מאמר שיטה

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

DOI:

10.3791/67120

⸱

2 במאי 2025

 ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שכפול הגנום מתואם על ידי חלבוני רפליזום, כולל הליקאזים, שמפרקים DNA דו-גדילי לגדילים בודדים אנטי-מקביליים, שכל אחד מהם דורש מצבי שכפול שונים: רציף (מוביל) ולא רציף (מפגרים). הבנת האינטראקציות בין חלבונים הקשורים לכרומטין עם גדילי DNA משכפלים ב-vivo היא קריטית להבהרת מנגנוני הרכבת הכרומטין ותיקון ה-DNA בשילוב עם שכפול DNA. פרוטוקול זה מציג את שיטת ההעשרה והריצוף של DNA נולד מקושר לחלבון (eSPAN), שנועדה לכמת את רמות החלבון היחסיות על גדילי DNA מובילים ומאחרים במזלגות שכפול. הליך eSPAN מתחיל באימונופרציפיטציה של כרומטין (ChIP, בשמרים) או בפיצול תחת מטרות ותיוג (CUT&Tag; בתאי יונקים) של חלבון מעניין, ואחריו העשרת ה-DNA המתפתח הקשור לחלבון באמצעות אימונופרציפיטציה של ברומודוקסיאורידין (BrdU). רצף מהדור הבא הספציפי לגדיל מיושם על ssDNA מבודד. טכניקה זו יכולה לשמש לקביעת האם חלבון מועשר במזלגות שכפול מובילים או מאחרים. ה-eSPAN מספק העדפת גדילים רחבי הגנום של חלבונים הקשורים לכרומטין, כולל היסטונים במזלגות שכפול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באורגניזמים אאוקריוטיים, שכפול הגנום מתחיל ממספר אתרים הנקראים מקורות שכפול, שבהם קומפלקס זיהוי המקור (ORC) נקשר ומפעיל את מנגנון החלבון לגיוס, כולל הליקאז CMG, כדי להתחיל שכפול DNA1. מנגנון הרפליזום בכל מוצא שכפול יוצר שני מזלגי שכפול הנעים דו-כיווני 2,3. מזלגות השכפול התאומים משכפלים את שני גדילי ה-DNA ההורים באמצעות סינתזה רציפה של הגדיל המוביל וסינתזה לא רציפה של הגדיל המפגיר. בהינתן האופי הא-סימטרי הזה של כל מזלג שכפול, רכיבי השכפול, כולל פולימראזות ה-DNA על הגדילים המובילים והאחרונים, שונים. ניתוחים גנטיים קודמים שהתבססו על פולימראזות DNA מוטנטיות מראה כי DNA Pol ε ו-DNA Pol δ הם הפולימראזים העיקריים האחראים לשכפול גדלים מובילים ומפגרים, בהתאמה 4,5. פותחו מספר שיטות לזיהוי העדפת גדילי ה-DNA, כולל Pu-seq 6,7, HydEn-seq8, ו-emRiboSeq או RiboSeq 9,10. שיטות גנטיות אלו לניתוח ספציפיות הגדיל מוגבלות לפולימראזות DNA ודורשות הכנסת מוטציות לכל חלבון 4,5,11,12. מעקב אחר הקשר של כל חלבון מטרה עם חוטים מובילים ומאחרים של מזלגי שכפול DNA יספק תובנות חשובות לגבי שכפול DNA. במאמץ זה, פיתחנו תחילה את טכניקת eSPAN (העשרה וריצוף של DNA מתהום שקשור לחלבון, איור 1) בתאי שמרים. כמחקר הוכחת עיקרון, הראינו תחילה כי Pol δ ו-Pol δ מועשרים על חוטים מובילים ומפגרים, בהתאמה. כמו כן, גילינו את העדפת הגדיל של רכיבי שכפול DNA מרכזיים, כולל הליקאז DNA משכפל, חלבון קישור DNA חד-גדילי (חלבון שכפול A), ומנורת PCNA של אנטיגן גרעיני מתפשט (PCNA) ופקטור השכפול של הטוען C (RFC)13. חשוב לציין שאנחנו ואחרים השתמשנו בשיטה זו כדי לחשוף מנגנונים של העברת היסטונים הורית, תהליך שהיה בלתי פתיר במשך למעלה מארבעה עשורים14, 15, 16, 17.

שיטת eSPAN כוללת שני שלבים עוקבים: העשרת חלבון המטרה באמצעות ChIP18 או CUT&Tag19 והעשרת ה-DNA המתהווה הקשור לחלבון באמצעות אימונופרציפיטציה של BrdU. בזן שמרים סטנדרטי (W303 או S288C), BrdU או EdU חוץ-תאיים אינם יכולים להיכנס לתאים ולהשתלב בכרומוזומים. זנים אלה חסרים נשא נוקלאוזידים מתאים לספיגת תימידין וכן את התימידין קינאז הנדרש לזרחון תימידין ל-TMP, שממיר את BrdU (או EdU) ל-BrdUMP (EdUMP). ביטוי של נשא נוקלאוזידים מאוזן אנושי 1 (hENT1) ושל וירוס הרפס סימפלקס תימידין קינאז (HSV-TK) מגביר את קליטת התימידין ואת המרת BrdU (או EdU) ל-BrdUMP (EdUMP)20. לכן, כדי לבצע את ניסוי eSPAN בשמרים, היה צורך להכניס את הזנים עם מבנה משולב BrdU (BrdU-Inc) (HSV-TK ו-hENT1)13,21.

בעבר, סיפקנו את פרוטוקול eSPAN לחלבוני שכפול DNA בשמרים22. לאחרונה שילבנו את שיטת CUT&Tag בפרוטוקול eSPAN בתאים יונקים כדי להתמודד עם שלבים טכניים מאתגרים שדורשים אופטימיזציה, כגון קישור צולב, גזירה של כרומטין, ומזעור מספר התאים ההתחלתייםשל 17,23. כאן סיפקנו היסטון eSPAN לוויזואליזציה באמצעות תאי שמרים (איור 2). שיטה זו משמשת בעיקר לניתוח התפלגות של צורות היסטונים מותאמות על גדילי DNA משכפלים. בעוד שבדקנו כמה סימני היסטון, השתמשנו ב-H3K4me3, סימן על ההיסטון ההורי H3, כדוגמה. כדי לנתח רכיבים וגורמים של רפלסום המעורבים בתיקון DNA במזלגות שכפול, אנו ממליצים לחתוך כרומטין לקטעים קטנים באמצעות סוניקציה כפי שתואר בפרסום הראשון שלנו22. עבור תאי יונקים, אימצנו את נהלי Cut&Tag המותאמים כדי להחליף את שלב ChIP שתואר בשמרים23. שינוי זה מפחית את כמות החומר ההתחלתי (תאים) והכי חשוב, מאפשר יצירת ספריות eSPAN לריצוף ללא שימוש בערכות הכנת DNA חד-גדיליות. לגבי פרוטוקול השמרים, בחרנו לא להשתמש בשיטת Cut&Tag כי כמות החומר ההתחלתי הייתה מספיקה. חשוב יותר, גילינו שהליכי Cut&Tag לא היו יעילים באופן עקבי עבור תאי שמרים בידינו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: להנחיות להכנת בופר ותגובה, ראו הנחיות להכנת מאגר ותגובות (קובץ משלים 1).

1. היסטון eSPAN בשמרים נבטיחים

הערה: רוב זני השמרים חסרים נשא נוקלאוזיד פונקציונלי לספיגת תימידין. כדי לתייג DNA ביעילות עם BrdU או EdU עבור eSPAN, נדרש זן21 חיובי לתימידין קינאז (TK+). בנוסף, רק זני שמרים מסוג 'A' יכולים לשמש לעצירת מחזור תאים באמצעות גורם אלפא.

  1. סנכרון תאי שמרים וסימון BrdU (8 שעות)
    1. החסן מושבה אחת של זן שמרים מתאים (TK+) לתוך 10 מ"ל מדיום YPD וגדל בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס על דוגמה מנערת לילה במהירות 220 סל"ד.
    2. מדוד את הצפיפות האופטית, OD600 ננומטר, עם ספקטרופוטומטר ודילל את התרבית ל-200 מ"ל מדיום YPD טרי עם OD600 ~0.2-0.3.
    3. מגדלים את התרבית עד OD600 ~0.4-0.5 (בדרך כלל לוקח 3-4 שעות) בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-220 סל"ד.
    4. הוסף 300 מיקרוליטר של גורם α (5 מ"ג/מ"ל) ותרבות ל-1.5 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד.
    5. הוסף מנה נוספת של 300 מיקרוליטר של α פקטור (5 מ"ג/מ"ל) וגדל עוד 1.5 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד.
    6. הכינו את תמיסת הקיבוע של 37.5% פאראפורמלדהיד וחממו את המדיום (200 מ"ל YPD + HU (הידרוקסיוראה)+ BrdU) ל-30°C במהלך סנכרון התא.
      זהירות: טפל ב-BrdU בזהירות כי הוא פוטנציאלי למוטגן וטרטוגן. הכינו תמיסה של 37.5% פאראפורמלדהיד במכסה אדים כימי כדי להימנע מחשיפה לאדים מזיקים, שכן פאראפורמלדהיד הוא פוטנציאלית כמסרטן.
    7. בדוק את המורפולוגיה של התאים (בצורת מוט) עם מיקרוסקופ אור כדי לוודא שלפחות 90% מתאי השמרים נמצאים בשלב G1 1 15 דקות לפני עצירה של 3 שעות G1. חלופה נוספת היא לבצע ניתוח מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לאשר את עיצור G124.
      הערה: בדוק את מורפולוגיית התאים ואשר את עצר G1 (90% עם צורת מוט) בשלב זה.
    8. אספו את התאים (כדור) בצנטריפוגציה ב-1600 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ושוטפים את כדור התא פעמיים עם 20 מ"ל מים מזוקקים כפולים קרים.
    9. החזירו את התאים ל-200 מ"ל של YPD + HU+ BrdU מחוממים מראש (30 מעלות צלזיוס).
      הערה: מטרת שחרור HU היא להבטיח שרוב תאי השמרים נמצאים בשלב S של שכפול מוקדם, מה שישפר את העקביות ויבטיח שחזוריות התוצאות. השמטת HU מקובלת אם נדרש עבודה עם תאי לוגריתם.
    10. תרבית התאים על אינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד למשך 45 דקות.
      הערה: ניתן לבצע ניתוח FACS כדי לאשר את שלב ה-S המוקדם. לניתוח FACS חשוב לכלול דגימת לוגית-פאזה כבקרה כדי להגדיר במדויק את אוכלוסיית תאי G1. לשילוב יעיל של BrdU, מומלץ להתחיל עם תאים שגדלים במהירות. חלק מהמוטנטים עם פגמים בגדילה איטית נוטים להראות יעילות סימון BrdU ירודה. היעילות של שילוב BrdU וביצועי BrdU-IP מוערכות באמצעות PCR כמותי על ידי השוואת אזורים משוכפלים ולא משוכפלים22 באמצעות DNA מבודד משלב 1.6.7.
  2. קיבוע ואיסוף דגימות (1 שעה)
    1. הוסיפו 6 מ"ל של 37% פאראפורמלדהיד טרי לריכוז סופי של 1%, ערבבו היטב, ודגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם ניעור עדין, 90 סל"ד.
    2. הרווה את הקיבוע על ידי הוספת 12 מ"ל של 2.5 מיליון גליצין, ערבב היטב, ודוגר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם ניעור עדין, 90 סל"ד.
    3. הפלטה את התאים ב-1600 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, שטוף את התאים פעמיים עם 20 מ"ל מים קרים על ידי סיבוב ב-1600 גרם למשך 5 דקות.
    4. אסוף את התאים בצינורות מכסה בורג בקוטר 2 מ"ל (50 מ"ל תאים/צינור) ואחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: תאים יכולים להישמר עד שנה (נקודת הפסקה).
  3. פירוק תאי שמרים ופיצול כרומטין (5 שעות)
    1. הפשיר את כדורי התאים, השהה מחדש באמצעות מערבולת עדינה, ושוטף עם 0.4 מ"ל של בופר ChIP ליזיס עם מעכבי פרוטאז ותערובת אנטיביוטיקה (מונעת צמיחת חיידקים מזהמים) וסובב ב-5,000 גרם למשך דקה.
    2. הוסף 0.1 מ"ל של בופר ניתוק ChIP המכיל מעכבי פרוטאז ותערובת אנטיביוטיקה, ואחר כך כ-100 מיקרוליטר של חרוזי זכוכית (0.5 מ"מ).
    3. ליז על ידי חרוזים לקצב במשך 3 מחזורים (30 שניות הפעלה/כיבוי, דקה אחת הפסקה) בחדר קר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. חורים בתחתית הצינור עם מחט חמה של 16 G.
      הערה: כדי לשמור על המחט החמה, נסה לשמור את הצינור קרוב לאש.
    5. אסוף את הליזאט על ידי קינון הצינור לתוך צינור DNA ריק בנפח 1.5 מ"ל ובצנטריפוגה ב-1600 גרם למשך 2 דקות, RT.
    6. שאפו את הסופרנטנט בזהירות מבלי להפריע לכדור (הכרומטין יהיה בחלק הפסולת של התא).
      זהירות: היזהרו לא לשאוף בטעות את כדור התא בעת השימוש בוואקום.
    7. החזירו את כדורי התא על ידי פיפטינג ב-0.35 מ"ל של MNase Didigtion Buffer בתוספת 0.5 mM spermidine ו-0.1 mM 2-מרקפטואנול.
    8. הוסף 10 יחידות MNase לתגובות, ערבב בעדינות על ידי הפיכת 4-6 פעמים מיד, ודגר באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: תנאי העיכול צריכים להיות מותאמים לכל אצווה של אנזים MNase כדי להעשיר עבור חלקי מונו-, די-או טרי-נוקלאוזומים.
    9. כיבוי עיכול MNase על ידי הוספת 5 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA לריכוז סופי של 10 mM EDTA. מערבבים אותם בעדינות באמצעות היפוך ושמרו את הצינורות מיד בקרח לפחות 30 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה בשלב זה. תנאי העיכול של MNase צריכים להיות מותאמים כך שיקבלו את רוב חלקי המונו-נוקלאוזום (140-450 bp)
    10. סוניקציה של תערובת התגובה עם מיקרוצינורות ביורופטור (1.5 מ"ל) למשך 3 דקות (הספק גבוה, 30 שניות הדלקה/כיבוי). סובב ב-10,000 גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: סוניקציה קצרה זו מסייעת לשחרר את הכרומטין לתוך הבופר.
    11. העבר את הסופרנטנט לצינורות חדשים וסובב עוד 10 דקות בטמפרטורה של 10,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
    12. אספו סופרנטנט (כ-400 מיקרוליטר), שמרו 30 מיקרוליטר מהדגימה כ-DNA קלט, והקפאו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. השתמשו בליזאט התא שנותר (~370 מיקרוליטר) באימונופרציפיטציה הבאה של כרומטין (שלב 1.4.1).
  4. אימונופרציפיטציה של כרומטין היסטון (לילה)
    1. הוסף 0.5 מיקרוגרם נוגדן H3K4me3 לליזאט ולנוטאט על הרוטור, 10 סל"ד בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה.
      הערה: כאן, H3K4me3 משמש כדוגמה. כמות הנוגדנים צריכה להיבדק בניסוייה.
    2. סובב ב-15,800 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והעבר את הסופרנטנט לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    3. הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזי חלבון G ספרוז שטופים מראש (3 פעמים שנשטפו עם בופר ליזיס ChIP, נוטט על הרוטור למשך 3 דקות כל אחד, אסף חרוזים בצנטריפוגציה ב-350 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס) ודוגר ב-4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    4. סובב ב-350 × גרם ב-RT, ושוטף חרוזים לפי הסדר הבא.
      1. שטוף פעמיים עם 1 מ"ל של בופר ליזיס קרח למשך 3 דקות בכל פעם על ידי סיבוב ב-10 סל"ד על רוטטור ב-RT.
      2. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל בופר קר קר עם בופר NaCl של 0.5 מטר למשך 3 דקות בסיבוב ב-10 סל"ד על רוטטור ב-RT.
      3. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של בופר שטיפה קר של Tris/LiCl למשך 3 דקות בסיבוב ב-10 סל"ד על רוטטור ב-RT.
      4. שטוף אחד עם 1 מ"ל של בופר שטיפה RT Tris/EDTA (לא בופר TE, קובץ משלים 1 למתכון). להוציא את כל הנוזל האפשרי מהפלט עם מחט של 16 גרם וחצי.
  5. חילוץ DNA (2 שעות)
    1. הוסף 0.1 מ"ל של שרף כילטינג 10% מעורבב היטב לצורך הפקת DNA לחרוזים השטופים (משלב 1.4.4.4), דגימת קלט (משלב 1.3.12), ולמערבולת.
    2. להרתיח 10 דקות על בלוק חום של 100 מעלות צלזיוס, ואז לקרר ל-RT כדי להיריב קרוס-לינק.
      הערה: מומלץ בחום להשתמש בקליפסים לנעילה עם סטופ-פופ לצינורות צנטריפוגה לשמירה על אטם הסגירה.
    3. הוסיפו 5 מיקרוליטר של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאז K לחרוזים ודגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך ניעור ב-400 סל"ד.
    4. הרתיחו את החרוזים על בלוק חום של 100 מעלות צלזיוס למשך עוד 10 דקות כדי לנטרל את פעילות הפרוטאז K.
      הערה: מומלץ בחום להשתמש בקליפסים לנעילה עם סטופ-פופ לצינורות צנטריפוגה לשמירה על אטם הסגירה.
    5. סובב את החרוזים ב-6000 גרם למשך 2 דקות ב-RT, ותשמור את הסופרנטנט.
    6. הוסף 100 מיקרוליטר של 2XTE לכדור. Vortex ו-Spin down ב-6000 גרם למשך 2 דקות ב-RT.
    7. ערבבו ושמרו את הסופרנטנטים (מהשלבים 1.5.5 ו-1.5.6) שנלקחו לעיל (כ-180 מיקרוליטר).
    8. טיהור דגימות של 30 מיקרוליטר ל-18 מיקרוליטר של בופר שחרור (EB, מסופק עם ערכת טיהור PCR) באמצעות עמודות טיהור DNA להכנת ספריית ssDNA (משלב 1.3.12 כקלט ושלב 1.5.7 כדגימות H3K4me3 ChIP-seq).
      הערה: ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך עד חודש (נקודת הפסקה).
  6. אימונופרציפיטציה של BrdU (5 שעות)
    1. רתחו דגימות (כ-150 מיקרוליטר קלט ו-H3K4me3 ChIP משלב 1.5.7) במשך 5 דקות על בלוק חום של 100 מעלות צלזיוס, ומיד מקררים בקרח למשך 5 דקות. הוסף 15 מיקרוליטר של 10x PBS ו-+1.35 מ"ל של בופר IP של BrdU + 0.5 מיקרוליטר אנטי-BrdU Ab + 1 מיקרוליטר tRNA של E.coli (10 mg/mL).
      הערה: זהו שלב קריטי. השתמשו בצנטריפוגות עם חיבור נמוך ל-DNA כדי להימנע מקשירות DNA לא ספציפיות.
    2. נוט ל-2 שעות על רוטור בטמפרטורה של 4°C ב-10 סל"ד.
    3. העבר את התערובת לצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 20 מיקרוליטר של חרוזי חלבון G Sepharose (שוטפים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של בופר IP של BrdU וסובב במשך 3 דקות כל אחד ב-10 סל"ד לכל שטיפה ב-RT) והפך את התערובת למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס על הרוטור ב-10 סל"ד.
    4. סובב ב-800 × גרם למשך דקה אחת ב-RT ושוטף לפי הדברים הבאים: שלוש פעמים עם 1 מ"ל של בופר IP קר של BrdU, 3 דקות על רוטור, ופעם אחת עם 1 מ"ל בופר TE למשך 3 דקות.
    5. סובב ב-800 × גרם למשך דקה אחת ב-RT ושאוף את הסופרנאנט.
    6. הוסף 100 × מיקרוליטר של TE + 1% בופר SDS לשאר החרוזים. דגר בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. סובב ב-800 × גרם למשך דקה אחת ב-RT.
    7. טיהר את הסופרנטנט ל-18 מיקרוליטר EB באמצעות עמודות טיהור DNA (דגימת BrdU IP ו-H3K4me3 eSPAN).
      הערה: השתמשו בצינורות הצנטריפוגות עם קישור נמוך כדי להימנע מקישור DNA לא ספציפי. ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך עד חודש (נקודת הפסקה).
  7. הכנת וריצוף ספריית ssDNA (3 שעות)
    1. הכינו את ספריות ה-DNA החד-גדיליות עם 15 מיקרוליטר של קלט מטוהר, BrdU IP, H3K4me3 ChIP ודגימות eSPAN (שלבים 1.5.8 ו-1.6.7) (כולל שלבי האדפטאז, ההרחבה והקשירה) בהתאם למדריכים שמספקים ssDNA וערכת הכנה לספריית DNA בעלות קלט נמוך, וטיהרו את מוצר הליגציה שהושג ל-20 מיקרוליטר של בופר שחרור EDTA נמוך (מסופק על ידי DNA Library Prep Kit).
      הערה: ישנם שני שלבי טיהור קשירה בערכה. פרוטוקול זה פועל לפי הליך של 200 בסיסים ו-<1 ננוגרם.
    2. הגברת ספריית ה-DNA באמצעות תערובת תגובה כוללת של 50 מיקרוליטר (חומרים מסופקים על ידי ערכת ההכנה של ספריית ssDNA): 20 מיקרוליטר של ספריית DNA מטוהר, 4 מיקרוליטר של תגובת W2, 10 מיקרוליטר של מגיב W3, 1 מיקרוליטר של אנזים W4, 1.5 מיקרוליטר של פריימרים של אינדקסים I7 (10 מיקרומואל, ראו רצף אוליגו משלים) ו-1.5 מיקרוליטר של אינדקסים של פריימר I5 (10 מיקרומטר, ראו רצף אוליגו משלים), 16 מיקרוליטר ddH ללא DNase2O. חממו את תערובת ה-PCR ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, לאחר מכן 18 מחזורים של 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-60 מעלות צלזיוס, ודקה אחת ב-68 מעלות צלזיוס, ומחזור אחד של 10 דקות בטמפרטורה של 68 מעלות צלזיוס.
      הערה: כל ספרייה צריכה להשתמש בשילוב ייחודי של פריימרים i7 ו-i5. מספר מחזורי ההגברה צריך להיות מותאם לפי כמות הספרייה כדי למנוע הגברה יתר, שעלולה לגרום לארטיפקטים של PCR. בהינתן כמות ה-DNA הנמוכה בדרך כלל בדגימות eSPAN, יש להשתמש עד 18 מחזורים.
    3. טיהור מוצרי ה-PCR על ידי ערבוב של 60 מיקרוליטר (נפח פי 1.0) של חרוזים (מחוממים מראש ל-30 מעלות צלזיוס) (ראו טבלת חומרים).
    4. ערבב היטב את מוצרי ה-PCR והחרוזים.
      1. תן לזה לעמוד ב-RT במשך 5 דקות. קשור חרוזים על המעמד המגנטי למשך 3 דקות ושוטף את החרוזים פעמיים עם (כל פעם 200 מיקרוליטר) עם 80% אתנול טרי.
      2. ייבוש את החרוזים באוויר למשך 2 דקות ומשחרר לתוך בופר EDTA נמוך של 20 מיקרוליטר (מסופק בערכת ההכנה של ספריית ה-DNA).
    5. מדדו את ריכוז הספרייה והתפלגות גודל השברים באמצעות מערכות אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה (ראו טבלת חומרים).
    6. אסוף כמות שווה של ספריות בודדות, כולל הקלט, H3K4me3 ChIP, BrdU IP ודגימות eSPAN, וביצוע רצף מקביל בזוגות עם פלטפורמת הריצוף Illumina. לגבי תהליך ניתוח הנתונים, ראו סעיף 3.
      הערה: קריטריוני ההערכה לתוצאות בקרת איכות הם: (i) לא זוהו שיאי מתאמ/פריימר-דימר (מתחת ל-180 bp). (ii) כל הספריות שיש לאחד הן בעלות התפלגות בגודל דומה וצרה (~300 bp רוחב). ייבוש היתר של החרוזים עלול לגרום לתפוקה נמוכה; השתמש בתחנת עבודה של DNA כדי למנוע זיהום. ניתן לאחסן ספריות ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של -20°C (נקודת הפסקה).

2. Histone eSPAN עם תא ES עכבר

הערה: ה-histone eSPAN עם תא ES עכבר זהה למעשה לפרוטוקול23 שפורסם בעבר.

  1. תיוג BrdU ואיסוף דגימות לתאי ES בעכבר (3 שעות)
    1. גדלו תאי ES עכבר במדיום תרבית תאי ES בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה לחה של 5%CO2 כדי להגיע ל-70%-80% קונפלינקסיביות. באופן כללי, נדרשו כמיליון תאים עבור eSPAN של היסטון. תאי זרע יום אחד לפני הניסויים כדי להבטיח שהתאים גדלים בשלב אקספוננציאלי.
    2. החלף את המדיום ודגר תאים עם BrdU בריכוז סופי של 50 מיקרומום למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה לחה, 5%CO2 .
      הערה: ניתן לנטר את יעילות התיוג של BrdU באמצעות ניתוח PCR כמותי. חלופה נוספת היא ניתוח אימונופלואורסצנציה או FACS כדי לנטר את יעילות השילוב של BrdU. תאים לא מסומנים יכולים לשמש כבקרה שלילית. אלו הם תנאי התיוג הסטנדרטיים לתאי ES בעכבר. מומלץ להתאים את תנאי הסימון בהתאם לתאים עם קצב רבייה משתנה ומשך פאזה S.
    3. שטוף את התאים פעמיים בעדינות עם PBS קר כקרח.
    4. טריפסיניזציה ואיסוף התאים על ידי כדורים ב-200 × גרם למשך 5 דקות.
    5. טפחו בעדינות את התאים למדיום כדי להחזיר אותם לתלייה, ואז ספרו אותם. צנטריפוגה את מספר התאים הנדרש ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    6. החזירו את כדור התא ל-4 מ"ל של בופר שטיפה על ידי פיפטינג והשליכו את הסופרנאנט. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    7. תלה שוב את הכדורים עם 4 מ"ל של בופר שטיפה וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    8. זרוק את הסופרנטנט ותלה מחדש את התאים בבופר שטיפה.
    9. הניחו את החרוזים המגנטיים מצופים ConA (השתמשו ב-10 מיקרוליטר חרוזים ל-250000 תאים; הגדילו את ההגדלה כאשר משתמשים ביותר תאים) ומרחבים מחדש ב-1 מ"ל בופר קישור. לאחר מספר היפוכים, מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי כדי לאפשר לחרוזים לשקוע.
    10. באמצעות פיפטה או ואקום במהירות נמוכה, השליכו את הסופרנטנטים. חזור על שלבי הכביסה פעמיים ותלה מחדש את החרוזים בבופר הקישור.
    11. הוסיפו חרוזי מגנט מצופים ב-ConA שנשטפו מראש לדגימות. ערבב טוב וסובב ב-RT ל-10-20 דקות.
    12. מניחים את הצינורות על מעמד מגנט כדי להשליך את כל הסופרנטנטים.
  2. תיוג19 לתאי ES בעכבר (2 ימים)
    1. החזירו את החרוזים (חרוזי מגנט מצופים ב-ConA הקשורים לתאים משלב 2.1.10) ב-200 מיקרוליטר של בופר נוגדנים קר. הוסיפו IgG כבקרה שלילית או את הריכוזים המתאימים של נוגדנים ראשוניים נגד החלבונים המעוניינים.
    2. ערבבו היטב וערבבו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
    3. מערבבים 2 מיקרוגרם של הנוגדן המשני וכמות נכונה של pA-Tn5 ביחס מולרי של 1:2. הביאו את הנפח הכולל ל-8 מיקרוליטר לדגימה עם גליצרול של 50% (v/v). פיפט כמה פעמים כדי לערבב טוב ולדגור ב-RT במשך שעה.
    4. הנח את דגימות ה-CUT&Tag על מעמד מגנט למשך 30 שניות וזרוק את כל הסופרנטנטים. הוסיפו 1 מ"ל של בופר Dig-wash לפלט החרוזים והפכו כמה פעמים.
      הערה: משלב זה ועד שלבי הכביסה הבאים (שלבים 2.2.5-2.2.6), מומלץ לדגור את החרוזים בבופרים למשך 3-5 דקות לאחר שלב ההפיכה כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
    5. הנח את הצינורות על מעמד מגנט והסר את כל הסופרנטנטים. הוסף 200 מיקרוליטר של בופר Dig-300 כדי להחזיר את החרוזים ולהוסיף 8 מיקרוליטר של תערובת הנוגדן המשני ו-pA-Tn5 לכל דגימה. לאחר ערבוב טוב עם פיפטינג מספר פעמים, דגר ב-RT במשך שעה.
    6. הנח את הצינורות על מעמד מגנט והסר את כל הסופרנטנטים. הוסף 1 מ"ל של בופר Dig-300 כדי להחזיר את החרוזים ולהפוך כמה פעמים.
    7. הנח את הצינורות על מעמד מגנט והסר את כל הסופרנטנטים. חזור על שלב הכביסה עוד 3 פעמים.
    8. הסירו את הסופרנטנטים לחלוטין והוסיפו 250 מיקרו-ליטר של בופר תגמנטציה כדי להחזיר את החרוזים ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
      הערה: מומלץ לנער בעדינות בשלב התגובה בתרמומיקסר כי החרוזים עלולים לשקוע לתחתית הצינורות.
    9. הנח את הצינורות על מעמד מגנט והסר את כל הסופרנטנטים. השתמש ב-1 מ"ל של בופר שטיפה של TAPS כדי להחזיר את החרוזים ולהפוך כמה פעמים.
    10. הנח את הצינורות על מעמד מגנט וזרוק את כל הסופרנטנטים.
    11. הוסף 250 מיקרוליטר של בופר Dig-300 המכיל 15 מ"מ EDTA, 0.1% (עם וולט) SDS, ו-0.1 מ"ג/מ"ל פרוטנאז K לשאר החרוזים. מערבב היטב ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה עם ניעור עדין.
  3. טיהור DNA גנומי ותיג במבחנה בתאי ES של עכבר (לילה)
    הערה: DNA גנומי מאותם תאים עבור eSPAN מופק ומוגדר לתיוג במבחנה , המשמש עבור BrdU-IP-ssSeq. תיוג ה-DNA הגנומי ואחריו BrdU-IP-ssSeq מיועדים לצורכי נרמול eSPAN.
    1. החזירו את התאים ל-300 מיקרוליטר של בופר DNA גנומי ובמערבולת במהירות מקסימלית עד שלא נראים כדורים.
    2. לכל דגימה, הוסף RNase A ב-100 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר השילוב, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת משקעים לחלבון לכל דגימה. תערוב טוב על ידי מערבוב וצנטריפוגה ב-15,000 גרם ב-RT למשך 3 דקות.
    4. הציל את הסופרנטנט על ידי העברתו לצינורות חדשים בנפח 1.5 מ"ל. הוסף איזופרופנול בנפח של 1x לדגימות וערבב טוב.
    5. סובב במהירות מקסימלית ב-RT למשך 3 דקות כדי לשחרר את ה-DNA הגנומי. שפוך בזהירות את הסופרנטנטים.
    6. הוסיפו 1 מ״ל אתנול טרי של 70% (v/v) לכל דגימה והפכו מספר פעמים. צנטריפוגה במהירות מקסימלית ב-RT למשך 3 דקות.
    7. צנטריפוגה ב-15,000 גרם למשך דקה אחת ב-RT והסרת האתנול שנותר באמצעות פיפטת P20. תן להתייבש באוויר למשך 5-10 דקות.
    8. הוסיפו 50 מיקרוליטר ddH2O ומערבולת לזמן קצר כדי להחזיר את ה-DNA הגנומי. המיס ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    9. צנטריפוגה לזמן קצר והעבר את הסופרנטנטים לצינורות חדשים בנפח 1.5 מ"ל. כמת את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
    10. הגדר את תגובת התיוג במבחנה כפי שמפורט בטבלה 1.
    11. ערבבו היטב ודגרו 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.
    12. הוסף 10 מ"מ EDTA, 0.1% (עם V) SDS, ו-0.1 מ"ג/מ"ל פרוטינאאז K לכל דגימה. ערבבו היטב על ידי מערבולת ודגרו לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור.
  4. חילוץ DNA והחלפת אוליגו (3 שעות)
    הערה: ניתן ליישם גם אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל (PCI) וגם טיהור עמודה לצורך חילוץ DNA. כאן מסופקים נהלים מפורטים באמצעות טיהור עמודות.
    1. הוסף 1.25 מ"ל (פי 5 נפח) של בופר קישור (מסופק עם ערכת טיהור PCR) לדגימות (שלבים 2.2.11. ו-2.3.12) וערבב היטב על ידי היפוך מספר פעמים.
    2. העמיסו את התערובת לעמודות טיהור DNA (בצינורות איסוף של 2 מ"ל) ולצנטריפוגה למשך 30 שניות ב-10,000 × גרם ב-RT. זרקו את הזרימה.
    3. הוסיפו בופר שחרור של 600 מיקרוליטר (כלול בערכה) לעמודים ולצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-10,000 × גרם ב-RT. השליכו את ה-flow-through.
    4. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 2 דקות כדי להסיר לחלוטין את הבופר שנותר. הניחו את העמודים בצינורות חדשים בנפח 1.5 מ"ל עם מכסים פתוחים וייבשו באוויר למשך דקה.
    5. הוסף 32 מיקרוליטר של DDH2O ללא DNase (או 10 mM Tris·HCl, pH = 8.0) למרכז הממברנה ומאפשר לו לנוח למשך דקה. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 2 דקות וה-DNA של CUT&Tag נמצא כעת בתמיסה.
    6. הוסיפו 32 מיקרוליטר של דגימת CUT&Tag DNA לצינור PCR חדש ואז מוסיפים 2 מיקרוליטר של תערובת dNTP (2.5 מילימטר כל אחת), 4 מיקרוליטר של 10x Ampligase buffer, ו-2 מיקרוליטר rep-B (10 מיקרומון). טפח בעדינות וערבב על ידי פיפטינג.
    7. תסתובב לזמן קצר ותפעיל את התוכנית הבאה להחלפת אוליגו23.
      50 מעלות צלזיוס, דקה אחת
      45°C, 10 דקות
      רמפה ל-37 מעלות צלזיוס, 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה
      37 מעלות צלזיוס, החזק
    8. בתרמחזור, הוסף 1 מיקרוליטר פולימראז DNA T4 ו-1 מיקרוליטר אמפליגז לכל צינור (נפח סופי, 40 מיקרו ליטר לדגימה). ערבב על ידי פיפטינג עדין.
    9. המשך את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתרמוסיקלר למשך 30-60 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן DNA בטמפרטורה של -20°C אם לא ממשיכים ל-BrdU IP מיד לאחר שלב זה (נקודת עצירה בטוחה).
  5. אימונופרציפיטציה של BrdU (בעצם זהה לפרוטוקול השמרים) (2 שעות)
    1. העבר את הדגימות לצינורות DNA באורך 1.5 מ"ל עם קישור נמוך. רתיחו דגימות 5 דקות על בלוק חום של 100 מעלות צלזיוס, ומיד מקררים בקרח למשך 5 דקות. הוסף 15 מיקרוליטר של 10x PBS ו-+1.35 מ"ל של בופר IP של BrdU + 0.5 מיקרוליטר אנטי-BrdU Ab + 1 מיקרוליטר tRNA של E.coli (10 mg/mL).
    2. נוט ל-2 שעות על רוטור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. העבר את התערובת לצינור המכיל 20 מיקרוליטר חרוזי חלבון G Sepharose (שנשטף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של בופר BrdU IP, כל 3 דקות).
    4. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    5. סובב ב-800 × גרם למשך דקה אחת ושטוף לפי הדברים הבאים: שלוש פעמים עם 1 מ"ל של בופר IP קר של BrdU, 3 דקות על רוטור; פעם אחת עם 1 מ"ל של TE buffer למשך 3 דקות.
    6. סובב ב-800 × גרם למשך דקה אחת ושאוף את הסופרנאנט.
    7. הוסיפו 100 מיקרוליטר של TE + 1% בופר SDS לשאר החרוזים. דגרו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. סובב על 800 × גרם למשך דקה אחת.
    8. לטהר את הסופרנטנט ל-18 מיקרוליטר של בופר שחרור (מסופק עם הערכה) באמצעות עמודות טיהור DNA (דגימת BrdU IP ו-H3K4me3 eSPAN).
  6. הגברה וריצוף PCR (1.5 שעה)
    1. הגבר ותייג דגימות ספריית DNA חד-גדילית באמצעות שילובי אינדקסים שונים. הכינו את תגובת ה-PCR על ידי הוספת הרכיבים הבאים ((DNA מטוהר [ChIP או ESPAN], פריימר אינדוקס I5 [1 מיקרוליטר], פריימר אינדוקס I7 [1 מיקרוליטר], תערובת NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (2x) [10 מיקרוליטר], ddH2O עד 20 מיקרוליטר), ערבוב הדגימות באמצעות פיפטינג, וסיבוב קצר.
    2. חממו את תערובת ה-PCR ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, לאחר מכן 12-14 מחזורים של 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס ו-20 שניות בטמפרטורה של 63 מעלות צלזיוס, ומחזור אחד של 2 דקות בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס.
    3. לטהר את מוצרי ה-PCR עם 18 מיקרוליטר של חרוזים פרמגנטיים (נפח של 0.8x) ל-20 מיקרוליטר של בופר עם EDTA נמוך.
    4. למדוד את ריכוז הספרייה והתפלגות גודל המקטעים באמצעות מערכות אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה.
    5. אסוף כמות שווה של ספריות בודדות, כולל הקלט, H3K4me3 ChIP, BrdU IP ודגימות eSPAN, וביצוע רצף מקביל בזוגות עם פלטפורמת הריצוף Illumina.

3. ניתוח נתוני eSPAN לתאי שמרים (יום אחד)

הערה: תהליך ניתוח הנתונים חל רק על נתוני השמרים; ניתוח נתוני eSPAN לתאי ES ניתן לעקוב אחריו כפי שמפורט בפרסום עדכני23.

  1. חלץ קבצי רצף גולמיים, רצפי מתאם חיתוך באמצעות כלי Trim Galore, והסרת קריאות קטנות מ-10 bp כדי להקטין את גודל קובץ הפלט ולמנוע קריסות של תוכניות יישור. ודא שהקבצים נמצאים בפורמט file1_1.fq, file1_2.fq לקריאות זוגיות:
    /TrimGalore-0.6.10/trim_galore גימור file.fq-o --אורך 10 - זוג
  2. צור קבצי אינדקס פפיון עבור הגנום המתייחס:
    Bowtie2-build genome.fa
  3. מיפוי את הקריאות לגנום הייחוס המתאים (גנום Saccharomyces (saccer3) עבור שמרים) באמצעות Bowtie 2:
    Bowtie2 -X גנום -1 trim_1.FQ -2 trim_2.FQ --מקומי --ללא זנב יונה --ללא צורמים --מקסינס 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
  4. הסר קריאות רב-מפות עם SAMtools וקריאות כפולות עם כלי Sambamba:
    תצוגת SamTools -bhs - q 40 input.bam -o output.bam
    sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
  5. השתמש ב-deeptools כדי ליצור את קבצי הכיסוי הקריאה המרכזיים על חוטי Watson ו-Crick בנפרד עבור כל דגימה מתוך קבצי bam נקיים:
    bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand הפוך -bs 1 - extendReads
    bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
  6. חישבו את ההטיה הממוצעת בכל מיקום נוקלאוזום25 עבור כל דגימה בהתבסס על הנוסחה: log2 קריאות קדימה (חוט ווטסון)/אחורה (חוט קריק) לאחר מיקום הנוקלאוזום הייחוס מופרדות25. סקריפטים R לחישובים אלו זמינים ב-https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. לחישוב סטנדרטי, השתמש בפקודות הבאות.
    הערה: שלב זה חל רק על נתוני השמרים; חישוב ההטיה לתאי ES ניתן לעקוב אחריו כפי שמתואר בפרסום עדכני23.
    RSCRIPT cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
  7. אם יש צורך, כוון את הטיית הגדילים באמצעות הטיית BrdU:
    RSCRIPT normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --יעד target_list --שליטה control_list
    הערה: "matrix_files" היא רשימת קבצים שנוצרה על ידי cal_bias. כתב R מופרד בפסיקים. לדוגמה: 'file1', 'file2', 'file3'. "classes_list" היא רשימה של מחלקות לדוגמה המתאימות לכל קובץ המופרד בפסיקים (למשל, 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list" היא רשימת תנאי דגימה התואמים לכל קובץ ומופרדת בפסיקים. כל קובץ יהיה מזווג לפי מחלקה ותנאי לצורך התאמת ההטיה. "target_list" היא רשימת שיעורים שנלקחו מ-classes_list. הוא יגדיר את המחלקות שישמשו כנתונים שיש להתאים על ידי הבקרות (למשל, 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "control_list" היא רשימה של קורסים שנלקחו מרשימת השיעורים. הוא יגדיר את המחלקות שישמשו כנתונים שיש לכוונן על ידי הבקרים. ודא שאורך הרשימה זהה לזה של target_list (למשל, 'brdu')
  8. לאחר החישוב וההתאמה, קבץ דגימות ויצר ויזואליזציות של הנתונים.
    סקריפט draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g קבוצה 1,קבוצה 2 --אינטרוול=T
    -s דורש רשימת קבצי הטיה שנוצרים על ידי הסקריפטים הנ"ל
    -o הוא קובץ הפלט
    -g מגדיר את קבוצות הניסוי לחישוב, כלומר, שכפולים ביולוגיים כדי להציג את ההטיה הממוצעת.
    --מרווח T או F, כדי להציג שגיאות סטנדרטיות על הגרפים בתוך קבוצות ניסוי.
    הערה: המידע על מקורות השכפול הוגדר על ידי נתוני הקניין הרוחני של BrdU. המידע על מיקום הנוקלאוזום היחיד התקבל ממאמר25 שפורסם בעבר. לניתוח נתוני תאי ES של עכברים, התקבל מידע המקור ממערך הנתוניםOK-seq 26, וחישוב ההטיה הממוצעת צריך לעקוב אחרי הפרוטוקול שתואר בעבודההקודמת 23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להשתמש ב-eSPAN לקבלת מידע ספציפי לגדיל לגבי חלבון יעד, כגון היסטונים ושינויים בהיסטונים. בתוצאה מייצגת זו, איסוף דגימות ותהליכי eSPAN בוצעו בהתאם לסכמטיקה המתוארת באיור 2 באמצעות מערכת שמרי הנבט. הטיפול והאיסוף של הדגימה עוקבים אחרי מצב שלב S מוקדם שטופלו בהידרוקסיוריאה כפרוטוקול זה. שני זני שמרים, WT (סוג פראי) ומוטנט mcm2-3A, שימשו. תת-יחידת הליקאז של ה-DNA MCM2 משמשת כמלווה הורי להיסטון H3-H4, בעוד שהמוטנט mcm2-3A (המכיל 3 מוטציות חומצות אמינו) חסר את היכולת לקשור א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי חלבונים הקשורים לחוטי שכפול מובילים ומאחרים חשוב להבנת מנגנוני שכפול הכרומטין והתהליך הנלווים, הרלוונטיים ישירות למחקר סרטן אנושי ולמנגנוני עמידות התרופות. מספר שיטות, כגון ג'ל דו-ממדי, אימונופרציפיטציה טבעית של כרומטין (nChIP), iPOND, ולכידת כרומטיןמתהווה 29,30,31, שימשו לחקר שכפול DNA ותהליכים נלווים כגון תיקון DNA. בנוסף, פותחו שיטות למיפוי in vivo של כרומטין מתהווה, כגון MINCE-Seq (מיפוי כרומטין נולד בחיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכון הלאומי לבריאות R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.), וקרן הסטארטאפ של הורמל (C.Y.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTA, pH 8.0תרמו פישר סיינטיפיק15575020
1.5 מ"ל DNA צינורות עם קישור נמוך  אפנדורף22431021
10x בופר AmpligaseלוסיגןA1905B
10x PBS קורנינג21-040-CV
10x TBSBioRad1706435
16 גרם x 1-1/2 אינץ'. BD PrecisionGlid NeedleBD ביוסיינסס305198
ערכת ספריית ACCEL-NGS 1 פלוס DNAטכנולוגיות DNA משולבות10009817ssDNA וערכת הכנה לספריית DNA עם קלט נמוך  
ביואנלייזר Agilent 2100  אג'ילנט2100 ביואנליזה
ערכת Agilent DNA 1000  אג'ילנט5607-1504
Ampligase לוסיגןA0110Kלטפל בפרפורמלדהיד בזהירות, הוא דליק ומסוכן.
AMPure XPבקמןA63881
ריאגנט SPRI של AMPure XPבקמן קולטרA63882
נוגדן אנטי-BrdU BD ביוסיינסס555627
נוגדן אנטי-H3K4me3 אבקאםab8580
מונה תאים אוטומטי, דגם TC10BioRad145-0001
Bacitracin סיגמא11702
בקטו פפטון תרמו פישר סיינטיפיק211830
בנזמידין הידרוכלוריד  סיגמאB2417מוצקים דליקים
BrdU סיגמאB5002טפל ב-BrdU בזהירות כי הוא פוטנציאלי למוטגן וטרטוגן.
BSAניו אינגלנד ביולאבסB9000S
CaCl2סיגמאC4901
חממת תרביות תאים תרמו פישר סיינטיפיק  דגם פורמה סדרה II עם מגדל CO2 מצופה במים3140
מדיום תרבית תאים 
קו תאים ES-E14 
Chelex-100 BioRad1422842200– גודל רשת יבשה 400
כלורופורם סיגמא366919
חרוזים מגנטיים מצופים Concanavalin A (ConA) מדעים פולי-מדעיים86057-10
דיגיטוניןמיליפור300410-5MG
DMSOסיגמאD8418
E. coli  tRNA סיגמא10109541001
אתנול תרמו פישר סיינטיפיקBP2818100לטפל באתנול בזהירות, הוא דליק
גלוקוזסיגמאG7021
גליצרול סיגמאG5516
HCl סיגמאH1758
HEPES סיגמאH3375
איזופרופנול תרמו פישר סיינטיפיקBP26324לטפל באיזופרופונול בזהירות, הוא דליק
KAPA HiFi HotStart Ready Mixרוש7958889001
KClסיגמאP9541
KOHסיגמא221473טפל ב-KOH בזהירות, הוא קורוזיבי
ואקום במהירות נמוכה
מעמד מגנט מיליפורLSKMAGS08
מאסטרסייקלר גרדיאנט PCR סייקלר תרמיאפנדורף5331
MgCl2סיגמאM8266
נוקלאז מיקרוקוקלי   (מנאס)וורת'ינגטוןLS004798
ערכת טיהור PCR של MinElute  קיאגן28006
מכה חרוזים קטנהMini BeadBeater 24 Disruptor607
מיני-צנטריפוגה אפנדורף5424R
MnCl2סיגמא244589
שייקר רב-פלטפורמתיפישרברנד02-217-765
חממת רעידות רב-פלטפורמיותציון דרךאינקו-שייקר 10L
בלוק חום רב-תרמי  אפנדורףתרמומיקסר C
N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-אמינופרופנסולפוניק חומצה nbsp; (נקישות)סיגמאT5130200– גודל רשת יבשה 400
NaCl סיגמאS9888
NaOH סיגמאS8045טפל ב-NaOH בזהירות, הוא קורוזיבי
NEBNext HiFi 2× מיקס מאסטר PCRניו אינגלנד ביולאבסM0541
NP-40 איגפל CA-630תרמו-סיינטיפיקJ61055. AP
פאראפורמלדהידסיגמא158127לטפל בפרפורמלדהיד בזהירות, הוא דליק ומסוכן.
אנזים pA-Tn5  אדג'ין121137
פפאבלוקסיגמא11429868001
פנול-כלורופורם-איזואמיל אלכוהול  Invitrogen15593049
Pipette P1000, P200, P20 ו-P2אפנדורף2231300004
PMSFסיגמא10837091001
טבליית קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמאS8830
טבליית קוקטייל מעכבת פרוטאז  סיגמאS8830
חרוזי חלבון G-ספרוז GE Healthcare17-0618-02
תמיסת משקעים לחלבוןקיאגן848023
תמיסת משקעים לחלבוןקיאגן848023טפל ב-KOH בזהירות, הוא קורוזיבי
תמיסת משקעים לחלבון קיאגן848023
פרוטינאז K סיגמא311584401
ערכת טיהור QIAquick PCR  קיאגן28106
RNase Aסיגמא10109169001
SDS סיגמאL3771
ספקטרופוטומטר&nb;תרמו סיינטיפיק.2000/2000c
Spermidine סיגמאS2626
T4 DNA Polניו אינגלנד ביולאבס, M0203
צנטריפוגה שולחנית בקמן קולטראלגרה X-5
Tris סיגמא11814273001
טריטון X-100 סיגמאT8787
תמצית שמרים תרמו פישר סיינטיפיק212730

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Stillman, B. ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex. Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).
  2. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).
  3. Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. Eukaryotic DNA replication fork. Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).
  4. Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication. Science. 317 (5834), 127-130 (2007).
  5. Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. Division of labor at the eukaryotic replication fork. Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).
  6. Daigaku, Y., et al. A global profile of replicative polymerase usage. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).
  7. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  8. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).
  9. Reijns, M. aM., et al. Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome. Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).
  10. Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).
  11. Stillman, B. DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes. Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).
  12. Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication. Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).
  13. Yu, C., et al. Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall. Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).
  14. Gan, H., et al. The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands. Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).
  15. Yu, C., et al. A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands. Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).
  16. Petryk, N., et al. Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication. Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).
  17. Li, Z., et al. DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands. Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).
  18. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  19. Kaya-Okur, H. S., et al. Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).
  20. Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains. Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  21. Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).
  22. Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast. Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).
  23. Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells. Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).
  24. Rosebrock, A. P. Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  25. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).
  26. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 10208(2016).
  27. Foltman, M., et al. Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication. Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).
  28. Jia, J., Yu, C. The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance. Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).
  29. Alabert, C., et al. Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components. Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).
  30. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).
  31. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).
  32. Ramachandran, S., Henikoff, S. Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing. Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).
  33. Petryk, N., et al. Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq. Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).
  34. Zhong, J., et al. Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application. BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).
  35. Li, Z., et al. Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements. Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).
  36. Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance. Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).
  37. Hanzlikova, H., et al. The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication. Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA Nascent DNADNAChromatin ImmunoprecipitationBrdUDNA Single Stranded DNA LibraryMNase

מאמרים קשורים