מאמר שיטה

יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67125

⸱

13 בדצמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

תקציר

אורגנואידים וסקולריים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) משחזרים את מגוון סוגי התאים ואת הארכיטקטורה המורכבת של רשתות כלי הדם האנושיות. מודל תלת-ממדי (תלת-ממדי) זה טומן בחובו פוטנציאל משמעותי למידול פתולוגיה וסקולרית ולבדיקת תרופות חוץ גופיות . למרות ההתקדמות האחרונה, אתגר טכני מרכזי נותר בייצור אורגנואידים באיכות עקבית, שהיא חיונית עבור בדיקות ויישומים במורד הזרם. כאן מוצג פרוטוקול שונה המשפר הן את ההומוגניות והן את יכולת השחזור של יצירת אורגנואידים וסקולריים. הפרוטוקול המתוקן משלב שימוש במיקרו-בארות ובקוקטייל CEPT (כרומן 1, אמריקסן, פוליאמינים ומעכב תגובת הדחק המשולב, טרנס-ISRIB) לשיפור היווצרות הגוף העוברי והישרדות התא. אורגנואידים מובחנים ובוגרים של כלי דם שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מאופיינים במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי תלת-ממדי שלם כדי לנתח את המורפולוגיה וכלי הדם המורכבים שלהם. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אורגנואידים וסקולריים באיכות גבוהה באופן מדרגי, מה שעשוי להקל על השימוש בהם במידול מחלות וביישומי סינון תרופות.

מבוא

מודלים מיקרופיזיולוגיים במבחנה, כולל מערכות אורגנואיד ורקמות על שבב, התפתחו בעשור האחרון 1,2,3. מערכות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) אלה שמקורן בתאים אנושיים נותנות מענה למגבלות בתרביות תאים דו-ממדיות (2D) קונבנציונליות ובמודלים של בעלי חיים, כגון היעדר רכיבים רבים במיקרו-סביבה הפיזיולוגית והבדלים גנטיים בין מינים, בהתאמה. הם מספקים תובנות פיזיולוגיות רבות יותר ומתאימים יותר למידול מחלות ולבדיקת תרופות מאשר מודלים קונבנציונליים. בין המודלים המיקרופיזיולוגיים, אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) הוכחו כמשחזרים את התכונות האדריכליות של רקמות אנושיות מקומיות ביעילות ופותחו כדי לחקות איברים אנושיים שונים, כולל המוח 4,5, הכליה6, הכבד 7,8 והרשתית9. כאן, אנו מתמקדים במיוחד ביצירת אורגנואידים וסקולריים מ- hiPSCs ומתווים פרוטוקול יעיל שמטרתו למזער את השונות בין דגימות אורגנואידים ואצוות שונות, ובכך לשפר את יכולת השחזור הכוללת.

כלי הדם ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס פיזיולוגי בכל האיברים האנושיים. היווצרות כלי הדם כרוכה בתהליכים של וסקולוגנזה ואנגיוגנזה, המתוזמרים באמצעות יחסי הגומלין בין תאי אנדותל וציור קיר (למשל, פריציטים ותאי שריר חלק של כלי הדם) ומושפעים מגירויים שונים10. פנינגר, וימר ועמיתיו פיתחו את השיטה הראשונה לייצור אורגנואידים וסקולריים11,12 המחקה את שני התהליכים הללו. בעזרת האורגנואידים שנוצרו משיטה זו, הקבוצה שלהם12 ו-13,14 הדגימו את הפוטנציאל של אורגנואידים וסקולריים למידול תקלות בכלי הדם במחלות. לדוגמה, בעבודות האחרונות שלנו13,14, נצפו פנוטיפים שונים, כגון הנבטת כלי דם ושינויים בהרכב תאי קיר, בין אורגנואידים כלי דם המחקים מחלות לבין עמיתיהם מסוג פרא. דוגמאות אלה מדגישות כי מודל אורגנואיד כלי הדם יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת תרופות על ידי חיקוי תקלות כלי דם הקשורות למחלה.

בהתבסס על עבודות הדור הראשוניות של אורגנואידים וסקולריים11,12, מוצג פרוטוקול מתוקן הכולל את השימוש במיקרווול כדי להקל על היווצרות גוף עוברי הומוגני (EB), גורם קריטי במזעור הווריאציות הנראות לעתים קרובות באותה אצווה של ייצור אורגנואידים. בנוסף, קוקטייל CEPT, שילוב של כרומן 1, אמריקסן, פוליאמינים ומעכב תגובת הלחץ המשולב (trans-ISRIB)15, משמש לשיפור הכדאיות של hiPSCs ותאים ממוינים במהלך תהליך היווצרות EB. שינוי זה נועד בעיקר להפחית את השונות בין דגימות אורגנואידים שונות ואצוות. אורגנואידים וסקולריים אחידים יכולים להיות מיוצרים עם פרוטוקול זה שנמשך כשבועיים, שבו מושרה וסקולוגנזה כדי לעזור לאנדותל להתארגן לרשתות צינוריות פרימיטיביות ביום 1, ואחריו השראת אנגיוגנזה ביום 5 כדי לפתח רשתות כלי דם מורכבות באורגנואידים. ביום 12-15, האורגנואידים שנוצרו צריכים להראות רשתות כלי דם בוגרות המורכבות הן מתאי אנדותל והן מתאי קיר.

פרוטוקול

איור 1 מציג סקירה כללית של השלבים המעורבים בפרוטוקול זה. מידע מפורט לגבי ריאגנטים וחומרים המשמשים בפרוטוקול זה ניתן בטבלת החומרים. מומלץ לחמם מראש את כל חומרי ההדפסה בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש, אלא אם צוין אחרת. כל החומרים והאספקה של תרביות התאים צריכים להיות אוטוקלאביים או סטריליים, והטיפול בתאים צריך להיעשות בארון בטיחות ביולוגית. נוסף על כך, יש להתאים בזהירות את ערך ה-pH של תערובת קולגן I ל-pH 7.3 כדי למנוע בעיות התמצקות אפשריות.

1. תחזוקת iPSC אנושית

  1. הפשירו את תמצית מטריצת קרום המרתף על קרח, נערו בעדינות את הבקבוק כדי לערבב את התמיסה, והכינו אליציטוטים של 0.5 מ"ל בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה P1000 וקצוות טרום קירור. אחסן את aliquots ב -20 ° C למשך עד 1 שנה.
  2. הפשירו אליקוט אחד של תמצית מטריצה (0.5 מ"ל) על קרח. יש לערבב עם 49.5 מ"ל של מדיום DMEM/F12 מקורר מראש בצינור של 50 מ"ל. מפזרים את התערובת לכל באר (1.5 מ"ל/באר) בצלחות בנות 6 בארות ולאחר מכן מנערים בעדינות את הצלחת כדי להבטיח שתמיסת הנוזלים מכסה את כל הבאר. אטמו את הצלחות בסרט פרפין ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
  3. הכן את אמצעי ההתרחבות hiPSC כמתואר בטבלה 1. הפוך aliquots של המדיום המלא (40 מ"ל / צינור) ולאחסן ב -20 ° C עד 1 שנה.
  4. שים צלחת מצופה מראש באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני תרבית hiPSC.
  5. חממו מראש את מדיום ההתפשטות hiPSC (40 מ"ל) ב-37°C והכינו את מצע הזריעה hiPSC כמתואר בטבלה 2.
  6. מעבירים את הצלחת המצופה מאינקובטור 37°C לארון הבטיחות הביולוגית. החלף את המדיום בצלחת המצופה במדיום זריעה hiPSC (1 מ"ל/באר).
  7. הפשירו בקבוקון שמור בהקפאה של hiPSCs מההקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
  8. העבר את התאים לצינור של 15 מ"ל ולאחר מכן הוסף 5 מ"ל של תווך DMEM/F12, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 100 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התאים.
  9. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים עם 1.5 מ"ל של מדיום הזריעה hiPSC. בעדינות resuspend תאים בצינור 15 מ"ל.
  10. Aliquot 10 μL של השעיית התא ומערבבים עם 10 μL של תמיסת טריפאן כחולה. מעבירים תערובת של 10 μL לשקופית ההמציטומטר ומכסים אותה בכיסוי.
  11. הרכיבו את השקופית על המחזיק והכניסו אותה למונה התאים האוטומטי. המתן עד שהמכשיר ימצא את המיקוד או כוונן את המיקוד באופן ידני על-ידי לחיצה על לחצן המיקוד +/- על המסך. לאחר מכן, השתמש בהגדרת ברירת המחדל ולחץ על לכידת לחצן. השתמש בקריאת צפיפות התא LIVE כריכוז של מתלה hiPSC שהוכן משלב 1.9.
  12. זרע 2 × 105 תאים בכל באר ולוודא כי התאים מופצים באופן שווה בבאר.
  13. תרבית את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולהחליף את המדיום עם תווך התפשטות hiPSC (1.5 מ"ל / באר) לאחר 24 שעות.
  14. שנה את המדיום מדי יום עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%. בדוק את המורפולוגיה של התא ואת גודל המושבה באופן שגרתי כדי לוודא שאין התמיינות ספונטנית. השליכו את התרבית והפעילו מחדש עם קבוצה חדשה של hiPSCs אם נצפתה הבחנה ספונטנית נרחבת (>5%).

2. היווצרות EB (יום 0)

  1. ביום 0, הכינו וחממו מראש את תמיסת הזריעה הבינונית DMEM/F12 מסוג DMEM/F12 ואת תמיסת ניתוק התאים ב-37°C למשך 20-30 דקות.
  2. מוציאים את מדיום התרבית מצלחת 6 הקידוחים ומוסיפים תמיסת ניתוק תאים שחוממה מראש (1.5 מ"ל/באר). לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 5-7 דקות.
  3. מעבירים את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית, מקישים על הצלחת כדי לנתק מושבות hiPSC ומפרקים את האגרגטים.
  4. העבר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל. הוסף 4.5 מ"ל של מדיום DMEM/F12. מזלפים בעדינות את התערובת למעלה ולמטה באמצעות צינור סרולוגי של 10 מ"ל חמש פעמים כדי לנתק תאים לתרחיף חד-תאי. הימנעו מיצירת בועות.
  5. צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התאים.
  6. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש בעדינות את התאים עם 1 מ"ל של מדיום זריעה hiPSC באמצעות פיפטה P1000.
  7. ערבבו 10 μL של תרחיף תאים עם 10 μL של תמיסה כחולה טריפאן לספירת תאים. מעבירים 10 μL מהתערובת לשקופית ההמציטומטר ומכסים אותה בכיסוי. הרכיבו את השקופית על המחזיק והכניסו אותה למונה התאים האוטומטי. לאחר שהמכשיר מוצא את המיקוד, לחץ על לחצן לכידה והשתמש בקריאת צפיפות התאים LIVE כדי לקבוע את ריכוז מתלה hiPSC.
  8. זרעו את התאים בצלחת המיקרווול התחתונה העגולה בעלת החיבור הנמוך במיוחד עם צפיפות של 2.7 × 105 תאים / באר כדי להניב 500-1,000 תאים לכל EB.
  9. הוסף 2 מ"ל של מדיום זריעה hiPSC לכל באר וערבב את התמיסה בעדינות כדי לפזר תאים באופן שווה.
  10. תרבית את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.

3. הבחנה וסקולרית (יום 1 - 5)

  1. ביום הראשון, הכינו את מדיום השראת המזודרם (MIM) כמתואר בטבלה 3 ובטבלה 4 וחממו אותו מראש בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. המדיום MIM חייב להיעשות טרי.
  2. השתמש פיפטה P200 כדי לשאוף בזהירות את התווך מצלחת microwell מבלי להפריע EBs בתחתית.
  3. הוסף 2.5 מ"ל של MIM באיטיות באמצעות פיפטה P200. תרבית את EBs ב MIM ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 2 ימים.
  4. ביום 3, החליפו בעדינות את המדיום ב-2.5 מ"ל מחומם מראש של מדיום התמיינות כלי הדם 1 (VDM1, טבלה 5) מבלי להפריע ל-EBs בתחתית המיקרו-באר. תרבית את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 2 ימים נוספים.

4. הטבעה הידרוג'ל (יום 5)

  1. הכינו את תערובת הקולגן I כמתואר בטבלה 6. מניחים צינור 50 מ"ל על קרח ומוסיפים תמיסת קולגן I, H2O, 10× DMEM/F12 בינוני, סודיום ביקרבונט ו- HEPES לאחר מכן. מערבבים היטב על ידי ניעור עדין של הצינור. הוסף תמיסת NaOH 1 M טיפה תוך כדי ניעור התמיסה המעורבת כדי להתאים את ערך ה- pH ל- 7.3 ובדוק את ערך ה- pH של התערובת עם מד pH.
    הערה: יש לקרר מראש את כל התמיסות על קרח לפני השימוש. בצע את ההליך על קרח בארון הבטיחות הביולוגית כל הזמן. הוספת תמיסת NaOH היא קריטית, ויש צורך בפיזור מהיר כדי ליצור תמיסה הומוגנית כדי למנוע ריפוי מקומי של קולגן I. נפח NaOH עשוי להשתנות בהתאם למספר הרב של תמיסת הקולגן I שבה השתמשתי. אין לזלף במרץ לערבוב, מכיוון שלחץ גזירה עלול לגרום לריפוי מקדים לא רצוי.
  2. הכינו את תערובת מטריצת קרום הקולגן I-basement כמתואר בטבלה 7. הוסף 1.25 מ"ל של מטריצת קרום מרתף לתערובת 5 מ"ל קולגן I שהוכנה משלב 4.1. מערבבים את התמיסה בעדינות על ידי ניעור הצינור.
  3. מניחים צלחת של 12 בארות על קרח למשך 2 דקות.
  4. הוסיפו באיטיות את תערובת מטריצת הממברנה I-basement של קולגן לצלחת בעלת 12 הקידוחים (1.5 מ"ל/באר) בעזרת הקצוות הרחבים. ודאו שהתערובת מפוזרת באופן שווה.
  5. שים את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות כדי למצק את השכבה הראשונה של הידרוג'ל.
  6. יש לשמור את שארית תערובת מטריצת ממברנות הקולגן I-basement על קרח לשימוש מאוחר יותר.
  7. העבר ~ 60 צברי תאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ומקרר את הצינור על קרח במשך 5 דקות. הסר בזהירות את המדיום עם קצה פיפטה P200.
    הערה: התחל שלב זה 1.5 שעות לאחר שלב 4.5.
  8. טיפתית, הוסיפו 1.5 מ"ל של תערובת קרום קולגן I-מרתף לאגרגטים וערבבו אותם בעדינות באמצעות קצוות פיפטה P200 רחבים.
  9. מעבירים את הצלחת עם שכבת ההידרוג'ל הראשונה מהאינקובטור (שלב 4.5) לארון הבטיחות הביולוגית.
  10. הוסף 1.5 מ"ל של המתלה המצטבר על השכבה נרפא. נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את האגרגטים באופן שווה. הימנעו מיצירת בועות.
  11. לדגור את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 2 שעות נוספות.
  12. הכן את מדיום התמיינות כלי הדם 2 (VDM2; טבלה 8) וחממו מראש את המדיום באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות לפני השימוש.
  13. הוסף 2 מ"ל VDM2 לכל באר ותגדל את התאים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2.
  14. החליפו את המדיום כל 3 ימים עם VDM2 שחומם מראש.
    הערה: (אופציונלי) אורגנואידים וסקולריים יכולים להשתחרר מתערובת הג'ל על ידי הסרת הג'ל עם מחט מזרק. אורגנואידים וסקולריים שנלקחו מהג'ל יכולים להישמר בנפרד בצלחת 96 בארות עם VDM2 (200 μL / well). שנה את המדיום כל 2-3 ימים.

5. 3D בדיקת Immunofluorescent

  1. אורגנואידים וסקולריים אמורים להתבגר בערך ביום ה-13. עבור אורגנואידים המוטבעים בהידרוג'ל, שאפו את המדיום בזהירות ושטפו עם PBS של 2 מ"ל שלוש פעמים (10 דקות בכל פעם). עבור אורגנואידים שנלקחו מהג'ל (לאחר שלב 4.14), אספו 6-10 אורגנואידים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, שאפו את המדיה ושטפו עם PBS של 2 מ"ל שלוש פעמים (10 דקות כל אחת).
  2. יש להוסיף 2 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לדגימה ולדגור ב-4°C למשך הלילה עם איטום סרט פרפין.
  3. הסר את תמיסת ה- PFA ושטוף את הדגימה עם PBS של 2 מ"ל ארבע פעמים (15 דקות בכל פעם).
  4. מוסיפים 2 מ"ל של חיץ חוסם (טבלה 9) ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  5. הסר את המאגר החוסם והוסף 1.5 מ"ל של נוגדנים ראשוניים (ראה טבלת חומרים למידע על נוגדנים; יש לדלל נוגדנים במאגר החוסמים). לדגור את הדגימה עם נוגדנים ראשוניים ב 4 ° C במשך 2 ימים עם רעד עדין.
    הערה: מומלץ לדלל את הנוגדן הראשוני (CD31, PDGFRβ ו-ERG1) במאגר החוסם ביחס של 1:400 (ראה טבלת חומרים למידע נוסף).
  6. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף עם 2 מ"ל PBST במשך שעה אחת שש פעמים.
  7. הוסף 2 מ"ל של נוגדנים משניים (ראה טבלת חומרים למידע על הנוגדנים; נוגדנים צריכים להיות מדוללים ב- PBST) לדגימה. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בחום של 4°C למשך יומיים עם ניעור עדין.
    הערה: מומלץ לדלל את הנוגדן המשני ב-PBST ביחס של 1:1000 (ראה טבלת חומרים למידע נוסף). יש להרחיק את הצלחת מהאור במהלך הדגירה ולשטוף משלב זה ואילך.
  8. הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטוף עם 2 מ"ל TBST שש פעמים (1 שעה בכל פעם). הוסף DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) למאגר הכביסה המשמש לשלב השטיפה האחרון אם יש צורך בצביעת גרעינים.
  9. עבור אורגנואידים אלה משובצים ג'ל, לחתוך את הג'ל לתוך 4 חתיכות ולהעביר אותם בזהירות 2 מ"ל צינורות microcentrifuge עם מרית. עבור האורגנואידים שאוחזרו, הסירו את מאגר הכביסה.
  10. השתמשו במגבונים כדי לספוג את התמיסה הנותרת מבלי לגעת בג'ל או באורגנואידים.
  11. הוסף 2 מ"ל של מגיב ניקוי רקמות מסיס במים (מדד השבירה = 1.49) לכל צינור. דגרו על הדגימות עם מגיב ניקוי בטמפרטורת החדר בחושך עד שהאורגנואידים מתבהרים (בדרך כלל במהלך הלילה). אין לנער את הדגימות.
  12. מעבירים בזהירות את האורגנואידים עם מגיב הניקוי למרכז צלחת תחתית הזכוכית באמצעות מרית.
  13. מכסים את האורגנואידים או חתיכת הג'ל בכיסוי 24 מ"מ × 24 מ"מ.
  14. דוחפים את הכיסוי כלפי מטה בעדינות עד שהוא מונח שטוח, וסנדוויץ' את הדגימות עם תחתית הזכוכית.
  15. הסירו את מגיב הניקוי המיותר בצלחת ואטמו את הכיסוי בלק.
  16. עבור הדמיה תלת ממדית, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של 10×. השתמש בסריקת אריחים ובסריקת מחסנית Z כדי לקבל תמונות הרכבה שלמות של אורגנואידים.

תוצאות

איור 1A מציג את התוכנית של פרוטוקול זה, כולל מרכיבי המפתח שבהם נעשה שימוש בכל שלב. ההבחנה החלה עם היווצרות EB, ואחריה אינדוקציה מזודרם ומפרט שושלת כלי דם (איור 1B-D). האגרגטים גדלו והפכו פחות כדוריים עם הזמן. אורגנואידים החלו להראות קצוות מחוספסים ביום 5. לאחר שהוטמעו בתערובת מטריצת קרום הקולגן I-basement, תאי אנדותל של כלי דם ופריציטים נבטו ויצאו החוצה ליצירת רשתות כלי דם מורכבות כבר ביום השביעי (איור 1E). מאחר שהמטרה העיקרית של שיטה מותאמת זו היא למזער את השונות בין אצוות דור שונות, מדדנו את גודל EB משתי אצוות בלתי תלויות, וגם מדידות הגודל וגם הניתוח הסטטיסטי אישרו את העקביות והאחידות בשיטה זו (איור 1F).

כדי לאמת את התמיינות כלי הדם, אורגנואידים נאספו ביום 5 לפני הטבעה ומוכתמים בסמנים וסקולריים, כולל CD31, ERG1 ו- PDGFRβ. האורגנואידים ביטאו CD31, ERG1 ו-PDGFRβ (איור 2), מה שמצביע על נוכחות של תאי אנדותל וסקולריים ופריציטים.

לאחר ניקוי הרקמות, רשתות כלי הדם נותחו במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי בהרכבה שלמה (איור 3A). אורגנואידים בוגרים הוכתמו ב-CD31, ERG1 ו-PDGFRβ ביום ה-17 (איור 3B, דגימה בבלוק הג'ל) וביום ה-28 (איור 3C, הדגימה נלקחה מבלוק הג'ל והתרבית בנפרד בצלחת של 96 בארות; שימו לב שרשת כלי הדם בקצוות עטפה את הספרואידים במקום להתרחב רדיאלית לאחר שנלקחה מבלוק הג'ל).

figure-results-1
איור 1: יצירת אורגנואידים וסקולריים. (A) סכימת השלבים וציר הזמן ליצירת אורגנואידים וסקולריים. (ב-ה) תמונות שדה בהירות מייצגות של אורגנואידים וסקולריים בשלבים שונים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. (F) ניתוח סטטיסטי בגודל EB משתי אצוות שונות מדור EB בשיטת microwell המוצגת בעבודה זו. עבור יצירת EB, 1,000 תאים לכל מיקרו-באר שימשו, ועבור אצוות 1 ו -2, n = 42 ו- n = 40, בהתאמה. המשמעות מוצגת כ-ns, לא משמעותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: צביעה חיסונית של אורגנואידים וסקולריים לפני הטבעה בג'ל. תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של אורגנואידים מוכתמים בסמני האנדותל (A) CD31 (ירוק) ו-(B) ERG1 (ירוק), כמו גם (C) סמן הפריציטים, PDGFRβ (ירוק), בהתאמה. גרעינים הוכתמו ב-DAPI (כחול). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אפיונים אימונופלואורסצנטיים של רשת כלי הדם באורגנואידים של כלי הדם. (A) תמונה מייצגת מראה אורגנואידים וסקולריים משובצים בג'ל בכלי הזכוכית לאחר ניקוי הרקמות. האורגנואידים היו שקופים אך נראו תחת אור UV של 385 ננומטר. (B) תמונה תלת-ממדית מייצגת של אורגנואיד כלי דם ביום ה-17. אורגנואיד כלי הדם הוכתם ב- DAPI (כחול), סמן תאי אנדותל כלי הדם, CD31 (ירוק) וסמן הפריציטים, PDGFRβ (מגנטה). (C) הדמיה תלת-ממדית מייצגת של אורגנואיד כלי דם שנלקח ביום ה-28, מוכתמת בסמני האנדותל CD31 (אדום) ו-ERG1 (ירוק). פסי קנה מידה: 150 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בינוני הרחבה hiPSC500 מ"ל
mTeSR Plus בינוני בסיסי400 מ"ל
תוספת mTeSR Plus100 מ"ל
גנטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)1 מ"ל

טבלה 1: הרכב מדיום הרחבת hiPSC.

מדיום זריעה hiPSC20 מ"ל
בינוני הרחבת PSC20 מ"ל
כרומן 1 (100 מיקרומטר)10 מיקרוליטר
אמריקסאן (1 מ"מ)30 מיקרוליטר
תוסף פוליאמין (1000x)20 מיקרוליטר
טרנס-איסריב (1 mM)14 מיקרוליטר

טבלה 2: הרכב מדיום הזריעה hiPSC.

N2B27 בינוני100 מ"ל
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAX48.6 מ"ל
מדיום נוירובזאלי48.6 מ"ל
תוסף GlutaMAX (100x)0.5 מ"ל
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (NEAA, 100x)0.5 מ"ל
2-מרקפטואתנול (1000x)0.1 מ"ל
גנטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)0.1 מ"ל
תוסף N2 (100x)0.5 מ"ל
תוסף B27 פחות ויטמין A (50x)1 מ"ל
הפרין, 4 kU/מ"ל0.1 מ"ל

טבלה 3: הרכב מדיום N2B27.

מדיום אינדוקציה מזודרם (MIM)3 מ"ל
N2B27 בינוני3 מ"ל
BMP4 (100 נ"ג/מיקרוליטר)0.9 מיקרוליטר
CHIR99021 (12 מ"מ)3 מיקרוליטר

טבלה 4: הרכב מדיום אינדוקציה מזודרם (MIM).

התמיינות כלי דם בינונית 1 (VDM1)3 מ"ל
N2B27 בינוני3 מ"ל
פורסקלין (12 מ"מ)0.5 מיקרוליטר
VEGFA (100 ננוגרם/מיקרוליטר)3 מיקרוליטר

טבלה 5: הרכב מדיום התמיינות כלי דם 1 (VDM1).

תערובת קולגן I5 מ"ל
קולגן I (3.61 גרם/מ"ל)2.77 מ"ל
10x DMEM/F12 בינוני0.5 מ"ל
סודיום ביקרבונט, 7.5%0.5 מ"ל
HEPES, 1 מטר0.5 מ"ל
H2O0.73 מ"ל
נאו, 1 מ'75 מיקרוליטר

טבלה 6: הרכב תערובת קולגן I.

קולגן I - תערובת מטריצת קרום מרתף6.5 מ"ל
קולאז' I מערבב5 מ"ל
מטריג'ל (10 מ"ג/מ"ל)1.5 מ"ל

טבלה 7: הרכב תערובת מטריצת קרום קולגן I-מרתף.

התמיינות כלי דם בינונית 2 (VDM2)5 מ"ל
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAX™3.67 מ"ל
גנטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)5 מיקרוליטר
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (NEAA, 100X)50 מיקרוליטר
2-מרקפטואתנול (1000x)5 מיקרוליטר
הפרין, 4 kU/מ"ל5 מיקרוליטר
תחליף סרום נוקאאוט0.75 מ"ל
פ.ב.ס.0.5 מ"ל
VEGFA (100 ננוגרם/מיקרוליטר)5 מיקרוליטר
FGF2 (100 ננוגרם/מיקרוליטר)5 מיקרוליטר

טבלה 8: הרכב מדיום התמיינות כלי דם 2 (VDM2).

מאגר חוסם50 מ"ל
נסיוב חמורים2.5 מ"ל
טווין 200.25 מ"ל
טריטון X-1000.25 מ"ל
תמיסת נתרן דאוקסיכולאט (1%, wt/v)0.5 מ"ל
PBS46.5 מ"ל

טבלה 9: הרכב חיץ חוסם לצביעת חיסון.

דיון

הפרוטוקול המתואר כולל שני שינויים מרכזיים לייצור הומוגני וניתן לשחזור של אורגנואידים וסקולריים באיכות גבוהה. השינוי הראשון הוא השימוש בצלחת מיקרווול כדי לאפשר שליטה טובה יותר באחידות EB. כנקודת מוצא של התמיינות כלי דם, גודל EBs הוא קריטי מכיוון שהוא מווסת את גורל תאי הגזע ואת יעילות ההתמיינות כלפי שושלות שונות. שינויים בגודל EB מובילים בדרך כלל לאורגנואידים הטרוגניים עם מבנה וארגון לא עקביים16,17. שיטת ייצור EB קונבנציונלית על ידי הרמת מושבות hiPSC11,12 מקשה על שליטה במספר התאים עבור EBs בודדים ובדרך כלל גורמת להיווצרות EB הטרוגנית. בפרוטוקול זה, hiPSCs מנותקים לתרחיף חד-תאי ונצברים מחדש במיקרו-בארות16,18. על ידי התאמת מספרי תאי הזריעה, ניתן למטב את גודל EBs כדי להבטיח התמיינות מזודרמלית עקבית ויעילה. עבור זריעת microwell, 500-1,000 תאים משמשים, וזה יכול להניב EBs קטנים יחסית (עם קוטר של 100-200 מיקרומטר). שיטה זו יכולה ליצור EBs אחידים בגדלים הרצויים מאצווה לאצווה (איור 1F) ובין שורות תאים שונות13. מאז יום 0, המורפולוגיה של EB השתנתה עם הזמן במהלך ההתמיינות: הצורה נעשית פחות כדורית, והמשטח נעשה מחוספס יותר (איור 1), אולם הנפח אינו גדל באופן משמעותי. המורפולוגיה התלת-ממדית של כלי הדם תלויה בצפיפות ההטבעה ובגדלים של האורגנואידים המוטבעים. אורגנואידים גדולים מדי (>500 מיקרומטר) גורמים בדרך כלל להתמיינות לא מספקת של תאי כלי הדם, בעוד שאורגנואידים קטנים מדי נוטים להיות בעלי כלי דם לא מפותחים.

השינוי השני הוא שילוב קוקטייל CEPT כדי לשפר את הכדאיות hiPSC במהלך היווצרות EB. כדאיות התא חיונית בנוסף לאיכות מושבות hiPSC בתהליך זה. כאשר hiPSCs מנותקים לתרחיף חד-תאי, מעכב ROCK Y27632 מתווסף בדרך כלל כדי לשפר את יכולת הקיום של התא. עם זאת, Y27632 הוכח כלא אופטימלי עבור hiPSCs בצפיפות נמוכה ועלול לגרום ללחץ בלתי רצוי בממברנה, בעוד שקוקטייל CEPT (המורכב מכרומן 1, אמריקסן, פוליאמינים וטרנס-ISRIB) יכול להפחית באופן משמעותי את הלחץ התאי ולשפר את הכדאיות במהלך תהליך היווצרות EB זה עם hiPSCs בצפיפות נמוכה יותר15.

לפני הטמעת אורגנואידים בג'ל, האורגנואידים נשמרים בצלחת המיקרווול, והשינוי הבינוני צריך להיות עדין כדי למנוע הפרעה אפשרית. עדיף להשתמש פיפטה 200 μL כדי לשנות את המדיום במשך 5 הימים הראשונים. יש לחמם מראש את כל המדיה המשמשת לייצור אורגנואידים וסקולריים לפני השימוש. במיוחד לאחר הטבעה בג'ל, השימוש במדיה קרה יכול להנזיל חלקית את מטריצת קרום המרתף ולהשפיע על נישת הידרוג'ל תלת ממדית להיווצרות רשת כלי דם. צפיפות ההטבעה ואפילו הפיזור של האורגנואידים הם גם גורמים קריטיים להיווצרות רשת כלי הדם. הטבעה צפופה של אורגנואידים עלולה להוביל לאיחוי יתר של רשתות כלי הדם, בעוד שצפיפות הטבעה נמוכה עלולה להוביל להיווצרות רשת לא מספקת. זריעת 60-80 אורגנואידים לכל באר והזזת הצלחת בעדינות קדימה ואחורה מיד לאחר הוספתם לשכבה הראשונה של הג'ל התלת-ממדי יכולה להפיץ טוב יותר אורגנואידים אלה.

פרוטוקול זה ניתן לשינוי נוסף עבור יישומים שונים. לדוגמה, ניתן ליישם רמזי מחסום דם-מוח (BBB) כדי לרסן עוד יותר את תאי האנדותל של כלי הדם מהיווצרות ממשק BBB19,20,21,22,23,24,25. ניתן להתאים גם את הרכב ההידרוג'ל התלת-ממדי. לדוגמה, פיברין וויטרונקטין משמשים בדרך כלל ליצירת רשת כלי דם במבחנה 25,26,27,28,29,30,31,32. ניתן להשתמש במטריצת קרום המרתף ללא קולגן I להטמעה, מה שעשוי לפשט את תהליך ההטבעה ולספק גירויים מכניים שונים.

אף על פי שהאורגנואידים של כלי הדם הנוצרים מפרוטוקול זה יכולים לשמש באופן פוטנציאלי למידול מחלות או ליישומי סינון תרופות, מגבלה אחת היא שאורגנואידים אלה רק מחזירים בעיקר את כלי הדם הנימיים עם מעט כלי דם גדולים יותר. עבור מחקר המתמקד בכלי דם גדולים יותר, ייצור אורגנואידים עשוי לדרוש גירויים מכניים נוספים 24,31,32,33. חיבור אורגנואידים וסקולריים עם מחזור הדם, כגון השתלה לבעלי חיים34 או התקנים מיקרו-/ מאקרו-פלואידים עם משאבות זילוח33, עשוי לטפל בכך.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

ברצוננו להכיר בתמיכה הטכנית של המשאב המשותף למיקרוסקופיה קונפוקלית ומיוחדת של מרכז הסרטן המקיף ע"ש הרברט אירווינג באוניברסיטת קולומביה, שמומן בחלקו באמצעות מענק מרכז NIH (P30CA013696). עבודה זו נתמכת על ידי NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, ק. ו. ל.). איור 1A נוצר באמצעות BioRender.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנול (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 שבר חמור נגד ארנב IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152להרכיב מחדש עם 0.25 מ"ל 50% גליצרול,  לאחסן ב-20 מעלות; C עד שנה, יחס דילול לשימוש: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 שבר חמור נגד עזים IgG (H+L) מעבדות המחקר החיסוני של ג'קסון705-606-147מרכיבות מחדש עם 0.25 מ"ל 50% גליצרול,   יש לאחסן ב-20° C עד שנה, יחס דילול לשימוש: 1:1000
תוסף B27 פחות ויטמין A (50x)Gibco12587010 להפשיר ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע ממחזור הקפאה-הפשרה
BMP4ProSpecCYT-081להרכיב מחדש עם ddH2O סטרילי בריכוז של 100 ng/µ L, aliquot ומאחסנים ב-20 מעלות;
נוגדן C CD31 ABCAMAB28364יחס דילול: 1:400
צנטריפוגהEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10מייצרים את תמיסת המלאי ב-12 מ"מ עם DMSO, ומאחסנים ב-20 מעלות; C עד שנה.
Chroman 1Tocris7163/10להפוך את תמיסת המלאי ב-100 ומיקרו; M עם DMSO, ואחסן ב-20 מעלות; C עד שנה.
קולגן I קורנינג40236
מיקרוסקופ קונפוקליניקוןAXRMP/Ti2
קורנינג צלחות אלפלזיהקורנינג4441
רוזנת II FL דלפק תאים אוטומטיתרמו פישרAMQAF1000
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAXGibco10565018
DMEM/F-12, אבקתGibco12500062הכינו תמיסת מלאי פי 10 עם ddH2O ביוגראד ועקרו אותו עם 0.2 ומיקרו; מסנן M. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGמייצרים את פתרון המלאי ב-1 מ"מ עם DMSO, ומאחסנים ב-20 מעלות; C עד שנה.
נוגדן ERGCell Singali Technology97249יחס דילול: 1:400
סרום בקר עוברי - פרימיוםאטלנטה ביולוגיתS11150הפשרה ב-4 מעלות; C  ו-aliquot, חנות ב-  -20 מעלות; C עד חמש שנים, או לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C למשך עד חודש
FGF2ProSpecCYT557מורכב מחדש עם ddH2O סטרילי בריכוז של 100 ng/µ L, aliquot ומאחסנים ב-20 מעלות; C
Fluorodish Cell Dish Dish PrecisionInstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099להרכיב מחדש עם DMSO בריכוז של 12 מ"מ, לאחסן ב-20 מעלות; C
ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)תוסף Gibco15710064
GlutaMAX (100x)Gibco35050061
Heparin, 100 kUMilliporeSigma375095100KUלהרכיב מחדש עם ddH2O סטרילי בריכוז של 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
IncubatorThermo Scientific13998123
החלפת סרום נוקאאוטGibco10828028הפשרה ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסון ב-20° C, הימנע ממחזור הקפאה-הפשרה
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230הפשרה ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסון ב-80° ג, הימנע ממחזור הקפאה-הפשרה
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA, 100x)Gibco11140050
ביולוגיה מולקולרית כיתהקורנינגמים 46000CV
mTeSR פלוס ערכתSTEMCELL Technologies1001130להפשיר ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסון ב-20° ג, הימנע ממחזור הקפאה-הפשרה
תוסף N2 (פי 100)Gibco17502048להפשיר ב-4 מעלות; C, aliquot ואחסון ב-20° ג, הימנע ממחזור הקפאה-הפשרה
תמיסת NaOH (1 M)Cytiva  HyCloneSH31088.01
מדיום נוירו-בזאליGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121להרכיב מחדש עם 10 מ"ל סטרילי ddH2O, לאחסן ב-4 מעלות; C למשך עד שבועיים
paraformaldehyde, 20%Electron Microscopy Sciences15713Sמדולל עם
PBS PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ נוגדןR& יחסAF385: 1:400
תוסף פוליאמין (1000x)Sigma-AldrichP8483
Rapiclear Reagent Reagent, 1.49SUNJIN LABRC149001
נתרן ביקרבונט (7.5%)Gibco25080094
נתרן דאוקסיכולאט מונוהידראטThermofisherJ6228822להמיס עם ddH2O לתמיסת מלאי של 1% (wt/v)
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10מייצרים את תמיסת המלאי ב-1 מ"מ עם DMSO, ומאחסנים ב-20° C עד שנה.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50 מ"ל
כתם כחול טריפן (0.4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116מרכיב מחדש עם ddH2O סטרילי בריכוז של 100 ng/µ L, aliquot ואחסון ב-20° ג
דילול D

מקורות

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3d tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  7. Koike, H., et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).
  8. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  9. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).
  10. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  11. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  12. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  13. He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. Biorxiv. , (2021).
  14. He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. Biorxiv. , (2024).
  15. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  16. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).
  17. Hwang, Y. -S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11. Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  18. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates. Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).
  19. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).
  20. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).
  21. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).
  22. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  23. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  24. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).
  25. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).
  26. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  27. Kim, J., et al. Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network. PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).
  28. Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. Biorxiv. , (2019).
  29. Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system. Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).
  30. Haase, K., Kamm, R. D. Advances in on-chip vascularization. Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).
  31. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).
  32. Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).
  33. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255(2019).
  34. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

iPSCCEPT
יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.