כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת ציטוטוקסיות תלויה בנוגדנים, בתיווך תאים (ADCC) באמצעות ערכת בדיקה ביולוגית של ADCC. שיטה זו מציעה כלי רב ערך להבהרת מנגנון ה-ADCC ולהערכת הפוטנציאל הטיפולי של נוגדנים באימונותרפיה של סרטן.
מאמר שיטה
הערכת ציטוטוקסיות תלויה בנוגדנים, בתיווך תאים בתאי סרטן באמצעות מבחן ביולוגי של מדווח ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלויי נוגדנים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
השיטה לציטוטוקסיות תלוית נוגדנים בתיווך תאים (ADCC) מייצגת כלי חשוב להערכת היעילות של נוגדנים טיפוליים באימונותרפיה לסרטן. הערכת פעילות ADCC בתאי סרטן חיונית לפיתוח ואופטימיזציה של טיפולים מבוססי נוגדנים. כאן, אנו מציעים גישה מתודולוגית של שימוש בערכת בדיקה ביולוגית של ADCC להערכה כמותית של תגובת ADCC באמצעות תאי סרטן בלוטת התריס כתאי אפקטור. הפרוטוקול כולל תרבית משותפת של תאי אפקטור עם תאי סרטן מטרה ביחסים שונים בנוכחות נוגדן טיפולי. ערכת הבדיקה הביולוגית של ADCC המשמשת בניסוי זה כוללת את תאי האפקטור המהונדסים גנטית המבטאים גן מדווח לוציפראז תחת שליטת גורמי הגורם הגרעיני של תאי T פעילים (NFAT). עם קשירת האנטיגן על פני השטח על תאי המטרה עם הנוגדנים ותאי האפקטור, תאי האפקטור משחררים לוציפראז, המאפשר כימות של ציטוטוקסיות באמצעות מדידת אות זוהר. בניגוד למבחני ADCC קונבנציונליים, שיטה זו הוכיחה את קשירת אנטיגן המטרה לנוגדנים ותאי אפקטור, שיכולים לייצר תוצאות אמינות בתקופה קצרה.
מבוא
ציטוטוקסיות תלויה בנוגדנים בתיווך תאים (ADCC) היא מנגנון חשוב שבאמצעותו נוגדנים מפעילים השפעות הרג תאים בתיווך חיסוני 1,2,3. תאי החיסון מופעלים על ידי קשירה לנוגדנים הטיפוליים, המקיימים אינטראקציה עם אנטיגנים על פני השטח של תאי המטרה כדי לשחרר גרנזימים, פרפורין, מה שמוביל למוות של תא המטרה. תאי חיסון אלה כוללים תאי הרג טבעיים (NK) ונויטרופילים 2,3,4,5,6,7. בדיקת ה-ADCC הפכה לכלי חשוב להערכת היעילות של נוגדן טיפולי 8,9.
בבדיקת ה-ADCC הקונבנציונלית, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) או תאי הרג טבעיים משמשים כתאי אפקטור לניטור היעילות של נוגדן טיפולי על ידי כימות שיעור התמותה של תאי המטרה. השיטה שלנו משתמשת בערכת בדיקה ביולוגית של ADCC הכוללת תאי אפקטור מהונדסים גנטית המבטאים גן מדווח לוציפראז בשליטה של גורמי תגובה של גורם גרעיני של תאי T פעילים (NFAT). לאחר מכן אנו מכמתים את הקישור של אנטיגן פני השטח על תאי המטרה עם הנוגדן ותאי האפקטור. שיטה זו מבוססת על תגובת ADCC המתרחשת בתקופה קצרה ללא צורך בתאי PBMC אנושיים. שלבי הניסוי כוללים תרבית משותפת של תאי אפקטור עם תאי מטרה בנוכחות נוגדנים טיפוליים.
במהלך הדגירה, הנוגדן הטיפולי נקשר לאנטיגן המטרה על פני תאי המטרה, מה שמוביל לקשירת תאי האפקטור ושבר ה-Fc של נוגדן. זה מפעיל את אלמנט התגובה של NFAT ומשחרר אותות זוהר להערכה כמותית של תגובת ה-ADCC.
לפני ביצוע הניסוי, יש לאשר את ביטוי אנטיגן המטרה בתאי המטרה על ידי זרימה ציטומטרית או כתמים מערביים. תאי המטרה עוברים תרבית ומועברים לצלחות של 96 בארות במשך 24 שעות לפני הניסוי. ריכוזים שונים של נוגדן טיפולי מתווספים יחד עם ספירת תאים שונה של תאי אפקטור כדי להשיג את היחס המחושב בין תאי אפקטור למטרה.
השלבים העיקריים בשיטה זו כוללים (1) הכנת תאי מטרה ותאי אפקטור, (2) יחסי אפקטור לתאי מטרה, (3) הכנת ריכוזים שונים של הנוגדן, ו-(4) משך דגירה משתנה. לאחר הדגירה, אותות הזוהר נמדדים באמצעות לומינומטר, המספק קריאה כמותית של פעילות ADCC. בהשוואה לשיטות אחרות למדידת ADCC, שיטה זו פשוטה יחסית לתפעול, והתוצאות מדויקות.
הבדיקה הביולוגית של מדווח ה-ADCC מצביעה על קשירת אנטיגן המטרה, הנוגדן הטיפולי ותאי החיסון בהפעלת מסלול ה-ADCC. קשירה זו מפעילה את שעתוק הגנים דרך מסלול ה-NFAT בתאי ג'ורקט מהונדסים על ידי תאי אפקטור עם קולטן FcγRIIIa המתבטא ביציבות, גרסת V158 (זיקה גבוהה). אלמנט התגובה NFAT מתווך את ביטוי הלוציפראז בתאי האפקטור10,11. הפעילות הביולוגית של הנוגדן במנגנון הפעולה (MOA) של ADCC מכומתת באמצעות אות הלוציפראז המופק ממסלול ה-NFAT. אות לוציפראז בתאי האפקטור - תאי ג'ורקט המבטאים קולטן FcγRIIIa - מכומת באמצעות קורא לומינסנציה (איור 1). יחס האות לרעש של הבדיקה גבוה.
פרוטוקול
1. איתור ביטוי EGFR ו-VEGFR בתאי מטרה
הערה: השתמש בכתמים מערביים כדי לזהות את ביטוי אנטיגן המטרה בתאי המטרה.
- הכנת מדגם
- תרבית התאים (BHT-101 ו-SW-1736 תאי סרטן בלוטת התריס האנושיים) בצלוחיות T75 באמצעות מדיום Roswell Park Memorial Institute (RPMI) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין ו-1% אנטיביוטיקה (פניצילין-סטרפטומיצין).
- קצור את התאים כשהם מתכנסים ב-80% על ידי הסרת אמצעי התרבות ושטיפת התאים עם PBS. הוסף 5 מ"ל PBS וגרד את התאים באמצעות מגרד תאים כדי להסיר את התאים מבקבוק התרבית. העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- ספור את התאים עם מונה תאים.
- Aliquot 5 × 106 של תאי BHT-101 ו-SW-1736 לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
- סובב את התאים בחום של 135 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את ה-PBS העל-טבעי.
- ליזה את גלולת התא על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה RIPA המכיל מעכבי פרוטאז-פוספטאז למשך 5 דקות על קרח. העבירו את הליזאט לצינור של 2 מ"ל, צנטריפוגה ב-15,000 × גרם למשך 15 דקות, והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 2 מ"ל.
- מדוד את ריכוז החלבון של ליזאט התא באמצעות ערכת בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA).
- יש להוציא 70 מיקרוגרם חלבון מליזאט תאים מכל דגימה, להוסיף 2x מאגר דגימת Laemmli בתוספת 10% 2-מרקפטואתנול, ולהרתיח את הדגימות ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לדנטורציה של דגימות.
- אלקטרופורזה של ג'ל והעברת ממברנה
- הכינו ג'ל פוליאקרילאמיד 8% נתרן דודציל סולפט (SDS) באמצעות מים מזוקקים (4.7 מ"ל), 30% אקרילאמיד (2.7 מ"ל), 1.5 מ' Tris Buffer, pH 8.8 (2.5 מ"ל), 10% נתרן דודציל סולפט (0.1 מ"ל), 10% אמוניום פרסולפט (100 מיקרוליטר) ו-TEMED (10 מיקרוליטר).
- הפעל 70 מיקרוגרם מהדגימות המפורקות בג'ל 8% SDS-polyacrylamide ב-80 וולט למשך 20 דקות וב-120 וולט למשך 100 דקות.
- העבירו את החלבון על הג'ל לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) ב-100 וולט למשך 90 דקות.
- לאחר ההעברה, יש לחסום את הממברנה עם חלב דל שומן 7% מדולל במאגר TBS-T (20 מ"מ Tris pH 7.6, 140 מ"מ NaCl, 0.2% Tween-20) למשך שעה.
- דגירה של נוגדנים
- דגרו את הממברנה החסומה עם קולטן גורם גדילה אנטי-אפידרמלי של עכבר (EGFR) ונוגדנים חד-שבטיים נגד קולטן גורם גדילה אנדותל (VEGFR) של ארנב (מדולל ב-1:1,000 בחלב דל שומן 7%) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
- לאחר הדגירה, שטפו את הממברנה ביסודיות עם מאגר מלח-טווין (TBS-T) (20 מ"מ Tris pH 7.6, 140 מ"מ NaCl, 0.2% Tween-20) למשך 7 דקות וחזרו על הפעולה 4x.
- דגרו את הממברנה עם הנוגדן המשני המצומד ל-HRP (מדולל ב-1:4,000 בחלב דל שומן 7% (TBS-T)) למשך שעה.
- לאחר הדגירה יש לשטוף היטב את הממברנה עם מאגר TBS-T למשך 7 דקות ולחזור על הפעולה 4 פעמים.
- זיהוי חלבונים
- דגרו את הממברנה במצע HRP כימילומינסנט שהוכן על ידי ערבוב של 1 מ"ל של תמיסת מי חמצן של מצע HRP עם 1 מ"ל של מגיב לומינול מצע HRP (שני הריאגנטים הם מערכת המצע הכימילומינסנטי) למשך 2 דקות.
- דמיין את הממברנה באמצעות מערכת הדמיה.
2. הכנת תאי מטרה
- תרבית תאי המטרה T, תאי BHT-101 ו-SW-1736 באופן אקספוננציאלי עד ש-80% מתכנסים במצע RPMI בתוספת 10% FBS, 1% L-גלוטמין ו-1% אנטיביוטיקה (פניצילין-סטרפטומיצין) בצלוחיות T-75.
- לאחר הסרת המדיה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS. דגרו על התאים עם 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים למשך 5 דקות כדי לעקור את התאים הדבקים. הוסף PBS כדי לעצור את התגובה של מאגר הדיסוציאציה של התאים הלא אנזימטיים. סובב את התאים ב -135 × גרם למשך 5 דקות והוסף 5 מ"ל PBS.
הערה: כאן, אנו משתמשים במאגר דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים כדי לשמר את שלמות חלבון פני הממברנה. - ספרו את התאים וזרעו אותם ב-15,000 תאים/בארות במיקרו-לוחות פוליסטירן לבנים עם 96 בארות עם תחתית שקופה ושטוחה.
3. הכנת ריכוזים משתנים של הנוגדן הטיפולי
- כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש ב-Cetuximab (נוגדן כימרי נגד EGFR) כדי לקשור EGFR והשתמש ב-Bevacizumab (נוגדן אנטי-VEGF-A אנושי) כבקרה שלילית.
- הכן את מאגר הבדיקה הביולוגית של ADCC על ידי הוספת 1.4 מ"ל של סרום IgG נמוך לתוך 33.6 מ"ל של RPMI-1640 (מסופק בערכה).
- השתמש במאגר ADCC Bioassay לדילול נוגדנים. הכן 400 מיקרוליטר מכל נוגדן בשלושה ריכוזים שונים: 30 מיקרוגרם/מ"ל, 3 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.3 מיקרוגרם/מ"ל (ריכוז פי 3) כדי לקבל את הריכוז הסופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל לכיסוי ספקטרום רחב לזיהוי המינון האופטימלי.
הערה: ריכוזי הנוגדנים הסופיים מבוססים על 25 מיקרוליטר של תאי מטרה מתורבתים, 25 מיקרוליטר של תאי אפקטור ו-25 מיקרוליטר של נוגדנים בכל באר של צלחת של 96 בארות.
4. הכנת תאי אפקטור
- אחסן את תאי האפקטור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- יש לחמם מראש את מאגר הבדיקה הביולוגית של ADCC באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש.
- הפשירו את תאי ADCC Bioassay Effector מאחסון קר של -80 מעלות צלזיוס על ידי הנחתם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס (כ-2-3 דקות). נדנד בעדינות ובדוק חזותית את הבקבוקון, אך אל תהפוך אותו במהלך תהליך ההפשרה.
- העבר 630ul של תאי אפקטור לצינור של 15 מ"ל המכיל 3.6 מ"ל של מאגר בדיקת ADCC. מערבבים היטב על ידי היפוך עדין של השפופרת פי 2.
5. דגירה של תאי אפקטור עם נוגדנים ותאי מטרה
- לאחר דגירה של לילה, הסר את המדיה מתאי המטרה (15,000 תאי סרטן לבאר) והוסף 25 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה הביולוגית של ADCC ו-25 מיקרוליטר של Cetuximab (אנטגוניסט EGFR) ו-Bevacizumab (אנטגוניסט VEGF) כדי לקבל את הריכוז הסופי של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל או 10 מיקרוגרם/מ"ל של תאי המטרה בכל באר לפי איור 2.
- הוסף 75,000 תאי אפקטור ב-25 מיקרוליטר של מאגר בדיקה ביולוגית ADCC לכל באר לתוך המיקרו-פלייט המכיל 96 בארות המכיל תאי מטרה. הבארות שמסומנות כ-No mAb פועלות כללא בקרת נוגדנים (איור 2).
- הוסף מאגר ADCC Bioassay לבארות המסומנות כ-AB (מאגר ADCC Bioassay) לבקרה ריקה.
- דגרו את הצלחת למשך 6 שעות.
6. קריאה כמותית של פעילות ADCC
- הכן את מגיב בדיקת הלוציפראז 4 שעות לפני המדידה על ידי הוספת מאגר בדיקת לוציפראז למצע בדיקת לוציפראז (ליופיליזציה).
- לאחר 6 שעות של דגירה של תאי מטרה, נוגדנים ותאי אפקטור, הוסף 75 מיקרוליטר של מגיב בדיקת לוציפראז לכל באר ודגירה למשך 30 דקות.
- לאחר תקופת הדגירה, מדוד את אות הזוהר בכל באר באמצעות לומינומטר, המספק קריאה כמותית של פעילות ADCC.
- לניתוח נתונים, חשב את אינדוקציית הקיפול באופן הבא:
אינדוקציה מתקפלת = RLU (נוגדן מושרה - רקע) / RLU (ללא בקרת נוגדנים - רקע).
כאשר RLU הוא יחידות זוהר יחסיות; נוגדנים המושרים הם בארות B3 עד B8 ו-C3 עד C8; אין בקרת נוגדנים = B2 ו-C2; רקע = RLU ממוצע מבאר A2 עד A5 (איור 2).
תוצאות
הביטוי של EGFR ו-VEGFR בתאי המטרה BHT-101 ו-SW-1736 זוהה באמצעות כתמים מערביים. ביטוי EGFR זוהה הן בתאי BHT-101 והן בתאי SW-1736 אך לא בביטוי VEGFR (איור 3).
באמצעות ערכת הבדיקה הביולוגית של ADCC, זיהינו את תגובת ה-ADCC של הנוגדן נגד EGFR, cetuximab, תוך שימוש בשורות תאים חיוביים ל-EGFR, BHT-101 ו-SW-1736, כתאי מטרה. Bevacizumab, מפעיל VEGF, שימש כנוגדן בקרה שלילי. ריכוזים שונים של נוגדנים ותאי אפקטור הודגרו עם תאי המטרה. אות הזוהר זוהה באמצעות קורא לוחות (איור 2). קפל גבוה יותר של אינדוקציה של פעילות ADCC נמצא בקבוצות Cetuximab (נוגדנים נגד EGFR), אך לא נצפתה פעילות ADCC ב-Bevacizumab (אנטגוניסט VEGF) עבור שני קווי התאים. זה הדגים את אפקט ה-ADCC המכוון לאנטיגנים של ממברנה חוץ-תאית EGFR עבור שני קווי התאים. על ידי שימוש בשיטה זו, תגובת ה-ADCC אומתה בנוכחות Cetuximab בשני קווי תאים אנאפלסטיים של סרטן בלוטת התריס (BHT101 ו-SW1736) (איור 4).
איור 1: דיאגרמה סכמטית המציגה את תגובת ה-ADCC עם ערכת הבדיקה הביולוגית ADCC. אתרי קשירת אנטיגן בנוגדנים הטיפוליים נקשרים לאנטיגנים פני השטח בתאי המטרה. קשירה זו מובילה לקשירת חלק ה-Fc של הנוגדן לקולטני FcƳRIIIa של תאי אפקטור, אשר הונדסו גנטית עם NFAT-RE luc, ומייצרים אות זוהר בתאי האפקטור. נתון זה שונה ממדריך ערכת הליבה של ADCC Reporter Bioassay באישור12. קיצורים: ADCC = ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלויי נוגדנים; Fc = אזור הניתן להתגבשות; NFAT = גורם גרעיני של תא T מופעל; RE = אלמנט תגובה; לוק = לוציפראז. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קריאת זוהר ודיאגרמה ניסויית של תכנון לוחות 96 בארות של מערכת התרבות המשותפת ADCC. אותות זוהר נקראים על ידי קורא זוהר. שורה א': בארות 1-9 מכילות מאגר ביו-מבחן ADCC. שורה B: בארות 3-8 מכילות את מערכת תגובת ה-ADCC של BHT101 (תאי מטרה + נוגדן + תאי אפקטור). הבארהשנייה ללא נוגדנים. הבארהתשיעית מכילה רק מאגר ADCC Bioassay. שורה C: 3rd-8 בארות מכילות את מערכת התגובה ADCC של SW-1736 (תא מטרה + נוגדן + תאי אפקטור). הבארהשנייה ללא נוגדנים. הבארהתשיעית מכילה רק מאגר ADCC Bioassay. שורה D: בארות 1-9 מכילות מאגר בדיקה. קיצורים: ADCC = ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלויי נוגדנים; AB = מאגר בדיקה ביולוגית ADCC; VEGFR = קולטן גורם גדילה אפיתל כלי דם; EGFR = קולטן גורם גדילה אפידרמלי; mAb = נוגדן חד שבטי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי ביטוי EGFR ו-VEGFR בקרצינומה של בלוטת התריס BHT-101 ו-SW-1736 באמצעות כתמים מערביים. ביטוי של EGFR, אך לא VEGFR, זוהה בשני קווי התאים. B-actin שימש כבקרת הטעינה. קיצורים: EGFR = קולטן גורם גדילה אפידרמלי; VEGFR = גורם גדילה אפידרמיס בכלי הדם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אינדוקציה מתקפלת של פעילות ADCC. (A) קו תאי סרטן בלוטת התריס BHT-101 מציג אפקט ADCC בנוכחות נוגדן נגד EGFR Cetuximab. (B) קו התאים של סרטן בלוטת התריס SW-1736 מציג אפקט ADCC בנוכחות הנוגדן נגד EGFR Cetuximab. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
דיון
כאן, הצגנו את שיטת הבדיקה הביולוגית של ADCC להערכת תגובת ה-ADCC של נוגדן טיפולי. השיטה פשוטה ומשתמשת בפורמט פשוט של "הוספה-ערבוב-קריאה" למדידה.
לפני ביצוע הניסוי, יש לאשר את ביטוי אנטיגן המטרה בתאי המטרה על ידי ציטומטריית זרימה או כתמים מערביים. ציטומטריית זרימה תהיה כלי טוב יותר לאיתור אנטיגן פני השטח. עם זאת, שימוש בזרימה ציטומטרית יכול להלחיץ את התאים, לגרום לאפופטוזיס ולהשפיע על כדאיות התא ולכן על הניתוח הכולל. בנוסף, זה עולה יותר מכתמים מערביים. בניסוי זה, השתמשנו בכתמים מערביים כשיטה מהירה וחסכונית יותר מכיוון שאנטיגנים ממוקדים ידועים כאנטיגנים על פני התא.
תאי ג'ורקט מהונדסים, שביטאו ביציבות את קולטן FcγRIIIa, גרסת V158 (זיקה גבוהה) ואלמנט תגובת NFAT המניע את הביטוי של לוציפראז גחלילית, שימשו כתאי אפקטור. הפעלת מסלול ה-NFAT מביאה לייצור לוציפראז, ופעילותו מכומתת בצורה של קריאת לומינסנציה. האות מייצג גם את הפעילות של ADCC.
ראשית, תאי מטרה (T) מודגרים עם תאי אפקטור (E) בנוכחות כמויות משתנות של נוגדנים בצלחות של 96 בארות למשך 6 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 לחה. יחס האפקטור: יעד של 5:1 משמש לאופטימיזציה של האות. לדוגמה, 75,000 תאי אפקטור נוספו ל-15,000 תאי מטרה. בתום הדגירה, מגיב בדיקת לוציפראז Bio-Glo מתווסף לכל באר, מודגר למשך 30 דקות, והזוהר (RLU, יחידות לוציפראז יחסיות) נמדד באמצעות קורא לוחות זוהר.
השלבים הקריטיים העיקריים בפרוטוקול זה הם: (1) הטיפול בתאי אפקטור. אין להפוך את בקבוקון התא במהלך תהליך ההפשרה, להתנדנד בעדינות, ויש להשתמש בו מיד לאחר ההפשרה כדי למנוע מוות תאים לא רצוי או להשפיע על ביצועי הזיהוי הביולוגי. (2). חשוב להשתמש במיקרו-לוחות פוליסטירן לבנים 96 בארות עם תחתית שקופה ושטוחה למדידות זוהר מכיוון שהזוהר נלכד מתחתית הקורא.
במחקר זה, ראינו את תגובות ה-ADCC החזקות והחלשות יותר של נוגדן האנטי-EGFR, cetuximab, בהתאם לכמות תאי המטרה וריכוז הנוגדנים. כמה סיבות לטיפול בכיול של תגובות ADCC חלשות: (1) הקריאות של הבדיקה הביולוגית של מדווח ADCC מגיעות מתאי אפקטור (E), עם מספר קבוע של 75,000 תאים לבאר במערכת התגובה של ADCC במחקר זה. לכן, אופטימיזציה של איכות תאי המטרה (T) היא היבט אחד שניתן לשפר. יחס ה-E:T במחקר זה היה 5:1, שניתן לכוונן עד 20:1. (2) ריכוז הנוגדנים הוא גם אחד הגורמים החשובים המשפיעים על תגובת ADCC. ניתן לבצע התאמות באמצעות דילול סדרתי של נוגדנים כדי לחקור את טווח הריכוז האופטימלי, ובכך להשיג תגובה מקסימלית בדוח ה-ADCC. (3) זמן הדגירה של נוגדנים, תאי מטרה ותאי אפקטור הוא גם קריטי לתוצאות הניסוי. במחקר זה, דגרנו במשך 6 שעות, שניתן להאריך עד 24 שעות כדי להשיג את תגובת ה-ADCC האופטימלית. (4) בנוסף, יש לחקור גם את ריכוז תמיסת החיץ (IgG נמוך) לבדיקת ADCC. ניתן להשיג את הריכוז האופטימלי בסרום לתגובת ADCC בטווח של 1% עד 10%.
שיטה ניסיונית זו מהירה ופשוטה, ומאפשרת השלמה תוך יום אחד באמצעות פרוטוקול פשוט של "הוספה-ערבוב-קריאה". התוצאות יציבות וניתנות לבדיקת אצווה. עם זאת, ערכת בדיקה ביולוגית זו אינה מזהה מוות תאים כמו שיטות ADCC קונבנציונליות המשתמשות בתאי PBMC או NK כתאי אפקטור12,13. במקום זאת, הוא משתמש בתאי ג'ורקט המבוטאים בקולטן FcγRIIIa כתאי אפקטור, מה שיעלה יותר מכיוון שהתאים מהונדסים גנטית. בהשוואה לניסויי ADCC מסורתיים 13,14, הוא מבטל את הדרישה לתרומות דם מאנשים בריאים ונמנע מהתהליך המורכב של חילוץ תאים חיסוניים, ובכך מפחית וריאציות בודדות שעלולות להשפיע על התוצאות. אותות הזוהר שזוהו הם מקשירה של תאי אפקטור לתאי מטרה, לא מהמוות בפועל של תאי מטרה. לכן, ייתכנו אי התאמות בהשוואה לשיטות זיהוי ADCC סטנדרטיות. יתר על כן, מאגר דיסוציאציה של תאים, שהוא יקר יותר מטריפסין, משמש לניתוק התאים הדבקים כדי לשמור על שלמות הממברנה.
ניתוח גנים מדווח ADCC מדגים דיוק ויציבות מצוינים, ומשמש כשיטת ניתוח יעילות לזיהוי המוני של תרופות נוגדנים טיפוליות. זה יכול גם לתפקד כשיטת ניתוח ביקורתית לאפיון מולקולות טיפוליות ופיתוח תהליכים15.
לסיכום, ADCC הוא מנגנון חיסוני חשוב, ולזיהוי הכמותי של ADCC יש חשיבות רבה בתחום האימונותרפיה. שיטה ניסויית זו מציעה אמצעי יעיל למדידה כמותית של ADCC15.
גילויים
כל המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
תודות
אנו אסירי תודה לפרופ' זנג (IMCB, A*STAR) על תמיכתו בעבודה זו. מחקר זה נתמך על ידי קרן הנוער של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC) (82202231), ופרויקט המדע והטכנולוגיה הרפואית והבריאותית של מחוז ג'ג'יאנג, סין (2021KY110,2024KY824).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.5% טריפסין-EDTA | Gibco | 15400-054 | לדלל 10x ב-PBS לייצור 0.05% טריפסין |
| 1x Tris Buffer מלח (TBS) | בסיס ראשון | BUF-3030-1X1L | לשטיפת ממברנה בספיגה מערבית |
| 1.5 M Tris Buffer, pH 8.8 | ראשון | BUF-1419-1L-pH8.8 | להכנת ג'ל SDS |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522-100ML | להכנת מדגם של Western Blotting |
| 30% תמיסת אקרילאמיד/ביס | Bio-Rad | #1610158 | להכנת ג'ל SDS |
| 4x Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610747 | להכנת דגימה של |
| מיקרופלייט פוליסטירן לבן 96 בארות עם תחתית שטוחה שקופה | Corning Incorporated | 3610 | לבדיקת |
| ADCC תאי אפקטור של ADCC Bioassay (0.65 מ"ל) | Promega | G7011 | כולל בערכת הליבה הביולוגית של מדווח ADCC (Promega G7010), 1 x 1 בקבוקון |
| ADCC מדווח ערכת ליבה ביולוגית | Promega | G7010 | מוזכר כערכת בדיקה ביולוגית ADCC לבדיקת ADCC בניסוי זה |
| אמוניום פרסולפט | סיגמא אולדריץ' | A3678-25G | להכנת ג'ל SDS |
| Bevacizumab (נוגדן אנטי VEGF אנושי) | MVASI-השתמש | כנוגדנים לבקרה שלילית בבדיקת | |
| ADCCBHT-101 | מכון לייבניץ DSMZ | ACC279 | קו תאי סרטן בלוטת התריס פפילרי אנאפלסטי אנושי |
| Bio-Glo Luciferase Assay Buffer | Promega | G7941 | כולל בערכת ליבת הבדיקה הביולוגית של מדווח ADCC (Promega G7010), 1 x 10 מ"ל |
| מצע בדיקת Bio-Glo Luciferase (ליופיליזציה) | Promega | G7941 | כולל בערכת ליבת הבדיקה הביולוגית של מדווח ADCC (Promega G7010), 1 x 1 בקבוקון |
| מגרד תאים | GenFollower | GD00235 | להסרת תא מבקבוק התרבית |
| Cetuximab (נוגדן כימרי נגד EGFR) | ERBITUX-השתמש | כנוגדנים טיפוליים בבדיקת ADCC | |
| מצע HRP Chemiluminescent | Merck Millipore | WBKLS0500 | לזיהוי חלבון בכתמים מערביים |
| מזוקקים | Gibco | 15230-162 | להכנת ג'ל SDS |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco | 10270-106 | תוסף מדיה תרבית |
| iBright CL1500 מערכת הדמיה | Thermo Scientific | 2462621100038 | לזיהוי חלבונים בכתמים מערביים |
| L-גלוטמין, 200 מ"מ | Gibco | 25030-081 | תוסף מדיה תרבית |
| IgG סרום | Promega | G7110 | כולל בערכת ליבת הבדיקה הביולוגית של מדווח ADCC (Promega G7010), 1 x 4 מ"ל |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | 42876589 | צנטריפוגה |
| עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד EGFR | BD Biosciences | 610016 | נוגדן ראשוני בכתמים מערביים |
| נוגדנים חד שבטיים נגד VEGFR BD | Biosciences | 571194 | נוגדן ראשוני במאגר |
| דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים | סיגמא אולדריץ' | C5789-100ML | לקצירת תאים מבקבוק T75 |
| פניצילין-סטרפטומיצין | PAN Biotech | P06-07100 | אנטיבקטריאלי עבור אמצעי תרבית |
| פוספט חוצץ מלח (PBS), pH 7.2, מסנן סטרילי | 1st BASE | CUS-2048-1x1L | השתמש כתמיסת כביסה לתאים |
| ערכת בדיקת BCA Pierce | Thermo Scientific | 23225 | למדידת ריכוז החלבון |
| מעכב פרוטאז ופוספטאז | Thermo Scientific | A32959 | לעיכול חלבון בהכנת דגימה ל-PVDF מערבי |
| ממברנה (Immobilin-P) | Merck Millipore | IPVH00010 | להעברת חלבון בכתמים מערביים |
| ארנב אנטי עכבר IgG, Fcγ נוגדן משני מצומד HRP | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | נוגדן משני בכתמים מערביים |
| מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני | מזל גדי מדעי | RPMI-XA | מדיה לתרבית תאים |
| RPMI-1640 | Promega | G7080 | כולל בערכת ליבת הבדיקה הביולוגית של מדווח ADCC (Promega G7010), 1 x 36 מ"ל |
| אבקת חלב רזה | Merck Millipore | 70166-500G | לחסימת ממברנה בכתמים מערביים |
| נתרן דודציל סולפט | 1st BASE | BIO-2050-500g | להכנת ג'ל SDS |
| SW-1736 | Cytion | 300453 | סרטן תאי קשקש אנושי קו תאים |
| T75 צלוחיות תרבית | SPL Lifesciences | 70075 | בקבוק תרבית תאים |
| Tecan Multimode Reader דגם Spark 10M | Tecan | 1607000294 | עבור כימות זוהר |
| TEMED | Bio-Rad | #1610801 | להכנת ג'ל SDS |
| Tween-20 | Promega | H5151 | לשטיפת ממברנה במערב |
| מנתח כדאיות תאי Vi-cell XR | בקמן קולטר | AL15072 | מונה תאים |
מקורות
- Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
- Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engagers for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).
- Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers. Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).
- Ochoa, M. C., et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells. Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).
- Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy. Front Immunol. 6, 368(2015).
- Chung, S., et al. Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells. J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).
- Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
- Cheng, Z. J., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).
- Parekh, B. S., et al. Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay. MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).
- Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond. Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).
- Chung, S., et al. Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities. MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).
- Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en (2023).
- Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro. Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).
- Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).
- Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. Antibody Fc. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).
הדפסות חוזרות והרשאות
