Method Article

בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לבידוד, אפיון וכימות של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה אנושית (EV) ומציג זרימת עבודה לניתוח נטול-תוויות של פרוטאום EV באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) הן ננו-חלקיקים שמקורם בתאים, סגורים בשומנים דו-שכבתיים, שאינם ניתנים לשכפול. EV זוכה כיום לתשומת לב במחקר קרדיווסקולרי בשל תפקידו בוויסות תקשורת בין-תאית, ועשוי לשמש כסמנים ביולוגיים חשובים למחלות לב וכלי דם. עם זאת, פרוטאום EV והפוטנציאל שלו כסמן ביולוגי באבחון לב וכלי דם נותרו לא מובנים היטב. פרוטוקול זה מציג שיטה סטנדרטית לבידוד וכימות של EV שמקורו בפלזמה וניתוח מטען החלבון שלהם באמצעות דגימות פלזמה ממטופלים המגיעים ליחידת כאבי חזה של בית חולים אוניברסיטאי גדול. לאחר פלבוטומיה שגרתית, EV מבודדים מפלזמה על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. ההעשרה של חלבוני סמן EV ספציפיים בבידוד EV מודגמת על ידי אימונובלוטינג, והתפלגות הגודל הממוצע וריכוזי EV בפלזמה מכומתים על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. לבסוף, ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועים משמשת לניתוח ללא תוויות של פרוטאום EV. פרוטוקול זה מספק אפוא גישה מקיפה לחקר ושימוש ב-EV שמקורו בפלזמה כנשאים פוטנציאליים של מידע ביולוגי קריטי, כמו גם לחקור את הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים חדשים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EV), על פי המינוח שאינו מוגדר באופן אחיד, הן ננו-חלקיקים המוקפים בשכבת שומן דו-שכבתית ומשתחררים על ידי סוגי תאים שונים, חסרי יכולת לשכפל1. קבוצה מגוונת זו כוללת אקסוזומים, תת-אוכלוסייה של EV ממוצא אנדוזומי, הנעה בדרך כלל בין כ-40 ננומטר ל-160 ננומטר בקוטר2. ניתן לזהות בנוזלי גוף רבים3, EVs מקלים על תקשורת בין-תאית על ידי העברת ביומולקולות פעילות שונות כגון חלבונים, mRNA, microRNA ושומנים. לפיכך, EV מספק מידע על תא המוצא שלהם באמצעות סמני פני שטח ספציפיים לתא, כאשר תכונותיהם מושפעות מאוד ממצב תא האב וסביבתו4. מאפיינים אלה הובילו להתעניינות גוברת בתפקיד הפוטנציאלי של EV כסמנים ביולוגיים, במיוחד בהקשר של מחלות לב וכלי דם.

מחקרים רבים במבחנה וב-vivo הראו כי מתח היפוקסי בשריר הלב מוביל לשחרור מוגבר של EV 5,6,7. המחקר העכשווי על מטען EV התמקד בעיקר במיקרו-RNA הקשור ל-EV, שיש לו פוטנציאל לשמש כסמן ביולוגי באבחון מחלות לב וכלי דם שונות 8,9,10. לעומת זאת, הראיות על פרוטאום EV במחזור נותרו נדירות יחסית, עם עוד פחות מחקרים שבדקו EV בפלזמה בחולי לב וכלי דם. בשני מחקרים מקיפים על EV שמקורו בפלזמה מחולים הסובלים מאוטם שריר הלב, המחברים זיהו פרופיל פרוטאום EV ספציפי המושרה על ידי איסכמיה עם רלוונטיות אבחנתית פוטנציאלית 6,11.

העיבוד המתודולוגי של EV הוכח כמאתגר מבחינה היסטורית, ונכון לעכשיו, אין המלצה חד משמעית לגישה האופטימלית לבידוד, אפיון וכימות EV. שיטות נפוצות לבידוד EV כוללות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, צנטריפוגה עם שיפוע צפיפות ושיטות סינון כגון כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל1. על פי הנחיות הקונצנזוס הנוכחיות, האפיון של מבודדי EV צריך לכלול ראיות לפחות לשלושה סמני חלבון פני שטח EV טיפוסיים, כגון טטרה-ספנינים או אנקסינים, בשילוב עם שיטת הדמיה1. כדי לבחון מטען EV ברמת החלבון, נעשה שימוש לרוב בשיטות מבוססות נוגדנים כגון Western blot או ELISA.

בהתחשב באתגרים המתודולוגיים הקשורים לבידוד ועיבוד של EV במחזור, פרוטוקול זה מציג מסלול מקיף מגיוס מטופלים ואיסוף דגימות ועד לבידוד, אפיון וכימות EV לאחר מכן של מבודדי EV בפלזמה. בנוסף, מחקר זה מציג זרימת עבודה לבידוד מיידי של EV שמקורו בפלזמה ממטופלים המגיעים למחלקת מיון (יחידת כאב בחזה) במרכז טיפול שלישוני בדרום מערב גרמניה, ואחריו ניתוח ללא תווית של פרוטאום EV פלזמה ספציפי למחלה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS). המטרה היא להקל על ניתוח תפוקה גבוהה לזיהוי חלבונים מועשרים באופן דיפרנציאלי הקשורים ל-EV על פני קבוצה גדולה של חולים עם מחלות לב וכלי דם איסכמיות, מולדות או (אוטו-אימוניות) מגוונות באבחנה הראשונית ולאורך התקדמות המחלה ו/או פתרונה. גישת סינון פרוטאומית זו מבקשת לזהות דפוסים של העשרת חלבון ספציפי ל-EV הקשורים למסלולי מחלה שונים, במטרה הסופית לחשוף סמנים ביולוגיים חדשים של חלבונים הקשורים ל-EV כדי לשפר את האבחון והניטור הטיפולי הנוכחי במחלות לב וכלי דם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפרוטוקול זה, גויסה קבוצת חולים למופת שכללה שלושה חולי ביקורת בריאים ללא סימנים למחלת לב וכלי דם נראית לעין ושני חולים עם אוטם שריר הלב המוגבר (NSTEMI). אישור מראש ניתן על ידי ועדת הביקורת המוסדית של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג (אישור IRB #S-351/2015), והתקבלה הסכמה בכתב מכל המטופלים לפני הגיוס. המטופלים גויסו מהיחידה לכאבי חזה של המחלקה הקרדיולוגית בבית החולים האוניברסיטאי היידלברג על סמך מצגת קלינית ראשונית, היסטוריה רפואית ותוצאות בדיקות אבחון.

קריטריוני ההכללה של חולי ביקורת בריאים כללו תצוגה קלינית לא טיפוסית או לא ספציפית, רמות סמנים ביולוגיים לבביים בגבולות הנורמליים, ללא היסטוריה של מחלות לב וכלי דם וממצאים נורמליים בכל בדיקות אבחון נוספות. קריטריוני ההכללה כללו היסטוריה של ממאירות או טיפול ציטוסטטי בחמש השנים האחרונות, המודיאליזה, תסמונות היפרליפידמיה משפחתיות וכל היסטוריה של מחלות לב וכלי דם. NSTEMI אובחן בהתאם להנחיות הנוכחיות12, עם היצרות כלילית רלוונטית המודינמית שאושרה על ידי אנגיוגרפיה כלילית. עבור כל מטופל, עד 36 מ"ל דם נאסף מהווריד הקדמי, לתוך צינורות איסוף בתוספת ציטראט באמצעות פלבוטומיה סטנדרטית13, ודגימות דם הועברו מיד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד EV באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית

הערה: נעשה שימוש בפרוטוקול צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד EV מדגימות פלזמה אנושיות. שני מחזורי אולטרה-צנטריפוגה (UC) עם כוח צנטריפוגלי הולך וגובר נערכו כדי למקסם את הטוהר של גלולת ה-EV שהתקבלה.

  1. בידוד פלזמה
    1. התחל לעבד דגימות דם מלאות, מקוררות ב-4 מעלות צלזיוס, תוך 120 דקות מהאיסוף כדי להבטיח את שלמות EV בפלזמה. השתמש בשפופרות איסוף דם בתוספת ציטראט (0.106 מול/ליטר ציטראט) כדי למנוע קרישה.
    2. יש לדלל 9 מ"ל של דם מלא מצוטר 1:1 בתמיסת מלח עם פוספט קר כקרח (PBS) כדי להפחית את הצמיגות. הוסף 5 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות (1.077 גרם/מ"ל) להפרדה במהלך צנטריפוגה.
    3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 × גרם למשך 25-30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. פיפטה בזהירות את שבר הפלזמה מהחלק העליון של כל עמודה לצינורות צנטריפוגה מיוחדים. המשך לשלבים הבאים או הקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. הסרת פסולת תאים וגופים אפופטוטיים
    1. צנטריפוגה של הפלזמה ב-20,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות אולטרה-צנטריפוגה עם רוטור בזווית קבועה, ללא בלימה. כדור גלוי של פסולת תאים וגופים אפופטוטיים אמור להיווצר בתחתית הצינור.
  3. בידוד EV
    1. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. אולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס, ללא בלימה, כדי לבודד EV, שיהווה כדור גלוי על דופן הצינור.
    2. הסירו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה אלקטרונית, והשאירו כ-1 מ"ל של פלזמה מדולדלת EV. עבור לפיפטה של 1000 מיקרוליטר עבור הפלזמה שנותרה, פיפטינג לאט כדי למנוע הפרעה לגלולת ה-EV. הטה את הצינור בהדרגה תוך כדי פיפטה כדי להבטיח שלא תישאר פלזמה בצינור.
  4. הכנה לניתוח במורד הזרם
    1. השעו מחדש את גלולת ה-EV המבודדת בהתאם לדרישות הניתוח במורד הזרם: למעקב אחר ננו-חלקיקים, השעו מחדש את גלולת ה-EV מ-9 מ"ל של דם מלא ב-200 מיקרוליטר של PBS; עבור LC-MS/MS, השהה EV שבודד מ-36 מ"ל של דם מלא ב-50 מיקרוליטר של מאגר RIPA 1x עם מעכב פרוטאז/פוספטאז 1%
    2. העבר את גלולת ה-EV המושעה לצינור של 1.5-2 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף או להמשיך לפי הצורך.

2. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים

הערה: כימות התפלגות גודל ה-EV הממוצע בדגימות פלזמה אנושיות נערך באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA), שיטת זיהוי מבוססת לייזר המנתחת את התנועה הבראונית של ננו-חלקיקים.

  1. דילול עבודה עבור NTA
    1. לדלל את תמיסת מלאי ה-EV (גלולת EV מושעה ב-200 μL PBS) עם PBS קר כקרח ביחסים של 1:10, 1:50, 1:100 ו-1:200. צור דילולי-עבודה שונים כדי לקבוע את הדילול המתאים ביותר להשגת ספירה סופית של 10-100 ננו-חלקיקים למסגרת במהלך מעקב אחר ננו-חלקיקים.
  2. הפעלת נת"ע
    1. הפעל את מכשיר ה-NTA והפעל את התוכנה הרלוונטית במחשב המחובר. הנח את החדר בתוך ארון הלייזר ולחץ על התחל מצלמה כדי להפעיל אותו.
    2. צייר 1 מ"ל PBS למזרק. חבר את המזרק לצינור הקדמי ושטוף היטב את מערכת הצינורות, וודא שלא יישאר אוויר בתא. עקוב אחר המצלמה כדי לזהות בועות אוויר או חלקיקים מזהמים.
    3. ערכו את דילול העבודה המוכן של EV במזרק של 1 מ"ל והזריקו אותו לתא.
    4. כוונן את רווח המסך כך שיתאים לבהירות הצג בכרטיסיות לכידה ותהליך . שנה את רמת המצלמה כדי להבדיל בין ננו-חלקיקים בבירור על המסך.
    5. הגדר סף זיהוי מתאים בכרטיסייה תהליך כדי להתאים את הרגישות להבחנה בין חלקיקים לרעשי רקע. שמור על ערך זה קבוע עבור כל המדידות באותו ניסוי.
    6. מקד את המצלמה באמצעות הגלגל בכל צד של המכשיר עד שהננו-חלקיקים נראים חדים על המסך.
    7. הגדר טמפרטורה קבועה (באופן אידיאלי 22 מעלות צלזיוס) עבור כל המדידות בהגדרות החומרה , מכיוון שתנועה בראונית תלויה בטמפרטורה.
    8. לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל במדידה. הזן את מזהה הדגימה ואת הממס בחלון המוקפץ.
    9. הקלט מינימום שלושה סרטונים של 30 שניות עבור כל ריצה לדוגמה. קדם את הדגימה בין מדידות כדי ללכוד דגימה מייצגת של תמיסת הננו-חלקיקים. אם משאבת מזרק זמינה, הגדר אותה במהירות קבועה והקלט ברציפות.
    10. לאחר ההקלטה, התוכנה מחשבת אוטומטית את הריכוז והתפלגות הגודל של ננו-חלקיקים. לחץ על שנה כדי להזין את מקדם הדילול המשמש לדגימה, ולאחר מכן שמור את התוצאות על ידי לחיצה על ייצוא.
  3. ניתוח נתונים
    1. לנתח את התוצאות באמצעות קבצי הפלט בתוכנה סטטיסטית.

ניתוח ללא תוויות של פרוטאום EV באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS)

הערה: ניתוח פרוטאום EV ללא תווית נערך באמצעות הפרדת חלבון ראשונית באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל של חלבוני EV לאחר ליזיס ממברנה. לאחר עיכול חלבון בתוך הג'ל עם טריפסין, הפפטידים נותחו באמצעות LC-MS/MS, עם ספקטרום בודד המותאם למסד נתונים של פרוטאומים אנושיים. יש לציין שאם רוצים ניתוח לא ממוקד של ליזטים EV, מומלץ להשתמש בפרוטאומיקה של רובה ציד ללא בחירה מוקדמת של טווח משקל מולקולרי ספציפי, מה שהופך את שלבים 3.1.1-3.1.7 של פרוטוקול זה למיותרים.

  1. עיכול טריפסין בתוך הג'ל
    1. הכן תמיסה של EV מושעה במאגר 1x RIPA על ידי הוספת מאגר טעינה Laemmli בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). מרתיחים דגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. טען את דגימות ה-EV, בתוספת מאגר העמסה, יחד עם סולם חלבון על ג'ל ביס-טריס 4%-12% לאלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)14. צבעו את הג'ל בכחול Coomassie למשך 1-4 שעות כדי לדמיין רצועות חלבון. הסר את הכתמים של הג'ל במים על ידי דגירה למשך הלילה.
    3. הוצא רצועות מוכתמות בקומאסי מאזורי ג'ל המכילים חלבונים מעניינים באמצעות להב אזמל.
    4. שטפו את חתיכות הג'ל עם 60 מיקרוליטר של 1:1 (v/v) 50 מ"מ triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) ואצטוניטריל (ACN), pH 8.5, למשך 10 דקות. כווצו את חתיכות הג'ל שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב-60 מיקרוליטר של ACN. לשטוף שוב עם 60 מיקרוליטר 50 מ"מ TEAB, pH 8.5.
    5. הפחיתו את החלבונים עם 10 מ"מ דיתיותרייטול (DTT) ב-100 מ"מ של TEAB ב-57 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וייבשו את חתיכות הג'ל.
    6. אלקילט החלבונים עם 10 מ"מ יודואצטמיד (IAA) ב-100 מ"מ של TEAB ב-25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך.
    7. שטפו את חתיכות הג'ל עם 60 מיקרוליטר של 100 מ"מ TEAB וכווצו אותם פעמיים למשך 10 דקות כל אחד ב-60 מיקרוליטר של ACN.
    8. הוסף 50 מ"מ של תמיסת טריפסין TEAB, מרוכזת בהתאם, לחתיכות הג'ל היבשות. יש לדגור במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. להרוות את התגובה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית (TFA).
    9. חלץ את הפפטידים המתקבלים על ידי דגירה עם 30 מיקרוליטר של 1:1 (v/v) 0.1% TFA ו-ACN למשך 30 דקות. יבשו את הג'לים עם 20 מיקרוליטר ACN למשך 20 דקות, ואז שטפו שוב עם 30 מיקרוליטר של 100 מ"מ TEAB למשך 20 דקות.
    10. כווץ את הג'ל פעמיים עם 20 מיקרוליטר ACN למשך 20 דקות כל אחד.
    11. רכזו את הסופרנטנט שנאסף מכל שלב מיצוי בצנטריפוגת ואקום והמיסו את הדגימה ב-15 מיקרוליטר של 0.1% TFA.
  2. ניתוח LC-MS/MS
    1. בצע ניתוח ננו-זרימה LC-MS/MS באמצעות ספקטרומטר מסה של כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה המחובר למנתח מלכודת יונים אלקטרוסטטית.
    2. השתמש ב-0.1% חומצה פורמית (FA)/1% ACN כממס A ו-0.1% FA/89.9% ACN כממס B.
    3. הפרד את הפפטידים בשיפוע ליניארי של 25 דקות: התחל מ-3% ממס B, הגדל את B ל-23% במשך 21 דקות, ואז ל-38% במשך 4 דקות, והמשך בשטיפה ב-95% B.
    4. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב רכישה תלוי נתונים, לסירוגין אוטומטית בין MS ל-MS2. רכוש ספקטרום MS (m/z 400-1600) ברזולוציה של 60,000 ב-m/z 400, ויוצר ספקטרום MS2 עבור עד 15 קודמים תוך שימוש באנרגיית התנגשות מנורמלת של 27 ורוחב בידוד של 1.4 m/z.
  3. חיפוש במאגר חלבונים
    1. חפש את ספקטרום MS/MS מול מסד הנתונים של החלבונים Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, יוני 2020) ומסד נתונים מזהמים מותאם אישית (חלק מ-MaxQuant, MPI Martinsried15,16) באמצעות Proteome Discoverer 2.5 עם Sequest HT.
    2. הגדר את הגדרות התוכנית באופן הבא: הגדר את סובלנות מסת היונים של השבר ל-0.02 Da ואת סובלנות מסת היונים של האב ל-5 עמודים לדקה. ציין טריפסין כאנזים המשמש לעיכול, והגדר קרבמידומתיל כשינוי קבוע לציסטאין, עם חמצון (מתיונין) ודמידציה (אספרגין, גלוטמין) כשינויים משתנים. כלול אצטילציה, אובדן מתיונין ושילובם כשינויים משתנים של קצה החלבון.
    3. כמת פפטידים באמצעות מצב כימות היונים המבשר, תוך שימוש בשיטת Top N Average (n = 3) לחישוב שפע חלבון17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV בודדו מדגימות פלזמה (n = 3) של חולים ללא מחלת לב וכלי דם גלויה, כמו גם מחולים עם אוטם שריר הלב שאינו בגובה ST (NSTEMI; n = 2), תוך שימוש בפרוטוקול האולטרה-צנטריפוגה הדיפרנציאלי שנקבע. הפרדה נאותה של EV בפלזמה אושרה על ידי אימונובלוטינג של חלבונים מועשרים ב-EV TSG-101, נספח 5 (Anx5) ו-CD9 בבודדי EV בהשוואה לפלזמה מדולדלת EV מאותם חולים (איור 1A). טרנספרין, המשמש כביקורת שלילית, נמצא בדגימות סרום מדולל EV אך לא ניתן היה לזהות אותו במבודדי EV, מה שאישר הפרדה נאותה של תאים. אימונובלוטינג לאינ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה בעולם האמיתי, צעד אחר צעד, מוכנה לשימוש להפרדה ואפיון של EV בפלזמה, כמו גם מבוא לניתוח פרוטאום ללא תווית המתאים לשילוב בפרקטיקה הקלינית השגרתית. תיאור מפורט והקפדה על מתודולוגיה מאוחדת לבידוד EV מדגימות פלזמה חשובים כדי להבטיח שחזור של התוצאות שהושגו. הספרות הנוכחית מצביעה על כך שתנאים טרום-אנליטיים יכולים להשפיע באופן משמעותי על מדידות עוקבות וניתוחים במורד הזרם של מבודדי EV. לכן, חיוני להתחיל בתהליך בידוד EV שמקורו בפלזמה בזמן, באופן אידיאלי להתחיל תוך 120 ד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG קיבלה פרס כבוד למרצים מ-Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; הוא קיבל מענקי מחקר מוסדיים מ-Roche Diagnostics ו-Daiichi Sankyo, ומשמש כיועץ ל-Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis ו-Boehringer Ingelheim, מחוץ לעבודה שהוגשה. JBK קיבלה מימון הקשור לפרויקט מהמרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK) ו-Roche Diagnostics. המחברים הנותרים מצהירים שאין ניגוד עניינים הקשור לעבודה שהוגשה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים להיידי דייגנטש, אמלי ורנר ואליזבת מרץ על תמיכתן הארגונית במהלך פרויקט זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli מדגם buffferBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
26.3 מ"ל בקבוק פוליקרבונט עם מכלול מכסה לאולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר355654
5810R צנטריפוגה ספסלEppendorf5811000015
אצטוניטריל (ACN)Biosolve0001204101BS
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS)Sigma-AldrichD8537
חומצה פורמית 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
יודואצטמיד (IAA)סיגמא-אולדריץ'I6125-5G
ספקטרומטר מסה Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS מאגר ריצהThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 תוכנהMalvern Panalytical 
עמוד 4  ביס 12 %, ג'ל חלבון ביס-טריסInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 אולטרה-צנטריפוגה רצפתיתבקמן קולטר521-4180
PageRuler Plus סולם חלבון מוכתםמראש תרמו פישר סיינטיפיק26619
קוקטייל מעכב פרוטאז/פוספטאז (100X)טכנולוגיית איתות תאים5872S
סמן חלבוןThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap ספקטרומטר מסהתרמו פישר מדעיIQLAAEGAAPFALGMBDK
כתמים מהירים coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µ m 1 גרםד"ר מישr119.aq.0001
SDS-PAGE ג'ל מסחריתרמו פישרNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
רכז מהירות VacSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, יוני 2020) מסד נתונים של חלבוניםUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Trifluoroacetic acid (TFA) עבור HPLC >99%, 100 מ"לסיגמא-אולדריץ'302031-100 מ"ל
טריפסין MS-כיתהתרמו פישר90058
סוג 50.2 Ti רוטור זווית קבועהבקמן קולטר337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000תרמו פישר ULTIM3000RSLCNANO
מיםביופתור0023214102BS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367, 6478(2020).
  3. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (22), 2180-2181 (2018).
  4. Zara, M., Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., Barbieri, S. S. Exosomes in cardiovascular diseases. Diagnostics (Basel). 10 (11), 943(2020).
  5. Ontoria-Oviedo, I., et al. Extracellular vesicles secreted by hypoxic ac10 cardiomyocytes modulate fibroblast cell motility. Front Cardiovasc Med. 5, 152(2018).
  6. Zara, M., et al. Plasma exosome profile in st-elevation myocardial infarction patients with and without out-of-hospital cardiac arrest. Int J Mol Sci. 22 (15), (2021).
  7. Anselmo, A., et al. Myocardial hypoxic stress mediates functional cardiac extracellular vesicle release. Eur Heart J. 42 (28), 2780-2792 (2021).
  8. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: A systematic review. Cardiovasc Res. 111 (4), 322-337 (2016).
  9. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circ Res. 110 (3), 483-495 (2012).
  10. Deddens, J. C., et al. Circulating microRNAs as novel biomarkers for the early diagnosis of acute coronary syndrome. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 884-898 (2013).
  11. Gidlof, O., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles reveals additional diagnostic biomarkers for myocardial infarction compared to plasma alone. Sci Rep. 9 (1), 8991(2019).
  12. Byrne, R. A., et al. ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 10, (2023).
  13. Garcia-Castrillo, L., et al. Recommendations for blood sampling in emergency departments from the European Society for Emergency Medicine (EUSEM), European Society for Emergency Nursing (EUSEN), and European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) working group for the pre-analytical phase. Clin Chem Lab Med. 62 (8), 1538-1547 (2024).
  14. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  15. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the maxquant environment. J Proteome Res. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  16. Cox, J., Mann, M. Maxquant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Blein-Nicolas, M., Zivy, M. Thousand and one ways to quantify and compare protein abundances in label-free bottom-up proteomics. Biochim Biophys Acta. 1864 (8), 883-895 (2016).
  18. Lacroix, R., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: Results of the international society on thrombosis and haemostasis SSC collaborative workshop. J Thromb Haemost. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  19. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  20. Lacroix, R., et al. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: Towards standardization of protocol. J Thromb Haemost. 10 (3), 437-446 (2012).
  21. Coumans, F. aW., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  22. Clayton, A., et al. Considerations towards a roadmap for collection, handling and storage of blood extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1647027(2019).
  23. Lucien, F., et al. Miblood-EV: Minimal information to enhance the quality and reproducibility of blood extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12385(2023).
  24. Zhang, X., Takeuchi, T., Takeda, A., Mochizuki, H., Nagai, Y. Comparison of serum and plasma as a source of blood extracellular vesicles: Increased levels of platelet-derived particles in serum extracellular vesicle fractions alter content profiles from plasma extracellular vesicle fractions. PLoS One. 17 (6), e0270634(2022).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12162(2022).
  26. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position paper from the working group on cellular biology of the heart of the European Society of Cardiology. Cardiovasc Res. 114 (1), 19-34 (2018).
  27. Davidson, S. M., et al. Methods for the identification and characterization of extracellular vesicles in cardiovascular studies: From exosomes to microvesicles. Cardiovasc Res. 119 (1), 45-63 (2023).
  28. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cell Mol Life Sci. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  29. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  30. Palviainen, M., et al. Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-implications for biomarker discovery. PLoS One. 15 (8), e0236439(2020).
  31. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the international society for extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  32. Gemoll, T., et al. Protein profiling of serum extracellular vesicles reveals qualitative and quantitative differences after differential ultracentrifugation and ExoQuick TM isolation. J Clin Med. 9 (5), 1429(2020).
  33. Kreimer, S., et al. Mass-spectrometry-based molecular characterization of extracellular vesicles: Lipidomics and proteomics. J Proteome Res. 14 (6), 2367-2384 (2015).
  34. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  35. Bateman, N. W., et al. Maximizing peptide identification events in proteomic workflows using data-dependent acquisition (dda). Mol Cell Proteomics. 13 (1), 329-338 (2014).
  36. Pino, L. K., Just, S. C., Maccoss, M. J., Searle, B. C. Acquiring and analyzing data independent acquisition proteomics experiments without spectrum libraries. Mol Cell Proteomics. 19 (7), 1088-1103 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles