הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67094

⸱

21 בפברואר 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

במאמר זה

סיכום

תרבית ממשק אוויר-נוזל משמשת בדרך כלל לפיתוח אפיתל דרכי נשימה פסאודוסטרטי על ידי התמיינות תאי אפיתל סימפונות אנושיים תקינים ראשוניים המחקים את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול קל לקביעת איכותו על ידי ניטור תכונותיו הביופיזיקליות, כגון תפקוד ריסוני ושלמות הממברנה.

תקציר

התמיינות תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של הריאה בממשק אוויר-נוזל (ALI) היא טכניקה פופולרית לפיתוח אפיתל רב-תאי של דרכי הנשימה הפסאודוסטרטיות המחקה את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. בעוד שההתמיינות של תאי הריאה הראשוניים בדרכי הנשימה צפויה, הערכת תכונות ביופיזיקליות כמו תפקוד ריסוני ואטימות הממברנה מספקת הערכת איכות של אפיתל דרכי הנשימה ומבטיחה את אמינות הניסוי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפיתוח אפיתל רב-תאי של דרכי הנשימה בתרבית ALI ומעריכים שתי תכונות ביופיזיקליות חשובות: תפקוד ריסוני ואטימות הממברנה. כדי לקבוע את הפונקציה הרירית, לכדנו את התנועה הרירית של אפיתל דרכי נשימה מובחן במשך 4 שבועות באמצעות מצלמה במהירות גבוהה המחוברת למיקרוסקופ הפוך, ולאחר מכן כימות תדירות פעימות ריסניות (CBF) באמצעות מערכת ניתוח וידאו סיימון אמון (SAVA). מדדנו גם התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) באמצעות מד וולט-אוהם כדי לקבוע את שלמות מחסום האפיתל של אפיתל דרכי הנשימה.

מבוא

מחלות נשימה כרוניות כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) וסיסטיק פיברוזיס הן חלק מהדאגות הבריאותיות העיקריות ברחבי העולם1. השכיחות של מחלות נשימה הנגרמות על ידי וירוסים כגון וירוס שפעת A אנושי, וירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV) ותסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) גורמים גם הם לנטל כלכלי ובריאות הציבור2. לכן, קיים צורך עצום לפתח משטרי טיפול במחלות נשימתיות המובילות לנזק בלתי הפיך לרקמות הנשימה. רקמת האפיתל הנשימתית עצמה לא רק מעורבת בספיגת חמצן אלא גם מספקת מחסום להגנה על הגוף מפני פלישה לפתוגנים וכימיקלים מסוכנים3. לאפיתל הנשימתי יש ארגון תאי מורכב המורכב משלושה סוגי תאים עיקריים: תאים ריסונים, תאי גביע ותאי בסיס. לאחרונה, דווח על נוכחות של תאים יונוציטים חדשים אך נדירים באפיתל דרכי הנשימה4. הרקמה המורכבת מתפקדת באופן מתואם כדי לספק תגובות חיסוניות מולדות כגון הפרשת פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, שחרור ציטוקינים להפעלת תגובה חיסונית נרכשת וסילוק ליחה5. היעדר מודל מתאים של דרכי נשימה הוא אחד החסמים לחקר זיהומים בדרכי הנשימה ופיתוח טיפולים.

מודל ממשק אוויר-נוזל (ALI) הופך לכלי מפתח למחקר על מחלות נשימה6. זהו מודל יעיל של דרכי נשימה ריאה במבחנה מכיוון שתאי דרכי הנשימה העיקריים של הריאה מתמיינים לאפיתל של דרכי הנשימה הפסאודוסטרטיות המורכב מלפחות שלושה סוגים של תאים השוכנים בדרך כלל בצד האפי של דרכי הנשימה. ראשית, תאים ריסניים מכסים את רוב הצד האפי של דרכי הנשימה ותורמים לסילוק ליח. שנית, תאי גביע מייצרים ריר והם התאים הגדולים ביותר השוכנים יחד עם תאים ריסניים בצד האפי של דרכי הנשימה. שלישית, תאי הבסיס שוכנים בשכבת הבסיס של דרכי הנשימה והם תאי האב המתמיינים לתאי אפיתל שונים 5,7. למרות שיונוציטים ותאי ציץ נדירים באפיתל דרכי הנשימה, הם עשויים גם למלא תפקיד בתפקוד הריסים ובחדירות הממברנה4. טכניקה זו שונה מתרבית התאים השקועה המסורתית, שאינה מחקה את סביבת הריאות in vivo. מכיוון ש- ALI מיוצר מתאי אפיתל ראשוניים שמקורם באנשים בריאים, חולי אסתמה ו- COPD, הוא מציע פלטפורמה מגוונת יותר לחקר תגובות לזיהום ופתופיזיולוגיה של מחלות.

הערכת הבריאות של התרביות שפותחו על ידי ALI היא היבט חיוני לניטור, המבטיח את יכולת הקיום, הפונקציונליות והרלוונטיות הפיזיולוגית של התאים בתרבית. זה משפר את הביטחון ביושרה, אמינות ויכולת השחזור של תרבויות ALI. כפי שפורסם בעבר, הקבוצה שלנו העריכה את שלמות תרבית ALI על ידי הערכת שני פרמטרים ביופיזיקליים: תפקוד ריסוני על ידי כימות תדירות פעימות ריסניות (CBF) ושלמות מחסום אפיתל על ידי קביעת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) 6,7,8. פינוי ליחה (MCC) הוא אחד המאפיינים החשובים של אפיתל דרכי הנשימה הנישא על ידי תאים ריסניים. אברונים מיוחדים הנקראים ריסונים על פני השטח של תאים ריסונים פועמים בגלים מטכרוניים כדי לנקות את דרכי הנשימה מזיהומים וחלקיקים נשאפים שנתקעו בשכבה הרירית של אפיתל דרכי הנשימה. MCC יעיל תלוי לחלוטין בפעילות ריסנית תקינה9. CBF טוב מעיד על אפיתל בריא ושלם של דרכי הנשימה; לפיכך, ניטור של CBF עבור תרביות ALI מספק תובנה חשובה לגבי שלמות האפיתל10. למרות שישנן דרכים רבות לכמת CBF, לדוגמה, מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה11 וטומוגרפיית קוהרנטיות אופטית דופלר12, כל שיטה זקוקה למומחיות טכנית וציוד מיוחד. בפרוטוקול זה, אנו מספקים דרך קלה יותר ופחות טכנית לכמת CBF של אפיתל דרכי הנשימה המובחן. תיארנו גם שיטה לכימות TEER של אותו אפיתל, המציינת את שלמות רקמות האפיתל ואת תפקוד המחסום13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול צריך להתבצע במצב סטרילי תחת מכסה מנוע זרימה למינרית ברמת בטיחות ביולוגית 2 (ארון בטיחות ביולוגית). יש להפשיר את כל התווך והתמיסות בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש. צנטריפוגה צריכה להתבצע ב 4 °C (75 °F). כל החומרים המשמשים בניסוי חייבים להיות סטריליים. התאים הראשוניים (תורם לא מזוהה) הושגו בשיתוף פעולה עם ד"ר קריסטינה ביילי מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה (UNMC), אומהה, ניו יורק. התאים הראשוניים הם מתורמים לא מזוהים, והתאים אינם שייכים לנבדק האנושי של NIH. התאים הושגו במסגרת הסכם העברת חומרים מאושר (MTA) בין אוניברסיטת צפון דקוטה, גרנד פורקס, ND, ו- UNMC, אומהה, ניו יורק. כאן, השתמשנו במעבר של 4 תאי NHBE. אף על פי שתאי NHBE בעלי מעבר גבוה יותר (עד מעבר 8) הוכחו גם כמתמיינים לאפיתל של דרכי הנשימה, אנו משתמשים באופן שגרתי בתאי NHBE במעבר ארבעה מכיוון שאין הבדל ברור בפרופילי שעתוק גנום שלם בין מעברים 1 עד 4, 6,14.

1. תרבית תאים ראשונית

הערה: טיפול זהיר בתאים הראשיים הוא חיוני. הפרוטוקול כולו צריך למנוע טיפול קשה ופיפטינג מוגזם של התאים הראשוניים.

  1. בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילית מוסיפים 5 מ"ל קולגן לצלחת תרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ (TC) כדי לצפות מראש את המנה. לדגור על צלחת TC עם קולגן בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.
  2. באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית, שאפו את הקולגן מצלחת ה-TC והחליפו אותו ב-8 מ"ל של תאי אפיתל שלמים של דרכי הנשימה (AEC) שהופרכו מראש בתוספת 2% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו-1% (v/v) אמפוטריצין B (טבלה 1).
  3. הפשיר בקבוקון אחד (המכיל 5 x 105 תאים) של תאי אפיתל סימפונות אנושיים נורמליים ראשוניים (NHBE) באמבט מים ב 37 ° C.
  4. עם פיפטה סרולוגית סטרילית של 5 מ"ל, הוסף 1 מ"ל של מדיום AEC שלם מופשר מראש לתאים כדי לאקלם את תאי NHBE, ולאסוף את כל התאים בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 212 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו בעדינות את התווך מהצינור והשהו מחדש את התאים בטיפות התווך שנותרו בצינור על ידי הקשה עדינה.
    הערה: יש להימנע מהקשות מוגזמות וקשות.
  6. באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 5 מ"ל, להוסיף לאט 2 מ"ל של מדיום AEC מלא לתאים מרחפים ולאסוף את כל התאים.
  7. הוסף את התאים לצלחת שנוספו מראש עם 8 מ"ל של מדיום AEC מלא. הזיזו את צלחת TC הצידה כדי לפזר את התאים בצלחת באופן אחיד.
  8. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור תרבית תאיCO2 לח בטמפרטורה של 85%-95%. לאחר 24 שעות, התבוננו בתאי NHBE מתחת למיקרוסקופ פי 10 או 20 לצורך חיבורם לצלחת ה-TC וצמיחתם. אם התאים מרחפים בתווך, זה מראה תאים מתים.
  9. לאחר 48 שעות, שואפים את המדיום הישן מצלחת TC עם פיפטה סרולוגית סטרילית.
  10. בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילית, מוסיפים לתאים 10 מ"ל של תווך AEC מלא שחומם מראש. הוסף את המדיה לאט לפינה אחת; הימנעו מזיגה ישירה על החלק העליון של התאים.
  11. שנה את מדיית AEC המלאה כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 95%-100%.

2. תרבות ממשק אוויר-נוזל

  1. באמצעות פיפטה P200, יש להוסיף 100 μL קולגן לתוספת טרנסוול מצופה מראש בקוטר 6.5 מ"מ עם קרום פוליאסטר בקובוביות 0.4 מיקרומטר (מכאן והלאה ייקראו תוספות) ולדגור ב-RT למשך 20 דקות.
  2. עם פיפטה סרולוגית סטרילית, שואפים את המדיום מתאי NHBE המשתלבים.
  3. הוסף 5 מ"ל של 1x מלח חיץ פוספט של Dulbecco (DPBS) עם פיפטה סרולוגית סטרילית לפינה אחת של צלחת TC.
  4. מערבלים בעדינות את הצלחת כדי לשטוף את התאים ולשאוף את 1x DPBS עם פיפטה סרולוגית סטרילית. ודא שהתאים אינם מתייבשים בשום שלב במהלך הפרוטוקול.
  5. באמצעות פיפטה סרולוגית, להוסיף 5 מ"ל של TrypsinLE לתאים לדגור ב 37 ° C באינקובטור לח CO2 תרבית תאים עד שכל התאים מנותקים מהמשטח התחתון של הצלחת.
  6. באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית, לאסוף את כל התאים בצינור חרוטי 15 מ"ל. עם פיפטה סרולוגית סטרילית, להוסיף 3 מ"ל של טריפסין לצלחת TC ולאסוף את כל התאים שיורית.
  7. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 212 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את המדיום וטפחו בעדינות על הצינורית כדי להשהות מחדש את התאים בטיפות הטריפסין שנותרו בצינור.
  8. באמצעות פיפטה סרולוגית להוסיף 2 מ"ל של תווך AEC מלא לתאים resuspended.
  9. ספור את התאים באמצעות hemacytometer או מונה תאים אוטומטי.
  10. לדלל את התאים עם מדיה AEC מלאה, כאשר כל תוספת מקבלת 5 x 104 תאים בנפח של 200 μL.
  11. בעזרת מלקחיים סטריליים מעבירים את התוספות לבאר ריקה בצלחת תרבית בת 24 בארות.
  12. באמצעות פיפטה P1000, להוסיף 500 μL של מדיה AEC מלאה לבאר הבסיסית של הצלחת.
  13. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את התוספות חזרה לבאר הבסיס בתוספת מדיית AEC שלמה.
  14. עם פיפטה P200, הוסף 5 x 104 תאי NHBE מרחפים ב 200 μL של מדיום AEC מלא לצד האפי של האינספק. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור תרבית תאיםCO2 לח של 85% - 95%.
  15. לאחר 24 שעות, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לראות אם הם יצרו שכבה מתמזגת בבאר.
    הערה: אם התאים אינם יוצרים שכבה מתמזגת, שנה את מדיום AEC הבסיסי כל 48 שעות בתווך AEC טרי ושלם עד שהתאים יוצרים חד-שכבה מתמזגת. תוך כדי שינוי מדיה בסיסית, להעביר את התוספות לבאר ריקה עם מלקחיים סטריליים. שאפו את המדיום הישן עם פיפטה P1000, הוסיפו מדיום טרי והחזירו את התוספות למדיום AEC טרי ושלם.
  16. ברגע שהתאים נפגשים, מעבירים את התוספות לבאר ריקה בעזרת מלקחיים סטריליים. באמצעות פיפטה P1000, שואפים את כל מדיום AEC הבסיסי.
  17. עם פיפטה P1000, הוסף 500 μL של התמיינות ממשק אוויר-נוזל מלא טרי (ALI) בינוני בתוספת 2% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו-1% (v/v) אמפוטריצין B לבאר הבסיסית.
  18. מעבירים את התוספות לבאר הבסיסית בתוספת מדיום ALI שלם באמצעות מלקחיים סטריליים. בעזרת פיפטה P200, שואפים בעדינות את מדיום AEC האפי מהבאר.
    הערה: אין להוסיף את הצד האפי עם מדיום ALI המלא. יש לשאוף את תווך ה-AEC בזהירות מהצד האפי כדי למנוע ניתוק תאים.
  19. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של תרבית תאי CO2 . לאחר 48 שעות, מעבירים את התוספות לבאר ריקה בעזרת מלקחיים סטריליים.
  20. באמצעות פיפטה P1000, שואפים את המדיום הישן ומוסיפים 500 μL טריים של מדיום ALI שלם.
  21. בעזרת מלקחיים סטריליים, מחזירים את התוספות לבאר עם מדיום טרי. המשך לשנות את מדיום ALI המלא כל 48 שעות עד יום 28 (ארבעה שבועות).
  22. ביום ה-28, באמצעות פיפטה P200, יש להוסיף 100 μL של 1x DPBS לצד האפי של התוספות ולדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של תרבית תאים CO2 למשך 30 דקות. שאפו ל-DPBS 1x עם פיפטה P200.
    הערה: יש להוסיף DPBS על ידי שפיכה על הקיר במקום ישירות לתאים. בעת שאיפת DPBS, הימנע מלגעת באפיתל ופיפטינג נמרץ מכיוון שכל נזק לאפיתל יכול לסכן את שלמות האפיתל (דמוי רקמות).
  23. מהשבועהשני של התמיינות יש להעריך את ייצור הריר על ידי התבוננות בשכבה כהה יותר עקב ריר על האפיתל מתחת למיקרוסקופ. את הריר המופרז ניתן להסיר על ידי שטיפת DPBS. בקצרה, הוסף 200 μL של 1x DPBS בצד האפי של התוספות על צלחת 24 בארות ודגר על הצלחת ב 37 ° C באינקובטור תרבית תאים CO2 לח במשך 30 דקות. הסר DPBS ושמור את הצלחת על 37 ° C באינקובטור לח CO2 תרבית תאים.

3. קביעת תדירות פעימות ריסניות

הערה: לקביעת CBF ב 37 ° C (במידת הצורך), המיקרוסקופ צריך להיות אינקובטור תא סביבה המספק 5% CO2 ב 37 ° C ולחות.

  1. הפעל את המיקרוסקופ עם המחשב המחובר אליו ותא הסביבה. פתח את דלת החדר כדי להניח את הצלחת המכילה את התוספות על במת המיקרוסקופ.
  2. לאחר הנחת הצלחת על הבמה, סגור את החדר. באמצעות ידית ההפעלה של שלב המיקרוסקופ, הזיזו את הצלחת כדי להציג את התוספות.
  3. בחר בעדשת ההגדלה של 20x במצב ניגודיות פאזה. התבוננו בצלחת דרך עינית המיקרוסקופ ומקדו את התא באמצעות ידית הכוונון.
  4. במסך המחשב, לחץ על סמל מערכת SAVA . תוכנית SAVA צריכה להיות מותקנת במחשב המחובר למיקרוסקופ.
  5. בממשק התוכנה, לחץ על הגדר ניסוי. בכרטיסייה הבאה, לחץ על צור ניסוי.
  6. תופיע כרטיסייה חדשה, תמסור פרטים על הספרייה שבה יאוחסנו הנתונים בתיבה הזן שם מדריך ניסויים ופרטי ניסוי בתיבה הזן תיאור ניסוי ולאחר מכן לחץ על אישור.
  7. לחץ על הניסוי שנוצר ומוצג בספריה תחת הניסויים.
  8. לחץ על שנה וספק פרטים לדוגמה בתיאור לדוגמה. לחץ על הוסף ולאחר מכן על יציאה כדי לצאת מכרטיסייה זו.
  9. בממשק התוכנה הראשי בחריץ הניסוי, בחר את הניסוי שנוצר מהתפריט הנפתח בממשק הראשי.
  10. לחץ על הקלט וידאו ועקוב אחר תדר הפעימות הריסי (CBF) על מסך המחשב. המסך יציג תנועה ריסנית ממוקדת.
  11. עבור כל הוספה, הקלט 6 שדות אקראיים שונים עבור 2.1 שניות ב- 120 מסגרות לשנייה. לחץ על שמור וידאו כדי לפקח על נתוני CBF.
  12. כדי לנתח נתונים, לחץ על ניתוח וידאו בממשק התוכנה. בכרטיסייה הבאה, לחץ על אישור.
  13. בכרטיסייה הבאה, לחץ על נתח הכל. הורד את הגיליון האלקטרוני שנוצר עבור כל ניסוי בתיקיית רכישת הנתונים SAVA במחשב במחשב.
  14. קח את התדירות הממוצעת של גאוס להצגת נתונים.

4. כימות ההתנגדות החשמלית transepithelial

הערה: כימות TEER זקוק לנוזל בצד האפי של אפיתל דרכי הנשימה. כדי לבסס פרוטוקול זה, הוסף 100 μL של 1x DPBS בצד האפי של אפיתל דרכי הנשימה בתוספות שכבר מכילות את המדיום הבסיסי (ניסיוני) או 500 μL של 1x DPBS.

  1. הפעל את מד המתח EVOM2 וולט באמצעות מתג ההפעלה. חבר את נגד הבדיקה ל-EVOM2 בחריץ הקלט.
  2. עקוב אחר הקריאה במסך EVOM2. אם זה מעל או מתחת 1000, אז זה צריך כיול. באמצעות מלקחיים, סובב את מתג ADJ באומטר EVOM2 וולט עד שהוא מראה קריאה אחידה של 1000.
  3. קח עלון ריק לקריאת בקרה ניסויית. באמצעות פיפטה P200 להוסיף 100 μL של 1x DPBS בצד apical של תוספת ריקה, בעוד 500 μL של 1x DPBS מתווסף בצד הבסיס עם פיפטה P1000.
  4. נתק את נגד הבדיקה וחבר את אלקטרודת STX2 בחריץ הקלט ב-EVOM2. נקו בעדינות את אלקטרודת STX2 עם 70% אתנול.
  5. הכנס את אלקטרודת STX2 ל- Emptyinsert עם DPBS 1x, תוך שמירה על רגל האלקטרודה הקצרה יותר בחלק האפי של כל תוספת ורגל האלקטרודה הארוכה יותר בחלק הבסיסי.
  6. הקלט את הקריאה היציבה על מסך EVOM2, מכיוון שהקריאה יכולה להשתנות עקב תנועה או סיבות לא ברורות אחרות.
  7. הכנס את אלקטרודת STX2 לאינסרט עם אפיתל מובחן למשך 28 יום, תוך שמירה על רגל האלקטרודה הקצרה יותר בחלק האפי של כל תוספת ורגל האלקטרודה הארוכה יותר בחלק הבסיסי בתווך.
  8. הקלט את הקריאה היציבה על מסך EVOM2. קח כמה קריאות עצמאיות כדי לחשב ממוצע אמין. החסר את הרקע (קריאת הוספה ריקה) מקריאת ההוספה הניסיונית לצורך חישוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

החוקרים העריכו הן את התפקוד הריסי והן את אטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה שהתקבלו מהתמיינות תאי NHBE ראשוניים משני תורמים בלתי מזוהים בלתי תלויים (שני מבוגרים בריאים שאינם מעשנים או מבוגרים עם COPD, מעל גיל 50). לצורך קביעת תפקוד ריסני, קבענו את ה-CBF של אפיתל דרכי הנשימה המובחן בן 28 הימים. ראינו CBF הגיע לפחות 3 הרץ עבור שני אפיתל דרכי הנשימה, אשר היה דומה לתוצאות שפורסמו בעבר (איור 1)6,7,14. ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אפיתל דרכי הנשימה הראשוני של האדם (תרבית ALI) משמש יותר ויותר כמודל ריאות חוץ גופיות להערכות ביולוגיות לחקר תפקוד ומנגנונים ולהפחתת השימוש בבעלי חיים14. ל- ALI מספר יתרונות על פני כל תרבות שקועה חד-שכבתית. לדוגמה, הוא מספק אפיתל דרכי נשימה דמוי רקמה המחקה את הצד האפי של נתיב האוויר הריאה 6,7,14. עם זאת, יש להעריך את האיכות והשלמות של אפיתל דרכי הנשימה המובחן פסאודוסטרטי כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי NIH P20GM113123 ומענק פיילוט של UND SMHS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x DPBSThermo Fisher Scientific, ארה"ב14190-144
דרכי הנשימה גידול תאיPromoCell, גרמניהC-21060
Amphotericin BThermo Fisher Scientific, ארה"ב15290-026
EVOM2 וולט Ohmmeterמכשירי דיוק עולמיים, ארה"בלא ישים
Heparin Solutionטכנולוגיות STEMCELLארה"ב07980
Hydrocortisone stockSTEMCELL technologies, ארה"ב07926
מיקרוסקופ: Leica DMI8 (Leica Microscope) עם מצלמה מהירה של 120f/sec (Basler) הקשורה למיקרוסקופ. Microsope קבוע גם עם חממת תא הבמה i8.Leica, ארה"בלא ישים
פניצילין-סטרפטומיציןקורנינג, ארה"ב30-002-CI
PneumaCult-ALI בסיס בינוני טכנולוגיות STEMCELL, ארה"ב05002
PureColAdvanced BioMatrix, ארה"ב5005
מערכת ניתוח וידאו Sisson-Ammons (SAVA). תוכנה V.2.1.15 Amson Engineering, ארה"בלא ישים
אפיתל בינוני

מקורות

  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M. The economic burden of non-influenza-related viral respiratory tract infection in the United States. Arch Intern Med. 163 (4), 487-494 (2003).
  3. LeMessurier, K. S., Tiwary, M., Morin, N. P., Samarasinghe, A. E. Respiratory barrier as a safeguard and regulator of defense against Influenza A virus and Streptococcus pneumoniae. Front Immunol. 11, 3(2020).
  4. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  5. Calven, J., Ax, E., Radinger, M. The airway epithelium-A central player in Asthma pathogenesis. Int J Mol Sci. 21 (23), 8907(2020).
  6. Talukdar, S. N., et al. RSV-induced expanded ciliated cells contribute to bronchial wall thickening. Virus Res. 327, 199060(2023).
  7. Osan, J., et al. Goblet cell hyperplasia increases SARS-CoV-2 infection in chronic obstructive pulmonary disease. Microbiol Spectr. 10 (4), e0045922(2022).
  8. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  9. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (4), a028241(2017).
  10. Rhee, C. S., et al. Ciliary beat frequency in cultured human nasal epithelial cells. Ann Otol Rhinol Laryngol. 110 (11), 1011-1016 (2001).
  11. Scopulovic, L., Francis, D., Pandzic, E., Francis, R. Quantifying cilia beat frequency using high-speed video microscopy: Assessing frame rate requirements when imaging different ciliated tissues. Physiol Rep. 10 (11), e15349(2022).
  12. Jing, J. C., Chen, J. J., Chou, L., Wong, B. J. F., Chen, Z. Visualization and detection of ciliary beating pattern and frequency in the upper airway using phase resolved Doppler optical coherence tomography. Sci Rep. 7 (1), 8522(2017).
  13. Yuksel, H., Turkeli, A. Airway epithelial barrier dysfunction in the pathogenesis and prognosis of respiratory tract diseases in childhood and adulthood. Tissue Barriers. 5 (4), e1367458(2017).
  14. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) Cell 3D Cultures for in vitro Lung Model Studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  15. Osan, J. K., DeMontigny, B. A., Mehedi, M. Immunohistochemistry for protein detection in PFA-fixed paraffin-embedded SARS-CoV-2-infected COPD airway epithelium. STAR Protoc. 2 (3), 100663(2021).
  16. Talukdar, S. N., McGregor, B., Osan, J. K., Hur, J., Mehedi, M. Respiratory Syncytial Virus Infection Does Not Induce Epithelial-Mesenchymal Transition. J Virol. 97 (7), e0039423(2023).
  17. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Front Pediatr. 2, 111(2014).
  18. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1, 14(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ממשק אוויר-נוזלתדר דפיקות השמירההתנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאליתאפיתליום רב-שכבתי מדומהתאי אפיתליום ברונכיאלייםמיקרוסקופיה במהירות גבוההמערכת SAVA
קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.