כאן, אנו מתארים שיטות לקעקוע בוגר Xenopus laevis (צפרדע אפריקאית ציפורניים) עם מכונת קעקוע סיבובית. קעקוע נכון יוצר ספרות כהות וקלות לקריאה שמחזיקות מעמד מספר חודשים והופכות את בעלי החיים לניתנים להבחנה בקלות למטרות מחקר ושמירת רשומות.
מאמר שיטה
שיטות לקעקוע Xenopus laevis עם מכונת קעקועים סיבובית
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים של בעלי חיים מרחיבים את היקף המחקר הביו-רפואי, מקדמים את הבנתנו בביולוגיה התפתחותית, מולקולרית ותאית ומאפשרים לחוקרים למדל מחלות אנושיות. תיעוד ומעקב אחר בעלי חיים בודדים מאפשרים לחוקרים להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר ולשכלל שיטות לשיפור רווחת בעלי החיים. קיימות מספר שיטות מתועדות היטב לסימון ומעקב אחר יונקים, כולל ניקוב אוזניים ותגי אוזניים. עם זאת, השיטות לסימון מיני דו-חיים ימיים מוגבלות, כאשר המשאבים הקיימים מיושנים, לא יעילים או יקרים מדי. בכתב יד זה, אנו מתארים שיטות ושיטות עבודה מומלצות לסימון Xenopus laevis באמצעות מכונת קעקועים סיבובית. קעקוע נכון מביא לקעקועים באיכות גבוהה, מה שהופך אנשים לניתנים להבחנה בקלות עבור חוקרים ומהווה סיכון מינימלי לבריאות בעלי החיים. אנו גם מדגישים את הגורמים לקעקועים באיכות ירודה, מה שעלול לגרום לקעקועים שדוהים במהירות ולגרום נזק מיותר לבעלי חיים. גישה זו מאפשרת לחוקרים ולווטרינרים לסמן דו-חיים, מה שמאפשר להם לעקוב אחר שכפולים ביולוגיים וקווים טרנסגניים ולשמור תיעוד מדויק של בריאות בעלי חיים.
מבוא
מודלים של בעלי חיים הם כלים שימושיים לחקר שאלות הנוגעות לבריאות האדם. בפועל, מחקר ביו-רפואי באמצעות מודלים של בעלי חיים דורש ארגון ותחזוקה קפדניים של מושבת בעלי חיים בריאה. שיטות עבודה מומלצות לטיפול אתי בבעלי חיים ולגידול שואפות להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לניסויים ולחדד שיטות עבודה כדי להבטיח רווחת בעלי חיים1. סוג צפרדע בעל טפרים, כולל Xenopus laevis (X. laevis; צפרדע אפריקאית בעלת טפרים) ו-Xenopus tropicalis (X. tropicalis; צפרדע בעלת טפרים מערביים), שימשו במחקר ביו-רפואי מאז שנות ה-30 של המאה ה-20, כאשר רופאים דרום אפריקאים השתמשו ב-X. laevis לביצוע בדיקות ההריון הראשונות2. בעוד בדיקות הריון מודרניות כבר לא דורשות צפרדעים, התפקיד של מחקר Xenopus נמשך. יתרונות השימוש בקסנופוס למחקר ביו-רפואי כוללים את הגנום המבואר היטבשלהם 3, ביוץ המושרה לאורך כל השנה של ביציםגדולות 4, וביציות המוטלות חיצונית הניתנות להפריה חוץ גופית. תכונות אלה הופכות אותם לנכס שימושי לאמבריולוגיה ופיתוח של בעלי חוליות 5,6,7, ביולוגיה מולקולרית ותאית בסיסית 7,8,9,10, ולמידול מחלות אנושיות 7,11,12,13.
שיטות אמינות למעקב אחר בעלי חיים בודדים של קסנופוס חיוניות לרישום שכפולים ביולוגיים ולשיפור הקפדנות והרבייה במחקר. מכיוון שקסנופוס שוכנים לעתים קרובות בקבוצות, סימון בעלי חיים מאפשר לחוקרים לעקוב בקלות אחר בעלי חיים בודדים4. שמירה על תיעוד מדויק של בעלי חיים יכולה לחסוך זמן ומשאבים ולשפר את היכולת לעקוב אחר בריאותם של בעלי חיים. לדוגמה, זיהוי פרטני של בעלי חיים יכול לשפר את תהליכי העבודה הארגוניים ליצירת קווי קסנופוס טרנסגניים, מכיוון שהדבר דורש דורות מרובים של צפרדעים עם גנוטיפים ספציפיים שאומתו על ידי ריצוף14, הדורש ארגון וזיהוי פרטני של בעלי חיים. זה נכון במיוחד כאשר מוטציות אלה חסרות פנוטיפים בוגרים שניתן להבחין בהם בקלות. באופן דומה, השימוש בביציות ובעוברים של Xenopus לחקר ביולוגיה תאית והתפתחותית בסיסית מועיל ממעקב אחר בעלי חיים בודדים. לאחר גרימת ביוץ, בעלי חיים צריכים לנוח לפחות 3 חודשים כדי למנוע סיבוכים בריאותיים כגון תסמונת ביוץ יתר15. שיטות זיהוי אינדיבידואליות מבטיחות כי בעלי חיים אינם מושרים לבייץ בתדירות גבוהה מדי.
סימון ומעקב אחר בעלי חיים גם מאפשר לאנשי המעבדה לעקוב אחר בעיות בריאותיות של בעלי חיים. בעלי חיים מאותו גנוטיפ חולים יכולים להצביע על רבייה מוגזמת או על חששות בריאותיים בלתי צפויים הקשורים לטרנסגן. באופן דומה, בעלי חיים שחולים לאחר הביוץ האחרון יכולים להצביע על בעיות עם ריאגנטים, חומרים או טכניקות. מעקב אחר בעלי חיים ובריאותם מאפשר לאנשי מעבדה ווטרינרים לעקוב כאשר חששות עולים מחדש ולנקוט באמצעי מניעה למניעת מחלות עתידיות. ביונקים, ישנן שיטות זיהוי רבות. שיטות קבועות לעכברים כוללות ניקוב אוזניים, תגי אוזניים, קעקוע ושבבים תת עוריים16. אלה יכולים להבדיל באופן ברור ואמין בין בעלי חיים בתוך מושבה או כלוב ויכולים להיות מנוהלים בקלות על ידי אנשי מעבדה. שיטות כגון ניקוב אוזניים הן זעיר פולשניות, דורשות רק פריט אחד של ציוד מיוחד, ועובדות עבור בעלי חיים ברוב הגילאים. בעוד שמערכות אלה פשוטות ושימושיות עבור עכברים, השימוש בהן בצפרדעים מציב מערך ייחודי של אתגרים. לצפרדעים ולדו-חיים אחרים אין פינה (מבנה אוזן חיצוני). כמה חוקרים הצמידו תגים ללסת, לבוהן או לגפה האחורית של החיה 17,18. גישה זו גרמה לבעיות שונות: תגי לסת גרמו לגירוי, וצפרדעים נסערות ניסו למשוך תגים עם הגפיים הקדמיות שלהם17. תגי הבוהן פילחו את הרשת בין אצבעות הרגליים, פגעו בתנועה ונשאו את הסיכון ללכת לאיבוד. ככאלה, דו-חיים זקוקים לשיטות זיהוי משלהם. מבחינה היסטורית, גזיזת אצבעות שימשה גם לסימון דו-חיים17,19. הבוהן נחתכת בזוג מספריים חדים, וניתן לזהות את החיה לפי אורך הבהונות בכפות הרגליים הקדמיות והאחוריות או לפי הזווית שבה הבוהן גדלה לאחור (בסלמנדרות). עם זאת, שיטה זו מעוררת חשש אתי שגזיזת הבוהן עלולה לפגוע בתנועת החיה17 . בנוסף, זה יכול לגרום לדימום ולהציג סיכון של זיהום. מערכת סימון מבוססת נוספת היא השתלות עצמיות של העור, שבהן העור נלקח מחלק אחד של הצפרדע ומוצמד בניתוח לחלק אחר. לדוגמה, מתוארת שיטה לסימון גב או כתף של צפרדע באמצעות שתל עור בהיר מחזה20 שלה. השתלות עור מגיעות גם עם מגבלות וסיכונים: ההליך הוא פולשני ומציג את הסיכון של זיהום הידרופילה Aeromonas, או רגל אדומה, נגע שעלול להיות קטלני; ריפוי מלא של autograft לוקח עד 6 שבועות; ועם השיטות המתוארות, רק 6 צפרדעים ניתן לשכן יחד בגלל מקומות מוגבלים לשים autograft20.
גישות סימון פחות פולשניות כוללות חרוזי זכוכית ושבבי משדר17,19. בשיטת חרוזי הזכוכית, חרוזי זכוכית מושחלים על תפר קטן ותופרים לתוך עור הצפרדע. זה מספק שונות גדולה יותר מאשר השתלות עור, עם לפחות 60 שילובי צבעים ייחודיים. עם זאת, קיים סיכון שהתפר יכול לצאת ולגרום לאיבוד החרוזים. לחלופין, ניתן להשתיל משדר שבב מתחת לעור בשק הלימפה הגבי של הצפרדע. שיטה זו נחשבת לשיטת הסימון הקבועה ביותר ומאפשרת לזהות ולקטלג באופן אינדיבידואלי מספר אינסופי של בעלי חיים. עם זאת, זוהי גם השיטה היקרה ביותר, שכן שבבים בודדים הם יקרים, ומושבה גדולה תהיה יקרה לסמן. שבבים דורשים גם סורק מיוחד כדי לקרוא19. גישה נפוצה אחת לזיהוי קסנופוס היא התייחסות לצביעה ולדפוס הטבעיים של בעלי החיים. זה עובד טוב במיוחד עבור צפרדעים כגון X. laevis, אשר יש דפוסים ברורים שנשארים לאורך כל הבגרות. עם זאת, דפוסים אלה יכולים להשתנות עם הזמן עם מתח, והצביעה יכולה להיראות שונה כאשר צפרדעים מועברות בין מיכלים שקופים וכהים15. בנוסף, שיטת זיהוי זו שימושית פחות עבור X. tropicalis, שיש לו דפוסי סימון פחות ברורים בהשוואה ל-X. laevis, או עבור בעלי חיים לבקנים, שאין להם סימוני צבע21. אפילו עבור מינים עם סימונים ברורים, אנשי מעבדה יכולים לפרש את המיקום והגודל של הסימונים באופן שונה, מה שעלול לגרום לטעויות בזיהוי. מסיבה זו, צילום בעלי חיים הוא אמין ביותר בשילוב עם שיטת זיהוי נוספת. לכן, אנו מבקשים לסמן ולזהות בעלי חיים מסוג Xenopus באמצעות טכניקה קלה להבחנה, קבועה וזעיר פולשנית.
ישנם מקורות מוגבלים שפורסמו המתארים שיטות לקעקוע דו-חיים. קעקוע תואר לצד טכניקות מיתוג אחרות, כולל מותגי חום, מותגי כסף חנקתי ומותגי הקפאה17. באותו משאב, הקעקוע נעשה על ידי ציור ספרות עם מחט היפודרמית 27G, והתהליך צוין כלא גורם לזיהום, בניגוד לטכניקות מיתוג אחרות, שהשתמשו בחוט בצורת ספרה או סימן אחר. במקור אחר, מכונת קעקוע חשמלית (שתוארה כמחט רוטטת) שימשה לסימון צפרדעים, אך מעט פרטים נמסרו על הטכניקה17,19. המחברים מזהירים כי על ידי הפרעה לשכבת הרפש המגנה על הצפרדע, הליך זה מגביר את הסיכון לרגל אדומה. אמנם אין שיטת סימון או זיהוי שהיא גם לגמרי לא פולשנית (כמו צילומים) וגם קבועה (כמו שבבים), אבל קעקוע מספק פשרה יעילה. קעקוע הוא פשוט יחסית בהשוואה לטכניקות אחרות, כגון השתלות עור. יתרונות נוספים כוללים עקומת למידה קטנה יותר וציוד זול יחסית. קעקוע דו-חיים ימיים מגיע עם אתגרים מסוימים, אשר יכולים להפחיד חוקרים ולפגוע בסימון מוצלח של בעלי חיים. מאמר זה נועד לספק לחוקרים שיטות מתועדות היטב לקעקוע קסנופוס בוגר באמצעות מכונת קעקועים סיבובית.
פרוטוקול
כל הנהלים המתוארים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של דארטמות' קולג '.
1. הגדרת ציוד
הערה: זרימת עבודה עבור ההליך והגדרת ספסל לדוגמה כלולות (איור 1).
- חבר את אקדח הקעקוע ואת דוושת הרגל לספק הכוח. מקם את דוושת הרגל מתחת למשטח העבודה.
- הרכבת אקדח הקעקועים
- בעזרת מפתח אלן או מברג משושה, שחררו את הברגים שבידית האחיזה (איור 2A, מוקף באדום).
- הכנס את קצה הפלסטיק עד לידית האחיזה. הדקו את הבורג כדי להחזיק אותו במקומו.
- הכניסו את צינור המתכת לחלק האחורי של ידית האחיזה (איור 2A). זה יותאם, אז להכניס אותו למחצית אורכו. הדקו את הבורג כדי להחזיק אותו במקומו.
- הכניסו מחט קעקוע דרך החלק האחורי של ידית האחיזה כך שהיא תשב בנוחות בקצה הפלסטיק שבקדמת ידית האחיזה (איור 2B).
- החלק את גב המחט וצינור המתכת דרך מהדק הצינור. התאימו את צינור המתכת כך שהמחט תתאים בנוחות לקצה הפלסטיק (איור 2B). הדקו ידנית את מהדק הצינור עד שהצינור לא יוכל לזוז (איור 2C).
- הסר את טבעת O השחורה וחבר את המחט לזרוע הרוטור; החליפו את טבעת ה-O כדי לאבטח את המחט למקומה (איור 2C).
- הגדר את המתח על ספק הכוח כך שיש מספיק כוח כדי לחדור את העור אבל לא כל כך חזק כי קשה לשלוט. לאחר חיבור ספק הכוח לחשמל, לחץ על דוושת הרגל כדי לוודא שההתקן פועל. היזהר לא לכוון את המחט על עצמך או על אנשי צוות אחרים.
הערה: מכונת הקעקוע המשמשת בפרוטוקול זה פועלת בצורה הטובה ביותר בין 6.0 ל- 9.0 וולט, אך הדבר עשוי להשתנות בין מכונות קעקוע לספקי מתח ויש לקבוע זאת אמפירית. - מלאו את המכסה של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל או סיר דיו מפלסטיק שסופק בדיו קעקוע שחור עד כשלושת רבעי הפקק המלא.
2. הרדמה
- הכינו את חומר ההרדמה במיכל גדול מספיק כדי להטביע נקבה בוגרת אחת של צפרדע X. laevis .
- בעזרת מים בטוחים לצפרדעים (ללא כלור), מוסיפים טריקאין לריכוז הסופי של 1.5 גרם/ליטר וסודיום ביקרבונט לריכוז הסופי של 3.5 גרם/ליטר. מערבבים להתמוססות. ה- pH של פתרון זה הוא 7.15.
אזהרה: טריקאין הוא חומר מגרה.
- בעזרת מים בטוחים לצפרדעים (ללא כלור), מוסיפים טריקאין לריכוז הסופי של 1.5 גרם/ליטר וסודיום ביקרבונט לריכוז הסופי של 3.5 גרם/ליטר. מערבבים להתמוססות. ה- pH של פתרון זה הוא 7.15.
- יש לטבול צפרדע אחת במיכל ההרדמה. ודאו שהצפרדע נשארת שקועה בתמיסת הטריקאין עד שהיא מורדמת (7-8 דקות).
- כדי לבדוק אם הצפרדע מורדמת לחלוטין, הרימו אותה, החזיקו אותה הפוכה ולחצו אותה היטב על רגל אחת. אם הצפרדע אינה נרתעת או מגיבה, ניתן לקעקע אותה.
- אם לצפרדעים לוקח באופן עקבי יותר מ-10 דקות להיות מורדמות, הכינו תמיסת טריקאין טריקאין טרייה עם סודיום ביקרבונט.
הערה: צפרדעים לא צריכות לבלות יותר מ -30 דקות בתמיסת טריקאין15.
3. קעקוע
הערה: לפני קעקוע חיה חיה, זה יכול להיות שימושי להתאמן על חתיכת פרי עם קליפה מוצקה (כגון לימון או בננה).
- הכינו מיכל התאוששות לצפרדעים לפני הקעקוע. ממלאים מיכל ב-10-15 ליטר מים טריים בטוחים לצפרדעים ומוסיפים אי קלקר. זה יספק משטח לצפרדע להתעורר מבלי לטבוע.
הערה: ניתן להכין אי קלקר באמצעות מכסה של מיכל קלקר קר המונח בתוך שקית רוכסן. - הניחו את הצפרדע המורדמת על גבה על מגבת נייר יבשה או נייר ספסל (איור 3A). השתמשו במגבות נייר לא מולבנות (חומות) לכל עבודה המערבת צפרדעים.
- בעזרת מגבון יבש ללא מוך, נגבו את המים והריר מחזה הצפרדע.
- מצאו את עצם החזה במרכז החזה של הצפרדע בעזרת אצבעות, ובעזרת היד הלא דומיננטית החזיקו את העור מתוח.
- סימון הצפרדע
- החזיקו את אקדח הקעקועים שהורכב במאונך ביחס למשטח העבודה וטבלו את המחט בדיו (איור 3B).
- שמירה על אקדח הקעקועים המורכב אנכי, לחץ על קצה המחט על עור הצפרדע לפני לחיצה על דוושת הרגל. ציירו קווים על עור הצפרדע תוך הפעלת לחץ אחיד.
הערה: דימום קל או אדמומיות הם נורמליים, כמו גם החלקת עור קלה. - אם המחט נתפסת על עור הצפרדע, נקו עודפי דיו או עור מהמחט בעזרת מגבון. עודף דיו הוא נורמלי במהלך קעקוע.
- אם החזה של הצפרדע מכוסה ביותר מדי דיו מכדי לראות בבירור את האזור המסומן (איור 3C), יש לנקות את עודפי הדיו בעזרת מים בטוחים לצפרדעים ומגבון (איור 3C). לאחר מכן, פתילו לחות עם מגבון יבש והמשיכו לסמן בדיו.
הערה: ניתן להכין בקבוק לחיץ של מים בטוחים לצפרדעים לפני הקעקוע. - המשיכו להשתמש בדיו באותו אזור עד שיישארו מספרים כהים וקריאים לאחר מחיקת עודפי דיו (איור 3D). במקום לצייר את כל הסימון או המספר בקו אחד, בצעו שוב ושוב קווים קטנים יותר, במיוחד בעקומות.
4. התאוששות
- הרטיבו מגבת נייר במים בטוחים לצפרדעים והניחו אותה שטוחה על גבי אי הקלקר (איור 4A).
- החזרת צפרדעים לטנקים עומדים
- הניחו את בטן הצפרדע על המגבת הפונה למים (איור 4B). מקפלים חצי ממגבת הנייר על החצי האחורי של הצפרדע ובעזרת ידיים קפוצות מרטיבים את החלק העליון של הצפרדע. ברגע שצפרדע יוצאת מההרדמה (כשעה לאחר הקעקוע), היא תיכנס למים באופן עצמאי ותשחה כרגיל.
- להחזיר צפרדעים לדיור לטווח ארוך לאחר 24 שעות, לאחר הקעקוע נרפא לחלוטין.
5. ניקיון ותחזוקת ציוד
- שימוש חוזר ואוטוקלאבינג של מחטי קעקוע
- יש לשטוף מחטים ב-100% איזופרופנול ומים שעברו דה-יוניזציה כדי לשחרר את הדיו ולקרצף את שאריות הדיו שלא התמוססו.
- לאחר הקרצוף, הניחו את המחטים בתוך מארז מתכת או עטפו אותן ברדיד אלומיניום ואוטוקלאבה למשך 30 דקות במחזור יבש.
- אם יש דיו על חתיכות של מכונת הקעקוע או ציוד אחר, לנגב אותו עם 100% אתנול ומגבת נייר.
- בתמיסת ההרדמה ריכוז הטריקאין הסופי הוא כ-0.5%. יש להשליך זאת בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בפסולת מסוכנת.
- אחסון ותחזוקה של ציוד
- במידת האפשר, אחסנו את מכונת הקעקועים בחדר יבש. עודף לחות יפגע ברכיבים החשמליים ויפחית את תוחלת החיים של המכונה.
- כדי לשמור על תקינות מכונת הקעקועים, בדקו את המסב על הרוטור (איור 2C) כדי לוודא שהוא לא השתחרר מתנודות22. ניתן להדק זאת באמצעות מפתח אלן או מברג משושה.
- בערך פעם בחודש, לשמן את המסב על זרוע הרוטור באמצעות שומן סיכה סמיך22.
- בחלק ממכונות הקעקוע, זרוע הרוטור יכולה להיתקע ולא תרטוט. כדי לתקן זאת, סובבו את זרוע הרוטור או דחסו את הקפיץ כך שהמחט תהיה במצב מונמך (איור 2C).
תוצאות
לקעקועים באיכות גבוהה יהיו משיכות כהות וקריאות על חזה הצפרדע, וניתן להבדיל ביניהם בבירור ממרחק של כמה מטרים (איור 5A). באופן כללי, מספרים וסימונים גדולים יותר טובים יותר לקריאות, אך ניתן להקטין שמות ומספרים ארוכים יותר כדי להתאים בנוחות לחזה הצפרדע. קשה יותר לשפוט אורך חיים של קעקועים, אולם קעקועי צפרדע באיכות גבוהה צריכים להישאר כהים וקריאים לפחות 3-6 חודשים (איור 5D-D'). ברגע שקעקוע דהה, ניתן לגעת בו באותה טכניקה.
טכניקה לקויה לא תגרום נזק לבעלי חיים, אבל יכולה לגרום לקעקועים לדהות במהירות (איור 5B), מה שמוביל לתיקונים תכופים יותר. קעקוע נלהב יתר על המידה עלול לגרום לדימום ואדמומיות, והצבת צפרדע בתנוחת התאוששות לא נכונה עלולה לגרום לטביעה לא מכוונת.
ניתן להעריך את איכות הקעקועים ואת יעילות הטכניקה בחודשים שלאחר הקעקוע (איור 5E). כל עוד יש דיו על הצפרדע לאחר תקופת ההחלמה, קעקוע נחשב מוצלח.
איור 1: זרימת עבודה של פרוטוקול והגדרת ספסל. (A) זרימת עבודה ותזמון. (1) צפרדעים מבלות 7-8 דקות בהרדמה בתמיסה של 1.5 גרם/ליטר טריקאין ו-3.5 גרם/ליטר סודיום ביקרבונט, pH 7.15, מומסים במים בטוחים לצפרדעים. בזמן שמקעקעים צפרדע אחת, ניתן להניח צפרדע שנייה על הסיפון במיכל ההרדמה. רק צפרדע אחת יכולה להיות בתמיסת טריקאין בכל פעם. (2) צפרדעים מבלות כ-10 דקות מחוץ למים בקעקוע. הזמן ישתנה בהתאם לגודל הקעקוע ולניסיון של צוות המעבדה. (3) צפרדעים חסרות הכרה מונחות על קלקר למשך 30-45 דקות כדי למנוע טביעה ומכוסות במגבת נייר רטובה כדי למנוע מהן להתייבש. (4) לאחר הקעקוע, הצפרדעים מבלות 24 שעות בהתאוששות במים עומדים טריים ובטוחים לצפרדעים. לאחר שהחלימו, ניתן להחזיר צפרדעים למושבה שלהן. (B) הגדרת ספסל עבור סביבת עבודה לדוגמה. סביבת העבודה של הקעקוע, מגבת נייר לא מולבנה, מרוכזת על הספסל. מכונת הקעקועים ואספקת המתח נמצאים משמאל למגבת הנייר. אלה ממוקמים בצד הדומיננטי של כוח האדם (כוח האדם הוא שמאלי). סיר דיו ודיו לקעקועים ממוקמים בסמוך לאספקת המתח ומחוץ לסביבת העבודה של הקעקוע. דוושת הרגל נמצאת באותו צד כמו אספקת המתח. לחיצה על דוושת רגל זו שולטת בתנועה הסיבובית. מגבונים ללא סיבים ובקבוק לחיץ עם מים בטוחים לצפרדעים נמצאים מימין למגבת הנייר. אלה משמשים לניקוי עודפי דיו מעור הצפרדע במהלך הקעקוע. מפתח אלן משמש להידוק ושחרור ברגים במכונת הקעקועים. זה משמש להרכיב ולפרק את מכונת הקעקוע. מיכל ההרדמה ומגבות נייר נוספות נשמרים גם הם על הספסל במהלך הקעקוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הרכבת מכונת קעקועים. (A) תמונה של מחט הקעקוע, ידית האחיזה והרכיבים הקשורים מפורקים. הברגים על ידית האחיזה המתכתית מסומנים בעיגול אדום. (B) תמונה של מחט הקעקוע שהורכבה כראוי לתוך ידית האחיזה. (C) תמונה של מחט הקעקוע והאחיזה שהורכבו לאקדח המקעקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מיקום והתייחסות לקעקוע צפרדע. (A) תמונה של צפרדע שוכבת עם הפנים כלפי מעלה על מגבת נייר. החץ מצביע על עצם החזה של הצפרדע. (B) תמונה של אנשי מעבדה מסמנים צפרדע. (C) תמונות של מספרים במהלך סימון בדיו, לפני (C) ואחרי (C') עודפי דיו נשטפו. (D) תמונה של קעקוע הצפרדע מיד לאחר הסימון בדיו, לפני ההתאוששות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התאוששות לאחר קעקוע. (A) אי קלקר. מכסה קופסת הקרח מקלקר מונח בתוך שקית עם רוכסן. (B) צפרדעים במצב התאוששות לאחר קעקוע. איי קלקר יכולים בדרך כלל להתאים לצפרדע אחת או שתיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמאות לתוצאות מייצגות. (A) קעקוע טרי 24 שעות לאחר הקעקוע. (B) טכניקות באיכות ירודה. ב-(B), מכונת הקעקוע לא הורכבה כראוי אך עדיין הייתה מסוגלת לתנועה סיבובית. תמונה זו צולמה 4 חודשים לאחר הקעקוע. ב-(ב'), מכונת הקעקועים לא הורכבה כראוי ולא הייתה מסוגלת לתנועה סיבובית. תמונה זו צולמה 6 חודשים לאחר הקעקוע. (ג) מכונת קעקועים שהורכבה בצורה לא נכונה. צינור המתכת וקצה הפלסטיק אינם קיימים, ואחיזת המתכת אינה מאובטחת כראוי לשאר מכונת הקעקוע. גומייה פוגעת בתנועה סיבובית (D) לפני (D) ואחרי (D') של צפרדע מקועקעת בטכניקה טובה ובהגדרת ציוד נכונה. (D) נלקח מיד לאחר הקעקוע, ו-(D') נלקח 4 חודשים לאחר הקעקוע. (E) נתונים כמותיים של תוצאות קעקוע צפרדעים. מבין הצפרדעים שקועקעו, ל-100% היו קעקועים גלויים מיד לאחר הקעקוע, ל-100% היו קעקועים 24 שעות לאחר הקעקוע, ול-91% היו קעקועים 4 חודשים לאחר הקעקוע. n = 58 צפרדעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
דיון
קעקוע בני אדם הוא צורת אמנות בת אלפי שנים, וכל עוד בני האדם קעקעו את עצמם, הם גם קעקעו או מיתגו בעלי חיים23 . הציוד והטכניקות לסימון בעלי חיים, בעיקר יונקים, מבוססים היטב, מתועדים היטב ונגישים באופן נרחב. בעוד שסימון בעלי חיים נועד במקור להבדיל בין הרתעת בעלי חיים וגניבות23, תפקידו במחקר הביו-רפואי הפך חשוב לא פחות.
היתרון של קעקוע דו-חיים הוא שקעקועים מחלימים תוך 24 שעות, וקעקועים טובים יחזיקו מעמד כמה חודשים (איור 5D). קעקוע מספק יתרונות מרובים עבור דיור וגידול של דו-חיים. קעקועים מאפשרים לחוקרים ולצוות הווטרינרי להבחין בקלות בין בעלי חיים בודדים באמצעות מספרים שקל לראות ולפרש, אפילו במכלים עם גוונים כהים יותר19. הליך זה יכול להיעשות גם על כל צפרדע בוגרת, לעומת autografts העור, אשר אינם מומלצים עבור צפרדעים מעל גיל2 15. והכי חשוב, קעקוע מאפשר לזהות מספר גדול של חיות, עם לפחות שלוש ספרות שמתאימות בנוחות לחזה של X. laevis (איור 5A).
לעומת הצמדת חרוזים או תגים, קעקוע אינו משאיר שום דבר שיכול ליפול וגורם לגירוי מוגבל17. בנוסף, קעקוע מאפשר ורסטיליות רבה יותר מאשר טכניקות מיתוג אחרות, הדורשות עיצוב חוט לתוך המותג. ההליך עצמו הוא הרבה פחות משבש מאשר autografts העור כי שום רקמה אינה מוסרת. עם זאת, כמו autografts, קעקוע הוא גם פולשני חלקית מציג סיכון קטן של פציעה או זיהום. זהו חלק הכרחי בסימון כל בעל חיים, אך חשוב לחוקרים להיזהר מדימום יתר במהלך הקעקוע ולפקח על בעלי חיים לזיהום A. hydrophilia . ניתן למנוע זאת על ידי שמירה על סביבת עבודה נקייה לפני, במהלך ואחרי הקעקוע ועל ידי הבטחת ריפוי מלא של הקעקועים לפני שבעלי החיים מוחזרים למושבה שלהם. בכתיבת המאמר ופיתוחו, אף אחת מהצפרדעים לא נפגעה לצמיתות או מתה מקעקוע. מגבלה של הליך זה היא שהוא נבדק רק על צפרדעים בוגרות מעל גיל שנה. עד כה, לא קועקעו צפרדעים בפרוטוקול זה. בנוסף, הליך זה אינו מותאם עבור X. tropicalis, אשר יש צבע כהה על החזה שלהם יהפוך קעקועים פחות מובחנים21. בעתיד, פרוטוקול קעקוע זה עשוי להתעדכן כך שיכלול שיקולים עבור X. tropicalis.
מכיוון שבית הגידול של הקסנופוס הוא מימי4, זה נורמלי שקעעקועים אלה ידהו עם הזמן. הצורך להחליף קעקועים לעיתים קרובות מתועד בקעקועי שפתיים אנושיים בתוך הפה, אשר דוהים מהר יותר מקעקועי אפידרמיס בגלל מגע מתמשך עם רוק ומשקאות24. עם זאת, תוחלת החיים של קעקוע תלויה במידה רבה בטכניקת הקעקוע. טכניקה לקויה יכולה לנבוע ממכונת קעקועים שהורכבה בצורה לא נכונה (איור 4C) או מהגדרות אספקת מתח תת-אופטימליות. הגדרת מתח נמוכה מדי תמנע מהמחט לחדור לעור, וכתוצאה מכך סימנים או קווים חלשים. הגדרת מתח גבוה מדי תגרום נזק מיותר לחיה. מקור נפוץ נוסף של קעקוע לקוי מגיע ממיקום מחט שגוי או לחץ כאשר אנשי הצוות מחזיקים את אקדח הקעקועים. לקעקוע עם פחות מדי לחץ יש את אותו אפקט כמו הגדרת מתח נמוך מדי, והוא יגרום לקעקוע קלוש שדוהה במהירות (איור 5B). בזמן הקעקוע, זה יכול להרגיש כאילו המחט מרפרפת על העור של הצפרדע במקום לנקב אותו. קעקוע עם יותר מדי לחץ יגרום לדימום מורגש או בלתי נשלט. הקעקוע הטוב ביותר נעשה בסבלנות ובשיטתיות על ידי סימון בדיו במקטעים קצרים וחזרה על קווים בלחץ כבד ועקבי.
בסך הכל, היתרונות של סימון בעלי חיים על ידי קעקוע בדו-חיים עולים על החסרונות. מעקב פרטני אחר קסנופוס במחקר ביו-רפואי מאפשר הקפדה מדעית במעקב אחר שכפולים ביולוגיים, מאפשר לחוקרים ולצוות הווטרינרי להעריך את רווחתם של בעלי חיים בודדים, ומבטיח תדירות מתאימה של ביוץ כדי לשמור על בריאותו ארוכת הטווח של החיה. לגבי 3Rs של מחקר בבעלי חיים - עידון, הפחתה והסרה- פרוטוקול זה רלוונטי ביותר לעידון והפחתה1. סימון צפרדעים מקל על חוקרים ווטרינרים לעקוב אחר בעיות בריאותיות, כמו גם לוודא שלצפרדעים ניתן זמן מנוחה מספק בין הניסויים. זה מזקק את תהליך המחקר על ידי הבטחת איכות גבוהה יותר של נתונים ודגימות שנאספו מבעלי חיים, כמו גם זיקוק שיטות גידול וטיפול בבעלי חיים. זה גם עוזר לשפר את יכולת השחזור בניסויים. בנוסף, סימון בעלי חיים מאפשר לעשות בהם שימוש חוזר, מה שמפחית את סך בעלי החיים הנדרשים. צפרדעים המטילות ביצים איכותיות במיוחד או שימושיות ביותר בניסויים אחרים יכולות להיות מסומנות כמתאימות יותר למחקר. אם צפרדעים באופן עקבי אינן שימושיות לניסויים, ניתן לזהות אותן ולהרחיק אותן מהמושבה, מה שחוסך משאבים ומקום. מטרת מאמר זה היא לתעד שיטות עבודה מומלצות בקעקוע דו-חיים ולספק למעבדות Xenopus פרוטוקול קעקוע מפורט ונגיש בקלות. פרקטיקה זו עדיין אינה נפוצה בתחום הקסנופוס , בין היתר משום שהמשאבים הקיימים המתפרסמים מוגבלים. משאב זה יאפשר לחוקרים לסמן בעלי חיים בבטחה וביעילות, לשפר את שמירת הרשומות עבור מושבות גדולות ולחדד את השימוש בדו-חיים במחקר ביו-רפואי.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים למרכז לרפואה השוואתית ומחקר של דארטמות' קולג' על מתן גידול יומי לבעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה. אנו מודים גם ללאה יעקב ולאדוויטה בוס על עזרתן בבדיקת הפרוטוקול ובצילום בעלי חיים. לבסוף, אנו מודים למעבדה של אן מילר על ההכשרה בפרקטיקה של קעקוע. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R00 GM147826 של NIH לג'.ל.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3 ספינות עגולות מחט | אספקת קעקועים ברחבי העולם | 1203RLB | ארוז סטרילי |
| 5 מחט עגולה חד פעמית ULTRA | אספקת קעקועים ברחבי העולם | HTIPRS5-U | ארוז סטרילי |
| 5 ספינות עגולות מחט | קעקועים ברחבי העולם | 1205RLB | ארוז סטרילי |
| 7 ספינות עגולות מחט | קעקועים ברחבי העולם | 1207RLB | ארוז סטרילי |
| קליפ כבל | ברחבי העולם אספקת קעקועים | N / A | |
| דוושת רגל | קעקועים ברחבי העולם | N / A | |
| Inkpots | ברחבי העולם אספקת קעקועים | N / A | |
| Kimwipes, מגבוני משימות עדינים | פישר סיינטיפיק | 06-666A | |
| RCA חיבור | ברחבי העולם אספקת קעקועים | N / A | |
| צעקה דיו מגרש שחור, 1oz | אספקת קעקועים ברחבי העולם | SI101 | |
| נתרן ביקרבונט (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| אחיזת נירוסטה | ברחבי העולם אספקת קעקועים | N / A | |
| התגנבות 2.0 מכונת קעקוע סיבובית | ברחבי העולם אספקת קעקועים | N/A | |
| התגנבות 2.0 מכונת קעקוע סיבובית תיבת סט | אספקת קעקועים ברחבי העולם | STEALTH2-SET | |
| אי קלקר | N / A | N / | A זהו המכסה של מיכל משלוח קר |
| קלקר טריקאין (אתיל 3-אמינובנזונאט מתאן סולפט) | סיגמא-אולדריץ' | E10521 | זהירות: |
| מגבות נייר לא מולבנות | Grainger | 2U229 | מגבות נייר חייבות להיות לא מולבנות, אקונומיקה רעילה לדו-חיים |
| כרךtagאספקת | קעקועים ברחבי העולם | N/A | |
| בקבוק כביסה (עם מים בטוחים לצפרדעים) | מים בטוחים לצפרדע של Fisher Scientific FB0340923T נטולי כלור, pH 7.0-8.5, מוליכות 1200-1800 | ||
| uSX. laevis נקבה בוגרת | Xenopus1 | N/A | |
| שקית ניילון עם רוכסן | N/A | N/A | שקית זו צריכה להיות גדולה מספיק כדי להכיל את אי הקלקר |
מקורות
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
- Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
- Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
- Sive, H. Xenopus: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Press. (2023).
- Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90(2017).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), 018(2023).
- Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), 22994(2017).
- Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), 23013(2017).
- Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), 23004(2017).
- Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), 038604(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
- Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
- Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328(2024).
- Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
- Cadillac, J. Animal identification systems used for mice. , The Jackson Laboratory. (2006).
- Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , Smithsonian Institute Press. 277-284 (1994).
- Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
- Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
- Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
- Rodel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
- Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. Worldwide Tattoo Supply. , (2015).
- Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
- Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
