מודל מתח חברתי משולב מרובה להפרעות פסיכיאטריות בעכברי C57BL/6J נקבות

מאות מיליוני אנשים חיים עם הפרעות פסיכיאטריות, כאשר הפרעות חרדה ודיכאון הן הנפוצות ביותר. על פי ארגון הבריאות העולמי, יותר מ -280 מיליון ו -301 מיליון אנשים ברחבי העולם חיו עם דיכאון וחרדה, בהתאמה, בשנת 2019¹. בשל מגיפת COVID-19, מספר האנשים שנפגעו מהפרעות חרדה ודיכאון גדל משמעותית - ב-26% ו-28%, בהתאמה - תוך שנה אחת בלבד. בקרב הנפגעים, השכיחות לכל החיים של הפרעות פסיכיאטריות בנשים גבוהה כמעט פי שניים מאשר אצל גברים², כאשר נשים מציגות תסמינים חמורים יותר, ליקוי תפקודי גדול יותר, פנוטיפים דיכאוניים לא טיפוסיים, הישנות תכופות יותר והיענות נמוכה יותר לתרופות ^3,4,5.

למרות שהבדלים בין המינים בהיבטים רבים של הפרעות פסיכיאטריות מתועדים היטב ^6,7,8, רוב המחקר הפרה-קליני התמקד בעיקר בנבדקים גברים, בעיקר בשל היעדר מודלים מתאימים של בעלי חיים נקביים ^9,10. כתוצאה מכך, הפתוגנזה של הפרעות אלה אצל נשים נותרה לא מובנת היטב. זה מדגיש את הצורך הדחוף בפיתוח מודלים של בעלי חיים הכוללים נבדקים נקבות, שיקלו על חקירת המנגנונים הנוירוביולוגיים העומדים בבסיס הפרעות פסיכיאטריות אצל נקבות.

מספר הולך וגדל של מודלים של לחץ חברתי עבור עכברים נקבות פותחו בהתבסס על פרדיגמת לחץ תבוסה חברתית חוזרת (RSDS) 11,12,13,14. לדוגמה, שני מודלים של RSDS שהוקמו לאחרונה בעכברים נקבות כללו שיפור מלאכותי של תוקפנות זכרית באמצעות יישום שתן זכרי על עכברים נקבות והפעלה כימוגנטית של תת-החלוקה הגחונית של ההיפותלמוס הגחוני בתוקפים זכרים 11,12,13. עם זאת, נטען כי התנהגויות תוקפניות אלה אינן מתרחשות באופן טבעי ועשויות שלא לייצג גורמי לחץ רלוונטיים עבור עכברים נקבות¹⁰. בנוסף, הריון הנובע מהתנהגות גוברת מסבך מחקרים מכניסטיים עוקבים.

מודל מותאם נוסף המבוסס על RSDS הוא פרדיגמת הלחץ של תבוסה חברתית עקיפה, שבה עכברים נקבות עדות חזותית לתבוסה חברתית בין-זכרית¹². פרוטוקולי תבוסה חברתית של נקבה-נקבה פותחו גם בזני מכרסמים שונים 14,15,16. למרות חששות מסוימים, נראה כי גורמי הלחץ החברתיים המשמשים בשני המודלים האחרונים רלוונטיים יותר מבחינה אטיולוגית להפרעות פסיכיאטריות אנושיות¹⁴. מודל דיכאון אידיאלי דורש תוקף קונסטרוקטיבי (אטיולוגי), כלומר השיטות מעוררות הלחץ המשמשות במודל חייבות לשקף מקרוב את הגורמים האמיתיים להפרעה.

מאמינים שהאטיולוגיה של הפרעות פסיכיאטריות היא רב-גורמית, המערבת גורמים ביולוגיים, גנטיים, סביבתיים ופסיכו-סוציאליים. מניפולציה של גורמי סיכון אלה בחיות מעבדה חיונית לפיתוח מודלים רלוונטיים למחקר מכניסטי וסינון תרופות. מודלים חברתיים ולא חברתיים של בעלי חיים המדמים גורם לחץ אחד או יותר יכולים לשכפל תסמיני ליבה ושינויים נוירוביולוגיים הקשורים להפרעות פסיכיאטריות אנושיות. לדוגמה, מודל הלחץ הקל הכרוני (CMS) גורם לפנוטיפים התנהגותיים נוירופתולוגיים ודמויי דיכאון יציבים ויעילים על ידי שילובים מתחלפים באופן אקראי של גורמי לחץ פיזיים מרובים (למשל, מצעים רטובים, מתלי זנב, הידוק זנב, צום)17,18,19,20,21,22,23. ממצאים אלה מצביעים על כך שמודלים חוזרים ונשנים של גורמי סיכון מרובים הם אסטרטגיה בת קיימא לבניית פרדיגמות לחקר הפרעות פסיכיאטריות. מודל לחץ תבוסה חברתית כרונית (CSDS) הוא אחת הפרדיגמות הנפוצות ביותר לדיכאון המדמה גורמי לחץ חברתיים 24,25,26. למרות שמודל זה מוגבל לחיקוי סוג אחד של גורם לחץ, הרלוונטיות האטיולוגית שלו הובילה להתקדמות משמעותית במחקר התרגומי. לדוגמה, מחקרים מבוססי CSDS זיהו תעלות אשלגן (K⁺) על נוירונים דופמינרגיים באזור הגחון כמטרות מפתח המתווכות עמידות לדיכאון, והדגישו פותחי תעלות K⁺ מסוג KCNQ - כגון רטיגבין (אזוגבין) - כמועמדים נוגדי דיכאון מבטיחים הן בעכברים דמויי דיכאון והן בחולים עם דיכאון 27,28,29,30,31. כתוצאה מכך, מספר מחקרים מכוננים ניסו לשנות את פרדיגמת CSDS כדי להדגים דיכאון נשי על ידי גרימת תוקפנות מכוונת נשית^11,12. הראיות לעיל תומכות ברעיון ששילוב גורמי לחץ חברתיים מרובים עם חשיפה חוזרת מייצג כיוון חשוב לפיתוח מודלים פסיכיאטריים בבעלי חיים נקבות.

בעכברי C57BL/6J נקבות, פותחה לאחרונה פרדיגמת מתח חברתי משולב מרובה (MISS) של 10 ימים כדי להדגים הפרעות פסיכיאטריות, והדגימה תוקף אטיולוגי, פנים, מבנה וחיזוי אמינים³². כדי לבסס את מודל ה-MISS, נקבות עכברי C57BL/6J נחשפו באופן אקראי מדי יום במשך 10 ימים רצופים לארבעה גורמי לחץ עוקבים: כישלון בתחרות חברתית (בדיקת צינורית), מתח תבוסה חברתית עקיפה שונה, מתח צפיפות בלתי נמנע ובידוד חברתי לאחר מכן³². מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט למידול פרדיגמת ה-MISS.

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית שוז'ו (אישור מס' 202207S127) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברים נקבות C57BL/6J (בני 7-8 שבועות לעכברי נבדק; בני 10-14 שבועות למועמדים לזכייה), עכברים זכרים C57BL/6J (בני 7-8 שבועות לבדיקת CD1 אגרסיבית) ועכברי מגדלים בדימוס CD1 ששימשו בניסויים אלה התקבלו ממקור מסחרי. כל העכברים שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם מזון ומים שסופקו עד גיל³³. מדידות התנהגותיות בסיסיות נלקחו - אם כי לא בהכרח עבור כל קבוצה - לפני תחילת פרדיגמת ה-MISS, כדי להבטיח שהתוצאות ההתנהגותיות הבאות מיוחסות לחשיפה ללחץ ולא לשונות אינדיבידואלית. סקירה כללית של הפרוטוקול המלא מוצגת באיור 1, ומערכי הניסוי שהושלמו מוצגים באיור 2. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. התרגלות

1. התרגלות לסביבה
   1. ייעד חדר נפרד אך ורק לפרוטוקול MISS, תוך שמירה על טמפרטורה קבועה (23 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס), לחות (50%-60%) ועוצמת אור (15-20 לוקס) במחזור אור-חושך של 12 שעות.
      הערה: אלא אם צוין אחרת, עכברי בית בחדר זה לאורך כל תקופת הדוגמנות.
   2. הכן כלובי עכבר סטנדרטיים (אורך × רוחב × גובה: 37 ס"מ × 16 ס"מ × 12 ס"מ) עם מכסי חוטי פלדה ומצעי קלחי תירס.
   3. השתמש בעכברים נקבות C57BL/6J בגילאי 7-8 שבועות כעכברים נבדקים. הקצו את העכברים באופן אקראי לקבוצות נאיביות ו-MISS, ושיכנו אותם בחמישה עכברים בכל כלוב.
      הערה: בחר עכברים נקבות עם גיל ומשקל גוף דומים לניסוי.
   4. השתמש בעכברים נקבות C57BL/6J בגילאי 10-14 שבועות כמועמדות לסינון מנצח³⁰. אכלס את העכברים הללו בקבוצות של ארבעה בכל כלוב כדי לבסס מעמדות חברתיים יציבים.
   5. השתמש בעכברי מגדל CD1 זכרים בדימוס כמועמדים תוקפניים. בית עכברי CD1 בנפרד כדי לבסס טריטוריאליות ולמנוע לחימה. השתמש בעכברים זכרים C57BL/6J שגודלו בקבוצה (5 עכברים בכלוב, בגילאי 7-8 שבועות) כפולשים לבדיקת CD1 אגרסיבית.
   6. אפשרו לכל העכברים להתרגל ולהתאושש מלחץ הובלה במשך 7 ימים לאחר הרכישה (איור 1A1).
   7. אכלס את כל העכברים עם מזון ומים זמינים אד ליביטום.
2. התרגלות לצינורות וטיפול
   1. הניחו צינור אקרילי קצר (איור 2A; אורך 10 ס"מ, קוטר פנימי של 26 מ"מ) בכל כלוב של עכברי נבדק ומועמדים מנצחים. אפשר לעכברים להתאקלם לצינורות וללמוד לעבור דרכם במשך 3 ימים.
      הערה: קוטר הצינור צריך להספיק בדיוק כדי לאפשר לעכבר בוגר אחד לעבור בצורה חלקה מבלי להסתובב.
   2. טפלו בעכברים נקבות ובמועמדים לזכייה במשך 1-2 דקות ביום במשך 3 ימים כדי להפחית את הסטרס שקשור לנסיינים לא מוכרים (איור 1A2).
   3. בתום תקופת ההתרגלות, סמנו את זנבו של כל עכבר בטוש אדום או שחור על בסיס שמן.
      הערה: בדוק את הסימונים באופן קבוע והחל מחדש במידת הצורך.

2. הכשרה לתחרות צינורות, סינון מנצחים וסינון תוקפן CD1

1. אימונים לתחרות צינורות
   הערה: לפרטים על הליך זה, עיין בדוחות קודמים ^32,34.
   1. הכינו עכברי נושא נקבות, מועמדות מנצחות, צינורות אקריליק שקופים (איור 2B; אורך 30 ס"מ, קוטר פנימי 26 מ"מ), מקלות פלסטיק, 75% אתנול ומגבות נייר. נקו את השולחן, הצינורות ומקלות הפלסטיק עם 75% אתנול כדי למנוע סימני ריח.
   2. אחוז בעדינות בזנב של כל עכבר נושא או מועמד מנצח והנח את העכבר על השולחן. אפשר לו לחקור בחופשיות במשך כדקה אחת לצורך התאקלמות סביבתית.
   3. החזק את העכבר בזנב והנח אותו בקצה אחד של הצינור.
      הערה: ודא שראש העכבר פונה לקצה הצינור, כאשר כפות רגליו הקדמיות נוגעות בשולחן, כדי למזער את הלחץ ולהקל על הכניסה.
   4. שחרר את הזנב ברגע שהעכבר נכנס לצינור ואפשר לו לעבור מרצון.
      הערה: השתמש במקל פלסטיק כדי לגעת בעדינות בזנב אם העכבר עוצר או מנסה לנסוע לאחור.
   5. הנח את העכבר בקצה הנגדי של הצינור וחזור על שלב 2.1.4. ספור את השלבים 2.1.3 - 2.1.5 כמחזור אחד.
   6. חזור על שלבים 2.1.3 ו-2.1.5 עבור שני מחזורים (איור 1B1).
   7. החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו. נקה את הצינור עם 75% אתנול כדי להסיר ריחות, שתן וצואה.
      הערה: ודא שהצינור נקי, יבש וללא שאריות ריח אלכוהול לפני השימוש עם העכבר הבא.
   8. חזור על שלבים 2.1.2-2.1.7 עבור כל העכברים הנקבות במשך 3 ימים רצופים, וודא שכל עכבר יתרגל לעבור דרך הצינור.
2. הקרנת הזוכים
   הערה: לפרטים על הליך זה, עיין בדוחות קודמים ^32,34.
   1. הכינו מועמדות מנצחות, צינורות (30 ס"מ אורך, 26 מ"מ קוטר פנימי), מקלות פלסטיק, 75% אתנול, מגבות נייר וטיימר. נקה וייבש את הציוד כדי למזער אותות ריח.
   2. לפני ההקרנה, אמן מחדש כל עכבר לעבור דרך הצינור למשך מחזור אחד. צייר קו אמצעי גלוי על הצינור.
   3. החזיקו את שני העכברים בזנבותיהם והניחו אותם בקצוות מנוגדים של הצינור. אפשרו להם להיכנס ולהיפגש בנקודת האמצע, ואז שחררו אותם בו זמנית והפעילו את הטיימר.
      הערה: השתמש בעכברים מאותו כלוב לכל תחרות.
   4. זהה את ה"מנצח" כעכבר שדוחף את השני החוצה מהצינור; להעניק לו נקודה אחת. ה"מפסיד" מקבל 0 נקודות.
      הערה: השתמש במקל פלסטיק כדי למנוע מהמנצח לסגת. אם שני העכברים קופאים ולא נסוגים תוך דקה אחת, גע בעדינות בזנב של כל עכבר עם מקלות פלסטיק כדי להניע פעולה.
   5. הפכו את עמדות ההתחלה של העכברים וחזרו על שלבים 2.2.3-2.2.4, והשיגו שוב את התוצאה (איור 1B2).
   6. החזירו את שני העכברים לכלוב הביתי שלהם ונקו את הצינור ביסודיות עם 75% אתנול.
   7. השתמש בתבנית סיבוב כדי להתאים כל עכבר לכל שאר חברי הכלוב, וחזור על שלבים 2.2.3-2.2.5 עבור כל זוג.
      הערה: גישה זו מבטיחה דירוג מקיף והוגן.
   8. דרג עכברים על סמך הציונים הכוללים. בחר את העכבר בעל הניקוד הגבוה ביותר בכל כלוב כ"מנצח" לניסויים הבאים.
3. סינון תוקפן CD1
   הערה: לפרטים על הליך זה, עיין בדוח הקודם³⁵.
   1. הכן עכברי מגדל CD1 בדימוס, עכברים זכרים C57BL/6J (פולשים) וטיימר.
   2. הנח עכבר זכר C57BL/6J ישירות לתוך כלוב הבית של זכר CD1 (תוקפן תושב) למשך 3 דקות.
      הערה: הפורץ לא יכול להימלט במהלך ההפעלה.
   3. רשום את ההשהיה להתקפה הראשונה, את מספר ההתקפות ואת משך ההתנהגויות האגרסיביות בפרק הזמן של 3 דקות כאינדיקטורים לאגרסיביות.
   4. חזרו על שלבים 2.3.2-2.3.3 פעם ביום במשך 3 ימים רצופים באמצעות עכברים פולשים שונים בכל יום (איור 1B3).
   5. בחר עכברי CD1 כתוקפנים לניסויים נוספים על סמך שני קריטריונים: (1) הם חייבים לתקוף לפחות בשניים מתוך שלושת המפגשים, ו-(2) חביון ההתקפה שלהם חייב להיות פחות מדקה אחת בכל מפגש.

3. דוגמנות

הערה: שלב זה כרוך בחשיפה אקראית לכישלון תחרות חברתית בבדיקת המבחנה, מתח תבוסה חברתית עקיפה ומתח צפיפות בלתי נמנע, ואחריו בידוד חברתי, במשך 10 ימים רצופים.

1. כישלון התחרות החברתית
   הערה: לפרטים, עיין בדוחות קודמים^32,34.
   1. הכינו עכברי נבדק, עכברים "מנצחים" מוקרנים, צינורות (30 ס"מ אורך, 26 מ"מ קוטר פנימי), מקלות פלסטיק, 75% אתנול, מגבות נייר וטיימר.
   2. לשכן מחדש עכברים נבדקים נקבות בנפרד (עכבר אחד לכל כלוב) ועכברים נאיביים בקבוצות (5 עכברים בכלוב).
      הערה: העבירו את העכברים התמימים לכלובים קבוצתיים חדשים בתחילת הדוגמנות. אין צורך במעבר לכלוב חדש במהלך תקופת הדוגמנות.
   3. נקו את השולחן, הצינורות ומקלות הפלסטיק עם 75% אתנול כדי למנוע סימני ריח.
   4. הסר בזהירות עכברים מכלובי הבית שלהם. מקם עכבר מיס ועכבר "מנצח" בקצוות מנוגדים של הצינור כך שהם ילכו קדימה ויפגשו בנקודת האמצע. עכבר ה-MISS יידחף החוצה מהצינור על ידי "המנצח".
      הערה: הגודל הגדול יותר, משקל הגוף הגבוה יותר והמעמד החברתי הדומיננטי של ה"מנצח" מבטיחים שעכבר ה-MISS הניסיוני כמעט תמיד יפסיד בתחרות הצינורות. אם העכברים נשארים ללא תנועה במשך יותר מ -30 שניות, גע בעדינות בזנב המנצח עם מקל פלסטיק כדי לעודד דחיפה.
   5. החלף את מיקומי שני העכברים וחזור על שלב 3.1.4. ספור את שלבים 3.1.4 ו- 3.1.5 כמחזור אחד.
   6. החזירו את העכברים ה"מנצחים" והעכברים "המנצחים" לכלובי הבית שלהם. נקה את השולחן, הצינור ומקל הפלסטיק כדי להסיר ריחות.
   7. הציגו עכבר מנצח חדש וחזרו על שלבים 3.1.4-3.1.5 עם אותו עכבר מיס. לכן כל עכבר MISS עובר שני מחזורים רצופים של תחרות שפופרת כושלת (איור 1C1, איור 2E).
   8. חזור על שלבים 3.1.4-3.1.7 עבור כל עכברי MISS במשך 10 ימים רצופים.
2. מתח תבוסה חברתית עקיפה שונה
   1. הכינו עכברי מגדלים אגרסיביים CD1 שיצאו לגמלאות (בבתים בודדים), עכברי C57BL/6J זכרים, עכברי MISS נקבות וכיסויים אקריליים מחוררים (איור 2C; אורך × רוחב × גובה: 8 ס"מ × 8 ס"מ × 5.5 ס"מ) עם חורים (5 × 5 בלוח העליון, 3 × 5 בדפנות; כל חור בקוטר 0.5 ס"מ).
   2. הנח עכבר מיס נקבה בתוך כלוב של תוקף CD1, כלוא מתחת לכיסוי אקרילי מחורר, כדי לאפשר התבוננות עקיפה באינטראקציות אגרסיביות.
      הערה: עקוב אחר הטיה פוטנציאלית של הכיסוי האקרילי על ידי עכבר CD1 או MISS. הפחתת מצעי קלחי התירס בכלובי CD1 מסייעת במניעת התהפכות.
   3. הכניסו לכלוב עכבר פולש זכר C57BL/6J כדי להיות מותקף פיזית על ידי עכבר CD1 למשך 10 דקות. נקבת עכבר ה-MISS צופה באינטראקציה דרך הכיסוי המחורר (איור 1C2, איור 2F).
      הערה: אם העכבר הפולש נפצע קשה, סיים מיד את ההפעלה וטפל בחיה. שימוש בכדורי קלחי תירס קטנים משפר את החוויה הסוחפת עבור עכבר MISS על ידי הגברת תזוזה של המצעים במהלך קרבות.
   4. לאחר 10 דקות, הסר את הפולש הזכר ואפשר לעכבר ה-MISS הנקבה 5 דקות נוספות של חשיפה חושית לעכבר CD1.
   5. חזור על שלבים 3.2.3-3.2.4 פעמיים נוספות עם פולשים זכרים שונים.
   6. החזר את עכבר ה-MISS לכלוב הביתי שלו. עקוב וטפל בכל פציעה אצל הפולשים הגברים.
   7. נקו את כיסויי האקריליק המחוררים וטאטאו את כל המצעים שנשפכו.
   8. חזור על שלבים 3.2.2-3.2.5 באמצעות מגדל CD1 חדש שפרש במשך 10 ימים רצופים.
3. לחץ צפיפות בלתי נמנע
   1. הכינו נקבות עכברי MISS, שרוול אטום לבן (איור 2D; אורך × רוחב × גובה: 14 ס"מ × 10 ס"מ × 20 ס"מ), כלובי עכבר סטנדרטיים עם מצעי קלחי תירס, 75% אתנול, מגבות נייר וטיימר.
   2. הניחו את השרוול האטום בתוך כלוב רגיל עם מצעים.
   3. הכניסו 12-15 עכברים נקבות (כל עכברי MISS או מעורבבים עם נקבות אחרות) לשרוול למשך 30 דקות ביום (איור 1C3, איור 2G).
      הערה: התאם את מספר העכברים בהתאם לגודלם כדי להבטיח צפיפות ללא דריסה. מנע בריחה על ידי כיסוי השרוול במכסה מחורר שקוף במידת הצורך.
   4. החזירו את העכברים לכלובים הביתיים שלהם ונקו את השרוול עם 75% אתנול.
   5. חזור על שלב 3.3.3 במשך 10 ימים רצופים.
4. בידוד חברתי
   1. הכינו עכברי MISS נקבות וכלובי עכברים סטנדרטיים עם מצעי קלחי תירס.
   2. עכברי MISS ביתיים בנפרד כשהם לא חווים כישלון בתחרות חברתית, לחץ תבוסה עקיפה או לחץ צפיפות, למשך שארית תקופת המידול של 10 ימים (איור 1C4, איור 2H).
      הערה: עכברים נאיביים מועברים בעדינות על ידי הזנב לכלוב זמני, ואז מוחזרים לכלוב הביתי שלהם ללא כל חשיפה ללחץ. ספקו מזון ומים אד ליביטום, כמו עם עכברי מיס.

4. מבחני התנהגות

הערה: ניסויים התנהגותיים נערכים תוך שבוע לאחר המודלים כדי להעריך התנהגויות דמויות דיכאון וחרדה בעכברים. לפני כל בדיקה, עכברים נקבות מועברות לחדר הבדיקות ההתנהגותיות (תאורת 15-20 לוקס) למשך שעה אחת של התרגלות. לאחר כל בדיקה, העכברים מוחזרים למתקן הדיור המקורי שלהם.

1. מבחן העדפת סוכרוז
   הערה: לפרטים, עיין בדוחות קודמים 36,37,38.
   1. הכינו עכברי נבדק, בקבוקי שתייה (50 מ"ל) עם צינורות כדוריים, כלובי עכבר סטנדרטיים עם צמרות חוטי פלדה, סוכרוז, משקל אלקטרוני, גליל מדורג, מוט ערבוב, נייר שקילה, מים, מחברת ועט.
   2. אכלס את כל העכברים הנבדקים (עכברים נאיביים ומיס עכברים) בנפרד.
   3. מלאו את הבקבוקים במי שתייה (~2/3 מהנפח).
      הערה: ודא שאין דליפה מהבקבוקים לפני תחילת הניסוי.
   4. ספק לכל עכבר שני בקבוקים מלאים במים המונחים זה לצד זה למשך יומיים של התרגלות.
   5. הכינו 1% מי סוכרוז (1 גרם סוכרוז לכל 99 מ"ל מים).
   6. בתחילת הבדיקה יש להחליף את המים בבקבוק אחד בתמיסת סוכרוז 1%. רשום את המשקלים הראשוניים של שני הבקבוקים.
   7. לאחר 12 שעות, רשום שוב את משקולות הבקבוק והחלף את מיקומי הבקבוקים כדי למנוע הטיית מיקום.
   8. לאחר 24 שעות, רשום את המשקולות הסופיות וחשב את העדפת הסוכרוז כ: העדפת סוכרוז (%) = (צריכת סוכרוז / צריכת נוזלים כוללת) × 100
   9. בסיום הבדיקה מחזירים את העכברים לכלובים הביתיים שלהם עם בקבוקי מים רגילים.
   10. נקו היטב את כל הבקבוקים והצינורות הכדוריים במים.
2. מבחן מתלי זנב
   הערה: בדיקה^{זו 32} עשויה להתבצע על אותה קבוצה או קבוצה נפרדת של עכברים בהתאם לתכנון הניסוי. במחקר זה הוא בוצע 3 ימים לאחר בדיקת העדפת הסוכרוז.
   1. הכינו עכברי נבדק, קופסת בדיקה לתליית זנב (גובה 55 ס"מ × רוחב 60 ס"מ × עומק 12 ס"מ), סרט דבק, שעון עצר, 75% אלכוהול ומגבות נייר.
   2. הגדר את מערכת מעקב הווידאו³⁹. הגדר אזור פעיל והתחל הקלטה.
   3. נקה את קופסת הבדיקה עם 75% אתנול.
   4. הדביקו בעדינות את העכבר ~2 ס"מ מקצה הזנב ותלו אותו הפוך, וודאו שראשו נמצא ~25 ס"מ מתחתית הקופסה.
      הערה: צמצם את הנדנדה והימנע ממתח מיותר.
   5. הקלט התנהגות באמצעות תוכנת המעקב³⁵ 6 דקות. השתמש בזמן חוסר תנועה מ-4 הדקות האחרונות לניתוח.
      הערה: חוסר תנועה מוגדר כהיעדר תנועה כשהגוף תלוי באופן פסיבי. אל תכלול נתונים אם העכבר נופל או מטפס למעלה.
   6. נתק בזהירות את הקלטת והחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלו.
3. מבחן שדה פתוח
   הערה: לפרטים, עיין בדוחות קודמים^40,41.
   1. הכינו עכברי נבדק, קופסת בדיקה בשדה פתוח (40 ס"מ × 40 ס"מ × 40 ס"מ), 75% אתנול ומגבות נייר.
   2. הגדר את מערכת מעקב הווידאו. חלקו למעשה את הזירה ל-4 ×-4 תת-אזורים; הגדר את 4 היחידות המרכזיות כאזור המרכזי, ואת השאר כאזור ההיקפי.
   3. נקה את קופסת הבדיקה עם 75% אתנול.
   4. הנח את עכבר הנושא בעדינות במרכז הקופסה, כשראשו פונה לאותו כיוון. אפשר לו לחקור במשך 5 דקות.
      הערה: השתמש במשטח להעברה כדי להפחית את לחץ הטיפול.
   5. רשום את המרחק הכולל שנסעת והזמן שבילה באזור המרכזי באמצעות מערכת מעקב הווידאו.
   6. בסיום הבדיקה יש להחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלו ולנקות את המכשיר.
4. מבחן מבוך מוגבה פלוס
   הערה: לפרטים, עיין בדוח הקודם³².
   1. הכינו עכברי נושא נקבות, מבוך פלוס מוגבה, 75% אתנול ומגבות נייר.
      הערה: המבוך מורכב משני מסלולי המראה ניצבים (50 ס"מ מעל הרצפה), כל אחד עם שתי זרועות (30 ס"מ אורך × 5 ס"מ רוחב). סט אחד כולל קירות בגובה 15 ס"מ (זרועות סגורות), ואילו הסט השני פתוח. השטח המרכזי הוא 5 ס"מ × 5 ס"מ.
   2. הגדר את מערכת מעקב הווידאו והגדר את הזרועות הפתוחות, הזרועות הסגורות והאזור המרכזי.
   3. נקו את המבוך עם 75% אתנול.
   4. הנח בעדינות את העכבר במרכז המבוך, מול זרוע פתוחה. אפשר חקירה חופשית למשך 5 דקות.
      הערה: השתמש במזרן כדי למזער את הלחץ במהלך המיקום.
   5. רשום את זמן השהות בכל זרוע באמצעות מערכת המעקב.
      הערה: אם עכבר נופל מהמבוך, אל תכלול את הנתונים שלו.
   6. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו ונקו את המבוך ביסודיות.

כדי לחקור אם חשיפה ל-MISS גורמת לשינויים התנהגותיים דמויי דיכאון, עכברי C57BL/6J נקבות (n = 16 לקבוצה; גודל המדגם נקבע באמצעות ניתוח כוח, ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2) שנחשפו לפרדיגמת MISS הוערכו באמצעות מבחני העדפת סוכרוז ותרחיף זנב, המעריכים תסמיני ליבה של דיכאון-אנהדוניה וייאוש התנהגותי, בהתאמה (איור 3A-F). בהשוואה לעכברי ביקורת נאיביים, עכברים שנחשפו ל-MISS הראו ירידה משמעותית בהעדפת סוכרוז, ללא שינוי מקביל בצריכת המים (איור 3C-D). נוסף על כך, עכברים בקבוצת ה-MISS הראו זמן קיפאון מוגבר במבחן השעיית הזנב (איור 3F), מה שמצביע על ייאוש התנהגותי מוגבר.

כדי להעריך אם חשיפה ל-MISS מובילה גם להתנהגויות דמויות חרדה, עכברים נבדקו בשדה הפתוח והעלו פרדיגמות מבוך פלוס. עכברים שנחשפו ל-MISS בילו פחות זמן באופן משמעותי באזור המרכזי של השדה הפתוח (איור 4A-C) ובזרועות הפתוחות של מבוך הפלוס המוגבה (איור 4D,E) בהשוואה לבקרות נאיביות.

באופן קולקטיבי, ממצאים אלה מראים כי חשיפה לפרדיגמת MISS גורמת להתנהגויות דמויות דיכאון וחרדה אצל עכברים נקבות.

איור 1: דיאגרמה סכמטית של מודל MISS. (A) התרגלות: עכברי ניסוי התאוששו מלחץ הובלה במשך 7 ימים, ולאחר מכן הרגלה וטיפול בצינור במשך 3 ימים. (B) אימון וסינון: (B1) עכברי אימון בצינור אומנו לעבור דרך הצינורית, 2 מחזורים ביום במשך 3 ימים רצופים. (ב2) סכמטי של הליך סינון המנצח. (ב3) סכמטי של הליך סינון מגדל בדימוס CD1 אגרסיבי. (C) שלב המידול המורכב מחשיפה אקראית לשלושה גורמי לחץ ואחריו בידוד חברתי במשך 10 ימים רצופים: (C1) כישלון בתחרות הצינורות. (ג2) לחץ תבוסה חברתית עקיפה. (ג3) לחץ צפיפות בלתי נמנע. (ג4) בידוד חברתי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מערך ניסיוני עבור פרדיגמת MISS. (A) שפופרת אקרילית באורך 10 ס"מ (קוטר פנימי: 26 מ"מ) המשמשת להרגלה. (B) צינור אקרילי באורך 30 ס"מ (קוטר פנימי: 26 מ"מ) המשמש לתחרות צינורות. (C) כיסוי מחורר (אורך × רוחב × גובה: 8 × 8 × 5.5 ס"מ) ללחץ תבוסה חברתית עקיפה. (D) השרוול האקרילי המשמש ללחץ צפיפות. (ה) תמונה מייצגת של הליך תחרות הצינורות. (F) תצלום של מערך מתח של תבוסה חברתית עקיפה. (G) מבט מלמעלה למטה על מערך מתח הצפיפות. (H) תצלום של עכבר שנמצא בבידוד חברתי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: חשיפה ל-MISS גרמה להתנהגויות דמויות דיכאון בעכברי C57BL/6J נקבות. (A) ציר הזמן של הניסוי. (ב) סכמטי של מבחן העדפת הסוכרוז. (ג) העדפת סוכרוז בנאיביות לעומת עכברים שנחשפו ל-MISS (מבחן t של סטודנט לא מזווג, t30 = 3.108, **P < 0.01; n = 16 עכברים לקבוצה). (D) צריכת נוזלים כוללת במבחן העדפת הסוכרוז (מבחן t של סטודנט לא מזווג, t30 = 0.8669, P > 0.05; n = 16 עכברים לקבוצה). (ה) סכמטי של מבחן מתלי הזנב. (F) זמן חוסר תנועה במבחן השעיית הזנב (מבחן t של סטודנט לא מזווג, t30 = 2.589, *P < 0.05; n = 16 עכברים לקבוצה). קווי שגיאה מייצגים SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: חשיפה ל-MISS גרמה להתנהגויות דמויות חרדה בעכברי C57BL/6J נקבות. (A) מסלולי פעילות מייצגים של עכברים נאיביים וחשופים ל-MISS במבחן השדה הפתוח. (B) זמן שהייה באזור המרכזי (מבחן t של סטודנט לא מזווג, t30 = 2.365, *P < 0.05; n = 16 עכברים לקבוצה). (C) סך כל המרחק שעבר (מבחן t של סטודנט לא מזווג, t30 = 1.467, P > 0.05; n = 16 עכברים לקבוצה). (D) מסלולים מייצגים במבחן המבוך המוגבה פלוס. (E) זמן שהייה בזרועות פתוחות (מבחן t של סטודנט לא מזווג, t30 = 2.786, **P < 0.01; n = 16 עכברים לקבוצה). קווי שגיאה מייצגים SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: נורמליות והומוגניות של מבחני שונות למבחן העדפת סוכרוז. תוצאות מבחן שפירו-וילק (טבלה א') ומבחן לוין (טבלה ב'), שבוצעו באמצעות SPSS, אישרו כי הנתונים עמדו בהנחות הנדרשות למבחן ה-t של הסטודנט הלא מזווג. התוצאות מצביעות על כך שהנתונים הופצו באופן נורמלי והפגינו הומוגניות של שונות, מה שמאמת את השימוש בבדיקות פרמטריות. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: הערכת גודל המדגם למבחן העדפת הסוכרוז. (A) גודל המדגם חושב באמצעות מחשבון גודל מדגם מקוון (https://www.trialstats.com/statbox/index.htm/samplesize/estimation?sid=4). (B) בהתבסס על נתונים ניסיוניים, מינימום של 15 עכברים לקבוצה הוערך כבעל עוצמה סטטיסטית מספקת. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.