איסוף נתונים גמישות ואמינות יותר (איור 2).
אחד המאפיינים הבולטים של מערכת זו הוא יכולתה להעריך עד ארבעה תרופות שונות בו-זמנית בארבעה דגים נפרדים, או לחקור את ההשפעות של עד ארבעה מינונים שונים של תרופה אחת בארבעה דגים נפרדים. מערך הניסוי יכול להשתנות מחשיפה חדה קצרה לסשנים ארוכים יותר הנפרשים על פני 1 h, הכוללים מינוני תרופות משתנים או שינויים בתנאי הסביבה כגון טמפרטורה והרדמה. במחקר זה, ביצענו ניסוי קצר כדי להדגים את יעילות השיטה, ובמיוחד להדגיש את התפקוד של מערך ארבעת האלקטרודות. בדקנו שלושה מינונים שונים של Amiodarone, תרופה אנטי-אריתמית מסוג class-III הידועה כמעוררת ברדיקרדיה ומאריכה את מרווח ה-QT בדגי זברה, לאורך תקופת חשיפה של 5 min, בדומה למחקר קודם20 שהשתמש באב-טיפוס הראשון של מכשיר זה.
בדומה למחקרים קודמים, הדגים הראו הן מרווח QTc מוארך והן ירידה בקצב הלב בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא טופלה. למרות זמן החשיפה הקצר, שהוא קצר יותר ממחקרים דומים רבים הנמשכים עד שעה אחת, הצלחנו להבחין בשינויים משמעותיים באותות ה-ECG ובפרמטרים לבביים (איור 3).
האופן שבו טיפול ב-Amiodarone הוביל לשינויים ניתנים לצפייה ב-ECG, אשר הגבירו עם העלייה במינון, מוצג ב-Figure 3A,B. באופן בולט, מרווח ה-QTc התארך עם כל העלייה עוקבת במינון ביחס לקבוצת הביקורת, שהציגה מרווח QTc של 330 ms. בקבוצות המטופלות, מרווחי ה-QTcs נמדדו כ-365 ms עבור 70 µM של Amiodarone, 480 ms עבור 100 µM, ו-546 ms עבור 200 µM. בהתאם לכך, נצפתה ירידה ניכרת בקצב הלב בתגובה למינוני ה-Amiodarone השונים ולמרווחי ה-QTcs המוארכים. קצב הלב ירד באופן משמעותי מממוצע של 120 ±5 BPM בקבוצת הביקורת ל-105 ±10 BPM ב-70 µM של Amiodarone, 90 ± 5 BPM ב-100 µM, ו-84 ±5 BPM ב-200 µM (Figure 3C,D).
על סמך ממצאים אלו, ניתן להסיק כי הטכניקה המוצעת החדשה מדגימה איכות דומה למחקרים קודמים17,18, תוך שימוש בגישה של שתי אלקטרודות (אלקטרודה עובדת אחת ואלקטרודת ייחוס אחת). אספנו בהצלחה נתונים מארבע אלקטרודות עובדות, ובחרנו באלקטרודה האופטימלית לצורך ניתוח כדי לדווח לאחר מכן על הפרמטרים הלבביים הצפויים. קריטריוני הבחירה תואמים לאלו של שיטות מוקדמות יותר, תוך דגש על הצורך בהדמיה ברורה של קומפלקס PQRST ורעש בסיס נמוך באות ה-ECG. דבר זה מאפשר את חישוב מרווחי ה-QT וה-QTc ומקל על זיהוי הבדלים ברורים. כמו כן, המתודולוגיה עברה תיקוף נוסף באמצעות בדיקה של שלושה חוקרים נוספים מהקבוצה שלנו שלא השתתפו בפיתוח המכשיר הנוכחי. הם יישמו תחילה את המתודולוגיה הראשונית שהוצעו על ידי המתכננים, ולאחר מכן הציעו שינויים בהתבסס על המשוב שלהם, מה שהוביל לזיקוק הגישה המוצגת כעת. תהליך שיפור איטרטיבי זה היה חיוני לשכלול המכשיר, תוך ניצול תובנות מחוקרים חיצוניים כדי להפוך אותו לידידותי יותר למשתמש ויעיל יותר ליישומים עתידיים.
מחקר קצר זה על תגובה לתרופות מדגיש את יעילות המכשיר לא רק בהקלטה סימולטנית של ECG מארבעה דגים שונים בתנאים שונים, אלא גם בלכידה של מספר (ארבעה) אותי ECG לכל דג. יכולת רב-גורמית זו מפחיתה משמעותית את הזמן והמאמץ הנדרשים להצבת האלקטרודות וממזערת את הסבירות לטעות אנושית על ידי אספקת מבחר של אותות. בחירה זו מאפשרת לבחור את האות המדויק ביותר או את היכולת לרכז נתונים ממספר אותות בהתאם למטרת המחקר. עם זאת, חשוב להבהיר כי שימוש במערך של ארבעה אלקטרודות אינו מבטיח באופן אוטומטי שכל ארבעת האותות יהיו נקיים ובאיכות גבוהה. המטרה העיקרית של השקת תכונה חדשנית זו היא להפחית טעויות אנוש ולחסוך בזמן על ידי אפשור ארבע הקלטות סימולטניות במקום הקלטות סדרתיות, דבר שיעיל יותר מבחינת זמן ופחות מלחיץ עבור הדגים, בהינתן סבילותם המוגבלת לזמן מחוץ למים ותחת הרדמה.
איור 1: מערכת Zebra II. (A) מבט איזומטרי של מכשיר ה-Zebra II (מודל SolidWorks) עם רכיבים מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקום אלקטרודות בדג זברה. (A) דרגות החופש של מחזיק אלקטרודות בעל 4 נקודות (תמונה קונספטואלית). (B) מיקום אלקטרודות על חזה הדג. (C) אות ECG ממחזיק אלקטרודות בעל 4 נקודות (ערוצים 1-4). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 3: השפעות של חשיפה חדה לאמיודרון (אותות ECG). (A) נתוני ECG מייצגים שהתקבלו מהמערכת והשינוי בפרמטרי ה-ECG עקב ריכוזי Amiodarone שונים. (B) שינוי ב-ECG עקב חשיפה ל-Amiodarone. (C) תרשים עמודות המתאר את השונות ב-HR. (D) תרשים עמודות המתאר את השונות במרווח QTc בנתוני ECG בריכוזי Amiodarone שונים. *p<0.05 (ניתוח שונות חד-כיווני עם מבחן Tukey). פסי השגיאה מצביעים על סטיית תקן. איור זה שונה מ-20. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
דיון
השלבים הנוכחיים שונו ושופרו בהתאם לגרסת המכשיר החדשה הזו ממחקר קודם שנעשה על ידי הצוות שלנו20. כאן, כלול גם עיצוב בעזרת מחשב (CAD) של המכשיר.
כפי שמודגש במדריך פתרון הבעיות של הפרוטוקול, ההתקן מחייב את המשתמש לבצע שלבים קריטיים מסוימים בחריצות ובדייקנות, מכיוון ששלבים אלה משפיעים באופן מכריע על איכות אות ה-ECG. בהתאם לממצאים מהמחקר הקודם שלנו20, מיקום האלקטרודות ממלא תפקיד משמעותי ברכישת קריאות א.ק.ג איכותיות וברורות מדגימות דג הזברה. בשל שיטה זו המרחיבה את מספר האלקטרודות העובדות מאחת לארבע ומציגה דרגות חופש נוספות, היא דורשת שלבי פתרון בעיות משלימים ומיקום אלקטרודות מעודן על אזור הגחון של הדג לקבלת תוצאות מיטביות.
היתרונות והתכונות החדשניות של המכשיר טמונים במדידה מורחבת לניסויים רב-שלביים, מוגבלים למחקרים בני שעה, סינון תפוקה גבוהה עם דגי זברה מרובים (ארבעה מחקרים בו זמנית), הגדרת ניסויים מבוקרת מאוד, הקלטות אלקטרופיזיולוגיה נוספות לכל דגימה (עד ארבע) וניתוח ואחסון נתונים אוטומטיים מבוססי ענן. מכאן, ברצוננו להדגיש כי הנושא העיקרי המטופל הוא הזמן הדרוש לביצוע בדיקת תרופות ומחקרי לב בדגי הזברה, שכן שיטות מסורתיות דורשות סינון אחד אחד וניסויים מרובים כדי לאסוף מספיק מידע22. זה גם מציע דרך חדשה להשתמש במערכים רב-ערוציים כדי להקליט א.ק.ג בצורה פשוטה יותר בהשוואה לאלה המשתמשים במערכי מיקרו-אלקטרודות (MEA) או במעגלים מודפסים גמישים (FPCB)18 שדרשו שלבים נוספים בייצור האלקטרודות שהוזכרו בתוספת ההליך הדרוש להצמדתן לדגים בהשוואה לשיטה המוצעת המסתמכת גם על מגע עם פני השטח אך בצורה פחות פולשנית.
מגבלות המערכת אינן שונות מאלו המוצגות בשיטות מסורתיות 19,20 אך הן פחות אינטנסיביות מכיוון שמערך רב-ערוצי משמש להפחתת מספר ניסויי ההקלטה הדרושים למחקר. מגבלות אלו מסתמכות על מיקום האלקטרודה, שכן מומלץ לעקוב אחר המיקום המוצע המוצג באיור 2B. כמו כן, צריך להיות ברור שהמשתמש לא יכול לצפות להקלטות מושלמות במהלך הניסוי הראשון בארבעת הערוצים שכן ההבדלים האנטומיים של הדגים והעיבוד המקדים של הדגימה (הסרת קנה מידה, הליכי חזה פתוח וכו') ישפיעו ישירות על איכות הבדיקות והצלחתן.
גילויים
הונג קאו ומייקל לאו הם המייסדים של Sensoriis, Inc. המערכת Zebra II של Sensoriis פותחה בתמיכת NIH, SBIR Phase II #R44OD024874. אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, בחנה ואישרה את מערכת היחסים של הונג קאו עם Sensoriis, Inc. בהתאם למדיניות ניגוד העניינים שלה. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
תודות
אנו אסירי תודה על התמיכה של #R44OD024874 שלב II של ה-NIH SBIR ל-H.C. ו-M.P.H.L. המחברים מבקשים גם להכיר בתמיכה הכספית הניתנת על ידי המועצה הלאומית למדעי הרוח, המדע והטכנולוגיה (CONAHCYT) במקסיקו באמצעות המלגה שכותרתה Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אמיודרון הידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | PHR1164-1G | אבקת אמיודרון |
| מד pH/mV ספיר | 10500308 | ||
| מדעי אתיל3-אמינובנזואט, מלח חומצה מתאנסולפונית, 98%, ACROS אורגניקס | פישר | AC118002500 | אבקת טריקאין |
| איזוטמפ פלטה חמה בוחש | פישר סיינטיפיק | SP88854200 | |
| מערכת Zebra II | Sensoriis | N/A | מערכת הקלטת א.ק.ג מסחרית של דג זברה |
| מערכת א.ק.ג של דג זברה | iWorx | ZS-200 | מערכת הקלטת א.ק.ג מסחרית של דג זברה |
מקורות
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: A report from the American heart association. Circulation. 145 (8), e153-e639 (2022).
- Zulkifly, H., Lip, G. Y. H., Lane, D. A. Epidemiology of atrial fibrillation. Int J Clin Pract. 72 (3), e13070(2018).
- Ferreira, C., Providência, R., Ferreira, M. J., Gonçalves, L. M. Atrial fibrillation and non-cardiovascular diseases: A systematic review. Arq Bras Cardiol. 105 (5), 519-526 (2015).
- Hu, Z., Ding, L., Yao, Y. Atrial fibrillation: mechanism and clinical management. Chin Med J. 136 (22), 2668-2676 (2023).
- Babapoor-Farrokhran, S., Rasekhi, R. T., Gill, D., Babapoor, S., Amanullah, A. Arrhythmia in COVID-19. SN Comp Clin Med. 2 (9), 1430-1435 (2020).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Koopman, C. D., et al. The zebrafish grime mutant uncovers an evolutionarily conserved role for Tmem161b in the control of cardiac rhythm. Proc Natl Acad Sci. 118 (9), e2018220118(2021).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. , Springer International Publishing. (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 161-171 (2010).
- Sun, P., et al. Micro-electrocardiograms to study post-ventricular amputation of Zebrafish heart. Ann Biomed Engg. 37 (5), 890-901 (2009).
- Lin, M. H., et al. Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish. Sci Rep. 8 (1), 15986(2018).
- Chaudhari, G. H., Chennubhotla, K. S., Chatti, K., Kulkarni, P. Optimization of the adult zebrafish ECG method for assessment of drug-induced QTc prolongation. J Pharmacol Toxicol Methods. 67 (2), 115-120 (2013).
- Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation. Sci Rep. 6, 25073(2016).
- Stoyek, M. R., Rog-Zielinska, E. A., Quinn, T. A. Age-associated changes in electrical function of the zebrafish heart. Prog Biophys Mol Biol. 138, 91-104 (2018).
- Cao, H., et al. Wearable multi-channel microelectrode membranes for elucidating electrophysiological phenotypes of injured myocardium. Integ Biol. 6 (8), 789-795 (2014).
- Lenning, M., et al. Real-time monitoring and analysis of zebrafish electrocardiogram with anomaly detection. Sensors. 18 (1), 61(2018).
- Yu, F., et al. Flexible microelectrode arrays to interface epicardial electrical signals with intracardial calcium transients in zebrafish hearts. Biomed Microdev. 14 (2), 357-366 (2012).
- Cho, S. J., et al. Zebrafish as an animal model in epilepsy studies with multichannel EEG recordings. Sci Rep. 7 (1), 3099(2017).
- Continuous electrocardiogram monitoring in Zebrafish with prolonged mild anesthesia. Le, T., et al. 42nd Ann Int Conf IEEE Engg Med Biol Soc, , 2610-2613 (2020).
- Le, T., et al. A novel wireless ECG system for prolonged monitoring of multiple zebrafish for heart disease and drug screening studies. Biosensors Bioelectron. 197, 113808(2022).
- Kouzehgar, K., Eslamian, S. Chapter 2 - Application of experimental data and soft computing techniques in determining the outflow and breach characteristics in embankments and landslide dams. Handbook Hydroinfo. 3, 11-31 (2023).
- Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (1), H269-H273 (2006).
הדפסות חוזרות והרשאות
