הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

צינור מקיף להערכת היעילות של אריתרופואיזיס אנושי במבחנה ובחוץ גופית

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

10 בינואר 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

במאמר זה

סיכום

מידול אריתרופואיזיס מספק הזדמנות יקרת ערך להבין את המשמעות הביולוגית של שחקנים בתהליך זה ולהעריך גישות טיפוליות חדשות שעשויות להקל על פגמי התמיינות. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה להבדיל ביעילות תאי גזע ואב המטופויאטיים CD34+ ex vivo.

תקציר

אריתרופואיזה, תהליך דינמי ויעיל להפליא האחראי לייצור המכסה היומית של כדוריות דם אדומות (כ-280 ±-20 מיליארד תאים ביום), חיוני לשמירה על בריאות הפרט. לכל הפרעה במסלול זה עלולות להיות השלכות משמעותיות, מה שמוביל לבעיות בריאותיות. על פי ארגון הבריאות העולמי, כ-25% מאוכלוסיית העולם מציגים תסמינים של אנמיה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאי אריתרואידים אנושיים הן במבחנה באמצעות תאי גזע ואב המטופויאטיים (HSPCs) ממקורות כגון דם טבורי (UCB) או דם שנלקח מתורמים בריאים ו-ex vivo עם HSPCs שבודדו ממח העצם של המטופלים. באמצעות גישה גנטית, ניתן לווסת גנים מעניינים ב-HSPCs, וניתן לנטר את השפעתם על אריתרופואיזיס בשלבים שונים של תהליך ההתמיינות. שיטה זו מאפשרת סינון של תרכובות המפריעות, משפרות או מצילות את היכולת של HSPCs להתמיין לתאי אריתרואידים בוגרים ולחקור את תפקידם של גנים מעניינים במהלך תהליך ההתמיינות האריתרואידית.

מבוא

מדי יום מיוצרים במח העצם כ-280 מיליארד תאי דם אדומים (RBCs) כדי להבטיח הובלת חמצן בכל הגוף1. אריתרופואיזיס הוא תהליך התמיינות מכוון היטב המייצר תאי דם אדומים בוגרים ומתפקדים מתאי גזע המטופויאטיים. מחלות רבות, הן נרכשות והן מולדות, יכולות להשפיע על תהליך זה, כולל תסמונת מיאלודיספלסטית, אנמיה אפלסטית, תלסמיה ואנמיה דיסריתרופויאטית מולדת2.

הביטוי הקליני של אריתרופואיזיס משובש הוא אנמיה, גורם עיקרי לתחלואה ברחבי העולם. תסמינים של אנמיה נעים בין עייפות, קוצר נשימה וסחרחורת למצבים מסכני חיים, כגון אי ספיקת לב ודום לב3. עם אנמיה המשפיעה על 1.8 מיליארד אנשים ברחבי העולם4, מידול אריתרופואיזיס ex vivo על מנת לחקור מצבים אלה והמנגנונים הבסיסיים שלהם נותר בעדיפות עולמית. השיטה המתוארת כאן שואפת לספק מודל פשוט וחזק לחקר התמיינות אריתרואידים בריאים וחולים כאחד. מודל זה מאפשר ניתוח תפקידים של גנים ספציפיים בתהליך זה ומאפשר בדיקה של תרכובות שיכולות להועיל לחולים אנמיים. מבחינה היסטורית, למידול אריתרופואיזיס לא יעיל היו אתגרים רבים, כולל מחסור בתאי גזע בכמה מחי עצם חולים וקשיים בחיקוי נישת מח העצם.

מחקרים קודמים השתמשו בפרוטוקולים דומים או מורכבים יותר; לדוגמה, Bondu et al. השתמשו בקוקטייל של ציטוקינים כולל אריתרופויטין (EPO), גורם תאי גזע (SCF) ואינטרלוקין-6 (IL6) במשך 4 ימים לפני שהוציאו את IL6 מקוקטייל ההתמיינות של אריתרואידים, לעומת זאת, Yip et al. הוסיפו EPO לקוקטייל הציטוקינים שלהם רק לאחר 7 ימים של תרבית נוזלית. Elvarsdóttir ואחרים פיתחו מודל תרבית תלת-ממדי (תלת-ממדי) עבור תאי CD34+ כדי לאפשר את ההתרחבות וההתבגרות הגבוהות ביותר של תאי אריתרואידים, כולל יצירת איים אריתרובלסטיים ואריתרוציטים נטולי גרעין, החשובים לחקר תופעות כגון סידרובלסטים טבעתיים 5,6,7,8. פרוטוקול זה משתמש רק בשלושה ציטוקינים בעת הרחבת התאים (כלומר, SCF, טרומבופויטין [TPO], וטירוזין קינאז 3 דמוי FMS [FLT3]) ושלושה ציטוקינים שנשמרו לאורך כל תהליך ההתמיינות (כלומר, EPO, IGF1 ו-SCF). אחד הקריטריונים המרכזיים המשותפים למחקרים השונים הללו הוא השימוש בתאי CD34+. למרות שמקורם של תאים אלה משתנה, הם מופעלים באופן עקבי בפרוטוקולים השונים הללו. המקורות עשויים לנוע בין איסוף לא פולשני של UCB להליכים פולשניים יותר להשגת דגימות מח עצם בוגרות שניתן לקצור מחולים מגויסים של מושבת גרנולוציטים (G-CSF) או מנקבים במח עצם. באופן כללי, מודלים של תרבית נוזלית נישאים במשך 14 יום, בעוד שמודלים תלת מימדיים יכולים לשמור על תאים לאורך תקופות ארוכות יותר. פרוטוקולים אלה חיוניים למידול מחלות גנטיות ושיבושים באריתרופואיזיס. ניתן להשתמש בגישות גנטיות, כגון נוקדאונים של RNA קצר סיכת ראש (shRNA), כדי להשתיק גנים מעניינים ולחקור את תפקידיהם באריתרופואיזיס. לאחר מכן ניתן לנטר את ההשפעה של השתקת גנים בשלבים שונים של התמיינות, ולספק מודל אנושי ex vivo של ייצור תאי דם אדומים לחקר אנמיה הן בבריאות והן בחולי. פרוטוקול זה כולל התמרה של תאי דם טבורי CD34+ עם shRNA המבטאים באופן מכונן גן מדווח, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), המאפשר למיין את הדגימות על ידי מיון תאים המופעל פלואורסצנטי (FACS). לאחר מכן התאים מודגרים באמצעי התמיינות למשך שבועיים ומנוטרים על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה וצביעה אימונוכימית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר על דגימות ראשוניות בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות (התייחסות REC: 21/EE/0133; מזהה פרויקט IRAS: 283103).

1. ייצור Lentivirus

הערה: יש לייצר נגיפי לנטי במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית L2 בתנאים סטריליים. יש ללבוש את כל ציוד ההגנה האישי הנדרש למעבדה זו, כולל כפפות כפולות. חומר מזוהם עובר טיהור בחומר חיטוי וירוסי לפני השלכתו לפח חיטוי. כאן, ערבול shRNA (בקרה) המכיל גן מדווח EGFP משמש להמחשת התהליך.

יום 1

  1. חממו את הג'לטין בחום של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שהוא נמס לחלוטין. יש לדלל ג'לטין ב-0.1% בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
  2. מצפים צלחת 150 מ"מ עם 2 מ"ל של 0.1% ג'לטין. השתמש ב-2 מנות לכל וירוס. דגרו את הכלים למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  3. זרעו 5 מיליון תאים HEK293T לכל צלחת מצופה ג'לטין ב-20 מ"ל של 10% מדיום נשר מותאם (DMEM) של Dulbecco′s והניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

יום 2

  1. בדוק שהתאים הגיעו לכ-50% מפגש. החלף את המדיום עם 22 מ"ל של 10% DMEM מבלי להפריע לשכבת התא שעתיים לפני הטרנספקציה.
  2. מכינים את תערובת הטרנספקציה.
    הערה: מכינים תערובת טרנספקציה אחת לכל מנה, מכיוון שנפח גדול יותר עלול להשפיע על היווצרות משקעי הסידן-פוספט.
    1. הכן את תערובת התגובה בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל באופן הבא: 32 מיקרוגרם פלסמיד, 20 מיקרוגרם פלסמיד PAX (pCMVdR8.74), 9 מיקרוגרם של פלסמיד VSVG (pMD.G2), והביא את הנפח עד 1125 מיקרוליטר באמצעות H2O.
    2. הוסף 125 מיקרוליטר של CaCl2 לתגובה ודגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על גלגלת.
    3. הכן 1.25 מ"ל של 2x HEPES בצינור צנטריפוגה נפרד של 15 מ"ל.
    4. הוסף 2x HEPES טיפה אחר טיפה לתערובת התגובה תוך כדי מערבולת עדינה, ולאחר מכן הניח את התערובת על רולר למשך 10 דקות ב-RT.
  3. הוצא את התגובה טיפה אחר טיפה על התאים בתבנית ספירלית והנח את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר הזזת הצלחת בעדינות בצורה צולבת כדי להומוגניזציה של המדיום.

יום 3

  1. שנה את המדיום עם 16 מ"ל של 10% DMEM מבלי להפריע לשכבת התא.

יום 4

  1. אוספים את הסופרנטנט ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסף 16 מ"ל של DMEM טרי לכל צלחת מבלי להפריע לשכבת התא.

יום 5

  1. אספו את הסופרנטנט והבריכה עם הסופרנטנט מהיום הרביעי. סנן לסילוק פסולת עם מסנן 0.45 מיקרומטר.
  2. העבירו כל 30 מ"ל (יום 4 + יום 5) סופרנטנט בצינור חרוטי לאולטרה-צנטריפוגה. הוסף את הצינורות בדלי נדנדה, עם מתאמים לתחתית החרוטית במידת הצורך.
  3. איזון הצינורות פנים אל פנים בדיוק של 0.02 גרם ואולטרה-צנטריפוגה ב-90,000 x גרם למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תאי גזע לכל צינור. סגור צינורות עם פרפילם ודגר את הצינור בחדר קר למשך 2-4 שעות תחת תסיסה.
  5. הכינו 20 מיקרוליטר מכל וירוס ואחסנו את הבקבוקונים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. שמור 2 מיקרוליטר מכל נגיף והוסף 400 מיקרוליטר DMEM.
    הערה: דילול זה ישמש לטיטרציה.

2. טיטרציה של Lentivirus

הערה: יש לטפל בנגיפי לנטי במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית L2 בתנאים סטריליים. יש ללבוש את כל ציוד ההגנה האישי הנדרש למעבדה זו, כולל כפפות כפולות. חומר מזוהם עובר טיהור בחומר חיטוי וירוסי לפני השלכתו לפח חיטוי.

  1. זרעים HEK293T בצלחת של 24 בארות. הוסף 50,000 תאים/באר ב-500 מיקרוליטר של 10% DMEM.
    הערה: השתמש ב-6 בארות לכל וירוס ושמור באר אחת לתאים לא מועברים.
  2. בצע את ההמרה. הוסף את הבארות השונות: 2 מיקרוליטר, 4 מיקרוליטר, 8 מיקרוליטר, 16 מיקרוליטר, 32 מיקרוליטר ו-64 מיקרוליטר של הנגיף המדולל משלב 1.13. הומוגניזציה בעדינות.
  3. שנה את המדיום 24 שעות לאחר מכן על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 10% DMEM.
  4. ביום 4 לאחר ההעברה, הכינו תאים לזרימה ציטומטרית.
    1. הכן מאגר FACS עם PBS, 2% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S), 2 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ו-1/2,000 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI).
    2. הסר את ה-supernatant והוסף 500 מיקרוליטר של מאגר FACS ישירות עם EDTA לכל באר.
    3. נתק את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  5. מסננים את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר ומעבירים אותם בצינורות FACS.
  6. קבע את אחוז תאי ה- EGFP על ידי ציטומטריית זרימה.
  7. הגדר את השערים הבאים:
    1. הגדר DAPI לעומת פיזור צדדי (SSC-A) כדי לא לכלול תאים מתים.
    2. הגדר גובה SSC (SSC-H) לעומת שטח SSC (SSC-A) כדי לא לכלול צבירות תאים ולבחור תאים בודדים.
    3. הגדר אזור פיזור קדימה (FSC-A) לעומת SSC-A כדי לשער את התאים ולהסיר את הפסולת על סמך גודל.
    4. הגדר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לעומת SSC-A כדי לבחור תאי GFP+ .
  8. טיל את הנגיף.
    1. חשב את ריכוז החלקיקים (מספר חלקיקים/מ"ל) עבור כל מצב:
    2. תאי EGFP x וירוס גורם דילול (200) x מספר התאים הזרעים x1000)/ נפח הנגיף.
      הערה: לדוגמה, תאים טופלו ב-64 מיקרוליטר של נגיף מדולל ב-1/200. לאחר ניתוח ציטומטריית זרימה, 54% מהתאים היו EGFP+. בתנאים אלה, הטיטר יהיה (54% x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8.44 x 107 חלקיקים/מ"ל.

3. התמרת תאי CD34+ מבודדים מדם טבורי

הערה חלק זה מבוצע בתנאים סטריליים. כאן, תאי CD34+ UCB (טוהר >85%) מתמרים עם shRNA אחד (בקרה) המכיל מדווח eGFP. הניסוי מבוצע עם שלושה שכפולים טכניים. יש להתאים את הפרופורציה למספר הדגימות.

יום 1

  1. הכן את המדיה והמאגר הבאים:
    1. הכן מדיום הפשרה: FBS בתוספת 1% P/S ו-10 מיקרוגרם/מ"ל DNAse
    2. הכן מאגר FACS: PBS בתוספת 1% P/S ו-2% FBS (± 10 מיקרוגרם/מ"ל DNAse)
    3. הכן אמצעי גירוי (במדיום תאי גזע) על ידי הוספת 150 ננוגרם/מ"ל SCF, 150 ננוגרם/מ"ל FLT-3, 10 ננוגרם/מ"ל IL-6, 25 ננוגרם/מ"ל G-CSF, 20 ננוגרם/מ"ל TPO ו-1% HEPES.
  2. הפשירו 100,000 תאי CD34+ UCB על ידי טבילה למשך 30 שניות באמבט המים ב-37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מ"ל של מדיום הפשרה טיפתי לכל בקבוקון ולאחר מכן השהה מחדש בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  3. העבירו את מתלה התאים טיפה אחר טיפה בסך הכל 5 מ"ל הפשרה בינונית בעדינות.
    הערה: כדי למנוע אובדן תאים, שמור בצד 2 מ"ל של מדיום הפשרה שישמש בסוף לשטיפת הקצה והבקבוקון.
  4. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT. שטפו תאים ב-10 מ"ל של מאגר FACS + DNAse.
  5. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT. השעו מחדש את כדור התא ב-2 מ"ל של אמצעי גירוי (קצה כביסה וצינור עם מדיום גירוי).
  6. ספרו את התאים באמצעות 5 מיקרוליטר של תרחיף תאים ו-5 מיקרוליטר של טריפאן כחול.
    הערה: שאוף למינימום כולל של 75,000 תאים (25,000 תאים/תנאי).
  7. העבירו את 2 מ"ל מתלה התאים לצלחת של 24 בארות ודגרו למשך ≥4-6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: כל התאים (75,000-100,000) נזרעים בבאר אחת בשלב זה.
  8. אסוף את התאים בצינורות FACS ומלא 1 מ"ל של מדיום תאי גזע. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT.
  9. להפשיר את הנגיף ולהוסיף את הנפח הנדרש למדיית הגירוי בריבוי זיהום (MOI) של 30.
  10. השעו מחדש את התאים הגלולים במדיה המכילה נגיף ב-100,000 תאים לכל נגיף של 100 מיקרוליטר לבאר אחת של צלחת של 96 בארות. יש להוסיף PBS לבארות ריקות ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

יום 2

  1. הכן מדיום הרחבה (במדיום תאי גזע) על ידי הוספת 150 ננוגרם/מ"ל SCF, 150 ננוגרם/מ"ל FLT3-L ו-20 ננוגרם/מ"ל TPO.
  2. הוסף את הנפח המלא של תרחיף התאים מבאר הצלחת של 96 בארות לצינורות FACS עם 1 מ"ל של מדיום תאי גזע. שטפו את הבאר ואת הקצה במדיום תאי גזע, וכתוצאה מכך הוסיפו מדיום תאי גזע של 2 מ"ל לתרחיף התאים בצינור ה-FACS.
  3. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT.
  4. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים ב-2 מ"ל של מדיית הרחבה. הוסף את מתלה התאים לבאר צלחת של 24 באר (שטפו את הבאר והטילו בתהליך לקבלת סך של 2 מ"ל). דגרו על התאים למשך 4 ימים בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: מיון התאים מתבצע לאחר מכן ביום השביעי.

4. CD34+ EGFP+ מיון תאים והתמיינות אריתרואידים

הערה חלק זה מבוצע בתנאים סטריליים.

  1. הכן את המדיה והמאגר הבאים.
    הערה: יש להכין מדיה עם ציטוקינים טריים:
    1. הכן את מאגר FACS על ידי השלמת PBS עם 1% P/S ו-2% FBS.
    2. הכן מדיית הרחבה (במדיום תאי גזע) על ידי הוספת 150 ננוגרם/מ"ל SCF, 150 ננוגרם/מ"ל FLT3-L ו-20 ננוגרם/מ"ל TPO.
    3. הכן אמצעי התמיינות אריתרוציטים (במדיום תאי גזע) על ידי הוספת 25 ננוגרם/מ"ל SCF, 3 U/mL EPO ו-50 ננוגרם/מ"ל IGF1.
    4. הכן 2x מדיית התמיינות אריתרוציטים (במדיום תאי גזע) על ידי הוספת 50 ננוגרם/מ"ל SCF, 6 U/mL EPO ו-100 ננוגרם/מ"ל IGF1.
  2. הוסף את נפח התאים המלא לצינור FACS נפרד (שטוף את הבאר והקצה בתהליך עם מדיום תאי גזע). צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  3. יש להוסיף 5 מיקרוליטר CD34 Ab/tube ולדגור בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מאגר FACS עם DAPI (דילול 1/2000 במאגר FACS) וצנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x g ב-RT.
  5. השעיה מחדש של תאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS עם DAPI (דילול 1/2000 במאגר FACS) וסנן תאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לפני המיון.
  6. הכן את החרוזים לשליטה:
    1. הוסף 0.5 מיקרוליטר של נוגדן CD34 (Ab) לטיפה אחת של חרוזים ב-100 מיקרוליטר של PBS ודגר בחושך ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    2. הוסף 1 מ"ל PBS. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x g ב-RT. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של PBS.
  7. הכן קווי תאים לוקמיים לבקרת GFP.
    הערה: השתמש בכל שורת תאים GFP+ זמינה כפקד; ניתן להשתמש בחרוזים במקום.
    1. הוסף תאי GFP (2 שפופרות FACS עם 100,000 תאים) ו-GFP+ (שפופרת FACS אחת עם 100,000 תאים) בשפופרת ה-FAKS.
      הערה: בסך הכל 3 צינורות.
    2. שטפו תאים ב-1 מ"ל של מאגר FACS. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT.
    3. השעו מחדש 100,000 תאי GFP ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS (לא צבוע), 100,000 תאי GFP ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS עם DAPI (דילול 1/2000 במאגר FACS) (צבוע DAPI), ו-100,000 תאי GFP+ ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS (תאי GFP+ ).
      הערה: צינורות בקרה ישמשו להגדרות שער ופיצוי בציטומטר הזרימה. אם התאים המשמשים הם 100% GFP, ניתן להוסיף תאי GFP לצינור (50,000 תאי GFP ו-50,000 תאי GFP+).
    4. סנן את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לפני המיון.
  8. הגדר את השערים הבאים:
    1. הגדר DAPI לעומת פיזור צדדי (SSC-A) כדי לא לכלול תאים מתים.
    2. הגדר גובה SSC לעומת שטח SSC (SSC-A) כדי לא לכלול צבירות תאים ולבחור תאים בודדים.
    3. הגדר אזור פיזור קדימה (FSC-A) לעומת SSC-A כדי להסיר את הפסולת בהתאם לגודל.
    4. הגדר GFP לעומת SSC-A כדי לבחור תאי GFP+ .
    5. הגדר CD34 (PerCP-Cy5.5) לעומת SSC-A כדי לבחור תאי CD34+ .
  9. הפוך את צינור ה-FACS של האיסוף לפני איסוף התאים כדי לצפות את דפנות הצינור ב-FBS.
  10. אסוף תאים במדיום תאי הגזע.
    הערה: כוון ל- 75,000-80,000 תאים (25,000 תאים x 3)
  11. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT והשעיית תאים ב-3 מ"ל של אמצעי התמיינות אריתרואידים.
  12. השעו ואז חלקו 1 מ"ל לבאר ב-3 בארות של צלחת 24 בארות. מלאו את כל הבארות החיצוניות ב-PBS.
  13. בצע חצי דלדול של מדיה כל יומיים והחלף אותה במדיית בידול אריתרוציטים פי 2.
    1. כדי לרענן את המדיה, ודא שהתאים מיושבים בתחתית הצלחת. יש להישען בעדינות על הצלחת ולהוציא 500 מיקרוליטר של מדיה.
    2. רענון על ידי הוספת 500 מיקרוליטר עם מדיית התמיינות אריתרואידית ציטוקין פי 2.
    3. העבירו את התאים ביום 6 לצלחת של 12 בארות והוסיפו 1 מ"ל מדיה כדי ליצור נפח סופי של 2 מ"ל.

5. ניתוח התמיינות אריתרואידים על ידי זרימה ציטומטרית פעמיים בשבוע מיום 6 עד יום 14

  1. הכן את המדיה והמאגר הבאים.
    1. הכן את חוצץ FACS על ידי השלמת PBS עם 1% P/S ו-2% FBS
    2. הכן אמצעי התמיינות אריתרוציטים (במדיום תאי גזע) על ידי הוספת 25 ננוגרם/מ"ל SCF, 3 U/mL EPO ו-50 ננוגרם/מ"ל IGF1.
  2. אסוף 200 תאי מיקרוליטר מכל באר של צלחת 12 הבארות והחלף אותם ב-250 מיקרוליטר של אמצעי התמיינות אריתרואידים 2x. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS לכל צינור.
  3. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  4. הוסף 1 מיקרוליטר של CD71 Ab (1/100), 1 מיקרוליטר של CD34 Ab (1/100) ו-1 מיקרוליטר של CD235a Ab (1/100) ודגירה בחושך ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. השעיה מחדש של תאים ב-1 מ"ל של מאגר FACS עם DAPI (דילול 1/2000 במאגר FACS). צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT.
  6. השעיה מחדש של תאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS עם DAPI (דילול 1/2000 במאגר FACS).
  7. הכן את החרוזים לשליטה:
    1. הוסף חרוזי פיצוי טיפה אחת לשני צינורות ב-100 מיקרוליטר של PBS ולאחר מכן הוסף 0.55 מיקרוליטר של נוגדן בודד לכל צינור כדי ליצור בקרות כתמים בודדות (אחד עבור CD34, אחד עבור CD71 ואחד עבור CD235a).
      הערה: טיפה אחת מספיקה לשני הפקדים.
    2. יש לדגור בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסף 1 מ"ל PBS.
    3. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x g ב-RT. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של PBS.
  8. הכן קו תאים לוקמיים לשליטה.
    הערה: תאי K562 מבטאים את סמן CD71 ויכולים לשמש כבקרה חיובית להגדרת ה-FACS.
    1. הוסף תאי GFP (2 שפופרות FACS עם 100,000 תאים) ותאי GFP+ (שפופרת FACS אחת עם 100,000 תאים) בשפופרת ה-FAKS.
    2. שטפו תאים ב-1 מ"ל של מאגר FACS. צנטריפוגה למשך 8 דקות ב-320 x גרם ב-RT.
    3. השעיה מחדש של 100,000 תאי GFP במאגר FACS (לא מוכתם), 100,000 תאי GFP במאגר FACS עם DAPI (דילול 1/2000 במאגר FACS) (צבוע DAPI), ו-100,000 תאי GFP+ במאגר FACS (תאי GFP+ ).
  9. הגדר את השערים הבאים:
    1. הגדר DAPI לעומת פיזור צדדי (SSC-A) כדי לא לכלול תאים מתים.
    2. הגדר גובה SSC לעומת שטח SSC (SSC-A) כדי לא לכלול צבירות תאים ולבחור תאים בודדים.
    3. הגדר אזור פיזור קדימה (FSC-A) לעומת SSC-A כדי להסיר את הפסולת בהתאם לגודל.
    4. הגדר את CD235a (APC-Cy7) לעומת CD71 (PE).
    5. הגדר CD34 (PerCP-Cy5.5) לעומת SSC-A.
  10. הפעל דגימה של תאי GFP לא מוכתמים ותאים מוכתמים מלאים על מנת להתאים את המתחים כך שהתאים ישבו במקום הנכון.
  11. הפעל חרוזים, תאי GFP+ ותאים מוכתמים ב-DAPI. לפצות ולהחיל פיצוי על הגדרות הציטומטר.
  12. הפעל את הדוגמאות ותעד את האירועים.

6. ניתוח התמיינות אריתרואידים על ידי צביעת גימסה

  1. הכן 5 צנצנות מכתים שקופיות:
    1. הכינו צנצנת צביעת שקופיות עם תמיסת אאוזין-מתילן כחולה 1:1 של מאי-גרינוולד ו-PBS.
    2. הכינו צנצנת מכתים עם 2.5 מ"ל מלאי Giemsa + 50 מ"ל PBS.
    3. הכינו צנצנת מכתים עם מים מזוקקים.
    4. הכינו צנצנת מכתים עם PBS.
    5. הכינו צנצנת מכתים עם מתנול קר כקר.
  2. אסוף 100,000 תאים לצביעה אופטימלית, הוסף 1 מ"ל PBS וצנטריפוגה 300 x גרם למשך 5 דקות.
  3. השליכו את המדיום והשעו מחדש ב -150 מיקרוליטר של PBS.
  4. הכן שקופיות, נייר סינון ומתאם חרוטי לתוך ציטוצנטריפוגה והכנת תאים לאט לתוך המתאם החרוטי.
  5. סובב ב 800 x גרם למשך 3 דקות. הסר את השקופיות והניח אותן בצנצנת שקופיות המתנול בקרח למשך 15 דקות.
  6. טבלו את השקופיות בתמיסת מאי-גרינוולד למשך 5 דקות וערבבו מדי פעם כדי להבטיח צביעה נכונה.
  7. לאחר מכן, טבלו את השקופיות בצנצנת PBS עד שלא ייגמר כתם.
  8. טבלו את השקופיות בתמיסת Giemsa למשך 20 דקות וערבבו מדי פעם כדי להבטיח צביעה נכונה.
  9. טבלו בזהירות שקופיות עם PBS עד שאף כתם לא יברח.
  10. אפשר לשקופיות להישאר ב-PBS למשך 3 דקות נוספות.
  11. טבלו את המגלשות במהירות במים מזוקקים וייבשו באוויר ב-RT.
  12. הוסף טיפה של שרף סינטטי על כל נקודה של תאים והוסף בעדינות כיסוי מעל.
  13. הניחו לשקופיות להתייבש למשך שעה אחת ב-RT ואטמו את הכיסוי עם לק כדי למנוע החלקה של ייבוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי CD34+ מדם טבורי או מח עצם מופשרים, מגורים ומומרים תחילה באמצעות shRNA המבטא GFP (איור 1A). תאי CD34+GFP+ ממוינים 4 ימים לאחר ההתמרה, על פי אסטרטגיית השער המומחשת באיור 1B. תוצאות מייצגות הראו התבגרות של תאי CD34+ לאחר התמרה ומיון FACS. תאים מנותחים (1) על ידי זרימה ציטומטרית בשלבים שונים של התבגרות, באמצעות צביעת CD71/CD235a 9,10,11

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, תיארנו שיטה יעילה ואמינה לגרימת התמיינות אריתרואידית של תאי גזע המטופויאטיים CD34+ (HSPCs) המבודדים ממח עצם בוגר (BM) או מדם טבורי (UCB). צינור זה כולל עריכה/שינוי של תאים ראשוניים כדי לחקור את תפקודו של כל גן מעניין במהלך תהליך ההתמיינות האריתרואידית. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי לחקור את הרלוונטיות התפקודית של גנים שלא היו קשורים בעבר להתמיינות אריתרואידית 12,13,14,15 ב-CD34+ HSPCs בריאים ובממאירויות המטופויאטיות כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה ותסמונת מיאלודיספלסטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

C.P., S.B. ו-K.RP. נתמכו על ידי תוכנית HARP, קרן הצדקה בארטס (G-002167), קרן קיי קנדל ללוקמיה (KKL1149) והאקדמיה למדעי הרפואה (SBF004\1099). אנו מודים לד"ר פנטליצה פרוטופפה על רכישת צביעת MGG ומיקרוסקופיה. אנו מכירים גם במתקני הזרימה הציטומטרית והמיקרוסקופיה של מכון הסרטן בארטס, אוניברסיטת קווין מרי בלונדון. אנו מודים לארגון הצדקה הבריטי אנתוני נולאן על שסיפק לנו את מנות הדם הטבורי ששימשו בכתב היד הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2x HEPESMerck51558
חרוזיםThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 נוגדןBD Biosciences347222
CD71 PE נוגדןBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX מדיום הרכבה VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
ג'לטיןMerckG1393
תמיסת GiemsaAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
Human EPOPeproTech100-64
ליגנד Flt-3 אנושיPeproTech300-19
אנושי G-CSFPeproTech300-23
אנושי IGF1PeproTech100-11
אנושי IL-6PeproTech200-06
SCF אנושיPeproTech300-07
Human TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa מנתח תאיםBD BiosciencesNA
מאי-גרונוולד פתרון Generon26250-01
Pannoramic 250 סורק תפוקה גבוהה 3DHISTECHNA
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו סיינטיפיק15140-122
שנדון ציטוספין 3 Thermo ScientificNA
טכנולוגיות תאי גזעבינונייםבינוניים 9655

מקורות

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ex vivoin vitroCD34Annexin V
צינור מקיף להערכת היעילות של אריתרופואיזיס אנושי במבחנה ובחוץ גופית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.