שיפור תוצאות התלמידים עם ניסיון מחקר לתואר ראשון המבוסס על קורס שיבוט מולקולרי ניתן להתאמה

סיכום

מודול שיבוט מולקולרי של Gibson Assembly הניתן להתאמה הועסק בפורמט ניסיון מחקרי לתואר ראשון (CURE) מבוסס קורס לתלמידי קורס מעבדה לביולוגיה מולקולרית. הערכת תוצאות הלמידה של התלמידים הראתה שיפור בהבנה ובביטחון בשיבוט מולקולרי לאחר השלמת CURE, ופלסמידים חדשים שובטו למחקר ביוסינתזה של מוצרים טבעיים.

תקציר

ההתקדמות המתמשכת של טכניקות ביולוגיה מולקולרית דורשת כי תוכניות הלימודים ביולוגיה מולקולרית מעודנות באופן קבוע כדי להכין ביעילות את התלמידים להיכנס לכוח העבודה עם יכולות מודרניות. בפרט, הופעתה של Gibson Assembly, טכניקת שיבוט מולקולרית אדפטיבית וניתנת להתאמה אישית, קידמה את הנוף של שיבוט מולקולרי בסביבות מחקר רבות. לפיכך, יצרנו מודול שיבוט של Gibson Assembly לפריסה בקורס מעבדה לביולוגיה מולקולרית באוניברסיטה הפוליטכנית של קליפורניה, סן לואיס אוביספו והערכנו את תוצאות הלמידה של התלמידים מהמודול. במהלך שלוש חזרות של הקורס, הסטודנטים השתתפו בפרויקט עצמאי מבוסס ניסוי שכלל שיבוט שלוש ספריות פלסמיד ייחודיות לתמיכה בפרויקטי מחקר בביוסינתזה של מוצרים טבעיים. התלמידים קיבלו שאלונים לפני ואחרי כדי להעריך את הבנתם בשיבוט מולקולרי ואת ביטחונם במונחים ובטכניקות של ביולוגיה מולקולרית. תגובות התלמידים הראו עלייה משמעותית הן בלימוד מושגי שיבוט מולקולרי והן בדיווח עצמי על ביטחון עם מונחים וטכניקות שיבוט מולקולרי. ניתן להכליל מסגרת מודול זו כדי ללמד את Gibson Assembly עבור יישומים שונים, ולספק למדריכים ערכת כלים להוראת טכנולוגיית שיבוט ניתנת להתאמה ומתפתחת תוך קידום פרויקטי המחקר שלהם.

מבוא

הכשרת סטודנטים לתואר ראשון במושגי ביולוגיה מולקולרית בסיסיים ובטכניקות מעבדה חיונית להתפתחותם המדעית והמקצועית שכן מתודולוגיות אלה נפוצות במסגרות מחקר שונות, כולל אקדמיה ותעשייה. ככזה, סטודנטים בביולוגיה (ריכוז ביולוגיה מולקולרית ותאית) וביוכימיה באוניברסיטה הפוליטכנית של קליפורניה, סן לואיס אוביספו (Cal Poly) נדרשים לקחת קורס מעבדה ביולוגיה מולקולרית חטיבה עליונה כדי ללמוד וליישם נושאים אלה (CHEM / BIO 475). תוכנית לימודים בסיסית לקורס זה פותחה בעבר בה התלמידים מבצעים שיבוט מבוסס טופואיזומראז (TOPO) כדי להרכיב פלסמיד המכיל אקטין המוכן מתבנית DNA משלים של שמרים (cDNA)¹. התלמידים מתכננים ניסויים המבוססים על שאלות המחקות השערות מחקר אותנטיות, ומגבירים את היכרותם עם פרקטיקות מעבדה ולמידה מבוססת חקירה. התקדמות מתמשכת בתחום הביולוגיה המולקולרית דורשת כי תוכניות הלימודים המתאימות להתאים להכין תלמידים עם יכולות מודרניות עבור כוח העבודה. בפרט, השימוש באסיפת גיבסון הפך לדומיננטי יותר בקהילה המדעית; בעוד השיטה הוקמה במקור כדי לסנתז כרומוזומים מלאכותיים², מעל 5,000 פרסומים בזמן דו"ח זה התייחסו לעבודתם המקורית של גיבסון ואחרים. הרכבה של גיבסון ייחודית בהשוואה למתודולוגיות שיבוט מסורתיות: היא ניתנת להתאמה אישית גבוהה ויכולה בקלות לקשור מקטעי דנ"א ליניאריים מרובים ללא צורך באתרי הגבלה כדי לייצר את הצמתים. לפיכך, ראינו הזדמנות לחדש את תוכנית הלימודים של CHEM / BIO 475 כדי לשלב טכניקות שיבוט מולקולרי מודרניות ולשפר את מודל הקורס מבוסס החקירה.

נקבע כי חוויות המחקר של התלמידים תורמות להבנה מושגית מוגברת, פיתוח מיומנויות והתמדה במדע³, אך לא לכל הסטודנטים לתואר ראשון יש הזדמנות להשתתף ישירות במעבדת מחקר. כדי להתמודד עם האתגר של קיבולת מוגבלת של סטודנטים במעבדות מחקר, חוויות מחקר לתואר ראשון מבוססות קורס (CUREs) פותחו והופעלו כדי להגדיל את הנגישות המדעית באמצעות מחקר אותנטי בכיתה. בעוד CUREs משתנים ביישומם, נקבעו פרקטיקות נפוצות המתייחסות לחמשת עקרונות המחקר המדעי. ב- CURE מתוכנן היטב, התלמידים 1) ישתמשו בפרקטיקות מדעיות, 2) ישתפו פעולה בפרויקט מחקר, 3) ינסו לגלות תגליות חדשות, 4) יתרמו לעבודה רלוונטית מחוץ לכיתה, ו -5) יעריכו מחדש וישנו השערות ושיטות במקרה של כישלון ניסויי⁴. בדומה לחוויות מחקר מסורתיות של סטודנטים במעבדה, CUREs הוכחו כמחזקים את אמון התלמידים במדע, מיומנויות מדעיות, בעלות על פרויקטים והתמדה במדע, טכנולוגיה, הנדסה ומתמטיקה (STEM)⁵. בעוד שבעבר דווח על CUREs הכוללים שיבוט מולקולרי 6,7,8,9,10,11,12,13, איננו מודעים לאף אחד מהם המדגישים את יכולת ההסתגלות של אסיפת גיבסון ליצירת ספרייה של פלסמידים מחקריים אותנטיים.

כאן, אנו מדווחים על הרחבה של תוכנית הלימודים הנוכחית מבוססת חקירה CHEM / BIO 475 באוניברסיטה הפוליטכנית של קליפורניה, סן לואיס אוביספו עם שני שיפורים עיקריים: ניסיון מעשי באמצעות אסיפת גיבסון והשתתפות סטודנטים ב- CURE, שסיפקה מבני פלסמיד מקוריים לפרויקטים מחקריים במימון הקרן הלאומית למדע (NSF-1708919 ו- NSF-2300890). במהלך שלושה יישומים של תוכנית לימודים זו, התלמידים תרמו לשני פרויקטי מחקר נפרדים המתמקדים בביוסינתזה של מוצרים טבעיים של מולקולות ביו-אקטיביות המיוצרות על ידי Actinomycetota. מוצרים טבעיים מכילים לעתים קרובות פרמקופורים עם פעילויות אנטיביוטיות, אנטי פטרייתיות ו / או אנטי סרטניות, מה שמקנה למולקולות קטנות אלה חשיבות במאמצי גילוי תרופות ופוטנציאל לרלוונטיות קלינית¹⁴. מחקר זה דורש יצירת ספריות פלסמיד כדי לאפשר לחקור הן את התפקוד והן את הפוטנציאל ההנדסי של אנזימים ביוסינתטיים חיידקיים. ב-CURE, סטודנטים תכננו וביצעו ניסויי Gibson Assembly כדי לשכפל את ספריות הפלסמיד הייחודיות הרלוונטיות לפרויקטי המחקר האלה (איור 1). בנוסף, הפורמט והעיצוב של המודול הוא ייחודי כי זה בקלות להסתגל כדי ליצור כל פלסמידים של עניין עבור פרויקטים מחקר אחרים.

איור 1: סקירה כללית של תפקידה של אסיפת גיבסון במעבדת המחקר שלנו. Actinomycetota מייצרת מוצרים טבעיים של מולקולות קטנות עם פעילויות ביולוגיות רלוונטיות מבחינה קלינית באמצעות צבירי גנים המקודדים אנזימים ביוסינתטיים. במחקר שלנו, פלסמידים המכילים גן ביוסינתטי מורכבים באמצעות אסיפת גיבסון לחקירות במורד הזרם של תפקוד האנזים המקודד. אייקונים מדעיים משנת Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סקירה כללית של המעבדה

המעבדה לביולוגיה מולקולרית היא קורס חטיבה עליונה הנדרש למגמות ביוכימיה וביולוגיה עם ריכוז ביולוגיה מולקולרית ותאית. סטודנטים אחרים העומדים בדרישות הקדם מוזמנים ללמוד את הקורס כקורס בחירה בחטיבה העליונה. הקורס מתקיים בשיתוף המחלקה לכימיה וביוכימיה והמחלקה לביולוגיה ב-Cal Poly. חברי סגל משתי המחלקות מלמדים בתורות את הקורס בכל סמסטר (שני רבעים ביולוגיה, רבע כימיה וביוכימיה).

הכיתה נפגשת במעבדה פעמיים בשבוע לפרקי זמן של 170 דקות ופעם בשבוע להרצאה של 50 דקות. מדורי מעבדה מכילים מקסימום של 16 סטודנטים ו 2-3 קטעי מעבדה מוצעים בכל רבעון. הקורס נמשך 10 שבועות, ובחינת הגמר נערכת במפגש האחרון בשבוע 10. זמן ההרצאה מוקדש לדיון בתיאוריה שמאחורי רבות מהטכניקות הניסוייות שנערכו במעבדה, כמו גם בנושאים עכשוויים בביולוגיה מולקולרית שאינם מכוסים במעבדה. תוכנית הליבה של המעבדה כוללת את תהליך שיבוט הגן אקטין משמרים¹, שנמשך כ-7 שבועות (13-14 מפגשי מעבדה). הטכניקות כוללות מיקרופיפטינג, בידוד RNA שמרים, הגברת גן שמרים באמצעות תגובת שרשרת שעתוק לאחור-פולימראז (RT-PCR), שיבוט טופו, סינון כחול-לבן, בידוד פלסמיד ואימות החדרה על ידי תקציר הגבלה ו- PCR, בניתוח סיליקו של שיבוטים, וניתוח רצף DNA. תוכנית הלימודים במשך 3 השבועות האחרונים של הקורס נתונה לשיקול דעתו של המדריך, אך כוללת תלמידים המשלימים "פרויקט עצמאי" עם תוצאות לא מוגדרות.

סקירה כללית של הניסוי

מוקד אחד של קבוצת המחקר שלנו הוא מסלולים ביוסינתטיים באקטינומיצטוטה. בעת תכנון הפרויקט העצמאי, חזינו שסטודנטים ייצרו פלסמידים באמצעות Gibson Assembly לשימוש בפרויקטי המחקר שלנו החוקרים ביוסינתזה של מוצרים טבעיים. בעוד שהאיטרציות של מודול הקורס המוערכות כאן היו מיוחדות לפלסמידים המאפשרים מניפולציה של מסלולים ביוסינתטיים, תהליך העבודה של הרכבת גיבסון ניתן להתאמה עצומה לפרויקטים אחרים של שיבוט מולקולרי (איור 2). תהליך העבודה פוצל לשלושה ניסויים שונים (A, B ו-C) שהושלמו על פני שתי תקופות הרצאה ושש תקופות מעבדה (3 שבועות בסך הכל) (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). לניסויים קדמו דפי עבודה לתמיכה בהכנת התלמידים ולהערכת הבנת התלמידים (קובץ משלים 3, קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5). זרימת העבודה מוצגת בפורמט גמיש לצרכים ולתחומי העניין של המדריך.

איור 2: זרימת עבודה של מודול Gibson Assembly. יום 1 ויום 4 הם תקופות הרצאה בהן התלמידים משלימים ניתוח רצף סיליקו ועיצוב ניסויי. ימים 2-3 ו-5-8 הם מפגשי מעבדה שבהם נערכים השלבים לשיבוט פלסמידים חדשים באמצעות אסיפת גיבסון, ולאחר מכן בידוד וסינון. תרשים הזרימה הציורי מקובץ לפי שלושת הניסויים שהתלמידים מבצעים (A, B ו-C). הוראות ופרוטוקולים מפורטים יותר ניתן למצוא במדריכים למדריך ולתלמיד המסופקים כקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2, בהתאמה. אייקונים מדעיים משנת Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מודול הפרויקט העצמאי Gibson Assembly נוסה לראשונה ברבעון האביב של 2019 ב- CHEM/BIO 475. בשנים 2020 ו -2021, הקורס נלמד באופן מקוון עקב מגיפת SARS-CoV-2. כאשר חודשה ההוראה הפרונטלית באביב 2022 ו-2023, סטודנטים בקורס הוזמנו להשתתף במחקר להערכת תוצאות למידה של פרויקט עצמאי של Gibson Assembly שבו ישובטו פלסמידים מקוריים ורלוונטיים למחקר. בשנת 2019, סטודנטים יצרו ספרייה של פלסמידים המורכבת מקלטות גנים מהגנום של Micromonospora echinospora ATCC 15837 ששובטו לתוך pKC1132 (איור 3). ספריית פלסמיד זו משמשת במעבדת המחקר שלנו כדי להשבית גנים בעלי עניין בצביר גנים ביוסינתטי משוער עבור המוצר הטבעי TLN-05220¹⁵. כדי להשלים את מחקרי השבתת הגנים שלנו, סטודנטים בשנת 2022 שיבטו ספרייה קטנה של גנים מאשכול הגנים המשוער TLN-05220 לתוך pUC19 (Figure 3); קבוצת המחקר שלנו השתמשה בפלסמידים אלה לשיבוט גנים לווקטורי ביטוי, כולל pET28b, לביטוי יתר וטיהור חלבונים. סטודנטים במחזור 2023 תרמו לעבודה מתמשכת על פרויקט הנדסה ביוסינתטית על epoxomicin synthetase¹⁶. בצוותים של 3-4, סטודנטים שיבטו תחומים מהונדסים של מודולי סינתטאז¹⁷ פפטיד לא ריבוזומלי לתוך וקטורים שונים של ביטוי חלבונים כדי למטב את ביטוי היתר והטיהור של האנזימים האלה במעבדת המחקר שלנו (איור 3). יתירות נבנתה בתוכנית השיבוט עבור כל קבוצה. לדוגמה, מחזור 2019 הכיל 44 תלמידים, ו -15 פלסמידים הוקצו לכיתה, לשיבוט. לפיכך, נעשה ניסיון שיבוט של כל פלסמיד פעמיים או שלוש.

תרשים 3: סיכום של פלסמידים משובטים וסטודנטים משתתפים במהלך חזרות פרויקטים עצמאיים בשנים 2019, 2022 ו-2023. פרויקט Gibson Assembly נפרס שלוש פעמים. בכל הצעה, הסטודנטים שיבטו ספרייה אחרת של פלסמידים שישמשו בפרויקטים מחקריים הבוחנים מסלולים ביוסינתטיים. פרויקטים בשנים 2019 ו-2022 תמכו בעבודתנו השוטפת על המוצר הטבעי TLN-05220¹⁵ עם שתי תגובות מקטע (קלטת גן אחת או גן אחד וקטור) Gibson Assembly. הפרויקט בשנת 2023 כלל החלפת תחומים בתוך מודולים 1 ו-2 של אנזים סינטטאז פפטידי לא ריבוזומלי (NRPS) המעורב בביוסינתזה של אפוקסומיצין¹⁶. השברים שבקעו מייצגים שני מוטנטים שונים של התחום שהוחלף, וצבעים אחידים מייצגים תחומים שלא הוחלפו. בסך הכל, שמונה מקטעי גנים שונים (ארבעה עבור מודול 1 וארבעה עבור מודול 2) נוצרו עם שלוחות תואמות עבור Gibson Assembly. עבור כל מודול, שני שילובים שונים של שלושה מקטעי גנים הורכבו עם אחד משני וקטורים שונים (pBAD33 ו-pET28, ארבעה מקטעים בסך הכל לכל הרכבה), עבור הפוטנציאל ליצור שמונה פלסמידים NRPS מהונדסים של NRPS. אייקונים מדעיים משנת Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סקירה כללית של הערכה

לפחות שבוע לפני תחילת הפרויקט העצמאי של Gibson Assembly, סטודנטים במחזורי 2022 ו-2023 הוזמנו להשתתף בחקירת תוצאות למידה, שתוכננה בדומה למחקר שנערך בקורס מעבדה לביוכימיה ב-Cal Poly¹⁸. הסטודנטים מילאו שאלון מקדים רב-ברירה בישיבת המעבדה לפני תחילת הפרויקט העצמאי ופוסט-שאלון רב-ברירה במהלך פגישת המעבדה הסופית (כלומר, לאחר שהשלימו את מודול הרכבת גיבסון). השאלונים לפני ואחרי השאלון כללו 28 שאלות זהות ושתי שאלות נוספות לאחר השאלון (30 בסך הכל). עשר שאלות תוכן נכתבו כדי להעריך את הידע של התלמידים על אנזימים ומנגנונים המעורבים בשיבוט מולקולרי (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR], הרכבת גיבסון, טרנספורמציה, סינון כחול-לבן). שבע השאלות הבאות ביקשו מהתלמידים להעריך בעצמם את היכרותם עם מונחי שיבוט מולקולרי (למשל, DNA פולימראז, אקסונוקלאז, ליגאז). 10 השאלות הבאות אפשרו לתלמידים להעריך את יכולתם לבצע טכניקות שיבוט מולקולרי (למשל, ניתוח רצף DNA, תגובות עיכול הגבלה, אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז). הסטודנטים גם דיווחו אם יהיה להם נוח להמשיך בקריירה בביולוגיה מולקולרית בהתבסס על הידע שלהם בטכניקות שיבוט מולקולרי. שתי שאלות נוספות נכללו לאחר השאלון כדי לאפשר לסטודנטים להעריך את מחויבותם ללמידה בקורס והאם הקורס היה חוויה לימודית בעלת ערך (קובץ משלים 6 ותיק משלים 7). כל הנתונים מתשובות התלמידים לשנים 2022 ו-2023 לפני ואחרי השאלון שולבו לניתוח וזמינים בטבלה משלימה S1.

פרוטוקול

המחקרים שכללו משתתפים אנושיים נסקרו ואושרו על ידי נבדקים אנושיים במועצת הסקירה המוסדית למחקר ב- Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). המשתתפים נתנו את הסכמתם מדעת בכתב להשתתף במחקר זה.

הפרוטוקול הבא מתאר את הכנת המדריך (שלבים 1.1-1.3), פעולות התלמידים למודול הוראה בן שלושה ניסויים הכולל PCR להשגת מקטעים ליניאריים (שלבים 2.1-2.7), הרכבה של גיבסון, טרנספורמציה ובחירה של שיבוטים (שלבים 3.1-3.5), בידוד פלסמיד וסינון (שלבים 4.1-4.4), והערכת תוצאות למידה (5.1 –5.2). הכנת המדריך מתארת דוגמה מייצגת אחת של תכנון פריימר והכנת מפת פלסמיד רצויה בסיליקו. כל חלקי הפרוטוקול ניתנים להתאמה עבור פלסמידים רצויים אחרים. כל ניסוי סטודנטים מחולק לשני מפגשי מעבדה של 3 שעות.

1. הכנת המדריך

1. עיצוב פריימר של Gibson Assembly באמצעות Benchling Assembly Wizard
   1. קבע את מקור תבנית ה- DNA עבור תוספות הגנים, כגון DNA גנומי, פלסמיד ו- DNA סינתטי.
      הערה: עבור גנים שיוגדלו מתבניות DNA גנומיות מורכבות, מומלץ לקבוע תחילה אתרי קישור ייחודיים לפריימרים בתוך תבנית הדנ"א הגנומי הספציפיים לגנים המעניינים, באמצעות הכלי הבסיסי לחיפוש יישור מקומי (BLAST) של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI)²¹, כמפורט בקובץ משלים 1. עבור תבניות פשוטות כגון פלסמידים או דנ"א סינתטי, המשך לשלב הבא.
   2. אחזור רצפי DNA של תוספות הגן והווקטור (לדוגמה, ראה רצף הגן polyketide hydroxylase ורצף pUC19 שסופקו כקובצי GenBank בקובץ המשלים 8). ייבא את רצף ההוספה הרצוי ואת הרצף הווקטורי הרצוי ל- Benchling, כל אחד מהם כקובץ רצף DNA חדש. פתח כל רצף מיובא כדי להיכלל בתגובת אסיפת גיבסון.
      הערה: ניתן לייבא קבצי רצף DNA במספר פורמטים, כולל GenBank ו- FASTA. ניתן גם לייבא רצף ישירות ממסד נתונים עם מספר הצטרפות או להדביק רצף נוקלאוטידים שהועתק מקובץ או מציג אחר.
   3. בתחתית המסך, אתר את הכלי אשף ההרכבה . לחץ/ י על ״אשף ההרכבה״ ולאחר מכן בחר/י ״צור הרכבה חדשה״. מתוך האפשרויות המוצגות, בחר Gibson ולחץ על התחל כדי להתחיל בהרכבה.
   4. בחלון הרצף הווקטורי , בחר את כל הבסיסים שייכללו בהרכבה מעמוד השדרה הווקטורי. התחל את הבחירה במיקום הנוקלאוטידים בקצה 3' של עלון הגן (לדוגמה, מיקום 657 של pUC19), ובחר את כל הנוקלאוטידים הנותרים שייכללו (למשל, דרך מיקום 656 כדי לכלול רצף pUC19 שלם). לאחר שנבחר, לחץ על הכרטיסיה עמוד שדרה בתחתית המסך| הגדר מקטע.
      הערה: עברו בין תצוגת 'מפת רצף ' לתצוגת 'פלסמיד ' של הווקטור לבחירת כל הבסיסים הרצויים בתבנית מעגלית. לחלופין, אם אתם מתכננים להכין את המקטע הווקטורי באמצעות תקציר הגבלה (במקום PCR) עבור Gibson Assembly, בצעו ליניאריזציה של רצף עמוד השדרה עם אתר חיתוך אנזים הגבלה (למשל, XbaI). לשם כך, לחץ על האתר שנחתך, החזק את מקש Shift לחוץ ולחץ שוב על האתר החתוך . לאחר מכן לחץ על הגדר מקטע כדי להגדיר את עמוד השדרה. שים לב שפריימרים ספציפיים לווקטורים לא ייווצרו על ידי Benchling אם עמוד השדרה הוא ליניארי עם אנזים הגבלה באשף ההרכבה.
   5. בחלון הוספת רצף , בחר בכל בסיסי ההוספה שייכללו בהרכבה. לאחר שנבחר, לחץ על הכרטיסיה הוספה בתחתית המסך | סט פרגמנט.
   6. במקרה של תוספות גנים מרובות, לחץ על לחצן + בצד ימין של אשף ההרכבה. בחלון הוספת רצף , בחר בכל בסיסי ההוספה שייכללו בהרכבה. לאחר שנבחר, לחץ על הכרטיסיה הוספה בתחתית המסך | סט פרגמנט.
   7. לאחר הגדרת כל המקטעים, שנה את שם ההרכבה לשם הפלסמיד הרצוי ולחץ על הרכיב מימין לאשף ההרכבה. בחר את מיקום התיקייה הרצוי הן לתיקיית רצף והן לתיקיית פריימר. לחצו על 'צור' להרכבת רצף הפלסמיד הרקומביננטי.
   8. פתח את הפלסמיד שהורכב ולחץ על היסטוריית הרכבה כדי להציג מפת פלסמיד בסיסית וסקירה כללית של הרצפים שמהם הוא נגזר. ודא שמיקומי הנוקלאוטידים עבור כל מקטע תואמים לעיצוב הרצוי.
   9. בכרטיסיה פרמטרים של הרכבה , הצג את שמות הפריימרים המיועדים להרכבה. שימו לב שיהיו שני פריימרים המיועדים לכל תוספת (קדימה ואחורה), ושמות הפריימרים ייגזרו מהכותרות של קבצי רצף הדנ"א. כמו כן, ודא שטמפרטורות ההתכה של הפריימר וטמפרטורות החישול המומלצות תואמות בחלון זה (ראה קובץ משלים 8, פריימרים מייצגים).
      1. אם טמפרטורות ההתכה של פריימר או חישול אינן אידיאליות, התאימו ידנית רצפי פריימר (לדוגמה, הסרת נוקלאוטידים כדי להפחית את טמפרטורת ההתכה) בתוך קובצי רצף הפריימר. לחלופין, לחץ על פתיחה מחדש והתאם את הגדרות הפריימר על ידי לחיצה על כפתור הגדרות אנזים/פריימר לצד כפתור ההרכבה באשף ההרכבה. לאחר מכן, חזור על שלב ההרכבה ובחן מחדש רצפי פריימר.
      2. אם רוצים לשכפל ספרייה של פלסמידים עם גנים רבים ושונים המשובטים לאותו עמוד שדרה וקטורי,
      3. השתמש באותו זוג פריימר עבור הווקטור בכל מקרה. לשם כך, הסר ידנית את כל הנוקלאוטידים מהפריימרים הווקטוריים שיתקינו את התלבטות הספציפיות לעל. נוקלאוטידים אלה יימצאו בקצה ה-5' של הפריימר. לאחר ההסרה, ודא שטמפרטורות ההתכה של הפריימר וטמפרטורות החישול תואמות (ראה קובץ משלים 8, פריימרים מייצגים).
      4. ודא שלכל זוגות הפריימרים יש טמפרטורות התכה וחישול דומות מאוד.
         הערה: זה יפחית את הצורך באופטימיזציה של טמפרטורת החישול של כל זוג ויאפשר לכל תגובות ה- PCR של התלמידים להיות מחזוריות בו זמנית באמצעות אותה תוכנית thermocycler.
   10. לאחר השלמת עיצוב הפריימר עבור פלסמידים רצויים, לחץ על סיום באשף ההרכבה. הזמינו את הפריימרים מחברת סינתזת DNA ושלפו דגימות של תבניות הדנ"א עבור תוספות ווקטור.
   11. בדוק זוגות פריימר ספציפיים להוספה ולווקטור לטמפרטורות חישול אופטימליות באמצעות ניסוי PCR הדרגתי עם תבניות DNA. בדוק את טמפרטורות החישול המומלצות על ידי Benchling ± 3 ° C בתחילה.
   12. לאחר קביעת טמפרטורות החישול, צור אליציטוטים של תמיסות פריימר, תבניות DNA וריאגנטים נחוצים לתגובות PCR לתלמידים.
2. לפני הניסויים, ספקו לתלמידים דפי עבודה לתמיכה בהכנה ולהערכת ההבנה (קובץ משלים 4, נספח 5 ונספח 6).
3. איסוף נתונים על תוצרי למידה
   הערה: אם אתם מעוניינים לאסוף נתוני תוצאות למידה ממודול Gibson Assembly ולפרסם את התוצאות, קבלו אישור למחקר עם נבדקים אנושיים בהתאם למדיניות המוסד.
   1. הזמינו את התלמידים להשתתף בחקירת תוצאות למידה לפחות שבוע לפני תחילת הפרויקט העצמאי של אסיפת גיבסון.
   2. בקשו מהסטודנטים המשתתפים למלא את השאלון המקדים רב ברירה (קובץ משלים 6) את מפגש המעבדה לפני תחילת הפרויקט העצמאי.

2. ניסוי תלמידים א': PCR להשגת מקטעים ליניאריים

1. השג פריימרים ותבניות DNA עבור PCR מהמדריך.
2. תגובות פיפטה 25 μL כולל DNA פולימראז MasterMix, תבנית DNA, פריימרים קדימה ואחורה, ומים ללא נוקלאז בהתאם להוראות במדריך לתלמיד (ראה קובץ משלים 2).
3. מחזור התגובה בתרמוסייקלר בהתאם למדריך לתלמיד בקובץ משלים 2. ודא שטמפרטורת החישול של התגובה מתאימה לפריימרים, ושזמן ההארכה מתאים לאורך המגבר הרצוי. עיין בקובץ משלים 2 ובקובץ משלים 3 לקבלת הוראות מפורטות.
4. אחסן תגובות PCR ב 4 ° C או -20 ° C עד תקופת המעבדה הבאה.
5. לנתח 5 μL של כל תגובה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose. בזמן שהג'ל פועל, הוסיפו 1 μL של אנזים הגבלת DpnI לכל תגובה שהשתמשה בדנ"א פלסמיד כתבנית. לדגור על תערובת זו במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   הערה: DpnI יפגע בכל תבנית DNA פלסמיד מעגלית שנותרה, מה שמקטין את הסיכוי לקבל תוצאות חיוביות שגויות בשלב הטרנספורמציה.
6. צלם את הג'ל כדי לאשר כי PCR היה מוצלח והגברה נכונה הושגה. טהרו תגובות PCR מוצלחות בעזרת ערכת טיהור PCR הזמינה באופן מסחרי. מדוד את הריכוז (ng/μL) של מוצר PCR מטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח לשימוש בחישובי הרכבה עוקבים של Gibson.
7. לפני פגישת הכיתה הבאה, עצבו את מתכון התגובה לאסיפת גיבסון (ראו קובץ משלים 2 וקובץ משלים 4).

3. ניסוי תלמידים ב': הרכבה של גיבסון, טרנספורמציה ובחירה של שיבוטים

1. פיפטה תגובת אסיפת גיבסון על פי המתכון המעוצב. לדגור על התגובה ב 50 ° C במשך 15 דקות. בזמן שהתגובות דוגרות, התכוננו לשינוי על ידי הפשרת תאי Escherichia coli בעלי כשירות כימית על קרח.
2. הפוך 2 μL של מכלול גיבסון לתאים בעלי כשירות כימית באמצעות הלם חום. פיפטה 100 μL של התאים שהשתנו על שני לוחות בחירה והתפשט עם חרוזים מעוקרים. הכינו ^10-4, ^{10-5 ו-10-6} דילולים של התאים הנותרים על אגר לוריא-ברטאני (LB). צלחת 100 μL של כל דילול סדרתי על LB (אין בחירה) ולהפיץ עם חרוזים מעוקרים.
   הערה: שלב זה מאפשר חישוב יעילות הטרנספורמציה.
3. לדגור את הצלחות לילה ב 37 ° C. לאחסן את הצלחות ב 4 ° C עד תקופת השיעור הבאה.
4. ספור מושבות על כל הלוחות וחשב את יעילות הטרנספורמציה בהתאם להוראות בקובץ משלים 2. פזרו מחדש צלחת סלקטיבית אחת עם ארבע מושבות מכל צלחת סלקטיבית ודגרו על צלחת זו בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.
   הערה: זה משמש כתרבות גיבוי של השיבוטים החיוביים שלך.
5. באמצעות טוש, בחר, הקף ותייג ארבע מושבות נפרדות על לוח הבחירה עם ראשי התיבות של התלמיד ומספר (לדוגמה, ABC1). שלפו צלחת LB-אגר חדשה המכילה אנטיביוטיקה לבחירה, השתמשו בטוש כדי לחלק את הצלחת לרבעים (כלומר, רביעיות), ולאחר מכן השתמשו ב~1/2 מכל מושבה כדי להתפשט מחדש לרביע המסומן בהתאמה וב-1/2 האחר כדי לחסן תרבית LB נוזלית של 5 מ"ל עבור כל אחת מארבע המושבות שנבחרו. הקפד לתייג את הצינורות עם זהות המושבה המתאימה (למשל, ABC1) ולהוסיף את הריכוז הנכון של אנטיביוטיקה לבחירה. לדגור על תרביות נוזליות באינקובטור מטלטל ב 37 מעלות צלזיוס לילה ואת צלחת האגר באינקובטור סטטי ב 37 מעלות צלזיוס; יש לאחסן תרביות וצלחות נוזליות בטמפרטורה של 4 °C עד לשיעור הבא.

4. ניסוי תלמידים ג': בידוד פלסמיד וסינון

1. בודדו דנ"א פלסמיד מהתרביות הנוזליות מניסוי ב' באמצעות ערכת מיניפרפ. למדוד את ריכוז הפלסמיד המבודד (ב-ng/μL).
2. תכנן תקציר הגבלה או מסך PCR לניתוח הפלסמידים המבודדים (ראה הוראות מפורטות בקובץ משלים 2 ודווח על ציפיות בקובץ משלים 5).
3. פיפטה, ההגבלה, מעכלת תגובות או תגובות על פי מתכונים מתוכננים ודוגרת בטמפרטורות ומשכי זמן שתוכננו קודם לכן.
4. ניתוח התוצאות באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.

5. הערכה

1. בקש מהסטודנטים המשתתפים למלא את השאלון הרב-ברירה (קובץ משלים 7) את פגישת המעבדה לאחר השלמת מודול ההרכבה של גיבסון.
2. שלב את כל הנתונים מהתשובות לפני ואחרי השאלון לניתוח.
   1. לבחון את המובהקות הסטטיסטית של העלייה בציון הממוצע של כל שאלת תוכן בנפרד בין השאלונים באמצעות מבחני t זוגיים דו-זנביים וגודל אפקט d של כהן.
   2. להעריך את עליית הביטחון של התלמידים עבור כל מונח וטכניקה בודדים כדי לקבוע את מידת השינוי ואת המשמעות הסטטיסטית שלו.
   3. לקבוע את ההשפעה של רקע התלמידים וגורמים אקדמיים על למידת התלמידים באמצעות רווח למידה מנורמל (NLG) ומבחני t לא מזווגים.
   4. להעריך את עמדות התלמידים כלפי ניסיון הפרויקט ואת הקריירה ביולוגיה מולקולרית על ידי הערכת הציונים הממוצעים.

תוצאות

הצלחת התלמידים בשיבוט
בכל איטרציה של מודול הרכבת גיבסון (2019, 2022 ו-2023), התלמידים התבקשו להכין דו"ח המסכם את ממצאיהם. בשנת 2019, 36 מתוך 44 סטודנטים (81.8%) דיווחו כי הם שיבטו בהצלחה את הפלסמידים שלהם בהתבסס על תוצאות המסך שהם תכננו עבור ניסוי C. 14 מתוך 20 סטודנטים (70.0%) דיווחו על הצלחה בשיבוט המבנים שהוקצו להם בשנת 2022, ואילו בפרויקט הקבוצתי בשנת 2023 12 מתוך 27 תלמידים (44.4% או 4 מתוך 8 קבוצות) דיווחו על הצלחה על סמך ניתוחי הסינון שלהם. המסקנות בדוחות התלמידים נבדקו על ידי המדריך או חוקרי הסטודנטים; פרשנויות התלמידים תוקנו אם נמצא כי תוצאות הסינון אינן תומכות בטענותיהם. דגימה אחת מכל פלסמיד שונה נותחה על ידי ריצוף סנגר, ואישרה את רצפי תוספות הפלסמיד עבור כל 15 הפלסמידים הרצויים בשנת 2019 וכל 12 הפלסמידים בשנת 2022. בשנת 2023 נעשה שימוש בריצוף ננו-נקבוביות אוקספורד פלסמיד שלם כדי לנתח את כל 8 הפלסמידים; עם זאת, רק 1 מתוך 8 פלסמידים תאם את הרצף הרצוי.

הערכה מבוססת תוכן של מושגי ביולוגיה מולקולרית
חלק התוכן של השאלון כלל 10 שאלות אמריקאיות שבחנו את הבנת התלמידים את מושגי הביולוגיה המולקולרית והשיבוט המולקולרי. השוואת ציוני התוכן הממוצעים לפני ואחרי השאלון עבור כל 10 שאלות התוכן גילתה עלייה משמעותית מ-63.7% ל-80.4% (p < 0.05, מבחן t זוגי דו-צדדי; איור 4), מה שמרמז על כך שהפרויקט העצמאי של אסיפת גיבסון שיפר את ההבנה של התלמידים בביולוגיה מולקולרית ובמושגי שיבוט. מבחן D של כהן קבע כי עלייה משמעותית זו מתאימה לגודל אפקט גדול (d = 0.891), מה שתומך בהבדל משמעותי בין תשובות התלמידים לפני ואחרי שאלות תוכן.

איור 4: שיפור ההבנה של התלמידים בביולוגיה מולקולרית ושיבוט מולקולרי בעקבות הפרויקט הבלתי תלוי. תרשים קופסה ושפם של תשובות התלמידים לשאלות בדיקת תוכן בביולוגיה מולקולרית ושיבוט מולקולרי לפני ואחרי השלמת הפרויקט העצמאי (גודל המדגם, n, של 46; גיבסון הרכבת שאלונים לפני ואחרי בקובץ משלים 6 ובקובץ משלים 7, בהתאמה). הציונים הממוצעים לפני ואחרי נותחו באמצעות מבחן t זוגי דו-זנבי, המצביע על עלייה משמעותית בתגובות נכונות של תלמידים (p < 0.5). התיבות מייצגות את 50% האמצעיים של הציונים (כלומר^{, אחוזונים} 25^עד 75), והשפם מייצג את ציוני המינימום והמקסימום (%). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן, בדקנו האם העלייה בציון הממוצע של כל שאלת תוכן בנפרד הייתה מובהקת סטטיסטית בין השאלונים שלפני ואחרי השאלונים. ניתוחים שהשתמשו במבחני t זוגיים דו-זנביים הראו כי תשובות התלמידים לשאלות על תגובות PCR, תקציר הגבלת DpnI, אנזימי Gibson Assembly ורצפי הוספה ווקטור של Gibson Assembly היו עליות משמעותיות (p < 0.05) לאחר השלמת הפרויקט העצמאי. לשאלות מבוססות תוכן אלה היו ציונים נמוכים יחסית לפני השאלון בהשוואה לממוצע התוכן הכללי של 63.7%, עם הציונים הנמוכים ביותר בשאלות על תקציר DpnI ואנזימי הרכבת גיבסון (34.8% ו-47.8%, בהתאמה). הממוצע לאחר הפרויקט של השאלות הנ"ל עלה ל-71.7% ו-89.1%, בהתאמה, קרוב יותר לממוצע התוכן הכולל של 80.4%. נתונים אלה מראים כי עד סוף הפרויקט, ההבנה של התלמידים הן של תקצירי DpnI והן של אנזימי הרכבת גיבסון השתפרה עם גודל השפעה גדול יותר מאשר החלק הכולל של התוכן בשאלון (d = 0.982).

הערכה אטיטודינלית של מונחי ביולוגיה מולקולרית וטכניקות מעבדה
השאלות חולקו לשני חלקים בשאלון התלמיד. בחלק הראשון התלמידים העריכו בעצמם את הידע שלהם בשבעה מונחים בביולוגיה מולקולרית בסולם של 1-4 (1 = "אין לי מושג מה פירוש המונח הזה" עד 4 = "אני יודע מה פירוש המונח הזה ויכול בקלות להסביר אותו למישהו אחר"). האמון הממוצע לטווח עלה משמעותית מ-3.52 ל-3.87 עם גודל אפקט גדול (p = 5.32 × ^10-15 ו-d = 1.40, בהתאמה; איור 5A). החלק השני שאל את התלמידים אם הם מסכימים עם האמירה "נוח לי להופיע..." אחת עשרה טכניקות מעבדה שונות לביולוגיה מולקולרית בסולם של 1-5 (1 = "מאוד לא מסכים" עד 5 = "מסכים מאוד"). הביטחון הממוצע של התלמידים של אחת עשרה טכניקות אלה גדל באופן משמעותי מ 3.82 ל 4.33 עם גודל אפקט גדול (p = 2.08 × ^10-11 ו d = 1.09; איור 5B).

איור 5: ביטחון מוגבר של תלמידים בהבנתם את הביולוגיה המולקולרית ואת שיבוט המונחים והטכניקות בעקבות הפרויקט הבלתי תלוי. קופסאות ושפמים של אמון התלמידים במונחים של ביולוגיה מולקולרית (A) ו-(B) טכניקות בשאלונים לפני ואחרי (Gibson Assembly Pre-and Post-Questionnaires in Supplemental File 6 and Supplemental File 7, בהתאמה). עבור אמון מונח (לוח A), התלמידים בחרו אמון בסולם של 4 חלקים (1-"אין לי מושג מה פירוש המונח הזה" עד 4-"אני יודע מה המונח הזה אומר ויכול בקלות להסביר את זה למישהו אחר"; גודל מדגם n של 45). ביטחון טכניקת מעבדה (פאנל B) הוערך בסולם בן 5 חלקים (1-מאוד לא מסכים ל-5-מסכים מאוד; גודל מדגם n של 42). הציונים הממוצעים לפני ואחרי נותחו באמצעות מבחני t זוגיים דו-זנביים, מה שמצביע על עלייה משמעותית בביטחון התלמידים הן במונח והן במערכי הנתונים של הטכניקה (p < 0.5). התיבה מציגה את 50% האמצעיים (כלומר^{, אחוזונים} 25^עד 75) של תשובות, כאשר שפם מציג דירוג ביטחון סובייקטיבי מינימלי ומקסימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הערכנו את העלייה בביטחון העצמי של התלמידים עבור כל מונח וטכניקה אינדיבידואליים וקבענו כי כל מונח למעט DNA פולימראז וטרנספורמציה הראה עלייה מובהקת סטטיסטית (p < 0.05, מבחן t זוגי דו-צדדי; טבלה 1). כל תלמיד, למעט אחד, סימן "אני יודע מה פירוש המונח הזה ויכול בקלות להסביר אותו למישהו אחר" עבור המונח DNA פולימראז הן בשאלונים שלפני והן אחרי השאלונים, כך שלא היה מקום לשיפור במונח זה (טבלה 1). עבור תקופת השינוי, 73.91% מהתלמידים בחרו ברמת האמון הגבוהה ביותר (מספר 4 בסולם) בסקר המקדים לעומת 80.4% בסקר שלאחר הסקר. תשע מתוך 11 טכניקות המעבדה שהוערכו הראו עלייה משמעותית בביטחון העצמי של התלמידים; זה לא כלל חישובי טוחנות ואלקטרופורזה בג'ל (טבלה 1). בממוצע, התלמידים דיווחו על ציונים גבוהים לפני השאלון עבור שתי הטכניקות הללו (4.71 ו-4.57, בהתאמה, לעומת ממוצע טכניקה של 3.81), מה שמצביע על כך שהתלמידים כבר היו בטוחים במונחים אלה לפני פרויקט אסיפת גיבסון. שאלות שהעריכו את ביטחון התלמידים בשאלות ביולוגיה כלליות (למשל, DNA פולימראז, אלקטרופורזה בג'ל, חישובי טוחנות) בדרך כלל לא הראו שינויים מובהקים סטטיסטית (טבלה 1). עם זאת, כל השאלות המיוחדות של אסיפת גיבסון הראו עליות משמעותיות עם גדלי ההשפעה הגדולים ביותר (d > 1.6) כאשר הטכניקה 'Gibson Assembly' הראתה את השינוי הגדול ביותר בביטחון התלמידים (טבלה 1 ואיור 6).

סוג התוכן	מונח/טכניקה	תשובה לשאלון ממוצע		מובהקות סטטיסטית		גודל אפקט (d)
		קדם	הצבה	ערך P	כן/לא
ביוכימיה כללית	מונח DNA פולימראז	3.98	3.98	מוגדר	לא	0
	טכניקת חישובי מולאריות	4.71	4.77	4.45E-01	לא	0.130
	טכניקת אלקטרופורזה בג'ל	4.57	4.68	1.68E-01	לא	0.254
שיבוט מולקולרי	עיצוב טכניקת פריימרים	3.05	3.57	7.23ה-04	כן	0.536
	בטכניקת שיבוט סיליקו	3.61	4.07	5.75ה-04	כן	0.533
	תקופת הקרנה כחול-לבן	3.59	4.34	4.10ה-06	כן	0.655
	תקופת בדיקת PCR	3.78	4.31	1.02E-06	כן	0.936
	תקופת מאסיפת גיבסון	2.87	3.78	7.41E-13	כן	1.69
	טכניקת הרכבה של גיבסון	2.59	4.20	1.14E-15	כן	1.61

טבלה 1: עליות משמעותיות ביחס לשאלות אטיטודינליות המתמקדות בשיבוט מולקולרי, אך לא בביוכימיה כללית. הממוצע בשאלון לפני ואחרי (Gibson Assembly Pre-and Post-Questionnaires in Supplemental File 6 and Supplemental File 7, בהתאמה) עבור שאלות נבחרות של מונח וטכניקה. מבחני t זוגיים דו-זנביים שימשו להערכת מובהקות (אם p < 0.05, כן; אם p ≥ 0.05, לא). עבור המונח DNA פולימראז, תשובות התלמידים היו זהות בין השאלון שלפני ואחרי השאלון, ולכן p אינו מוגדר. גודל ההשפעה של השוואת תשובות התלמידים עבור כל שאלה לפני ואחרי נקבע באמצעות ערכי d של כהן (d ≥ 0.8 נחשב לאפקט גדול). ככל שגודל האפקט גדול יותר, כך גדל הסיכוי שהתגובות לפני ואחרי יהיו שונות בתוך קבוצת המדגם. גודל המדגם n הוא 45 ו 42 עבור שאלות מונח וטכניקות, בהתאמה. קיצור: AVG = ממוצע.

איור 6: עלייה בשאלות על אסיפת גיבסון. מספר התשובות לסטודנטים דיווחו על אמון במונח אסיפת גיבסון (A) ובטכניקת (B) בשאלונים לפני ואחרי השאלונים. תשובות הביטחון לטווח היו בסולם של 4 חלקים (1 - "אין לי מושג מה פירוש המונח הזה" עד 4 - "אני יודע מה פירוש המונח הזה ויכול בקלות להסביר אותו למישהו אחר"). תשובות הביטחון בטכניקת המעבדה נעו בין 1-מאוד לא מסכים ל-5-מסכים מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן הערכנו אם גורמי הרקע של התלמידים משפיעים על מידת הלמידה של התלמיד מהפרויקט העצמאי. הן תפיסת הישגים¹⁹ והן פערי ביצועים²⁰ הוכחו כמתמשכים בקורסי STEM לתואר ראשון בשל מגדר; לפיכך, השתמשנו ברווח למידה מנורמל (NLG) ובמבחני T לא מזווגים כדי לקבוע אם פער מגדרי דומה נצפה בפרויקטים עצמאיים אלה. בהתבסס על מבחנים סטטיסטיים אלה, לא מצאנו שלמגדר התלמידים הייתה השפעה על תוצאות הלמידה של התלמידים. בדקנו גם אם גורמים אקדמיים כגון ראשי, GPA, ציונים בקורסים קודמים והציון הסופי ב- BIO/CHEM 475 היו קשורים באופן משמעותי לתוצאות הלמידה של התלמידים מהפרויקט העצמאי. בעוד שסטודנטים שהתמחו בביוכימיה (טבלה משלימה S1 וטבלה משלימה S2) היו בעלי ממוצע ציונים גבוה יותר וציוני קורס סופי וכל אחד מהם בנפרד הראה ממוצע NLG גבוה יותר, מבחני t לא מזווגים לא הראו מובהקות סטטיסטית בין גורמי רקע אינדיבידואליים אלה לבין תוצאות הלמידה. מבחני t לא מזווגים שימשו גם להערכת הבדלים ב-NLG בין קבוצות 2022 ו-2023. במחזור 2023 נמצא שיפור לימודי גבוה משמעותית מאשר במחזור 2022 בשאלות התוכן (לוח משלים S3). זה מצביע על כך שלמרות שיעור הצלחת השיבוט הנמוך יותר של קבוצת 2023, הם השיגו הבנה טובה יותר של ביולוגיה מולקולרית ומושגי שיבוט מולקולרי מאשר קבוצת 2022. בעוד הסיבות להבדל זה אינן ברורות, נתונים אלה מראים כי הצלחת השיבוט אינה הכרחית לחינוך יעיל עם מודול זה.

בנוסף להערכת השליטה של התלמידים בטכניקות מעבדה, הערכנו את עמדותיהם כלפי ניסיון הפרויקט והקריירה בביולוגיה מולקולרית. שאלה אחת, שהוצגה הן בהערכות לפני הפרויקט והן אחריו, מדדה את רמת הנוחות שלהם בקריירה המערבת טכניקות ביולוגיה מולקולרית. התוצאות מראות כי הפרויקט שיפר באופן משמעותי את נוחות התלמידים בקריירה בביולוגיה מולקולרית (p = 8.46 × ^10-5), כאשר הציון הממוצע עלה מ -3.60 ל -4.09 בסולם 1-5 שלנו. יתר על כן, השאלון שלאחר הפרויקט כלל שאלות על מסירותם של התלמידים למקסום חוויית הלמידה שלהם והערכתם את ערך הפרויקט. המשיבים דירגו את מחויבותם בממוצע של 4.48 וראו בפרויקט הזדמנות למידה בעלת ערך רב, עם ציון הערכה ממוצע של 4.73. יחד, ממצאים אלה מדגישים את הערך של הפרויקט העצמאי בצמיחה האקדמית של התלמידים, כמו גם את ההתלהבות והביטחון במאמצי הביולוגיה המולקולרית.

טבלה משלימה S1: נתונים גולמיים אנונימיים. כל תשובות התלמידים והמגמות מהשאלונים לפני ואחרי שנאספו במהלך האיטרציות של 2022 ו-2023 של מודול Gibson Assembly CURE. עיין בקובץ משלים 6 ובקובץ משלים 7 כדי לראות את השאלות המתאימות, לפני ואחרי השאלות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

לוח משלים S2: הבדלים ברווח הלמידה המנורמל לפי חוגים עבור כל חלק בשאלון. מבחני t לא מזווגים קבעו כי אף סוג שאלה לא הראה הבדלים משמעותיים ברווח למידה מנורמל (NLG) לפי מז'ור (p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

לוח משלים S3: ההבדל ברווח הלמידה המנורמל לפי עוקבה עבור כל חלק בשאלון. מבחני t לא מזווגים הראו כי לקבוצת 2023 יש רווח למידה מנורמל גבוה משמעותית (NLG) עבור שאלות תוכן בהשוואה לקבוצת 2022 (p < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: מדריך מדריך עבור מודול CURE הרכבה של גיבסון. מדריך למדריכים ליישום מודול Gibson Assembly CURE. הוראות שלב אחר שלב ניתנות למדריכים להתכונן לקורס על ידי עיצוב וסינון פריימרים להרכבה של גיבסון בהתבסס על תבנית העניין שלהם. הנושאים והפעילויות שהמדריכים צריכים לכסות במהלך כל הרצאה ותקופת מעבדה לניסויים א'-ג' מתוארים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: מדריך לתלמיד עבור מודול CURE הרכבה של Gibson. מדריך לספק לתלמידים, כולל מידע רקע רלוונטי על אסיפת גיבסון ופרוטוקולים שלב אחר שלב עבור כל ניסוי (A-C). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: התנסות א' בתכנון גליונות עבודה (פרטניים וצוותיים). דפי עבודה אישיים וקבוצתיים לתלמידים כדי להבין ולהתכונן להגברה PCR עבור קטעי הרכבה של גיבסון. רק אחד מדפי עבודה אלה צריך להיות מוקצה על ידי המדריך בהתבסס על המבנה של הפרויקט העצמאי (אישי או צוותי). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: דף עבודה לתכנון ניסוי ב'. גליון עבודה לתלמיד כדי לסייע בחישובים הדרושים להגדרת תגובת אסיפת גיבסון. ניתן להתאים את מספר הקטעים בגליון העבודה בהתבסס על עיצוב השיבוט עבור הפלסמידים המעניינים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 5: גליון עבודה לתכנון ניסוי ג'. דף עבודה לתלמיד כדי לסייע בתכנון תקציר הגבלה או ניסוי PCR כדי לסנן את הפלסמיד המעניין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: שאלון מקדים להרכבה של גיבסון. שאלון בן עשרים ושמונה שאלות שניתן לתלמידים לפני תחילת מודול CURE הרכבה של גיבסון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 7: Gibson Assembly Post-Questionnaire. שאלון בן שלושים שאלות שניתן לתלמידים לאחר השלמת מודול ההרכבה של גיבסון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 8: תיקיית Zip המכילה קבצי רצף GenBank ( .gb) של גן הידרוקסילאז פוליקטידי, וקטור pUC19 ופלסמיד שהורכב על ידי גיבסון, וטבלה של פריימרים מייצגים. עיין בקבצים אלה לתכנון פריימר לדוגמה באשף הרכבה Benchling והשלמת דפי עבודה לתכנון ניסויי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

כאן, אנו מציעים פרויקט מעבדה מתכוונן בכיתה לתואר ראשון המלמד סטודנטים שיבוט מולקולרי באמצעות Gibson Assembly במסגרת מחקר מבוססת קורס. בסך הכל, 28 פלסמידים חדשים שובטו על ידי סטודנטים לתואר ראשון במסגרת כיתתית. ההצלחה שדווחה על ידי תלמידים בודדים נעה בין 44.4% ל-81.8% על פני שלוש קבוצות, והצלחת השיבוט הכוללת הייתה 80% (28 מתוך 35 פלסמידים שהוקצו שולבטו בהצלחה). הצלחה נמוכה יותר של שיבוט בשנת 2023 נבעה ככל הנראה משני גורמים מורכבים. ראשית, שפופרות של דגימות דנ"א של תבנית סומנו בשמות קרובים מאוד; ייתכן שהיו ערבובים של תבניות הדנ"א שהוכנו על ידי סטודנטים חוקרים, מה שהוביל לשילוב של מקטעים ליניאריים לא תואמים במהלך תגובת אסיפת גיבסון שבוצעה על ידי סטודנטים במעבדת ההוראה. באיטרציות עתידיות של פרויקט זה, יש לרצף תחילה את הדנ"א של התבנית או לסנן אותה עם תקציר הגבלה כדי לאשר את הזהות הנכונה לפני שהיא מסופקת לתלמידים. שנית, האיטרציה של פרויקט זה בשנת 2023 כללה מכלולים של ארבעה מקטעים (וקטור אחד ושלוש תוספות), לעומת מכלולים של שני מקטעים בשנים קודמות (וקטור אחד ותוספת אחת). ייתכן שהדבר גם הפחית את הצלחת השיבוט בפרויקט זה, שכן יותר מקטעים בהרכבה של גיבסון יכולים להפחית את יעילות התגובה²². באיטרציות עתידיות של פרויקט זה, ניתן לבנות יתירות רבה יותר על ידי כך שקבוצות רבות יותר ישבטו את אותו פלסמיד או על ידי כך שקבוצות יגדירו תגובות מרובות של הרכבת גיבסון ביחסים שונים של הוספה לווקטור כדי להגדיל את הסבירות לקשירת פלסמיד מוצלחת וטרנספורמציה. בנוסף, הכללת חפיפות ארוכות יותר בין מקטעים והארכת זמן הדגירה של תגובת אסיפת גיבסון עשויה להגביר את ההצלחה במכלולים עם 4–6 מקטעים²³.

בנוסף לשיבוט פלסמידים חדשים, תוצאות הסקר לפני ואחרי הפרויקט מצביעות על כך שהתלמידים שיפרו את הבנתם בביולוגיה מולקולרית ובמושגי שיבוט מולקולרי, עם גודל ההשפעה הגבוה ביותר עבור שאלות הקשורות לשיבוט אסיפת גיבסון. בנוסף, אמון התלמידים שדיווחו על עצמם במונחים של ביולוגיה מולקולרית ובטכניקות מעבדה השתפר משמעותית לאחר השלמת הפרויקט עבור רוב אלה שהוערכו. הרכבת גיבסון היא טכניקת שיבוט מולקולרית חשובה ורב-תכליתית המשמשת במחקר אקדמי ובתעשיית הביוטכנולוגיה². על ידי הוראת מושגים אלה ומיומנויות מעשיות בקורס מעבדה, לכל הסטודנטים לתואר ראשון יש הזדמנות שווה לסיים עם יכולת מחקר ומיומנויות שכירות כשהם נכנסים לכוח העבודה או לחינוך מתמשך.

תוכנית הלימודים של אסיפת גיבסון המתוארת כוללת את חמשת המרכיבים של CURE⁴ מוצלח. התלמידים השתמשו בפרקטיקות מדעיות על ידי עיצוב פרוטוקולים משלהם, כולל מטרות וציפיות המבוססות על גדלי אמפליקון PCR וקיצוצי תקציר הגבלה (קובץ משלים 3, קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5). הפרויקט העצמאי מקדם את שיתוף הפעולה של התלמידים על ידי חלוקת ההכנה של כל קטע נדרש בין החברים בקבוצה ובסופו של דבר ניצול הקטעים מכל חבר קבוצה בתגובת קשירה אחת (Experiment A Planning Worksheet (Team-Based) in Supplemental File 3). הפלסמידים שפרויקטים עצמאיים אלה נועדו לשכפל הם פלסמידים ביטוי חדשניים עם רלוונטיות לפרויקטים מחקריים מחוץ לכיתה, ועשויים לספק נתונים למחקר הניתן לפרסום. בדומה לניסיון מחקרי מסורתי יותר, שיעורי ההצלחה בשיבוט בקורס CURE לא היו 100%. הסטודנטים התבקשו להעריך משתנים שעשויים היו להניב תוצאות שליליות ולהציע השערות המסבירות מדוע הפלסמיד לא שובט בהצלחה, מה שמהווה חווית למידה אותנטית לתלמידים לגבי תוצאות מחקר.

באיטרציה זו של Gibson Assembly CURE, התלמידים שיבטו פלסמידים הרלוונטיים למחקר המוצר הטבעי Actinomycetota; עם זאת, זרימת העבודה תוכננה להיות בעלת יכולת הסתגלות גבוהה גם לפרויקטים אחרים. הפרוטוקולים המוצגים כאן הם כלליים, ומאפשרים לתלמידים לשכפל פלסמידים שיכולים לשמש למטרות מחקר רבות בתוך שישה מפגשי מעבדה ושתי הרצאות. המסגרת מאפשרת לתלמידים לשכפל פלסמידים חדשים בנפרד, או לתלמידים לעבוד יחד כדי לשכפל פלסמיד יחיד מתוך >2 מקטעים ליניאריים בגישה מבוססת צוות. בסך הכל, ניתן להתאים גישה זו למגוון רחב של פרויקטי מחקר שעשויים לדרוש שימוש משתנה בהרכבה של גיבסון.

מחקר זה העריך את הישגי הלמידה של התלמידים באמצעות גישה מבוססת CURE להוראת Gibson Assembly, אך ניתן היה להשיג תובנות נוספות באמצעות הרחבת המחקר. בעוד שהפורמט שלפני ואחרי השאלון איפשר הערכה של תוצאות למידה בעקבות הפרויקט העצמאי, לא בוצעה השוואה להוראה מבוססת הרצאות של Gibson Assembly. השוואה של CURE מבוסס ניסוי לפעילות מעבדה מבוססת הרצאות או מסורתית יותר, שבה תוצאות הניסוי כבר מתוכננות לתלמידים, תספק תובנה נוספת אם תוצאות הלמידה המשופרות של Gibson Assembly יהיו ספציפיות למודל הקורס של CURE. לבסוף, בעוד שחלק משאלות התוכן הקשורות לאסיפת גיבסון הראו שיפורים משמעותיים בהבנה, אחרות לא. שאלות הנוגעות לחפיפות ההומולוגיות המשמשות בהרכבה של גיבסון, כיצד הן מותקנות וכיצד הן משתלבות מחדש בתגובת שיבוט של אסיפת גיבסון לא השתפרו. הדבר מצביע על כך שהסבר נוסף או הערכת למידה נוספת בנושאים אלה עשויים לשפר את הבנת התלמידים ביישומים עתידיים של תוכנית לימודים זו.

מבנה הפרויקט העצמאי של Gibson Assembly ממשיך להיות מיושם ב-Cal Poly. באיטרציות עתידיות של הקורס, פרויקט זה ישתנה כדי לאפשר עצמאות גבוהה יותר של התלמידים, יצירת השערות ועיצוב ניסוי. שינוי תוכנית הלימודים הקרוב ב- Cal Poly מציג את ההזדמנות להאריך את הפרויקט העצמאי כך שיכלול עיצוב פריימר בהובלת סטודנטים, בחירת עמוד שדרה וקטורי, ניתוח רצפים ו / או בדיקות במורד הזרם של פלסמידים, כגון לביטוי חלבונים. בנוסף, הפרויקט העצמאי יכול להיות מותאם אישית כדי ללמד טכניקות ביולוגיה מולקולרית רלוונטיות אחרות כגון מוטגנזה מכוונת אתר או עריכת גנים בהתאם לצרכים של פרויקטי מחקר מתמשכים. שינוי הטכניקות שהתלמידים משתמשים בהן בפרויקט העצמאי יכול לספק הבחנה רבה יותר באילו נושאים מתאימים לפורמט CURE, ואילו מתגלים כקשים ליישום.

יחד, דו"ח זה מפרט מודול הוראה של Gibson Assembly הניתן להתאמה המיישם CURE הן כדי לשפר את הבנת התלמידים של מתודולוגיית שיבוט מתפתחת והן כדי להגביר את המיומנות בתהליך המדעי. הפרויקט העצמאי שיפר את תוצאות הלמידה של התלמידים ואת הביטחון ברוב המונחים והטכניקות של הביולוגיה המולקולרית שהוערכו. אנו מעודדים את השימוש וההתאמה של מודול זה לא רק כדי ליצור פלסמידים מחקר חדשים, אלא גם כדי לשפר את נגישות התלמידים ואת הביטחון בטכניקות מחקר, הכנה טובה יותר של סטודנטים לתואר ראשון לקריירה עתידית ב- STEM. באופן אידיאלי, עבודה זו תעודד שיפורים בתוכניות הלימודים בביולוגיה מולקולרית ותעודד הסתגלות לקורסי STEM ככל שמתודולוגיות המחקר המדעי ממשיכות להתפתח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דאוקסיריבונוקלאוטיד טריפוספט (dNTPs, 10  מ"מ)	פישר סיינטיפיק	FERR0191	תוצרת בית' רכיב מאסטרמיקס
דיתיותרייטול (DTT)	פישר סיינטיפיק	FERR0861	תוצרת בית' רכיב מאסטרמיקס
DpnI	ניו אינגלנד Biolabs	R0176S	1000 יחידות
פישרברנד איזוטמפ חממה מיקרוביולוגית	פישר סיינטיפיק	15-103-0513
פישרברנד איזוטמפ אמבט מים	פישר סיינטיפיק	S28124
ג'ל חומצת גרעין אדומה ג'ל	כתם ביוטיום	NC9594719	10,000X
GeneJET מיצוי ג'ל וניקוי DNA מיקרו קיט	תרמו סיינטיפיק	FERK0831	100 Preps
GeneRuler 1 kb סולם DNA	פישר סיינטיפיק	FERSM0314	100 יישומים
מרק LB, מילר	פישר BioReagents	BP9723-500	500 גרם
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	פישר סיינטיפיק	BP214-500	תוצרת בית 'רכיב MasterMix
Mastercycler nexus X2 שיפוע Thermocycler	Eppendorf	6337000027
מיקרופוגה 16 צנטריפוגה	בקמן קולטר	A46474
מיקרומונוספורה חיידקי אכינוספורה סוג	אמריקאי אוסף תרבות	ATCC 15837
תנור מיקרוגל	ג'נרל אלקטריק
ביולוגיה מולקולרית כיתה אגרוז	פישר ביו-ריאגנטים	BP160-100	100 גרם
ננוטיפ ספקטרופוטומטר מיקרונפח אחד	תרמו סיינטיפיק	13-400-518
NEB 5-אלפא מוכשר E. coli	ניו אינגלנד Biolabs	C2987H	20 x 0.05 מ"ל
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621S	10 תגובות
ניו ברונסוויק Innova 40 שייקר מסלולי ספסל	ניו ברונסוויק	M1299-0090
נוקלאז ללא נוקלאז	מים פישר ביו-ריאגנטים	BP248450	50 מ"ל
PEG-8000	פישר סיינטיפיק	BP233-100	תוצרת בית 'רכיב MasterMix
Phusion DNA פולימראז	ניו אינגלנד Biolabs	M0530	תוצרת בית 'רכיב MasterMix
איזון נייד	Ohaus	SKX123
pUC19 וקטור	ניו אינגלנד Biolabs	N3041S
Q5 נאמנות גבוהה 2x מאסטר מיקס	ניו אינגלנד Biolabs	M0492S	100 תגובות
T5 Exonuclease	Epicentre	T5E4111K	רכיב MasterMix תוצרת בית
Taq DNA Ligase	New England Biolabs	M0208	רכיב MasterMix תוצרת בית
Tris-HCl	Fisher Scientific	AAA1137918	Homemade' רכיב MasterMix
TriTrack DNA טעינת ג'ל צבע (6x)	Thermo Scientific	FERR1161	5 x 1 מ"ל
Zyppy פלסמיד מיני-פרפ ערכת Zymo	Research	D4019	100 Preps
Β-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD+)	New England Biolabs	B9007S	רכיב MasterMix תוצרת בית