Method Article

בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לבידוד, אפיון וכימות של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה אנושית (EV) ומציג זרימת עבודה לניתוח נטול-תוויות של פרוטאום EV באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) הן ננו-חלקיקים שמקורם בתאים, סגורים בשומנים דו-שכבתיים, שאינם ניתנים לשכפול. EV זוכה כיום לתשומת לב במחקר קרדיווסקולרי בשל תפקידו בוויסות תקשורת בין-תאית, ועשוי לשמש כסמנים ביולוגיים חשובים למחלות לב וכלי דם. עם זאת, פרוטאום EV והפוטנציאל שלו כסמן ביולוגי באבחון לב וכלי דם נותרו לא מובנים היטב. פרוטוקול זה מציג שיטה סטנדרטית לבידוד וכימות של EV שמקורו בפלזמה וניתוח מטען החלבון שלהם באמצעות דגימות פלזמה ממטופלים המגיעים ליחידת כאבי חזה של בית חולים אוניברסיטאי גדול. לאחר פלבוטומיה שגרתית, EV מבודדים מפלזמה על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. ההעשרה של חלבוני סמן EV ספציפיים בבידוד EV מודגמת על ידי אימונובלוטינג, והתפלגות הגודל הממוצע וריכוזי EV בפלזמה מכומתים על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. לבסוף, ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועים משמשת לניתוח ללא תוויות של פרוטאום EV. פרוטוקול זה מספק אפוא גישה מקיפה לחקר ושימוש ב-EV שמקורו בפלזמה כנשאים פוטנציאליים של מידע ביולוגי קריטי, כמו גם לחקור את הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים חדשים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EV), על פי המינוח שאינו מוגדר באופן אחיד, הן ננו-חלקיקים המוקפים בשכבת שומן דו-שכבתית ומשתחררים על ידי סוגי תאים שונים, חסרי יכולת לשכפל1. קבוצה מגוונת זו כוללת אקסוזומים, תת-אוכלוסייה של EV ממוצא אנדוזומי, הנעה בדרך כלל בין כ-40 ננומטר ל-160 ננומטר בקוטר2. ניתן לזהות בנוזלי גוף רבים3, EVs מקלים על תקשורת בין-תאית על ידי העברת ביומולקולות פעילות שונות כגון חלבונים, mRNA, microRNA ושומנים. לפיכך, EV מספק מידע על תא המוצא שלהם באמצעות סמני פני שטח ספציפיים לתא, כאשר תכונותיהם מושפעות מאוד ממצב תא האב וסביבתו4. מאפיינים אלה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפרוטוקול זה, גויסה קבוצת חולים למופת שכללה שלושה חולי ביקורת בריאים ללא סימנים למחלת לב וכלי דם נראית לעין ושני חולים עם אוטם שריר הלב המוגבר (NSTEMI). אישור מראש ניתן על ידי ועדת הביקורת המוסדית של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג (אישור IRB #S-351/2015), והתקבלה הסכמה בכתב מכל המטופלים לפני הגיוס. המטופלים גויסו מהיחידה לכאבי חזה של המחלקה הקרדיולוגית בבית החולים האוניברסיטאי היידלברג על סמך מצגת קלינית ראשונית, היסטוריה רפואית ותוצאות בדיקות אבחון.

קריטריוני ההכללה של חולי ביקורת בריאים כללו תצוגה קלינית לא טיפוסית או לא ספציפית, רמות סמנים ביולוגיים לבביים בגבולות הנורמליים, ללא היסטוריה של מחלות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV בודדו מדגימות פלזמה (n = 3) של חולים ללא מחלת לב וכלי דם גלויה, כמו גם מחולים עם אוטם שריר הלב שאינו בגובה ST (NSTEMI; n = 2), תוך שימוש בפרוטוקול האולטרה-צנטריפוגה הדיפרנציאלי שנקבע. הפרדה נאותה של EV בפלזמה אושרה על ידי אימונובלוטינג של חלבונים מועשרים ב-EV TSG-101, נספח 5 (Anx5) ו-CD9 בבודדי EV בהשוואה לפלזמה מדולדלת EV מאותם חולים (איור 1A). טרנספרין, המשמש כביקורת שלילית, נמצא בדגימות סרום מדולל EV אך לא ניתן היה לזהות אותו במבודדי EV, מה שאישר הפרדה נאותה של תאים. אימונובלוטינג לאינ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה בעולם האמיתי, צעד אחר צעד, מוכנה לשימוש להפרדה ואפיון של EV בפלזמה, כמו גם מבוא לניתוח פרוטאום ללא תווית המתאים לשילוב בפרקטיקה הקלינית השגרתית. תיאור מפורט והקפדה על מתודולוגיה מאוחדת לבידוד EV מדגימות פלזמה חשובים כדי להבטיח שחזור של התוצאות שהושגו. הספרות הנוכחית מצביעה על כך שתנאים טרום-אנליטיים יכולים להשפיע באופן משמעותי על מדידות עוקבות וניתוחים במורד הזרם של מבודדי EV. לכן, חיוני להתחיל בתהליך בידוד EV שמקורו בפלזמה בזמן, באופן אידיאלי להתחיל תוך 120 ד.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG קיבלה פרס כבוד למרצים מ-Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; הוא קיבל מענקי מחקר מוסדיים מ-Roche Diagnostics ו-Daiichi Sankyo, ומשמש כיועץ ל-Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis ו-Boehringer Ingelheim, מחוץ לעבודה שהוגשה. JBK קיבלה מימון הקשור לפרויקט מהמרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK) ו-Roche Diagnostics. המחברים הנותרים מצהירים שאין ניגוד עניינים הקשור לעבודה שהוגשה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים להיידי דייגנטש, אמלי ורנר ואליזבת מרץ על תמיכתן הארגונית במהלך פרויקט זה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli מדגם buffferBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26.3 מ"ל בקבוק פוליקרבונט עם מכלול מכסה לאולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר355654
5810R צנטריפוגה ספסלEppendorf5811000015
אצטוניטריל (ACN)Biosolve0001204101BS
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS)Sigma-AldrichD8537
חומצה פורמית 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
יודואצטמיד (IAA)סיגמא-אולדריץ'I6125-5G
ספקטרומטר מסה Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS מאגר ריצהThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 תוכנהMalvern Panalytical 
עמוד 4  ביס 12 %, ג'ל חלבון ביס-טריסInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 אולטרה-צנטריפוגה רצפתיתבקמן קולטר521-4180
PageRuler Plus סולם חלבון מוכתםמראש תרמו פישר סיינטיפיק26619
קוקטייל מעכב פרוטאז/פוספטאז (100X)טכנולוגיית איתות תאים5872S
סמן חלבוןThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap ספקטרומטר מסהתרמו פישר מדעיIQLAAEGAAPFALGMBDK
כתמים מהירים coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µ m 1 גרםד"ר מישr119.aq.0001
SDS-PAGE ג'ל מסחריתרמו פישרNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
רכז מהירות VacSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, יוני 2020) מסד נתונים של חלבוניםUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Trifluoroacetic acid (TFA) עבור HPLC >99%, 100 מ"לסיגמא-אולדריץ'302031-100 מ"ל
טריפסין MS-כיתהתרמו פישר90058
סוג 50.2 Ti רוטור זווית קבועהבקמן קולטר337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000תרמו פישר ULTIM3000RSLCNANO
מיםביופתור0023214102BS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles