Method Article

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

DOI:

10.3791/67079

⸱

November 22nd, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Parasitology Laboratory, School of Life Sciences, Jawaharlal Nehru University, 2Laboratory of Malaria and Vector Research and National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד המנגנונים לערעור השפעת התרופות על ידי טפיל המלריה הוא באמצעות חיווט מחדש של התעתיק שלו. ההשפעה בולטת יותר עבור גני מטרה השייכים למשפחת הרב-גנים. פלסמודיום פלציפרום חלבון קינאזות השייכות למשפחת CDPK חיוניות להתפתחות שלב הדם. ככאלה, CDPK נחשבים למטרות טובות לפיתוח תרכובות נגד מלריה. הגישה הגנטית הכימית שימשה בעבר להבהרת תפקודם של חלבונים קינאזים באיקריוטים גבוהים יותר. זה דורש החלפה של שאריות שומר הסף בחומצת אמינו אחרת עם שרשרת צדדית אחרת באמצעות מניפולציה גנטית. החלפת חומצות אמינו בעמדת שומר הסף מווסתת את הפעילות של חלבון קינאז ומשנה את רגישותו לסוג מסוים של תרכובות הידועות כמעכבי קינאז גבשושיות (BKIs) המסייעות בזיהוי פונקציונלי של גן המטרה. כאן, ניצלנו את הגישה הגנטית הכימית כדי להבין מנגנוני פיצוי שהתפתחו על ידי טפיל מוטנטי בעל אלל היפומורפי של cdpk1. בסך הכל, הגישה שלנו מסייעת בזיהוי מסלולי פיצוי שעשויים להיות ממוקדים בו זמנית כדי למנוע התפתחות עמידות לתרופות נגד קינאזות בודדות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מלריה היא אחת המחלות הזיהומיות המובילות האחראית למיליוני מקרי מוות מדי שנה, במיוחד אצל ילדים מתחת לגיל5 שנים. אין חיסון זמין קלינית נגד מלריה. יתר על כן, פלסמודיום פלציפרום, טפיל המלריה האנושי הקטלני ביותר, ידוע כבעל עמידות נגד התרופה בקו החזית הנקראת ארטמיסינין 2,3,4,5. יש צורך דחוף לזהות מטרות חדשות לתרופות ואסטרטגיות חדשות שניתן לפרוס במהירות כדי למנוע את התפשטות עמידות ארטמיסינין ברחבי העולם. הבנה טובה יותר של מנגנון הפעולה של תרופות והבסיס המולקולרי של מסלולי פיצוי יכולה לסייע בתכנון אסטרטגיות טובות יותר כדי למנוע התפתחות של עמידות לתרופות.

קינאזות חלבוניות השייכות למשפחת קינאזות חלבונים תלויות סידן (CDPKs) חיוניות בשלבים רבים של התפתחות הטפיל במהלך שלבים אריתרוציטים, מיניים ופרה-אריתרוציטיים6. במהלך שכפול א-מיני של P. פלציפרום, CDPK5 ידוע כממלא תפקיד קריטי ביציאה של מרוזואיטים מסכיזונטים בוגרים7. מחיקה מותנית של CDPK5 אינה מאפשרת לסכיזונטים לשחרר מרוזואיטים לזרם הדם, מה שמוביל למוות של הטפיל. המנגנון המולקולרי של יציאת טפיל בתיווך CDPK5 אינו מובן לחלוטין ונחשב כמערב חלבון קינאז G (PKG) כמווסת במעלה הזרם 7,8. CDPK7 חיוני להבשלת טפילים בשלב הטבעתי לטרופוזואיט9. CDPK4 הוא חבר נוסף במשפחת CDPK שהוא קריטי להתפתחות השלב המיני אצל יתושים. הוא מעורב במספר שלבים במהלך תהליך ההלקאה ולכן הוא קריטי להיווצרות גמטות חופשיות, תנועתיות, זכריות 10,11,12,13. רכיבי פוספורילט CDPK1 של קומפלקס קרום פנימי ורופטריה14,15. יתר על כן, מחיקה מותנית של CDPK1 גורמת להיפו-זרחן של חלבונים המעורבים בפלישה של RBC16. הוכח כי CDPK1 מווסת את פריקת אברוני האפיק במהלך תהליך הפלישה17. CDPK1 מסייע גם ביציאה של merozoites מ RBC נגוע על ידי phosphorylating SERA5 פרוטאז18. CDPK1 פוספורילציה הוא מקומי מועדף בקצה האפי של merozoite, שם הוא עשוי לתקשר עם חלבוני טפיל אחרים הדרושים לתהליך הפלישה19,20. CDPK1 מעורב גם בהיווצרות גמטות זכריות ונקביות, שהוא שלב קריטי להעברת מלריה ולהתפתחות המינית של הטפיל בתוך יתושים21.

הגישה הגנטית הכימית שימשה בעבר לזיהוי תפקידים פונקציונליים של קינאזות יונקים22,23. הגישה משתמשת בהחלפת שאריות בעמדת השוער בחומצת אמינו של שרשרת צדדית אחרת. השינוי בשאריות שומר הסף מווסת את גודלו של כיס ATP סמוך, שבתורו משנה את הנגישות של תרכובות כימיות הנקראות מעכבי קינאז גבשושי (BKIs) לכיוון האנזים המוטנטי בהשוואה לסוג הפראי. החלפה של שארית מגושמת בעמדת השוער בשארית קטנה יותר מאפשרת גישה ל-BKIs, בעוד שהחלפה הפוכה הופכת את הקינאז לעמיד בפני BKIs. במקרים מסוימים, החלפת שאריות שומר הסף קשורה לירידה בפעילות הקינאז של אנזים המטרה, מה שהופך את השינוי לבלתי סובלני למחקרים פונקציונליים24,25. ההשפעה השלילית של החלפת שומר הסף על פעילות האנזים ניתנת לביטול על ידי יצירת מוטציה מדכא באתר שני בקינאז25 הבלתי סובלני. גישה גנטית כימית שימשה לחקר הפונקציה של חלבון Apicomplexan kinases. CDPK4 מסוג פרא המכיל שאריות שוער קטנות יותר עוכב באופן סלקטיבי על ידי מעכבי קינאז חבוטים BKI-1 ו- 1294, מה שהוביל לחסימה בהתפתחות הגמטוגנזה הגברית והביצית11,12. החלפה של שאריות שוער קטנות ב-CDPK4 בשאריות מתיונין מגושמות הובילה לירידה בעיכוב בתיווך BKI בהלקאה11. CDPK1 של Toxoplasma gondii, טפיל Apicomplexan הקשור קשר הדוק לטפיל המלריה, הוכח כמעורב בתנועתיות ובפלישה של תאי מארח על ידי טכיזואיטים26,27. כיס שוער קטן יותר של TgCDPK1 מסוג פרא נוצל לתכנון מעכבים ספציפיים שהפחיתו את הפתוגנזה של המחלה במודלים של בעלי חיים28,29. מעורבותו של פ. פלציפרום חלבון קינאז G (PKG) בהתפתחות סכיזוגונית מאוחרת והיווצרות גמטה הודגם על ידי עיכוב פעילות האנזים באמצעות מעכבים פרמקולוגיים ספציפיים30,31. החלפת תראונין בעמדת השוער בגלוטמין (T618Q) הפחיתה מאוד את רגישות האנזים המוטנטי למעכבים, וכתוצאה מכך גמטוגנזה תקינה והתקדמות סכיזונט לטבעת30,31.

רוב המחקרים הקודמים השתמשו בגישה גנטית כימית לאפיון פונקציונלי של קינאזות מטרה 11,12,22,23,26,30,31 אולם אימצנו גישה זו כדי להבין את התפתחותם של מנגנוני פיצוי בטפילים המכילים אלל היפומורפי של חלבון קינאז. מוקדם יותר הראינו כי החלפה של שאריות שומרי סף מסוג פרא ב-CDPK1 במתיונין (T145M) מביאה לירידה של ~47% בפוטנציאל הטרנס-פוספורילציה של האנזיםהמוטנטי 32. טפיל מוטנטי המכיל את האלל ההיפומורפי של cdpk1 (cdpk1t145m) מותאם מראש לפעילות מופחתת של CDPK1 על ידי חיווט מחדש של שעתוק של בני משפחת CDPK אחרים. אנו מאמינים כי ניתן להשתמש באסטרטגיה זו באופן כללי כדי להבהיר את מנגנוני הפיצוי בטפילים מוטנטיים המכילים אללים היפומורפיים של קינאזות חלבוניות חיוניות. קינאזות אחרות המפצות חלקית על תפקודו של קינאז המטרה עשויות להיות מעוכבות בו זמנית יחד עם קינאז המטרה כדי למנוע התפתחות עמידות לתרופות נגד קינאזות בודדות. זה עשוי לשמש אסטרטגיה טובה יותר לשליטה במלריה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-P. זן טפיל פלציפרום (NF54) התקבל מאלברו מולינה קרוז 21,32,33. O+ תאי דם אדומים אנושיים המשמשים לתרבית הטפילים התקבלו ממרכז הדם רוטרי, ניו דלהי, הודו. הפלסמידים, pL6eGFP ו-pUF1, התקבלו מחוסה-חואן לופז-רוביו. DSM267 התקבל מ מרגרט א 'פיליפס ו Pradipsinh ק Rathod. WR99210 סופק על ידי חברת התרופות ג'ייקובוס.

1. בניית פלסמיד לביטוי CDPK1 רקומביננטי ב- Escherichia coli

  1. תכנן את זוג הפריימר אוליגונוקלאוטיד כדי להגביר את ה- CDS המלא של הגן cdpk1 (PlasmoDB accession no. PF3D7_0217500) באמצעות תוכנת ניתוח פריימר.
    1. הגבירו את ה-CDS המלא באמצעות DNA פולימראז עם זוג אוליגונוקלאוטידים ספציפיים לגן: Pk1fpgex ו-Pk1rpgex (ראו טבלה 1) באמצעות cDNA שהוכן מפלסמודיום פלציפרום כתבנית בנפח תגובה של 20 μL. הגדר את תנאי הגברת ה-PCR באופן הבא: דנטורציה ראשונית ב-98°C למשך 2 דקות, (דנטורציה ב-98°C למשך 30 שניות, חישול ב-52°C למשך 20 שניות, הארכה ב-62°C למשך 20 שניות) x 36, הארכה סופית ב-62°C למשך 10 דקות. יש לאחסן את מוצר ה-PCR בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
  2. יש לעכל 1 מיקרוגרם של מוצר ה-PCR המוגבר ו-1 מיקרוגרם של פלסמיד הביטוי pGEX4T1 עם אנדונוקלאזות הגבלה מסוג BamHI (20,000 U/mL) ו-NotI (20,000 U/mL) למשך 3-4 שעות ב-37°C בנפח תגובה כולל של 30 μL.
  3. כדי לטהר את מוצר ה-PCR המעוכל פעמיים ואת הפלסמיד, השתמש בערכת ניקוי PCR מבוססת עמודות ופעל לפי הוראות היצרן.
  4. יש לדחוס 100 ננוגרם של פלסמיד pGEX4T1 מטוהר בעל עיכול כפול עם תוספת ביחס מולארי וקטורי-להחדרה של 1:5 באמצעות 1 μL של ליגאז DNA T4 בנפח תגובה כולל של 10 μL. לדגור על תגובת הקשירה ב-16°C למשך הלילה.
  5. שינוי צורה E. קולי תאים מוכשרים DH5α עם התערובת הקשורה בהתאם לפרוטוקול היצרן והצלחת על לוחות אגר LB המכילים אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל).
  6. מסך ארבעה שיבוטים חיידקיים המתקבלים מהטרנספורמציה לנוכחות הפלסמיד הרקומביננטי על ידי טיהור הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד מיני על פי הוראות היצרן. אשר את הפלסמיד הרקומביננטי על ידי עיכול הגבלה כפולה באמצעות BamHI ו- NotI, כמתואר לעיל בשלב 1.3.
  7. בדוק עוד יותר את השיבוטים החיוביים לעיכול הגבלה עבור הרצף הנכון על ידי ריצוף DNA Sanger. שינוי צורה E. קולי BLR(DE3) pLysS תאים מוכשרים עם מבנה פלסמיד מאומת רצף עבור ביטוי חלבון CDPK1.

2. ביטוי וטיהור של חלבון CDPK1 רקומביננטי ב- E. coli

  1. ביטוי של CDPK1 רקומביננטי
    1. חסן שיבוט יחיד של E. קולי זן BLR(DE3) pLysS המכיל את מבנה הפלסמיד מאומת הרצף ל-10 מ"ל של מדיום LB המכיל אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל). לדגור על התרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב 200-250 סל"ד.
    2. לחסן את התרבית השניונית עם 1% של התרבית הראשונית ולאפשר לתאי החיידק לגדול לשלב אמצע לוג ב 37 ° C. כאשר הצפיפות האופטית (OD) של התרבית המשנית מגיעה ל-0.7-0.9 ב-600 ננומטר, יש לגרום לביטוי של CDPK1 רקומביננטי באורך מלא על ידי הוספת איזופרופיל 1 mM ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ולדגור במשך 10-12 שעות ב-24°C.
    3. לאחר הדגירה, קוצרים את ה-E. תאי קולי על ידי צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 10 דקות. דקרו את הסופרנאטנט ושמרו על כדורית התא.
    4. הכינו את מאגר הליזה עם ההרכב הבא: 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mg/mL lysozyme, 1 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
    5. השהה מחדש את כדורית התא פי 10 מנפח משקל הגלולה של חיץ הליזיס. סוניק את מתלה התא למשך 15 דקות במרווחים של 9 שניות מופעל, 15 שניות כבוי כדי למנוע חימום מקומי שעלול להוביל לדנטורציה של חלבון.
    6. צנטריפוגו את הליזט בטמפרטורה של 17,000 x גרם למשך שעה אחת ודגרו על הסופרנאטנט השקוף עם חרוזי גלוטתיון למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. עקוב אחר הפרוטוקול המוזכר להלן כדי להשיג חלבון CDPK1 רקומביננטי מטוהר.
  2. כרומטוגרפיית זיקה באמצעות חרוזי גלוטתיון לטיהור CDPK1 המתויג ב-GST
    1. קח 500 μL של חרוזי גלוטתיון מרחפים לחלוטין עבור 250 מ"ל של תרבית חיידקים וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות decant supernatant.
    2. שטפו את החרוזים עם 5 מ"ל של חיץ מחייב (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3) והפכו כדי לערבב.
    3. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. יש לחזור על שטיפה וצנטריפוגה לקבלת 3x-4x.
    4. מוסיפים את החרוזים לתא החיידק ליזט ודגרים במשך 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס עם רעד קל (20-30 סל"ד).
    5. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. ניתן לשמור את הסופרנאטנט כדי להעריך את כמות CDPK1 הרקומביננטי שנותר לא מאוגד.
    6. שטפו את החרוזים הקשורים ל-CDPK1 לפחות 5-6 פעמים עם PBS המכיל 1 mM DTT ואחריו שטיפה עם 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.5.
    7. האטו את החלבון הכבול פי 2 תחילה עם 250 מיקרוליטר של חיץ אלוציה 1 (EB1) ואחריו פי 2 עם 250 מיקרוליטר של חיץ אלוציה 2 (EB2). ההרכב של EB1 ו-EB2 הוא 10 mM גלוטתיון מופחת ב-50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5 ו-20 mM מופחת גלוטתיון ב-50 mM Tris, 100 mM NaCl ו-pH 7.5, בהתאמה.
    8. יש לדגור על החרוזים הקשורים ל-CDPK1 במאגרים 1 ו-2 בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5-10 דקות באמצעות תסיסה עדינה או סיבוב מקצה לקצה.
    9. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ובזהירות להעביר את supernatant המכיל את חלבון רקומביננטי CDPK1 מדולל בצינור נפרד.
    10. חזור על שלבים 2.2.8 ו- 2.2.9 כדי להשיג 2 elutes כל אחד עם EB1 ו- EB2.

3. מוטגנזה מכוונת אתר ליצירת חלבונים מוטנטיים רקומביננטיים CDPK1

  1. השתמש בפלסמיד pGEX4T1 המכיל רצף מאומת cdpk1 גן. אנו מעדיפים להשתמש באותו פלסמיד ששימש לשינוי זן E. coli BLR (DE3) pLysS.
  2. תכננו את הפריימרים כך שיציגו מוטציה של שומר סף ברצף הגנים cdpk1 מסוג פראי. שאריות שומר הסף מסוג פרא (T145) מקודדות על ידי קודון ACC בגן cdpk1 . החלף את שומר הסף של תראונין בשאריות שוער קטנות (סרין, T145S) ומגושמות (מתיונין, T145M) המקודדות על ידי קודונים AGC ו- ATG, בהתאמה.
  3. עקוב אחר ההנחיות שהוזכרו להלן כדי לעצב את הפריימרים קדימה ואחורה עבור מוטגנזה מכוונת אתר.
    1. ודאו ששני הפריימרים משלימים זה את זה. שמור 15-20 נוקלאוטידים של רצף ללא שינוי משני צידי המוטציה. ודא שהטמפרטורה Tm נעה בין 50°C ל-55°C עבור הרצף, למעט האתר שעבר מוטציה.
  4. השתמש בערכת מוטגנזה מכוונת אתר כדי ליצור את המבנים המוטנטיים של שומר הסף של cdpk1. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להציג את המוטציה הרצויה. הפריימרים המשמשים למוטגנזה מכוונת אתר מפורטים בטבלה 1.
  5. טפלו בתערובת התגובה עם אנזים 0.5 μL DpnI (20,000 U/mL) כדי לעכל את הפלסמיד ההורי, שעבר מתילציה. לדגור על תערובת התגובה ב 37 ° C במשך 3 שעות. להפוך E. coli DH5α תאים מוכשרים עם תערובת התגובה שטופלה DpnI.
  6. מסך ארבעה שיבוטים כל אחד ממבני פלסמיד T145M ו- T145S כדי לאמת את הכנסת המוטציה הרצויה ברצף הגן cdpk1 באמצעות ריצוף DNA.
  7. התמירו את הפלסמידים המאומתים ברצף בזן E . coli BLR(DE3) pLysS לביטוי חלבוני CDPK1 T145M/S רקומביננטיים כמתואר בשלב 1.5.
  8. לבטא ולטהר את החלבונים המוטנטיים של שומר הסף CDPK1 בעקבות השלבים המתוארים בסעיף 2 עבור חלבון CDPK1 מסוג פראי.

4. בדיקת פעילות קינאז חוץ גופית של CDPK1

הערה: פעילות הקינאז של CDPK1 רקומביננטי מסוג בר וחלבונים מוטנטיים של שומר הסף מוערכת על ידי גישת תיוג אפיטופים סינתטית למחצה כפי שתוארה על ידי Allen et al.34.

  1. לדגור 50 ng של חלבון רקומביננטי במאגר המכיל 50 mM Tris, 50 mM MgCl2, 1x קוקטייל מעכב פוספט עם 2 מיקרוגרם חלבון בסיסי מיאלין (MBP) כמצע אקסוגני של CDPK1 בתערובת התגובה הכוללת של 50 μL.
  2. בהתאם לתנאים הדורשים נוכחות או היעדר סידן, להוסיף CaCl2 או EGTA, בהתאמה כדי להפוך את הריכוז הסופי של 2.5 mM כל אחד במאגר הבדיקה קינאז. הוסף ATPγS לריכוז הסופי של 100 מיקרומטר למאגר כדי להשתמש בו כמקור לקבוצת פוספט מסוף הניתנת להעברה.
  3. לדגור על תערובת התגובה ב 30 ° C באמבט מים במשך 1 שעות, ולאחר מכן סיום התגובה על ידי תוספת של 5 mM EGTA. הוסף 5 μl של 50 mM p-nitrobenzyl mesylate (PNBM) לתערובת התגובה ולאפשר לו לדגור ב 20 ° C באמבט מים במשך 2 שעות עבור alkylation של זרחן serine ו threonine שאריות ב transphosphorylation MBP ו autophosphorylated CDPK1.
  4. לסך של 55 מיקרוליטר של תערובת תגובה, יש להוסיף 19 μL של מאגר דגימת SDS 4x ולחמם ב-95°C למשך 5 דקות.

5. ניתוח כתם מערבי לזיהוי תוצרי תיו-פוספורילציה של בדיקת קינאז במבחנה

  1. הכינו ג'ל SDS-PAGE 12% וטענו 15 μL מכל דגימה. הפרד את תערובת התגובה כדי לדמיין CDPK1 אוטופוספורילציה ו- MBP transphosphorylated.
  2. מעבירים את החלבונים המופרדים מג'ל SDS-PAGE לקרום PVDF בשיטת העברה רטובה32.
  3. חסום את האתרים הלא ספציפיים בממברנת PVDF על ידי דגירה עם חלב רזה 5% במי מלח חוצצים Tris (20 mM Tris-HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl) המכיל 0.05% Tween 20 למשך שעה אחת ב- RT.
  4. יש לדגור על קרום PVDF עם הנוגדן הראשוני של הארנב כנגד תיאופוספורילטים אלקילטים בדילול של 1:2,500 למשך הלילה ב-4°C במאגר החסימה.
  5. לאחר הדגירה של הלילה, שטפו את הכתם 3x עם מלח חוצץ טריס עם 0.05% Tween 20 במשך 10 דקות כל אחד.
  6. יש לדגור על הכתם עוד יותר עם נוגדן משני נגד ארנב עיזים בחיץ חוסם בדילול של 1:5,000 למשך שעה אחת ב-RT, ולאחר מכן לשטוף במי מלח חוצצים טריס המכילים 0.05% Tween 20.
  7. לכסות את הכתם עם מצע chemiluminescent על ידי ערבוב יחס שווה של פתרון A ותמיסה B על פי הוראות היצרן ולחשוף על סרט רנטגן בחדר חשוך כדי לקבל אותות של אוטופוספורילציה CDPK1 ו transphosphorylation MBP.

6. שיבוט רצף מדריך למיקודמוקדCDPK1 להכנסת החלפת שומר סף  

הערה: הרצף המנחה של 20 נוקלאוטידים נבחר על ידי אצירה ידנית ושוכפל בפלסמיד pL6eGFP באתר BtgZI על ידי שימוש בשלבים הבאים.

  1. עיכול pL6eGFP באמצעות אנזים BtgZI
    1. יש לעכל 1 מיקרוגרם של פלסמיד pL6eGFP35 עם 1 μL של אנזים BtgZI (5,000 יחידות/מ"ל) למשך 4 שעות ב-60°C בתערובת תגובה של 20 μL, בהתאם לפרוטוקול יצרן האנזים לתנאי תגובה.
    2. לאחר תקופת הדגירה של 4 שעות, הפעל את הפלסמיד המעוכל על ג'ל אגרוז 1% והוציא את חתיכת הג'ל (~ 9.8 קילובייט) המכילה את הפלסמיד המעוכל. לטהר את הפלסמיד המעוכל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מבוססת עמוד בהתאם להוראות היצרן.
  2. חישול אוליגוס
    1. הרכיבו מחדש את האוליגונוקלאוטידים (Ck1GUIDEFWD ו-Ck1GUIDEREV) במים נטולי DNase/RNase כדי להכין תמיסת מלאי של 100 מיקרומטר.
    2. ערבבו 20 מיקרומטר מכל אוליגונוקלאוטיד בתמיסה המכילה 10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl ו-1 mM EDTA. יש לדגור על התערובת בטמפרטורה של 95°C באמבט יבש למשך 5 דקות ולאפשר לתגובה להתקרר לטמפרטורת החדר. זה בדרך כלל לוקח 1 שעה עבור הטמפרטורה של תערובת התגובה כדי להשיג RT.
    3. דללו את האוליגונוקלאוטידים המחושלים ל-0.5 מיקרומטר ב-Tris pH 8.0, והתוצאה היא נפח תערובת תגובה כולל של 100 μL.
  3. תגובת In-fusion
    1. שלב 1.5 μL של אוליגונוקלאוטידים מדוללים עם 100 ng של פלסמיד ליניארי מעוכל BtgZI בתערובת מראש של אנזים In-Fusion 5x בנפח תגובה כולל של 10 μL כדי ליצור מדריך CDPK1 המכיל פלסמיד pL6CK1G.
    2. לדגור על התגובה במשך 15 דקות ב 50 ° C. אחסן את התגובה ב 4 ° C עד שתמשיך עם השינוי של E. קולי.
      הערה: לאחסון לטווח ארוך, ניתן לאחסן את תערובת התגובה ב -20 °C.
  4. טרנספורמציה של E. קולי תאים מוכשרים מהממים
    1. הוסף 2.5 μL של תערובת התגובה ל - E. קולי תאים מוכשרים כוכבים ולהמשיך בתהליך הטרנספורמציה בעקבות פרוטוקול היצרן.
    2. צלחת את התאים המוכשרים שעברו טרנספורמציה על צלחת LB ampicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל) ולאפשר לחיידקים מותמרים לגדול ב 37 ° C בן לילה.
    3. בחרו את המושבות שעברו טרנספורמציה וחלצו את הפלסמיד באמצעות ערכת פלסמיד מיני-הכנה מסחרית. בצע את הוראות היצרן לטיהור פלסמיד. אימות החדרת המדריך לפלסמיד באמצעות ריצוף DNA של Sanger.

7. שיבוט זרוע הומולוגיה לתיקון מוקד CDPK1 מוגבל אנדונוקלאז Cas9

הערה: זרוע הומולוגיה הכוללת את SNPs שיוכנסו למוקד המטרה מסונתזת באופן מסחרי. אנחנו בדרך כלל לוקחים זרוע הומולוגיה של 400-1000 bp אורך. זרוע ההומולוגיה מכילה מוטציות שקטות באזור הרנ"א המנחה וב-PAM כדי למנוע חיתוך מחדש של הלוקוס שהשתנה לאחר שילוב ה-SNPs הרצויים. זרוע ההומולוגיה (המקבילה לנוקלאוטידים 133 עד 553 של CDPK1), המשלבת מוטציות שומר סף Met או Ser ומוטציות שקטות, מוקפת באתרי הגבלה AflII ו- SpeI.

  1. מעכל כפול 1 מיקרוגרם של pL6CK1G והפלסמיד המכיל את זרוע ההומולוגיה באמצעות 0.5 μL כל אחד מאנזימי הגבלה AflII (20,000 U/ml) ו- SpeI (20,000 U/ml) למשך 4 שעות ב- 37 ° C בתערובת תגובה של 20 μL.
  2. הפעל את התגובה המלאה של פלסמידים מעוכלים פעמיים על ג'ל אגרוז 1.5% וטהר את הפסים המתאימים לזרוע ההומולוגיה ועמוד השדרה של פלסמיד של pL6CK1 באמצעות ערכת מיצוי ג'ל בהתאם להוראות היצרן.
  3. קשרו את זרוע ההומולוגיה המעוכלת עם 100 ננוגרם של פלסמיד pL6CK1 ביחס וקטור להכנסה של 1:5 בנפח תגובה כולל של 10 μL באמצעות ליגאז DNA T4. לדגור על תגובת הקשירה לילה ב 16 ° C. הפוך תאים מוכשרים E. coli DH5α עם תערובת קשירה מלאה על פי הוראות היצרן.
  4. לוחים את התאים שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר LB המכילים אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) כדי לבחור טרנספורמציות חיוביות. בחר מושבות בודדות מצלחת LB ampicillin ולטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת מיצוי פלסמיד.
  5. אשר את השיבוט לנוכחות זרוע ההומולוגיה על ידי עיכול הפלסמיד המטוהר עם אנזימי AflII ו- SpeI באמצעות אותו מצב עיכול כמתואר בשלב 7.3. אשר את השיבוטים החיוביים לעיכול כפול עוד יותר על ידי ריצוף DNA Sanger כדי לאמת את הרצף המלא של זרוע ההומולוגיה.

8. טיהור פלסמידים pL6CK1Met, pL6CK1Ser ו-pUF1 להעברת טפיל מלריה

  1. הגדר 5 מ"ל של תרביות ראשוניות של שיבוטים מאומתים ברצף של pL6CK1Met, pL6CK1Ser ו- pUF1 במדיה LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ודגרה במשך 10 שעות. מעבירים את התרבות הראשונית לתרבות המשנית ביחס של 1:1000 ודגרים 12 שעות נוספות.
  2. משחררים את תרבית החיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 5000 x גרם למשך 10 דקות בבקבוק צנטריפוגה.
  3. בודדו את הפלסמידים באמצעות ערכת טיהור פלסמיד בהתאם לפרוטוקול היצרן. ממיסים את הדנ"א של פלסמיד במים נטולי DNase/RNase לצורך העברה ישירה של הטפיל.

9. תרבית חוץ גופית של פלסמודיום פלציפרום וסנכרון סורביטול לטרנספקציה

הערה: P. falciparum בתרבית חוץ גופית בכדוריות דם אדומות אנושיות (RBCs) מבוצעת על פי השיטה המתוארת על ידי Trager ו Jensen36.

  1. להפיץ זן NF54 של P. פלציפרום על ידי תרבית ב-Rbcs אנושיים O+ בהמטוקריט של 2% בתווך RPMI מלא (cRPMI) המכיל RPMI 1640 בתוספת L-גלוטמין, 25 mM HEPES, 25 mM נתרן ביקרבונט ו-50 מיקרוגרם/מ"ל היפוקסנטין. השלימו את המדיום עם 0.5% AlbuMAX II ו-10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ושמרו על התרבית ב-37°C באטמוספירה של 5% O2, 5% CO2 ו-90% N2.
  2. כדי שסנכרון סורביטול יקבל טפיל שלב טבעתי, גלול את הטפילים האסינכרוניים בצינור חרוטי של 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב 2,300 x גרם למשך 3 דקות ב- RT. השליכו את הסופרנטנט.
  3. לדגור RBCs טפילים עם 9 כרכים של 5% סורביטול במשך 10 דקות ב 37 ° C. לאחר הדגירה, משחררים את ה-RBCs באמצעות צנטריפוגה במהירות של 2,300 x גרם למשך 3 דקות ומשליכים את הסורביטול.
  4. לשטוף את הטפילים המטופלים סורביטול עם RPMI חלקי, iRPMI (מדיה RPMI ללא albumax וסודיום ביקרבונט) ולאחר מכן לדגור אותם cRPMI. השתמש בטפילי שלב הטבעת במחזור הבא עבור טרנספקציה פלסמיד.

10. טרנספקציה של טפיל שלב טבעתי עם פלסמידים pL6CK1Met, pL6CK1Ser ו- pUF1

הערה: השלבים הבאים משמשים להעברה ישירה של טפילים בשלב הטבעתי עם DNA פלסמיד.

  1. הכינו 2x cytomix buffer37 על ידי המסה ב-30 מ"ל מים, 240 mM KCl, 0.3 mM CaCl2, 4 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 mM K2HPO4/KH2PO4 ו-50 mM HEPES. כוונן את ה- pH ל- 7.6. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 50 מ"ל. סנן לעקר את המאגר באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, דללו את מאגר הציטומיקס 2x במים סטריליים כדי לקבל מאגר ציטוטומיקס 1x.
  2. בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל, הוסף 100 μL של RBCs טפיליים ארוזים בשלבי טבעת ושטוף אותם 2x עם 5 מ"ל של 1x cytomix buffer. בצע את השטיפות על ידי צנטריפוגה ב 994 x גרם במשך 3 דקות ב RT.
  3. לאחר השטיפה, הסירו את החיץ והוסיפו 50 מיקרוגרם מכל פלסמיד (pL6CK1Met/pUF1 ליצירת מוטציית T145M ו-pL6CK1Ser/pUF1 ליצירת מוטציית T145S) ל-RBCs הטפילים הדחוסים. לאחר מכן, הוסף חיץ 2x בהתאם לנפח הפלסמיד והתאם את עוצמת הקול ל 400 μL עם ריכוז חיץ 1x.
  4. מעבירים 400 μL של התמיסה הנ"ל לתוך 0.2 ס"מ cuvettes עבור כל transfection. אלקטרופורט באמצעות התנאים הבאים: 0.31 kV, 950 μF והתנגדות מוגדרת לאינסוף.
  5. לאחר אלקטרופורציה, להסיר את הטפילים נגועים מן cuvette, לערבב אותם עם cRPMI, ולהעביר אותם לתוך בקבוק T25 עם נפח כולל של 15 מ"ל. לדגור על הטפילים במשך 2 שעות בתנאים שהוזכרו בשלב 9.1.
  6. לאחר הדגירה, להעביר את הטפילים נגועים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל צנטריפוגה ב 994 x גרם במשך 3 דקות. הסר את supernatant ולשטוף את הטפילים עם 10 מ"ל של RPMI שלם. תרבית אותם עם cRPMI טרי במשך 2 ימים, חידוש מדיום התרבות לאחר 24 שעות.
  7. לאחר 48 שעות, הסר את ה- cRPMI מכל בקבוק והשהה מחדש את התרבית ב- cRPMI המכילה 2 ננומטר של WR99210 ו- 150 ננומטר של DSM26738. לאחר מכן, העבירו את התרבית לבקבוק T75 על ידי הוספת 400 μL של RBCs טריים. חדשו את המדיה מדי יום עם cRPMI המכיל WR99210 ו- DSM267 למשך 7 ימים. לאחר מכן, להוסיף cRPMI המכיל את שתי התרופות כל יומיים עד יום 14 לאחר transfection.
  8. ביום ה -14, aliquot 200 μL של תרבית נגועה ב 1.5 מ"ל של צינור מיקרוצנטריפוגה (MCT) להכנת שקופיות. הורידו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 500 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את הסופרנאטנט והעבירו את התאים לשקופית. בצע מריחה באמצעות שקופית אחרת על-ידי הצבתה בזווית של 45°.
  9. תקנו את המגלשה במתנול והכינו את כתם Giemsa על ידי דילול 1:10 במים טהורים במיוחד. לאחר מכן, הכתימו את המגלשה על ידי טבילתה המלאה בכתם Giemsa למשך 20 דקות. שטפו את המגלשה תחת מים זורמים וייבשו אותה היטב. לאחר מכן, צפו בשקופית תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 100 על ידי מריחת שמן טבילה.
  10. לאחר הטפילים הם דמיינו, לחדש את התקשורת מדי יום ולאפשר להם לגדול במשך 2-3 ימים. לאחר מכן, הסר את הטפילים כדי לאמת את השינוי הרצוי ברצף גן המטרה במוקד היעד.
    הערה: אם הטפילים אינם נראים ביום ה -14, חדש את המדיה (המכילה את שתי התרופות) לאחר 4 ימים. חותכים את הטפיל ב -30% ומוסיפים דם טרי כדי לשמור על המטוקריט 2% כל 7 ימים עד שהטפילים מופיעים שוב.

11. אימות PCR של טפיל מהונדס עם שינוי רצוי של מוקד cdpk1

  1. לאחר 2-3 ימים של צמיחת טפילים, הוציאו 500 מיקרוליטר תרבית והעבירו אותה ל-MCT של 1.5 מ"ל.
  2. משחררים את התאים בצנטריפוגה במהירות של 2,400 x גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, lyse RBCs על ידי טיפול saponin.
    1. לטיפול בסאפונין, יש להוסיף 10 μL של תמיסת סאפונין 10% ל-1 מ"ל של כדורי טפיל מרחף ולשמור על טמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות. צנטריפוגה את התאים ב 2,400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant. חזור על שלב זה עד שהאדמומיות נעלמת לחלוטין ומתקבלת גלולה בצבע שחור של טפילים.
  3. שטפו את כדורית הטפיל עם 1 מ"ל של 1x PBS על ידי צנטריפוגה ב 2,400 x גרם במשך 5 דקות. לאחר מכן, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר מים נטולי DNase/RNase. חממו את כדורית הטפיל המרחף מחדש ב 95 ° C במשך 5 דקות, ואחריו צנטריפוגה ב 16,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל DNA טפיל לצינור טרי.
  4. השתמש בחומר הגנטי לעיל כדי להגביר את הגן באורך מלא המשתמש בערכת הפריימר ck1f1 ו - ck1r3wt (ראה טבלה 1), תוך התמקדות ספציפית באזור שמחוץ לזרוע ההומולוגיה כמתואר לעיל בשלב 1.2. רצף את האזור ההומולוגיה המכיל את מוטציית T145M באמצעות פריימר ck1f1 .

12. הגבלת דילול להשגת טפילים טרנסגניים משובטים

  1. לאחר אימות הרצף, לדלל את תרבית הטפיל transfected כדי להשיג ריכוז סופי של 1 טפיל לכל 200 μL. לאחר מכן, הוסף 100 μL של התרבות המדוללת לבארות של צלחת תרבית רקמה 96 בארות. בצע את השלבים הבאים (12.2-12.4) כדי להשיג 1 טפיל/200 μL.
  2. הכינו 10 מ"ל של RBCs טפילים עם המטוקריט 2%. להעריך את אחוז הטפילים של התרבית באמצעות שיטת צביעת Giemsa שתוארה לעיל. לאחר מכן, ספור את המספר הכולל של RBCs בתרבית מדוללת 1:100 באמצעות המוציטומטר.
    המספר הכולל של RBCs/mL = המספר הממוצע של RBCs שנספרו x גורם דילול x 104
    מספר RBCs/mL טפילים = (אחוז פרזיטמיה x המספר הכולל של RBCs/mL)/100
  3. הכינו דילול 1:10,000 של RBCs טפילים על ידי דילול סדרתי של התרבית הראשונית פי 2 (דילול 1:100 כל אחד).
  4. הוסף נפח מתאים (במיקרוליטרים) מהתרבות המדוללת כדי להשיג סך של 50 טפילים ב 10 מ"ל של מדיה, הבטחת 2% המטוקריט. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של מדיה המכילה 50 טפילים לכל באר של צלחת 96 באר. מניחים את הצלחת בסקדור אטום סמוק בגז מעורב (הרכב כמתואר לעיל בשלב 9.1) ודגרים ב 37 מעלות צלזיוס. החלף את המדיה לאחר כל יומיים.
  5. החלף את המדיה עם cRPMI המכיל 2% hematocrit כל7 יום עד הטפילים מופיעים.
    1. הטה את לוח 96 הבארות לזווית של 45° ואפשר ל- RBCs להתיישב. באמצעות פיפטה סרולוגית, הסר בזהירות את המדיה מכל באר וצפה בשינוי צבע לצהוב בבארות המכילות טפילים, בניגוד לצבע הוורוד של המדיה בבארות נטולות טפילים. שינוי צבע זה מתרחש מכיוון שהטפילים חומציים את המדיום.
  6. לאחר התבוננות בשינוי הצבע, מוציאים כמות קטנה של תרבית מהבאר המציגה שינוי צבע ומכינים כתם על שקופית, מתייגים אותה במספר המתאים למיקום הבאר. הכתימו את המגלשה בכתם Giemsa והתבוננו בה תחת מיקרוסקופ כמתואר לעיל.
  7. מעבירים את תכולת הבאר לבקבוק T25 שבו נצפו טפילים תחת המיקרוסקופ. אפשר לטפילים לגדול בבקבוק T25 במשך 4-5 ימים ולחדש את התקשורת כל יומיים.
  8. ברגע שהטפילים מגיעים ל 2-3%, לחלץ 500 μL של תרבית טפיל. לאחר מכן, saponin-lyse RBCs ולהמשיך לחלץ חומר גנטי טפיל באמצעות השיטה המתוארת בסעיף 11.
  9. כדי לאשר את היווצרותם של טפילים טרנסגניים משובטים, הגדר תגובת PCR כמתואר לעיל בשלב 1.1.1 ושלח את מוצר ה- PCR לריצוף DNA כדי לאשר את הכנסת ה- SNPs הרצויים במוקד המטרה.

13. ניתוח תמלול באמצעות PCR בזמן אמת

  1. פרקול/סורביטול טיהור וסנכרון של הטפילים
    1. הכינו שיפוע פרקול/סורביטול39,40 על ידי שכבות רציפות של 3 מ"ל כל אחת של 70% ואחריה 40% תמיסות של פרקול/סורביטול בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    2. שכבה עדינה 1-2 מ"ל של תרבית טפיל המכילה בעיקר את הטפיל בשלב סכיזונט של WT ו- CDPK1 T145M על גבי השיפוע.
    3. צנטריפוגה את השיפוע ב 2,300 x גרם במשך 15 דקות ב RT באמצעות deacturation להגדיר 4 בצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד.
    4. אספו את הטבעת האמצעית המכילה שלבי טרופוזואיט וסכיזונט של הטפיל מממשק השיפוע בצינור חרוטי טרי של 50 מ"ל.
    5. שטפו את הטפילים על ידי הוספת נפח שווה של 9:1 (cRPMI:10xPBS), ואז צנטריפוגה של 994 x גרם למשך 3 דקות כדי לשטוף את הטפילים.
    6. שטפו שוב את הגלולה בתמיסה של 19:1 (cRPMI:10xPBS), ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות של 994 x גרם למשך 3 דקות.
    7. הוסף כל כדורית טפיל לצלוחיות נפרדות המכילות cRPMI עם המטוקריט 2% (מודגר מראש ב 37 ° C). לדגור על הצלוחיות במשך 4 שעות בתנאים כמתואר לעיל בשלב 9.1 כדי לאפשר פלישה של merozoites מן schizonts מועשר לתוך RBCs טריים.
    8. לאחר 4 שעות, לטפל בטפילים עם סורביטול כמתואר לעיל בשלבים 9.2-9.4 כדי לקבל טפילים מסונכרנים מאוד 0 - 4 שעות שלב הטבעת.
    9. לדגור על טפילים מסונכרנים במשך 44 שעות לאחר הטיפול סורביטול כדי לקבל את שלב סכיזונט 44 - 48 שעות של הטפיל.
  2. בידוד RNA מסכיזונטים של טפילי WT ו-CDPK1 T145M
    1. קצרו את הטפילים WT ו-CDPK1 T145M ב-44-48 שעות לאחר הפלישה. שטפו את כדורי הטפיל עם 1x PBS ב 994 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C.
    2. השהה מחדש את כדורי הטפיל ב 1 מ"ל של PBS 1x וטפל בהם עם ספונין כדי לשפוך את RBCs שמסביב כמתואר בשלב 11.2.1.
    3. להשהות מחדש את גלולת הטפיל ב 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA ולאחסן ב -80 ° C עד עיבוד נוסף.
    4. הפשיר את הגלולה הקפואה ב 15-30 ° C עבור דיסוציאציה מלאה של מתחמי נוקלאופרוטאין.
    5. הוסף 200 μL של כלורופורם לכל מ"ל של מגיב מיצוי RNA ולנער את הצינורות במרץ ביד במשך 15 שניות. יש לדגור ב-RT למשך 2-3 דקות.
    6. צנטריפוגה את התערובת ב 16,200 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. RNA יישאר אך ורק בשכבה המימית העליונה חסרת צבע. בודדו RNA באמצעות ערכה בהתאם להוראות היצרן.
  3. סינתזת cDNA מהרנ"א של WT וטפיל CDPK1 T145M
    1. יש לטפל בדגימות המכילות RNA באמצעות ערכה להסרת DNA בהתאם להוראות היצרן להסרת DNA מזהם.
    2. סנתז cDNA מדגימות RNA מבודדות באמצעות ערכת סינתזת cDNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. אנו משתמשים בפריימרים הקסמרים אקראיים לתהליך השעתוק ההפוך במקום פריימרים אוליגו-dT.
    3. ודא שבקרות NO-RT (תגובות מוגדרות מבלי להוסיף את אנזים השעתוק ההפוך) עבור כל דגימת RNA המשמשת להכנת cDNA כדי למנוע נשיאה של זיהום DNA גנומי מ- RNA מטוהר במהלך הכנת cDNA.
    4. בדוק את cDNA על ידי הגברת כל מקטע גן המכיל רצף אינטרוני מתערב, כגון הגן cdpk1 באורך מלא, כדי לשלול זיהום DNA גנומי. השתמש בתנאי PCR כמתואר בשלב 1.1.1.
  4. ניתוח ביטוי תעתיק של טפיל WT ו- CDPK1 T145M
    1. השתמש ב- cDNA שהוכן מטפילי WT ו- CDPK1 T145M כדי לבצע ניתוח ביטוי תעתיק של 11 גנים שונים באמצעות PCR בזמן אמת. 11 גני המטרה כוללים 7 חברים ממשפחת CDPK ו-4 קינאזות המעורבות בפלישה ל-RBC (ראו טבלה 2 עבור גנים ופריימרים מתאימים המשמשים ל-PCR בזמן אמת).
    2. עיצוב פריימרים באמצעות תוכנת סינתזת פריימר. הגבירו כ-120 bp מכל גן שנבחר באמצעות פריימרים ספציפיים לגן עם טמפרטורות התכה דומות.
    3. הגבירו את גני המטרה באמצעות ערבוב מקדים והריצו את הצלחת על מערכת PCR בזמן אמת באמצעות פרמטרי המחזור הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95°C למשך 3 דקות ולאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב-95°C למשך 10 שניות, חישול ב-52°C למשך 20 שניות והארכה ב-62°C למשך 30 שניות.
    4. לנרמל את רמת הביטוי של כל גן באמצעות שני גנים ביתיים, גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) ותראונין tRNA ליגאז (ThrRS)32. חשב את הביטוי היחסי של כל קינאז מטרה בטפיל CDPK1 T145M בהשוואה לבקרת WT.
    5. בצע את הניתוח הסטטיסטי באמצעות חבילת הניתוח הסטטיסטי R. לחלופין, השתמש בכל תוכנת ניתוח אחרת.
      הערה: שיטות שעתוק גלובליות כגון RNA-Seq או microarray הן גישות טובות יותר להשגת תצוגה רחבה יותר של חיווט מחדש של שעתוק בטפילים מוטנטיים בהשוואה ל- WT.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WT CDPK1 רקומביננטי מבוטא כחלבון היתוך עם תג N-terminal Glutathione S-transferase (GST) ומטוהר באמצעות כרומטוגרפיית זיקה GST. חלבון CDPK1 המטוהר זוהה באמצעות כתם מערבי באמצעות נוגדנים נגד CDPK1 ונוגדנים נגד GST (איור 1). שאריות שומר הסף של תראונין (T145) ב-WT CDPK1 הוחלפו ב-Met וב-Ser תוך שימוש במוטגנזה מכוונת אתר כדי ליצור חלבונים רקומביננטיים CDPK1T145M ו-CDPK1T145S מוטנטיים, בהתאמה (איור 2). בדיקת קינאז במבחנה נעשתה כדי להעריך את פעילות הקינאז של כל חלבוני CDPK1 רקומביננטיים. פעילות הקינאז נבדקה באמצעות גישת תיוג אפיטופים חצי סינתטית34 על-ידי זיהוי קבוצת אסטר תיו-פוספט באמצעות נוגדן ספציפי בפורמט כתם מערבי (איור 3). ההשפעה של החלפת שומרי סף על פעילות האוטופוספורילציה של CDPK1 והטרנספוספורילציה של MBP המשמש כמצע אקסוגני של CDPK1 הוערכה על ידי כימות העוצמה של רצועות האוטופוספורילציה והטרנספוספורילציה בהתאמה. CDPK1 מוטנטי עם שומר סף מתיונין שמר על ~ 53% פעילות טרנספוספורילציה, בעוד שנוכחות של סרין בעמדת שומר הסף הובילה לביטול מוחלט של טרנספוספורילציה של המצע (איור 3). SNPs המובילים להחלפת שוער מ-Thr ל-Met (T145M) הונדסו בלוקוס cdpk1 אנדוגני באמצעות CRISPR-Cas9 באמצעות מערכת דו-פלסמידית (איור 4 ואיור 5). לא ניתן היה ליצור טפילים מוטנטיים עם תחליפי T145S, אולי בשל ההשפעה הקטלנית של שומר הסף Ser על פעילות CDPK1. CDPK1T145M הטפילים המוטנטיים שובטו בשיטת הדילול המגביל, והחלפת שומר הסף אושרה באמצעות ריצוף סנגר כדי לאמת את היווצרות הטפיל המוטנטי CDPK1T145M. רמות תעתיק של 11 קינאזות שונות, כולל 7 בני משפחת CDPK ו-4 קינאזות אחרות שהיו מעורבות בהתפתחות סכיזוגונית מאוחרת של הטפיל, נבדקו באמצעות PCR בזמן אמת (איור 6). רמות הביטוי של 11 קינאזות שונות הושוו בין CDPK1T145M הטפילים המוטנטיים והטפילים מסוג בר (WT), שנורמלו לגנים של משק הבית. ביטוי התעתיק של בני משפחת CDPK השתנה במוטציה CDPK1T145M בהשוואה לטפיל WT (איור 6). תמלילים המראים ביטוי גבוה יותר במוטנט CDPK1T145M עשויים לפצות על תפקודו של CDPK1 בטפיל המוטנטי CDPK1T145M.

figure-results-1
איור 1: אפיון של סוג בר רקומביננטי באורך מלא (WT) PfCDPK1. חלבון WT CDPK1 באורך מלא שהתמזג עם תג N-terminal Glutathione S transferase (GST) טוהר על ידי כרומטוגרפיית זיקה והופרד ב-10% SDS-PAGE. CDPK1 נדד למסה המולקולרית החזויה של ~ 87 kDa, כפי שמוצג בג'ל הפוליאקרילאמיד המוכתם Coomassie Brilliant Blue R-250. חלבון רקומביננטי שהופרד ב-SDS-PAGE הועבר לקרום PVDF ועובד לניתוח כתמים מערביים עם נוגדנים נגד CDPK1 ו-anti-GST. פס המתאים ל-CDPK1 רקומביננטי באורך מלא ב-SDS-PAGE זוהה עם שני הנוגדנים, מה שאישר את זהות החלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אפיון חלבונים מוטנטיים רקומביננטיים מטוהרים של CDPK1. (A) יישור רצף חומצות האמינו הראשוניות של TgCDPK1 ו-PfCDPK1 (Plasmodb accession no. PF3D7_0217500). תראונין במיקום 145 של PfCDPK1 מתאים לגליצין 128, עמדת שומר הסף ב-TgCDPK1 (מסומן באדום). (B) ייצוג קריקטוריסטי של שאריות שומר הסף Thr (מסומנות באדום) המקודדות על ידי קודון משולש ACC (עיגול שחור) ב-WT CDPK1. החלפת שאריות שומר הסף במוטגנזה מכוונת אתר ליצירת חלבוני CDPK1 מוטנטיים רקומביננטיים עם Met (מודגש בצהוב) ב-CDPKT145M ו-Ser (מודגש בכחול) ב-CDPKT145S. (C) פרופיל SDS-PAGE של WT רקומביננטי וחלבונים מוטנטיים של CDPK1. החלבונים המוטנטיים הרקומביננטיים WT ושומר הסף טוהרו על ידי כרומטוגרפיית זיקה GST והופרדו ב-SDS-PAGE. כל החלבונים הרקומביננטיים מתאימים למשקל המולקולרי הצפוי של ~87 kDa. M- סולם משקל מולקולרי. (D) אפיון של CDPK1 WT רקומביננטי וחלבונים מוטנטיים באמצעות כתם מערבי. החלבונים המוטנטיים הרקומביננטיים WT ושומר הסף של CDPK1 הופרדו ב-SDS-PAGE והועברו לקרום PVDF לצורך כתישה מערבית. רצועות המתאימות לחלבוני WT רקומביננטי באורך מלא וחלבוני CDPK1 מוטנטיים ב- SDS-PAGE זוהו עם נוגדנים נגד CDPK1 ו- anti-GST, המאשרים את זהותם של כל החלבונים הרקומביננטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: החלפת שומרי סף ב-CDPK1 מובילה לירידה בפעילות הקינאז של אנזימים מוטנטיים. (A) ייצוג קריקטוריסטי של גישת תיוג אפיטופים סינתטית למחצה לזיהוי פעילות קינאז של חלבון CDPK1. רק פעילות טרנספוספורילציה מתוארת כאן. חלבון CDPK1 thiophosphorylates מצע אקסוגני (S, ריבוע ירוק מוצק) בנוכחות ATPγS (משולש צהוב מוצק), מקור לקבוצת תיופוספט טרמינלית ניתנת להעברה). השארית thiophosphorylated הוא alkylated על ידי טיפול עם p-nitrobenzyl mesylate (PNBM), יצירת אסטר thiophosphate כי הוא מזוהה לאחר מכן עם נוגדן המזהה באופן ספציפי alkylated thiophosphate adduct. (B) בדיקת פעילות קינאז במבחנה באמצעות גישת תיוג אפיטופ סינתטי למחצה שימשה לבדיקת ההשפעה של החלפת שומר סף על פוטנציאל האוטופוספורילציה והטרנספוספורילציה של חלבונים מוטנטיים רקומביננטיים CDPK1. כל החלבונים הרקומביננטיים מפגינים פעילות קינאז תלוית סידן. זרחן אוטומטי של CDPK1 וטרנס-פוספורילציה של חלבון בסיסי מיאלין (MBP), מצע אקסוגני, ניכר רק בנוכחות סידן כלורי (Ca2+), בעוד שלא זוהה זרחן בנוכחות EGTA, כלטור ספציפי של יוני Ca2+ . מוטציות שומרי הסף מראות פעילות אוטופוספורילציה מופחתת, בעוד שהטרנספוספורילציה של MBP בוטלה לחלוטין בשנת CDPK1T145S. CDPK1T145M שומר על פוטנציאל טרנספוספורילציה (~ 53%) כפי שדווח קודם לכן32. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: בניית פלסמידים להחדרת SNPs בעמדת שומר סף בלוקוס cdpk1 באמצעות CRISPR-Cas9. רצף מנחה של 20 נוקלאוטידים המתאימים ל-432 עד 451 bp שובט באתר ההגבלה BtgZI בפלסמיד pL6eGFP כדי ליצור pL6CK1G. זרוע הומולוגיה (421 bp) המשלבת את SNPs הרצויים (T145M או T145S, קודון תואם מוצג בירוק) יחד עם מוטציות מגן (מוצג באדום) שובטה ב-pL6CK1G בתוך אתרי אנזימי הגבלה AflII ו-SpeI כדי ליצור pL6CK1GT145M ו-pL6CK1GT145M, בהתאמה. מוטציות מגן מונעות חיתוך מחדש של הלוקוס שהשתנה לאחר העריכה הרצויה. Cas9 endonuclease מקודד בפלסמיד שני, pUF1 מופנה לאתר המטרה בתוך מוקד cdpk1 בעזרת RNA מנחה מבוטא מפלסמיד pL6CK1GT145M/S . Cas9 מציג שבירת גדיל כפול באתר המטרה לכיוון צד 5' של רצף PAM. ה- DSB מתוקן באמצעות זרוע הומולוגיה בפלסמיד pL6CK1GT145M/S . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ייצוג סכמטי של P. transfection falciparum עם פלסמידים CRISPR להכנסת מוטציית שומר הסף (T145M) בלוקוס cdpk1 . i) אסינכרוני P. תרבית פלציפרום מטופלת בסורביטול כדי להשיג טפילים מסונכרנים בשלב הטבעת. ii) טפילים מסונכרנים בשלב הטבעתי נלקחים בקובט אלקטרופורציה יחד עם פלסמידים pL6CK1GT145M/S ו- pUF1 המרחפים מחדש בתמיסת חיץ. 3) הטפילים מחושמלים במתח של 310 וולט, 950 מיקרו-פרנהייט ועמידות אינסופית. ד) לאחר הטרנספקציה, הטפילים מועברים לבקבוק T25 המכיל תווך RPMI שלם טרי (cRPMI) ומתורבתים במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הטפילים הנגועים עוברים ל- cRPMI בתוספת התרופות WR99210 ו- DSM267 ומורחבים בבקבוק T75. v) ביום ה-14 מכינים מגלשות ומוכתמות באמצעות כתם Giemsa. vi) לאחר מכן, כתם הדם הוא דמיינו תחת מיקרוסקופ אור כדי להעריך את נוכחותם של RBCs טפילים. vii) עם הדמיה, הטפילים מורשים לגדול בנוכחות סמים. לאחר מכן, הטפילים מעובדים כדי לקבל את התבנית עבור PCR וריצוף DNA לאימות השינוי הרצוי של מוקד היעד cdpk1 . viii) לאחר האימות, טפילים טרנסגניים שבטיים מתקבלים על ידי הגדרת דילול מגביל בצלחת 96 בארות. ix) טפילים טרנסגניים משובטים מבארות חיוביות מועברים לצלוחיות T25 ומורשים לגדול. x) טפילים טרנסגניים שבטיים מאומתים עוד יותר באמצעות PCR ונוכחות SNPs רצויים בעמדת שומר הסף באמצעות ריצוף DNA וניתוח הכרומטוגרמה. הנתון שונהמ-32. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: ייצוג סכמטי של השלבים המשמשים לניתוח תעתיק של גני מטרה באמצעות PCR (RT-PCR בזמן אמת). ט) פ. תרבית פלציפרום עם טפילי שלב סכיזונט בוגרים בעיקר מתקבלת באמצעות טיפול סורביטול באותו מחזור. ii) הטפילים מוכנסים בעדינות בשכבות על שיפוע של 70/40 פרקול/סורביטול בצינור חרוטי של 15 מ"ל להעשרת טפילי שלב סכיזונט בוגרים. iii) הטבעת השחורה בשלב הביניים של 40% ו-70% אישי/סורביטול מועברת לצינור טרי של 50 מ"ל, מעובדת ומושעה מחדש ב-cRPMI. הטפילים המועשרים בשלב סכיזונט מודגרים עם RBCs טריים מודגרים מראש ב 37 מעלות צלזיוס לפלישה. iv) הטפילים מתורבתים במשך 4 שעות ולאחר מכן מטופלים עם 5% סורביטול כדי לקבל טפילים מסונכרנים מאוד 0-4 שעות שלב הטבעת. v) הטפילים עוברים תרבית נוספת לטיפול נוסף של 44 שעות לאחר סורביטול כדי לקבל טפילי שלב סכיזונט מסונכרנים מאוד של 44-48 שעות. vi) הטפילים המסונכרנים מטופלים בסאפונין כדי לשחרר אותם מה-RBCs ומאוחסנים בריאגנט מיצוי RNA. סך כל הרנ"א מבודד מטפילי מיצוי הרנ"א. vii) cDNA מוכן מהרנ"א המבודד. viii) ניסוי PCR בזמן אמת מוגדר עם תבנית cDNA כדי להגביר את גני המטרה באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים. הצלחת מופעלת על מערכת PCR בזמן אמת. ix) נתוני ביטוי התמליל מנותחים באמצעות תוכנת ניתוח. הגרף מייצג רמות ביטוי תעתיק דיפרנציאלי של 11 קינאזות בטפילי CDPK1 T145M בהשוואה לסוג הבר (WT). נתון זה שונה מ32. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שם גןרצף פריימר
Pk1fpgexATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG
Pk1rpgexATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCAAATTTTGTGCATC
Ck1T145SGTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAAGCGAATTATTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145S_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
CK1T145MGTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGATTATTATGAAGGTGGGGAA
Ck1T145M_antisenseTTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC
Ck1GUIDEFWDTAAGTATATAATATTATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA
Ck1GUIDEREVTTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA
ck1f1 ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG
ck1r3wtTGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG

טבלה 1: רשימת פריימרים ששימשו במחקר.

שם הגןפריימר קדמיפריימר הפוך
CDPK1 (PF3D7_0217500)GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATCATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT
CDPK2 (PF3D7_0610600)GGAACAGGAGAATTTACAACGACTGTATACATAATAACACCACTAGACCAG
CDPK3 (PF3D7_0310100)CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGGCAGCGTCCATTGTAAG
ACATCTTTTTATTAAATC
CDPK4 (PF3D7_0717500)ATACTTCTCTCAGGGTGCCCCTTATCACTAATTTTTTT
GAATTGTGGTAAATCG
CDPK5 (PF3D7_1337800)GGAGGTCGAGATGGATACGAATAGTATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG
CDPK6 (PF3D7_1122800)CCTCCCGTAGATAATATATTATTATCTAGATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC
CDPK7 (PF3D7_1123100)AGTCCTAAAAAAGATATA
TAAAGAACTAGGTAGTAG		TTTAAAAATAATCTCTCCCCACAACCC
PKA (PF3D7_0934800)AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGGCTTTTGTTTCTTCTTAAA
AATGTAAAAAATTCTCC
PKG (PF3D7_1436600)אCATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC
PKB (PF3D7_1246900)CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACGGAGAGCGCAATTAGCCATATTG
PI3K (PF3D7_0515300)CCCCTTCAATTTGTGTGTGAAACAGATCACATTTGTTATACTT
ATTATCATCACATTTGTT
GAPDH (PF3D7_1462800)GGAAGGAAAGATATCGAAGTAGGGGTTACCTCACATGG
ThrRS (PF3D7_1126000)CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTTTAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC

טבלה 2: רשימת גני המטרה (מספר זיהוי PlasmoDB) יחד עם רצף הפריימרים המשמשים לניתוח PCR בזמן אמת.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת טפיל מהונדס מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 מבוססת על נתוני פעילות קינאז במבחנה עם אנזימים רקומביננטיים. עדיף לייצר כמה שיותר חלבונים רקומביננטיים מוטנטיים עם שאריות שוער שונות ככל האפשר. מכיוון שהגנום P. falciparum עשיר מאוד ב-AT, לכן, ביטוי של חלבונים רקומביננטיים ב-E. COLI עשוי לדרוש אופטימיזציה של קודון. זה יעזור בהערכה מקיפה של החלפת שומר הסף על פעילות קינאז של האנזים המוטנטי. החלפת שומר הסף המביאה להפחתת פוטנציאל הטרנספוספורילציה נבחרת ליצירת טפיל טרנסגני חליפין אללי. במקביל, החלפת שומר סף המבטלת לחלוטין את פעילות הטרנספוספורילציה של הקינאז צריכה להילקח כבקרה שלילית. שיקול חשוב נוסף בעת יצירת טפיל החליפין האללי הוא החדרת מוטציה נרדפת יחד עם מוטציית הבדיקה והבקרה השלילית. יצירת הטפיל המכיל מוטציה נרדפת בלוקוס cdpk1 משמשת כבקרה פנימית חשובה לשלילת טעויות טכניות בעת החדרת מוטציית הבדיקה. יתר על כן, הטפיל המהונדס הנושא מוטציה נרדפת יכול לשמש כבקרה לכל המחקרים ההשוואתיים במקום טפיל WT.

השתמשנו במערכת דו-פלסמידית ליצירת הטפיל המוטנטי שומר הסף32,35. עם זאת, ניתן להגדיל את היעילות של החדרת SNP במיקום היעד באמצעות מערכת פלסמיד אחת במקום מערכת פלסמיד שני41. במערכת פלסמיד יחיד, כל האלמנטים הקריטיים הדרושים לעריכת גנים בתיווך CRISPR-Cas9 משולבים בפלסמיד יחיד במקום שניים. הפלסמיד הבודד מקודד את Cas9 endonuclease, מתמלל sgRNA המורכב מ-tracrRNA והרנ"א המנחה, ומכיל זרוע הומולוגיה לתיקון השבר הדו-גדילי שהוכנס על ידי אנדונוקלאז Cas9 באתר המטרה. במערכת דו-פלסמידית, הטפילים נגועים יחד עם שני הפלסמידים. מכיוון שמספר הטפילים המקבלים את שני הפלסמידים בו זמנית במערכת דו-פלסמידית יהיה נמוך בהשוואה למערכת פלסמיד יחיד, לכן, יעילות עריכת גנים בתיווך קריספר נמוכה יותר במערכת דו-פלסמידית בהשוואה למערכת פלסמיד יחיד. לחלופין, ניתן להשתמש גם באסטרטגיית התאבדות-הצלה42 שבה זרוע ההומולוגיה מסופקת כמקטע ליניארי או בפלסמיד ללא סמן בחירת תרופות (פלסמיד הצלה). אנדונוקלאז Cas9 ומדריך קידוד sgRNA RNA מסופקים בפלסמיד המכיל קלטת בחירת תרופות (פלסמיד התאבדות). מכיוון שמקטע ליניארי או פלסמיד ללא קלטת בחירת תרופות נוטים יותר ללכת לאיבוד במהלך שכפול הטפיל, יש לתקן בקלות את השבר הדו-גדילי שהוצג על ידי אנדונוקלאז Cas9 במיקום המטרה באמצעות זרוע ההומולוגיה שיכולה להיות זמינה למשך זמן מוגבל. לאסטרטגיה זו יש כמה יתרונות על פני מערכת דו-פלסמידית מכיוון שהיא יעילה יותר, ואין צורך לשכפל את זרוע ההומולוגיה בפלסמיד אחר. וריאציות אחרות של עריכת גנים CRISPR-Cas9 עשויות להיחשב גם להחדרת SNP במיקום היעד43.

בחרנו ידנית את אזור המדריך להצגת החלפת T145M בלוקוס cdpk1 . ניתן לבחור רצף מדריך מתאים להחדרת שבר דו-גדילי במיקום המטרה באמצעות תוכנות מקוונות שונות הזמינות באופן חופשי כגון Chopchop44, CRISPOR45, CCTop46, Cas-OFFinder47. תוכנות אלה, בנוסף לאספקת היעילות של כל רצף מדריך, מספקות גם את ציוני הספציפיות ומחוץ למטרה, המגדילים את שיעור ההצלחה של ניסוי עריכת גנים בתיווך CRISPR-Cas9.

ישנן שיטות שונות זמינות עבור transfection של טפילי מלריה. אנו משתמשים בטפילים בשלב הטבעתי לניסויי טרנספקציה48,49, עם זאת, טעינה מראש של RBCs עם פלסמידים שימשה בהצלחה גם למחקרי טרנספקציה של טפילים50. בשיטה זו, RBCs נגועים פלסמידים תחת קבוצה מסוימת של פרמטרים באמצעות electroporation ולאחר מכן משמשים זיהום עם טפילים מטוהרים בשלב מאוחר. הטפילים פולשים RBCs כי הם טעונים מראש עם פלסמידים. במהלך גדילתם בתוך RBCs טעונים מראש עם פלסמידים, הטפיל לוקח DNA פלסמיד באמצעות מנגנון לא ידוע50. קיימת שיטה נוספת שניתן להשתמש בה עבור טרנספקציה של טפילים הדורשת טפילים בוגרים מאוד מטוהרים בשלב סכיזונט עבור העברה ישירה עם פלסמידים. המכשיר המשמש לטרנספקציה של סכיזונטים מטוהרים הוא 4D-nucleofector51. הבחירה בשיטת טרנספקציה משתנה בין קבוצות מחקר שונות בהתאם למשאבים הזמינים ולשיעור ההצלחה. כדאי לבדוק איזו משלוש השיטות עובדת עבור קבוצה מסוימת ולהשתמש בה לניסויי טרנספקציה עוקבים. ניתן ליישם שתי שיטות ברציפות כדי להגדיל עוד יותר את יעילות הטרנספקציה. לדוגמה, שלב הטרנספקציה הראשון עשוי להשתמש בטפילים בשלב הטבעת, ואחריו תוספת של RBCs טריים טעונים מראש עם פלסמידים.

בחרנו רק גנים מעטים לניתוח תעתיק CDPK1T145M הטפילים בהשוואה לביקורת בהתבסס על ספרות קודמת או נוכחות של בני משפחת CDPK. עם זאת, כדי לקבל תצוגה מקיפה של חיווט מחדש של שעתוק גלובלי בטפיל המהונדס המכיל אלל היפומורפי של גישות CDPK1 כגון RNA-Seq או microarray ניתן להשתמש.

השיטה המשמשת במחקר זה יכולה להיות מיושמת על קינאזות אחרות של טפיל המלריה כדי להבין את התפתחותם של מנגנוני פיצוי תחת לחץ סמים. המידע המתקבל באמצעות טכניקה זו עשוי להיות שימושי בפריסה אסטרטגית של תרופות משולבות כדי למנוע התפתחות והתפשטות של עמידות לתרופות. התמקדות בשני קינאזות או במספר קינאזות המראות השלמה פונקציונלית היא אסטרטגיה טובה יותר מאשר התמקדות בקינאזות בודדות לצורך שליטה וחיסול מלריה.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים בתמיכה ובמתקנים הזמינים באמצעות מתקן המכשור המרכזי, בית הספר למדעי החיים, JNU. תמיכה כספית מהמחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) ל- AB מוכרת גם היא בהכרת תודה. אנו מודים לחוזה-חואן לופז-רוביו על אספקת פלסמידים pL6eGFP ו-pUF1. לגוף המממן אין כל תפקיד בהכנה ובהחלטה לפרסם את העבודה. MS היא זוכת מלגת JRF-SRF מהמועצה למחקר מדעי ותעשייתי.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
קוקטייל מעכב פוספט 1xSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
נוגדן נגד GSTThermoFisher ScientificG7781
נגד עכבר HRPסיגמא-אולדריץ'A4416
נגד ארנב HRPסיגמא-אולדריץ'A6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
צנטריפוגהThermoFisher מדעית Sorvall legend micro 17R
( לכדורי תא חיידקים)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
צנטריפוגה (לטפיל כדורים/עיבוד)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (רוטור TX-400)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS תאים מוכשריםSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a תאים מוכשריםTakara Bio9057
קוביות אלקטרופורציה, פער של 0.2 ס"מBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP מגיב כימילומינסנטG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
גלוטתיון Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, חומצה חופשיתMerck391338
היפוקסנטיןMerck4010CBC
ערכת שיבוט In-fusion HDTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, זרחן  Merck13-110
NotINEBR3189S
נוקלאובונד Xtra Maxi EF   Takara Bio 740424
NucleoSpin ג'ל וניקוי PCR מיני ערכהTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA פולימראזTakara BioR045A
קוקטייל מעכב פרוטאזרוש
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL ערכת מוטגנזה מכוונת אתרAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
נתרן ביקרבונטSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III ערכת סינתזה של גדיל ראשוןThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
נוגדן אסתר תיופוספטAbcamAb92570
צנטריפוגה 11836170001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report 2023. , World Health Organization. Geneva. (2023).
  2. Rosenthal, P. J., Asua, V., Conrad, M. D. Emergence, transmission dynamics and mechanisms of artemisinin partial resistance in malaria parasites in Africa. Nat Rev Microbiol. 22 (6), 373-384 (2024).
  3. Rosenthal, P. J., et al. The emergence of artemisinin partial resistance in Africa: how do we respond. Lancet Infect Dis. S1473-3099 (24), 00141-00145 (2024).
  4. Woodrow, C. J., White, N. J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread. FEMS Microbiol Rev. 41 (1), 34-48 (2017).
  5. Amaratunga, C., Witkowski, B., Khim, N., Menard, D., Fairhurst, R. M. Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Lancet Infect Dis. 14 (6), 449-450 (2014).
  6. Sharma, M., et al. CDPKs: The critical decoders of calcium signal at various stages of malaria parasite development. Comput Struct Biotechnol J. 19, 5092-5107 (2021).
  7. Dvorin, J. D., et al. A plant-like kinase in Plasmodium falciparum regulates parasite egress from erythrocytes. Science. 328 (5980), 910-912 (2010).
  8. Absalon, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 5 is required for release of Egress-specific organelles in Plasmodium falciparum. mBio. 9 (1), e00130-e00218 (2018).
  9. Kumar, P., et al. Regulation of Plasmodium falciparum development by calcium-dependent protein kinase 7 (PfCDPK7). J Biol Chem. 289 (29), 20386-20395 (2014).
  10. Kumar, S., et al. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 4 is critical for male gametogenesis and transmission to the mosquito vector. mBio. 12 (6), e0257521(2021).
  11. Ojo, K. K., et al. A specific inhibitor of PfCDPK4 blocks malaria transmission: chemical-genetic validation. J Infect Dis. 209 (2), 275-284 (2014).
  12. Ojo, K. K., et al. Transmission of malaria to mosquitoes blocked by bumped kinase inhibitors. J Clin Inves. 122 (6), 2301-2305 (2012).
  13. Fang, H., et al. Multiple short windows of calcium-dependent protein kinase 4 activity coordinate distinct cell cycle events during Plasmodium gametogenesis. Elife. 6, e26524(2017).
  14. Green, J. L., et al. The motor complex of Plasmodium falciparum: phosphorylation by a calcium-dependent protein kinase. J Biol Chem. 283 (45), 30980-30989 (2008).
  15. Ekka, R., Gupta, A., Bhatnagar, S., Malhotra, P., Sharma, P. Phosphorylation of Rhoptry protein RhopH3 is critical for host cell invasion by the malaria parasite. mBio. 11 (5), e00166-e00220 (2020).
  16. Kumar, S., et al. PfCDPK1 mediated signaling in erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Nat Commun. 8 (1), 63(2017).
  17. Bansal, A., et al. Characterization of Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 1 (PfCDPK1) and its role in microneme secretion during erythrocyte invasion. J Biol Chem. 288 (3), 1590-1602 (2013).
  18. Iyer, G. R., et al. Calcium-dependent phosphorylation of Plasmodium falciparum serine repeat antigen 5 triggers merozoite egress. J Biol Chem. 293 (25), 9736-9746 (2018).
  19. Alam, M. M., et al. Phosphoproteomics reveals malaria parasite Protein Kinase G as a signalling hub regulating egress and invasion. Nat Commun. 6, 7285(2015).
  20. More, K. R., et al. Phosphorylation-dependent assembly of a 14-3-3 mediated signaling complex during red blood cell invasion by Plasmodium falciparum merozoites. mBio. 11 (4), e01287-e01320 (2020).
  21. Bansal, A., et al. PfCDPK1 is critical for malaria parasite gametogenesis and mosquito infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (4), 774-779 (2018).
  22. Hengeveld, R. C., et al. Development of a chemical genetic approach for human aurora B kinase identifies novel substrates of the chromosomal passenger complex. Mol Cell Proteomics. 11 (5), 47-59 (2012).
  23. Bishop, A. C., et al. Design of allele-specific inhibitors to probe protein kinase signaling. Curr Biol. 8 (5), 257-266 (1998).
  24. Alaimo, P. J., Knight, Z. A., Shokat, K. M. Targeting the gatekeeper residue in phosphoinositide 3-kinases. Bioorg Med Chem. 13 (8), 2825-2836 (2005).
  25. Zhang, C., et al. A second-site suppressor strategy for chemical genetic analysis of diverse protein kinases. Nat Methods. 2 (6), 435-441 (2005).
  26. Ojo, K. K., et al. Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 1 is a target for selective kinase inhibitors. Nat Struct Mol Biol. 17 (5), 602-607 (2010).
  27. Lourido, S., et al. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
  28. Rutaganira, F. U., et al. Inhibition of calcium dependent protein kinase 1 (CDPK1) by Pyrazolopyrimidine analogs decreases establishment and reoccurrence of central nervous system disease by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 60 (24), 9976-9989 (2017).
  29. Lourido, S., et al. Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii. J Med Chem. 56 (7), 3068-3077 (2013).
  30. McRobert, L., et al. Gametogenesis in malaria parasites is mediated by the cGMP-dependent protein kinase. PLoS Biol. 6 (6), e139(2008).
  31. Taylor, H. M., et al. The malaria parasite cyclic GMP-dependent protein kinase plays a central role in blood-stage schizogony. Eukaryot Cell. 9 (1), 37-45 (2010).
  32. Bansal, A., et al. Reduced activity of mutant calcium-dependent protein kinase 1 is compensated in Plasmodium falciparum through the action of protein kinase G. mBio. 7 (6), e02011-e02016 (2016).
  33. Bansal, A., Molina-Cruz, A., Brzostowski, J., Mu, J., Miller, L. H. Plasmodium falciparum calcium-dependent protein kinase 2 is critical for male gametocyte exflagellation but not essential for asexual proliferation. mBio. 8 (5), e01656-e01717 (2017).
  34. Allen, J. J., et al. A semisynthetic epitope for kinase substrates. Nat Methods. 4 (6), 511-516 (2007).
  35. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol. 32 (8), 819-821 (2014).
  36. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  37. van den Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res. 20 (11), 2902(1992).
  38. Coteron, J. M., et al. Structure-guided lead optimization of triazolopyrimidine-ring substituents identifies potent Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase inhibitors with clinical candidate potential. J Med Chem. 54 (15), 5540-5561 (2011).
  39. Krugliak, M., Ginsburg, H. The evolution of the new permeability pathways in Plasmodium falciparum--infected erythrocytes--a kinetic analysis. Exp Parasitol. 114 (4), 253-258 (2006).
  40. Ginsburg, H., Landau, I., Baccam, D., Mazier, D. Fractionation of mouse malarious blood according to parasite developmental stage, using a Percoll-sorbitol gradient. Ann Parasitol Hum Comp. 62 (5), 418-425 (1987).
  41. Zhang, W. W., Lypaczewski, P., Matlashewski, G. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms. mSphere. 2 (1), e00340-e00416 (2017).
  42. Lu, J., et al. A redesigned CRISPR/Cas9 system for marker-free genome editing in Plasmodium falciparum. Parasit Vectors. 9, 198(2016).
  43. Sharma, M., Bansal, A. CRISPR: a revolutionary tool for genome engineering in the protozoan parasites. , Genome Engineering via CRISPR-Cas9 System, Academic Press. (2020).
  44. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  45. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  46. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  47. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  48. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. H., Su, X. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (4), 973-977 (1995).
  49. Fidock, D. A., Wellems, T. E. Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10931-10936 (1997).
  50. Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic Acids Res. 29 (3), 850-853 (2001).
  51. Moon, R. W., et al. Adaptation of the genetically tractable malaria pathogen Plasmodium knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 531-536 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Malaria ParasiteCompensatory PathwaysProtein KinasesCDPK FamilyChemical GeneticsHypomorphic AlleleCRISPR Cas9 EditingDrug ResistanceKinase InhibitionTranscriptional Rewiring

Related Articles