Method Article

קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי

DOI:

10.3791/67094

⸱

February 21st, 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית ממשק אוויר-נוזל משמשת בדרך כלל לפיתוח אפיתל דרכי נשימה פסאודוסטרטי על ידי התמיינות תאי אפיתל סימפונות אנושיים תקינים ראשוניים המחקים את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול קל לקביעת איכותו על ידי ניטור תכונותיו הביופיזיקליות, כגון תפקוד ריסוני ושלמות הממברנה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמיינות תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של הריאה בממשק אוויר-נוזל (ALI) היא טכניקה פופולרית לפיתוח אפיתל רב-תאי של דרכי הנשימה הפסאודוסטרטיות המחקה את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. בעוד שההתמיינות של תאי הריאה הראשוניים בדרכי הנשימה צפויה, הערכת תכונות ביופיזיקליות כמו תפקוד ריסוני ואטימות הממברנה מספקת הערכת איכות של אפיתל דרכי הנשימה ומבטיחה את אמינות הניסוי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפיתוח אפיתל רב-תאי של דרכי הנשימה בתרבית ALI ומעריכים שתי תכונות ביופיזיקליות חשובות: תפקוד ריסוני ואטימות הממברנה. כדי לקבוע את הפונקציה הרירית, לכדנו את התנועה הרירית של אפיתל דרכי נשימה מובחן במשך 4 שבועות באמצעות מצלמה במהירות גבוהה המחוברת למיקרוסקופ הפוך, ולאחר מכן כימות תדירות פעימות ריסניות (CBF) באמצעות מערכת ניתוח וידאו סיימון אמון (SAVA). מדדנו גם התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) באמצעות מד וולט-אוהם כדי לקבוע את שלמות מחסום האפיתל של אפיתל דרכי הנשימה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות נשימה כרוניות כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) וסיסטיק פיברוזיס הן חלק מהדאגות הבריאותיות העיקריות ברחבי העולם1. השכיחות של מחלות נשימה הנגרמות על ידי וירוסים כגון וירוס שפעת A אנושי, וירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV) ותסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) גורמים גם הם לנטל כלכלי ובריאות הציבור2. לכן, קיים צורך עצום לפתח משטרי טיפול במחלות נשימתיות המובילות לנזק בלתי הפיך לרקמות הנשימה. רקמת האפיתל הנשימתית עצמה לא רק מעורבת בספיגת חמצן אלא גם מספקת מחסום להגנה על הגוף מפני פלישה לפתוגנים וכימיקלים מסוכנים3. לאפיתל הנשימתי יש ארגון תאי מורכב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול צריך להתבצע במצב סטרילי תחת מכסה מנוע זרימה למינרית ברמת בטיחות ביולוגית 2 (ארון בטיחות ביולוגית). יש להפשיר את כל התווך והתמיסות בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש. צנטריפוגה צריכה להתבצע ב 4 °C (75 °F). כל החומרים המשמשים בניסוי חייבים להיות סטריליים. התאים הראשוניים (תורם לא מזוהה) הושגו בשיתוף פעולה עם ד"ר קריסטינה ביילי מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה (UNMC), אומהה, ניו יורק. התאים הראשוניים הם מתורמים לא מזוהים, והתאים אינם שייכים לנבדק האנושי של NIH. התאים הושגו במסגרת הסכם העברת חומרים מאושר (MTA) בין אוניברסיטת צפון דקוטה, גרנד פורקס, ND, ו- UNMC, אומהה, ניו יורק. כאן, השתמשנו במעבר של 4 תאי NHBE. אף על פי שתאי NHBE ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים העריכו הן את התפקוד הריסי והן את אטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה שהתקבלו מהתמיינות תאי NHBE ראשוניים משני תורמים בלתי מזוהים בלתי תלויים (שני מבוגרים בריאים שאינם מעשנים או מבוגרים עם COPD, מעל גיל 50). לצורך קביעת תפקוד ריסני, קבענו את ה-CBF של אפיתל דרכי הנשימה המובחן בן 28 הימים. ראינו CBF הגיע לפחות 3 הרץ עבור שני אפיתל דרכי הנשימה, אשר היה דומה לתוצאות שפורסמו בעבר (איור 1)6,7,14. ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל דרכי הנשימה הראשוני של האדם (תרבית ALI) משמש יותר ויותר כמודל ריאות חוץ גופיות להערכות ביולוגיות לחקר תפקוד ומנגנונים ולהפחתת השימוש בבעלי חיים14. ל- ALI מספר יתרונות על פני כל תרבות שקועה חד-שכבתית. לדוגמה, הוא מספק אפיתל דרכי נשימה דמוי רקמה המחקה את הצד האפי של נתיב האוויר הריאה 6,7,14. עם זאת, יש להעריך את האיכות והשלמות של אפיתל דרכי הנשימה המובחן פסאודוסטרטי כ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי NIH P20GM113123 ומענק פיילוט של UND SMHS.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific, ארה"ב14190-144
דרכי הנשימה גידול תאיPromoCell, גרמניהC-21060
Amphotericin BThermo Fisher Scientific, ארה"ב15290-026
EVOM2 וולט Ohmmeterמכשירי דיוק עולמיים, ארה"בלא ישים
Heparin Solutionטכנולוגיות STEMCELLארה"ב07980
Hydrocortisone stockSTEMCELL technologies, ארה"ב07926
מיקרוסקופ: Leica DMI8 (Leica Microscope) עם מצלמה מהירה של 120f/sec (Basler) הקשורה למיקרוסקופ. Microsope קבוע גם עם חממת תא הבמה i8.Leica, ארה"בלא ישים
פניצילין-סטרפטומיציןקורנינג, ארה"ב30-002-CI
PneumaCult-ALI בסיס בינוני טכנולוגיות STEMCELL, ארה"ב05002
PureColAdvanced BioMatrix, ארה"ב5005
מערכת ניתוח וידאו Sisson-Ammons (SAVA). תוכנה V.2.1.15 Amson Engineering, ארה"בלא ישים
אפיתל בינוני

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ciliary FunctionMembrane ImpermeabilityAirway EpitheliumAir Liquid InterfaceCiliary Beat FrequencyTransepithelial Electrical ResistancePseudostratified EpitheliumBronchial Epithelial CellsHigh Speed MicroscopySAVA System

Related Articles