הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67142

⸱

6 בספטמבר 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את התכנון, היצירה והיישום של פוספטאזות מווסתות רפמיצין. שיטה זו מספקת ספציפיות גבוהה ובקרה זמנית הדוקה של הפעלת phosphatase בתאים חיים.

תקציר

טירוזין פוספטאזים הם משפחה חשובה של אנזימים המווסתים תפקודים פיזיולוגיים קריטיים. לעתים קרובות הם אינם מווסתים במחלות אנושיות, מה שהופך אותם למטרות מפתח של מחקרים ביולוגיים. כלים המאפשרים ויסות של פעילות phosphatase הם אינסטרומנטליים בדיסקציה של תפקידם. גישות מסורתיות, כגון ביטוי יתר של מוטציות שליליות פעילות או דומיננטיות, או הפחתת רגולציה באמצעות siRNA, חסרות שליטה זמנית. מעכבי Phosphatase לעתים קרובות יש ספציפיות ירודה, והם רק מאפשרים לחוקרים לקבוע אילו תהליכים מושפעים עיכוב של phosphatase.

פיתחנו גישה כימוגנטית, מערכת רפמיצין מווסתת (RapR), המאפשרת ויסות אלוסטרי של תחום קטליטי של פוספטאז המאפשר בקרה זמנית הדוקה של הפעלת פוספטאז. מערכת RapR מורכבת מתחום iFKBP המוכנס לאתר אלוסטרי בפוספטאז. הדינמיקה המבנית הפנימית של תחום RapR משבשת את התחום הקטליטי, מה שמוביל להשבתה של האנזים. תוספת של רפמיצין מתווכת את היווצרות קומפלקס בין iFKBP לבין חלבון FRB מבוטא במשותף, אשר מייצב את iFKBP ומחזיר את הפעילות לתחום הקטליטי של הפוספטאז.

מערכת זו מספקת ספציפיות גבוהה ובקרה זמנית הדוקה של הפעלת phosphatase בתאים חיים. יכולותיה הייחודיות של מערכת זו מאפשרות זיהוי אירועים חולפים וחקירת מסלולי איתות בודדים במורד הזרם של פוספטאז. פרוטוקול זה מתאר קווים מנחים לפיתוח RapR-phosphatase, אפיונו הביוכימי וניתוח השפעותיו על איתות במורד הזרם וויסות מורפודינמיקה של תאים. הוא גם מספק תיאור מפורט של אסטרטגיה של הנדסת חלבונים, בדיקות במבחנה המנתחות את פעילות פוספטאז, וניסויי הדמיה של תאים חיים המזהים שינויים במורפולוגיה של התא.

מבוא

חלבון טירוזין פוספטאזות הם משפחה קריטית של חלבונים המעורבים בשפע של אירועי איתות תאי. הוכח כי הם ממלאים תפקיד מפתח בוויסות התפשטות תאים, נדידה ואפופטוזיס 1,2,3. כתוצאה מכך, חוסר ויסות של חלבון טירוזין פוספטאז מוביל למגוון של מחלות מתישותוהפרעות 4,5,6,7. חקר התפקוד הפיזיולוגי של פוספטזות טירוזין ותפקידן בהתפתחות פתולוגיות אלה עוכב היסטורית על ידי מחסור בכלים הדרושים לחקירת המורכבות של איתות פוספטאז8.

באופן מסורתי, פוספטזות נלמדות באמצעות שיטות שאין להן את הספציפיות הרצויה ו / או אינן מספקות שליטה זמנית על פעילותן. מגבלות קריטיות אלה של הכלים הזמינים מקשות על ניתוח תפקידים ספציפיים של פוספטזות במסלולי איתות. ביטוי יתר של מוטציות שליליות פעילות ודומיננטיות או הפחתת ויסות הביטוי של הפוספטאז מספקים ספציפיות אך חסרים שליטה זמנית ולעתים קרובות יכולים להפעיל מנגנוני פיצוי שיסתירו את הפונקציה האמיתית של האנזים.

מעכבים פרמקולוגיים מאפשרים ויסות זמני של פוספטאזות. עם זאת, מעכבי פוספטאז רבים ידועים לשמצה שאינם ספציפיים בשל ההרכב השמור היטב של האתר הפעיל בטירוזין פוספטאז9. בנוסף, בשל אילוצי תכנון, מעכבים המכוונים לאתר הקטליטי מפגינים חדירות נמוכה של קרום התא10. מגבלה נוספת של מעכבים היא שהם מאפשרים רק בדיקה של ההשפעות של הפעלת phosphatase11. לפיכך, יש צורך בכלים המאפשרים הפעלה ספציפית, מווסתת זמנית של פוספטאזות. כלים אלה יאפשרו לחוקרים לזהות את ההשפעות הישירות של הפעלת פוספטאז, ולהפריד אותם ממפל איתות מקבילי מרובים המופעלים לעתים קרובות על ידי גירויים ביולוגיים. חשוב לציין, שליטה זמנית הדוקה בפעילות מאפשרת זיהוי אירועים חולפים הנגרמים על ידי פוספטאז ומפרידה בין ההשפעות של פעילות פוספטאז חריפה וממושכת. שילוב של ויסות זמני עם ניתוח מוטציות יאפשר ניתוח מפורט של תפקידים ספציפיים של תחומים בודדים של הפוספטאז וחקירה של איתות במורד הזרםשלו 12.

כדי להתמודד עם היעדר היכולות הרצויות בכלים הקיימים, קבוצת קרגינוב פיתחה את מערכת Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. מערכת RapR משתמשת בתחום מתגים מהונדס, iFKBP, המאפשר ויסות אלוסטרי של חלבון הריבית (POI). החדרת תחום iFKBP במיקום אלוסטרי צמוד לאתר הקטליטי של נקודת העניין הופכת אותו לרגיש לוויסות על ידי רפמיצין. בהיעדר רפמיצין, iFKBP משבש את האתר הקטליטי עקב הדינמיקה המבנית הגבוהה במהותה של iFKBP ובכך משבית את נקודת העניין. התוספת של רפמיצין גורמת לאינטראקציה של iFKBP עם החלבון FRB (איור 1). זה גורם לייצוב של תחום המתג, אשר כתוצאה מכך משחזר את המבנה והתפקוד של התחום הקטליטי של נקודת העניין. ככזה, הכלי מאפשר הפעלה ספציפית וניתנת לוויסות זמני של נקודת העניין.

figure-introduction-1
איור 1: סכמטי של מערכת רפמיצין מווסתת RapR-Shp2. RapR מאפשר הפעלה אלוסטרית של החלבון המעניין בתוספת רפמיצין. נתון זה שונה מ- Fauser et al.12. קיצורים: iFKBP = FKBP12 הניתן להכנסת; FRB = תחום מחייב FKBP-רפמיצין; R = רפמיצין; Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הכלי RapR יכול להיות מיושם על משפחות חלבונים שונות. ניתן להשתמש בו כדי לווסת קינאזות חלבון, כמו גם פוספטאזות12,14. פרוטוקול זה יתמקד ביישום של כלי RapR כדי לשלוט Shp2 phosphatase. Shp2 הוא חלבון טירוזין פוספטאז המתבטא בכל מקום ומעורב בתהליכי איתות כגון התפשטות, הגירה, אימונומודולציה והתמיינות 1,16,17,18. דיסרגולציה של Shp2 נקשרה למספר סוגי סרטן מוצקים, לוקמיה מיאלואידית והפרעות התפתחותיות 5,7. עם זאת, Shp2 נפל קורבן לאותם חסרונות כלים כפי שתואר לעיל. כדי להילחם במגבלות אלה, RapR-Shp2, מבנה Shp2 ספציפי וזמני הניתן לווסת, פותח ואופיין12.

לפני הפיתוח של RapR-Shp2, היה ידוע כי Shp2 היה מעורב בנדידת תאים 19,20,21. עם זאת, תפקידו הספציפי באיתות המעורב בתהליך זה לא היה ידוע. כמו כן, לא היה ידוע באיזה סקאלת זמן Shp2 מווסת את נדידת התאים ואילו שינויים מורפודינמיים ספציפיים הוא גורם בנקודות זמן שונות של הפעלתו. יתר על כן, לא היה ברור אם הפעלה חריפה וממושכת של Shp2 תגרום להשפעות שונות. באמצעות RapR-Shp2 נמצא כי הפעלה חריפה של Shp2 גורמת להתפשטות תאים חולפים, עלייה בבליטות, קיטוב תאים ונדידה. מסלולים ספציפיים במורד הזרם של Shp2 המווסתים שינויים מורפודינמיים מובהקים זוהו גם הם12. פרוטוקול זה מספק פרטים לתכנון ואפיון RapR-Shp2, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להנחות את הפיתוח והיישום של פוספטזות RapR אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכנון של RapR-phosphatases

  1. תכנון
    הערה: באמצעות RapR-Shp2 כדוגמה, פרוטוקול זה מפרט את השלבים החשובים ליצירת טירוזין פוספטאז מווסת רפמיצין. הפרוטוקול המתואר ממוטב עבור Shp2 וייתכן שיהיה צורך בשינויים נוספים כדי להתאים לתכונות ספציפיות של פוספטזות בודדות.
    1. כדי להבטיח שהפעילות הקטליטית של Shp2 נשלטת אך ורק על ידי רפמיצין ולא על ידי מנגנונים אנדוגניים, הכניסו מוטציה לתוך הפוספטאז כדי לשמור אותו בקונפורמציה פעילה מכוננת. במקרה של Shp2, הציגו את מוטציית D61A.
      הערה: אם מוטציה מפעילה אינה מוצגת עבור PTPase ספציפי, אז גרסת RapR שלה תתפקד כמערכת מגודרת AND המווסתת על ידי אותות אנדוגניים ורפמיצין.
    2. זהה אתרי החדרת iFKBP בתחום הקטליטי של הפוספטאז באמצעות המבנה הגבישי כדי להנחות את הבחירה כפי שתואר קודם לכן13. אם מבנה אינו זמין, בצעו יישור רצף חומצות אמינו עם התחום הקטליטי של Shp2 phosphatase כדי לזהות את אתרי ההחדרה (איור 2A). ודא שאתר ההחדרה ממוקם בלולאה גמישה המצומדת מבנית לכיס הקטליטי אך ממוקמת הרחק מהכיס כדי למנוע הפרעה סטרית של קשירת המצע על ידי iFKBP.
      הערה: פרטים נוספים על ההוספה נדונים בדיון.
    3. שקול את סוג רצף המקשר שישמש בין תחום iFKBP שהוכנס לבין phosphatase של עניין. בחירת רצף המקשר האופטימלי חשובה ביותר להצלחת כלי ה-RapR, והיא נידונה בהמשך הדיון (איור 2B).

figure-protocol-1
איור 2: סכמטיות של שיקולים בעת תכנון RapR-phosphatase. (A) יישור של Shp2 (סגול), PTP1B (ירוק) ו-PTP-PEST (ורוד) כאשר אתרי ההחדרה השמורים מסומנים. (B) ייצוג של הכנסת מקשר בין Shp2 ו-iFKBP. (C) תחום פוספטאז של Shp2 בצבע בז' עם אתרי החדרה המסומנים בכחול. נתון זה שונה מ- Fauser et al.12. קיצורים: Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase; iFKBP = FKBP12 הניתן להכנסת; PTP = חלבון טירוזין פוספטאז; RapR = רפמיצין-מוסדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. יצירת RapR-phosphatase

  1. החדרת iFKBP לתוך phosphatase של עניין באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר שונה
    1. צור "megaprimer" קידוד iFKBP באמצעות PCR.
      1. תכננו פריימרים לסינתזה של "מגה-פריימר" המכילים 20-25 נוקלאוטידים המתחשלים לקצה 5' או 3' של iFKPB, רצף מקשר שיחבר את iFKPB לפוספטאז המעניין, ו-28-32 נוקלאוטידים המתאימים לאתר ההחדרה (איור 3). אשר כי המוצר המתקבל מכיל את iFKPB משני צדדיו שברים חישול לפני ואחרי אתר החדרת phosphatase של עניין.
      2. סנתז את iFKBP המכיל "megaprimer" באמצעות PCR (10 μL של 5x פולימראז buffer, 1 μL של 50 ng/μL תבנית DNA המכיל iFKBP, 2 μL של 10 mM dNTP, 0.5 μL של מלאי 100 μM של כל פריימר "megaprimer" [קדימה ואחורה], 35 μL של מים, 1 μL DNA פולימראז). פצל תגובת PCR זו לשתי תגובות נפרדות של 25 μL לפני הפעלת ה- PCR. הפעל את מחזור ה-PCR בהתאם להמלצות יצרן ה-DNA פולימראז או למחזור ה-PCR הסטנדרטי הבא: (i) 98°C למשך 2 דקות, (ii) 98°C למשך 30 שניות, (iii) 55-70°C למשך 30 שניות, (iv) 72°C למשך 30 שניות, (v) חזור על שלבים ii-iv 25x, (vi) 72°C למשך 2 דקות.
      3. לטהר את "megaprimer" באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose. יש לטעון את תכולת ה-PCR מהשלב הקודם לג'ל אגרוז 1% ולמרוח 120 וולט למשך כ-30 דקות. חפשו את ה"מגה-פריימר" באורך 400 נוקלאוטידים בג'ל, הוציאו את השבר וטיהרו באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראו טבלת חומרים).
        הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
    2. מוטגנזה מכוונת אתר שונה
      1. הכן את תגובת המוטגנזה מכוונת האתר השונה באמצעות פלסמיד המכיל את הגן של phosphatase של עניין כמו התבנית (5 μL של 5x חיץ פולימראז, 2 μL של 50 ng / μL תבנית, 2 μL של 10 mM dNTP, 10 μL של "megaprimer" חולץ, 2.5 μL של מים, 2.5 μL של DMSO, 1 μL של DNA פולימראז).
        הערה: הוספת DMSO בתערובת התגובה מורידה את טמפרטורת החישול22.
      2. הפעל את מחזור ה- PCR הבא: שלב דנטורציה ראשוני ב- 98 ° C למשך 3 דקות, ואחריו 18 מחזורים של שלבים רצופים של דגירה ב- 98 ° C למשך 30 שניות, 65 ° C עבור 20 שניות, 60 ° C עבור 20 שניות, 55 ° C עבור 20 שניות, 50 ° C עבור 20 שניות, 72 ° C במשך 18 דקות. הפעל את המחזור במשך הלילה (זמן המחזור הוא 7 שעות). לאחר השלמת המחזור, אחסן את תגובת ה- PCR ב- 4 מעלות צלזיוס.
        הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
      3. לאחר סיום המחזור, יש להוסיף 1 μL של אנזים DpnI ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
        הערה: DpnI יעכל את התבנית השיורית ויגדיל את התפוקה של המוצר המסונתז החדש.
      4. הפוך את המוצר המעוכל ל- DH5α תאים מתאימים בהתאם להוראות היצרן. צלחת את השינוי על לוחות אגר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה לבחירה (carbenicillin עבור pcDNA RapR-Shp2 לבנות). לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה. לאחר שהמושבות גדלו, אחסנו את צלחות LB ב 4 °C למשך עד חודש אחד.
        הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  2. בידוד מבנה DNA רצוי המכיל RapR-phosphatase
    1. ביצוע בדיקת PCR של מושבות חיידקים23. מכיוון שלא כל המושבות הגדלות על צלחת LB יכילו את הפלסמיד הרצוי, הקפד לסנן לפני בידוד ה- DNA של פלסמיד.
      הערה: השתמש בפריימרים עבור המסך שיתאים לתבנית ולגן iFKBP. ניתן לבצע את המסך באמצעות Taq polymerase mastermix (ראה טבלת חומרים).
    2. לאחר זיהוי מושבות חיוביות, יש לחסן מושבה חיובית אחת ב-3 מ"ל של מרק LB כולל אנטיביוטיקה מתאימה, לדגור ולנער בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
    3. הפקת DNA פלסמיד מהתרבית הנוזלית בהתאם להוראות היצרן עבור ערכת מיצוי ה- DNA של פלסמיד (ראה טבלת חומרים)
      הערה: מומלץ לרצף את מבנה RapR PTPase החדש שנוצר לפני המשך הערכה חוץ גופית .

figure-protocol-2
איור 3: סכמה של עיצוב פריימר ואסטרטגיית שיבוט מוטגנזה מכוונת אתר שונה. שלב 1 הוא סינתזה של iFKBP המכיל "megaprimer" עם "קצוות דביקים" חישול לאתר החדרת phosphatase של עניין, ושלב 2 הוא החדרת "megaprimer" לתוך phosphatase של עניין. נתון זה שונה מ Karginov et al.13. קיצור: iFKBP = FKBP12 הניתן להכנסת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הערכה של RapR-PTPase על ידי בדיקת פעילות חוץ גופית

הערה: פרוטוקול זה משמש להערכת הרגולציה של הפעילות של RapR-PTPase מהונדס. להלן מתואר ניתוח של Shp2 immunoprecipitated באמצעות שבר N-terminal פוספורילציה של פקסילין כמצע. ייתכן שיהיה צורך לבחור מצע אחר עבור PTPase ספציפי של עניין.

  1. יום 1
    1. צלחת 800,000 תאי HEK293T / באר בצלחת תרבית רקמה 6 בארות במדיה DMEM בתוספת תוספת L-גלוטמין (ריכוז סופי של 2 mM) ו 10% FBS על ידי נפח. מניחים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה.
  2. יום 2
    1. ברגע שהתאים הם ~60-80% מתמזגים, העבר אותם בהתאם לפרוטוקול היצרן המועדף של עוצר הטרנספקציה (ראה טבלת חומרים).
      1. דוגמה לפרוטוקול טרנספקציה: הוסף 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (pcDNA-mCherry-FRB ו- pcDNA-flag-RapR-Shp2, כל אחד) ל- 200 μL של DMEM ללא סרום ו- 6 μL של מגיב טרנספקציה ודגור על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסף 100 μL של תערובת transfection לכל באר של תאים. כלול דגימות נגועות במבני Shp2 שליליים פעילים ודומיננטיים כבקרה. יש לדגור למשך הלילה באינקובטור של 37°C ו-5%CO2 .
  3. יום 3
    1. הכנת חלבון-G ספארוז
      הערה: הכינו קצוות פיפטה חתוכים לפני הטיפול בספארוז. יש להשתמש בטיפים לחיתוך בכל שלב שבו מטפלים בספארוז. Sepharose צריך להיות resuspended ביסודיות בכל שלב לפני pipetting.
      1. יש להשהות מחדש ולקחת את הכמות המתאימה של Protein-G Sepharose לתוך צינור של 1.5 מ"ל. עבור כל באר בצלחת 6 בארות, להשתמש 10 μL של חלבון G Sepharose. לקבלת צלחת מלאה של 6 בארות, השתמש 60 μL של Sepharose.
      2. לשטוף את Sepharose עם 1 מ"ל של חיץ Lysis (ראה טבלה של חומרים). מיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,000 × גרם ולהסיר בזהירות את מאגר הליזיס. חזור על הפעולה פעמיים.
      3. להשהות מחדש את Sepharose ב 380 μL של חיץ Lysis. הוסף BSA לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ונוגדן (0.5 μL לכל דגימת IP, נוגדן נגד דגל [ראה טבלת חומרים]). הפוך על מסובב ב 4 ° C במשך 1.5 שעות.
        הערה: יש לקבוע את כמות הנוגדנים האופטימלית באופן ניסיוני עבור כל נוגדן בו נעשה שימוש.
    2. הכינו תאים למשקעים חיסוניים.
      1. הוסף כמות מתאימה של רפמיצין (תמיסת מלאי של 1 מ"מ באתנול) לריכוז סופי של 1 מיקרומטר או הוסף את אותו נפח אתנול (בקרה שלילית) לדגימות. דגירה במשך שעה אחת באינקובטור של 37°C ו-5%CO2 .
      2. מניחים את צלחת 6-באר עם תאים על קרח בעדינות לשטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS קר. לשאוף את PBS ולהוסיף 300 μL של חיץ ליזה (עם 1 מיקרומטר רפמיצין עבור דגימת phosphatase פעיל או נפח שווה ערך של אתנול בדגימת הבקרה השלילית) ולגרד עם מגרד התא. העבירו את הדגימות לצינורות של 1.5 מ"ל ולמיקרו-צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם ב-4°C.
      3. העבר 20 μL של supernatant לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל כדי לבדוק את רמות הביטוי. הוסף 20 μL של 2x Laemmli buffer עם 5% β-mercaptoethanol לכל צינור כדי לשמש לבדיקת ביטוי ולדגור ב 95-100 ° C במשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט הנותר עבור המשקעים החיסוניים בשלב 3.3.3.3.
    3. משקעים חיסוניים של RapR-Shp2
      1. שטפו את החלבון-G ספארוז משלב 3.3.1.3. עם 1 מ"ל של חיץ ליזיס. מיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,000 × גרם ב-4°C בכל פעם ושאפו בזהירות את חיץ הליזיס. חזור על שלב זה 2x.
      2. באמצעות קצוות חתוכים, להשהות מחדש את Sepharose ב Lysis Buffer (50 μL לכל דגימה, כך עבור צלחת 6 באר, resuspend ב 300 μL של Lysis Buffer). פיפטה 50 μL של תערובת Sepharose מרחף לתוך צינור חדש נפרד 1.5 מ"ל עבור כל דגימה.
        הערה: יישאר ספרוז מושהה בתמיסת חיץ ליזיס עקב נפח הספארוז.
      3. הוסף את הסופרנאטנט שנותר מהתאים המוכנים משלב 3.3.2.3 לכל צינור של ספרוז. סובבו ב-4°C למשך 1.5-2 שעות.
    4. בדיקת פעילות פוספטאז
      הערה: מצע Shp2 צריך להיות מוכן על ידי זרחון מטוהר N-terminal קטע של פקסילין באמצעות קינאז Src פעיל באופן מכונן בעקבות פרוטוקול תגובת קינאזשתואר קודם לכן 12.
      1. לקראת סוף שלב 3.3.3.3, הכינו את תמיסת פוספו-פקסילין. לכל דגימה, הוסף תמיסת פוספו-פקסלין (ריכוז סופי של 3 מיקרוגרם/מ"ל) ל-40 מיקרוליטר של חיץ אימידזול כולל (ראה טבלת חומרים). הוסף רפמיצין לריכוז הסופי של 1 מיקרומטר לאליציטוט של תמיסת פוספו-פקסלין עבור דגימות RapR-Shp2 מופעלות ונפח שווה ערך של אתנול לתמיסה עבור דגימות לא מופעלות.
      2. כוונו את שייקר החימום ל-32°C.
        הערה: פוספטזים אחרים עשויים להזדקק לטמפרטורה שונה לפעילות מיטבית.
      3. לשטוף Sepharose עם דגימות משלב 3.3.3.3 2x עם 0.5 מ"ל של חיץ Lysis (ראה טבלה של חומרים). שטפו את הדגימות 2x עם 0.5 מ"ל של Wash Buffer. כל חיץ צריך להכיל רפמיצין ב 1 מיקרומטר עבור דגימות מופעלות או נפח שווה ערך של אתנול עבור דגימות לא מופעלות. הסירו כמה שיותר חיץ לאחר השטיפה הסופית.
        הערה: ברגע שמגיעים לשלב זה, כדאי להשתמש בפיפט כדי להסיר כמויות סופיות של חיץ לאט ובזהירות כדי לוודא שאף אחד מהספארוז אינו שואף. כל חיץ שנותר ישפיע על ריכוז פוספו-פקסילין ויוביל לקריאה לא מדויקת.
      4. הוסף 40 μL של תערובת חיץ פוספו-פקסילין מוכן Imidazole לכל דגימה, עם או בלי רפמיצין (תלוי דגימה). מערבבים בעדינות רבה ומכניסים מיד לשייקר החימום ודגרים במשך 40 דקות בחום של 32°C. כוונו את שייקר החימום למינימום של 1,000 סל"ד כדי לוודא שהדגימה נסערת לחלוטין למשך הדגירה.
      5. עצור את התגובה על ידי הוספת 40 μL של 2x Laemmli Buffer לכל דגימה. לדגור את הדגימות ב 95-100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. מצננים את הדגימות.
      6. טען 15 μL מכל דגימה (כולל דגימות הליזט משלב 3.3.2.3.) על ג'ל SDS-polyacrylamide הדרגתי של 4-15% והפעל פרוטוקול כתם מערבי סטנדרטי באמצעות ממברנות PVDF.
      7. כתם באמצעות נוגדן anti-Flag כדי לזהות את מבנה RapR-Shp2, anti-mCherry כדי לזהות mCherry-FRB, ו-anti-pY118 או anti-pY31 paxillin כדי לזהות זרחן פקסילין.
        הערה: הכתמים המערביים המתקבלים צריכים להיראות דומים לאיור 4.

4. ניתוח פעילות RapR-Shp2 בתאים חיים

הערה: פרוטוקול זה משמש לקביעת היכולת של RapR-Shp2 לפרק מצעים אנדוגניים ולגרום לאיתות במורד הזרם. RapR-PTPases אחרים ידרשו ניתוח של המצע והמסלולים הספציפיים שלהם.

  1. יום 1
    1. צלחת 198,000 תאי A431 / באר בצלחת תרבית רקמה 6 בארות במדיה DMEM בתוספת 10% FBS ו- L-גלוטמין (ריכוז סופי של 2 mM). מניחים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה.
  2. יום 2
    1. להדביק תאים עם מבנים אדנו-ויראליים המבטאים RapR-Shp2 ו FRB על ידי הוספת אדנווירוס ישירות למדיה כבר בצלחת. השאירו את אדנו-וירוס על התאים באינקובטור של 37°C ו-5%CO2 למשך הלילה. השתמש בתאים נגועים ב- FRB רק כבקרה שלילית.
      הערה: כמויות אדנווירוס יצטרכו להיקבע על בסיס כל מקרה לגופו תלוי titer.
  3. יום 3
    1. הרעיבו תאי A431 על ידי דגירה ב-DMEM עם 0.5% FBS במשך 4 שעות לפני הניסוי.
    2. הוסף רפמיצין לריכוז סופי של 1 מיקרומטר או לאותו נפח אתנול (בקרה שלילית) לתאים למשך 2-4 שעות.
      הערה: הדגירה יכולה להיות שונה עבור פוספטזות אחרות.
    3. מניחים את צלחת 6-באר עם תאים על קרח בעדינות לשטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS קר. שאפו את PBS, הוסיפו 300 מיקרוליטר של חיץ ליזיס (ראו טבלת חומרים), וגרדו במרץ עם מגרד תאים. העבירו את הדגימות לצינורות של 1.5 מ"ל ולמיקרוצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 2,000 × גרם ב-4°C.
    4. העבר 250 μL מכל דגימה לצינור חדש של 1.5 מ"ל. הוסף 250 μL של חיץ 2x Laemmli עם 5% β-מרקפטואתנול ודגור ב 95-100 ° C במשך 5 דקות.
    5. טען 25 μL מכל דגימה על ג'ל SDS-PAGE הדרגתי של 4-15% והפעל פרוטוקול כתם מערבי סטנדרטי באמצעות ממברנות PVDF.
    6. הערך את הזרחן בתיווך RapR-Shp2 של EGFR ו-PLCγ באמצעות נוגדנים נגד pY992 EGFR ונוגדנים נגד pY783 PLCγ. הערך את ההפעלה במורד הזרם של MAP kinase Erk1/2 על ידי הערכת הזרחן שלו על שאריות pT202/pY204.
      הערה: הכתמים המערביים המתקבלים צריכים להיראות דומים לאיור 5.

5. ניתוח שינויים מורפודינמיים הנגרמים על ידי הפעלת RapR-Shp2 בתאי HeLa באמצעות דימות תאים חיים

הערה: פרוטוקול זה משמש לקביעת ההשפעה של הפעלת RapR-Shp2 על היווצרות בליטות תאים, התפשטות תאים ונדידה.

  1. יום 1
    1. צלחת 700,000 תאי HeLa בצלחת תרבית תאים 35 מ"מ ומניחים באינקובטור 37 ° C ו 5% CO2 . אפשר לתאים להיצמד לצלחת (~ 2-3 שעות).
    2. בצע טרנספבקט של התאים בהתאם לפרוטוקול היצרן המועדף של מגיב טרנספקציה (ראה טבלת חומרים).
      1. פרוטוקול טרנספקציה לדוגמה: הוסף 0.5 מיקרוגרם של DNA (פלסמידים pcDNA-mCherry-FRB ו- pcDNA-Venus-RapR-Shp2, כל אחד) ל- 100 μL של DMEM ללא סרום ו- 6 μL של מגיב טרנספקציה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאים ודגרים לילה באינקובטורCO2 של 37°C ו-5%. השתמש בתאים נגועים pcDNA-mCherry-FRB רק כבקרה שלילית.
    3. ציפוי הדמיה חיה #1.5 25 מ"מ זכוכית עגולה מכסה עם פיברונקטין (5 מ"ג / ליטר) על ידי דגירה במשך 1 שעה ב 37 ° C.
  2. יום 2
    1. שטפו את מכסה הזכוכית המצופה עם PBS.
    2. לוחים את תאי HeLa הנגועים על מכסה הזכוכית המצופה במדיה DMEM בתוספת 10% FBS ו- L-גלוטמין (ריכוז סופי של 2 mM) כדי להשיג מפגש של 30% 4 שעות לפני ההדמיה.
    3. שעתיים לאחר הציפוי, העבירו בעדינות את המדיה שבצלחת למדיה שחוממה מראש ללא סרום Leibovitz L-15 למשך שעתיים.
    4. הכתימו את התאים בכתם קרום פלזמה אדום עמוק CellMask בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    5. הניחו את המכסה בתא הדמיה נקי (ראו טבלת חומרים). הוסף 1 מ"ל של מדיה L-15 שחומם מראש ולכסות עם 1 מ"ל של שמן מינרלי שחומם מראש כדי למנוע אידוי. שמור על התא בטמפרטורה של 37°C עד להדמיה.
    6. דמיינו את התאים בטמפרטורה של 37°C באמצעות שלב מחומם.
      1. בחר ערוצים מתאימים להדמיה של מבנה RapR ו- CellMask להדמיית אפיפלואורסצנטיות. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במטרה 40x שאליה בוצעה הפניה (ראה טבלת חומרים) ובערכות המסננים הבאות: מסנני עירור 514/10 ומסנני פליטה 540/21 עבור הדמיית Venus-RapR-Shp2, מסנני עירור 561/10 ומסנני פליטה 595/40 עבור הדמיית mCherry-FRB, ומסנני עירור 640/20 ופליטת 655LP עבור הדמיית CellMask Deep Red. השתמש במראה פוליכרואית מרובת פסים לכל התעלות הפלואורסצנטיות (ראה טבלת חומרים).
      2. צלם תמונות כל 2 דקות במשך 4-4.5 שעות.
        הערה: שינויים מורפודינמיים מהירים יותר ידרשו רכישה תכופה יותר.
      3. לאחר שעה של הדמיה, הוסף רפמיצין לריכוז סופי של 1 מיקרומטר כדי לעורר RapR-Shp2.

6. ניתוח תמונות

הערה: פרוטוקול זה יתאר את היצירה של מסיכות תא בהתבסס על . קבצי מחסנית TIF שנאספו מניסויי הדמיה חיים. לאחר מכן הוא יתאר כיצד ליצור מאקרו ב- ImageJ כדי לנתח את המסכות, מה שיביא לגיליון אלקטרוני של אזור התא שלאחר מכן ינותח לשינויים לאורך זמן. לבסוף, הפעילות הבולטת והנסוגה של התא תנותח באמצעות Metamorph.

  1. צור מסיכה בינארית של תמונות CellMask באמצעות הפונקציה MovThresh מחבילת התוכנהCellGeo 24.
  2. העתק את התיקיה MovThresh לתיקיית ניתוח התמונות.
  3. העתק את CellMask או תמונות ערוץ סמן ממברנה אחרות לתיקייה MovThresh.
    1. אם צולמו תאים מרובים במיקום אחד, חתכו את התמונות כדי ליצור קבצים הכוללים תא אחד בלבד לפני יצירת המסיכה ב- MatLab.
  4. ודא שהספרייה מוגדרת כראוי לתיקייה MovThresh ב- MatLab.
  5. הפעל את MovThresh.
  6. ייבא ערימות תמונות אחת בכל פעם.
  7. בחר Smoothed Curve ולאחר מכן הפעל את Rethreshold.
  8. שמור כמספר Mask_Image בתיקיה חדשה בשם 'מסיכות'.
  9. לאחר שכל אוספי התמונות יומרו למסיכות, פתחו את אוספי התמונות בתוכנת ImageJ25.
    1. ניתוח אזור התא ב- ImageJ
      1. פתחו את כל אוספי התמונות של 'מסיכות' ב-ImageJ.
      2. התאימו את קביעת המידות לשטח.
      3. לחץ על תוספים | פקודות מאקרו | שיא.
      4. קליק תהליך | בינארי | הפוך בינארי.
        1. בחר באפשרות ברירת המחדל .
          הערה: אל תלחץ על שום דבר נוסף בעת הקלטת המאקרו. אם שלבים נוספים כלולים, מומלץ להפעיל מחדש משלב 6.9.1.3.
      5. לחץ על נתח | לנתח חלקיקים.
        1. בטל את הסימון של כל התיבות מלבד סיכום.
      6. סיים להקליט ולחץ על צור את המאקרו.
      7. לחץ על הפעל עבור כל אוסף תמונות לאחר בחירתו ושמור את טבלת התוצאות עבור כל אוסף תמונות. אפשרות ברירת המחדל תישמר כקובץ csv.
      8. שמור את המאקרו והשתמש בו שוב לניתוחים עתידיים (אופציונלי).
    2. עיבוד נתוני אזור בגיליון אלקטרוני
      1. עבור כל תא מנותח, ממוצע את שטח התא מתמונות שצולמו לפני ההפעלה עם רפמיצין.
      2. חלק את כל ערכי השטח בשטח הממוצע של התא שקדם לחיבור רפמיצין.
      3. חשב את הערך הממוצע עבור כל נקודת זמן עבור כל התאים המצולמים וקבע את מרווחי בר-סמך של 90%. התווה את הנתונים.
    3. ניתוח פעילות בולטת של תאים
      1. העתק את התיקייה ProActive לתיקיית ניתוח התמונות.
      2. העתק את אוספי התמונות עם מסיכה מ- MovThresh לתיקיית ProActive החדשה שנוצרה.
      3. פתח את MatLab והגדר את הספרייה לתיקייה ProActive.
      4. הפעל את ProActive.
      5. יבא את קובצי אוסף התמונות של התאים עם מסיכה לממשק המשתמש הגרפי ProActive.
      6. הגדר את סוג הפעילות. ניתוח פעילות בולטת יפיק נתונים שנצברו באזור ; ניתוח פעילות פסילה יפיק נתונים שאבדו באזור ; והפעילות הכוללת תפיק נתוני שינוי שטח כוללים (הן אבודים והן רווחים).
      7. הגדר אזור להגדרת נורמליזציה.
      8. החלקה על העקומה באמצעות ערכי הסף המוצעים או באמצעות ממוצע לסף מחדש בכל נקודת זמן. פעולה זו ממוצעת את ערכי הסף על פני חלון מסוים, וממזערת את חוסר העקביות בערכי הסף בין נקודות זמן.
      9. לחץ על קובץ | שמירה בשם | תוצאות ( .mat)
        1. אם אתה מעבד את כל שלושת סוגי פעילות האזור, תן לקובצי הנתונים המעובדים את השם הבא: ProResultData #, RetResultData # או ResultData #.
          הערה: כלול את הרווח לפני המספר ומספר את הנתונים החל מ - 1.
      10. חזור על הפעולה משלב 6.9.3.6. לכל אוספי התמונות עם מסיכה שיובאו.
      11. לאחר שכל התאים עובדו, סגור את ממשק המשתמש הגרפי הפרואקטיבי.
      12. פתח את DataToFileTotalArea בעורך Matlab כדי לעבד קבצי "ResultData" של הפעילות הכוללת.
      13. שנה את מספר התאים כך שיתאים למספר קבצי התוצאות שנוצרו. אם 7 תאים עובדו בשלבים 6.9.3.5–6.9.3.10, ודא ששלוש השורות הראשונות של קובץ ה- Script הן כדלקמן:
        filename='נתוני תוצאה ';
        תאים=1:7;
        פיגור = 1;
      14. לחץ על הפעל וחזור על פעולה זו עבור DataToFileProtArea ו- DataToFileRetArea לעיבוד נתונים בולטים ופסילות, בהתאמה. ניתוח זה יפיק שלושה קבצי טקסט "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" ו- "AllCellsRet.txt"
      15. פתח את קבצי .txt בגיליון אלקטרוני ונרמל כמו בסעיף 6.9.2. חשב את הערך הממוצע עבור כל נקודת זמן עבור כל התאים המצולמים וקבע רווחי סמך של 90%. התווה את הנתונים.
        הערה: החלקות המתקבלות מהשלבים לעיל אמורות להיראות דומות לאיור 6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 4 מדגים תוצאות שניתן לצפות להן מבדיקת פעילות פוספטאז המבוססת על פקסילין. בניסוי זה, פעילות פוספטאז שלילית פעילה ודומיננטית של Shp2 הושוותה לזו של RapR-Shp2 פעיל ולא פעיל באמצעות פוספו-פקסילין כקריאה. מבני Shp2 עברו זירוז חיסוני ונתונים לבדיקת הפעילות כמתואר בפרוטוקול. קריאות הפוספו-פקסילין עבור Shp2 פעיל ו-RapR-Shp2 פעיל היו דומות, מה שמצביע על כך שה-RapR-Shp2 הפעיל לא הושפע לרעה מהכנסת תחום RapR והוא שמר על פעילות מלאה לאחר הפעלתו. Shp2 שלילי דומיננטי ו-RapR-Shp2 לא פעיל היו דומים גם ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים לפיתוח, אפיון ויישום של פוספטאזות מבוקרות כימוגנטית. הכלי RapR-Shp2 מסתמך על מתג מווסת רפמיצין המוכנס לתחום הקטליטי Shp2. כוחו של כלי זה הוא הספציפיות ואת השליטה הטמפורלית הדוקה של פעילות phosphatase. הכלי ישים לפוספטזות אחרות, ובשילוב עם טכנולוגיית RapR-TAP שתוארה קודם לכן, מאפשר שחזור של מסלולי איתות בודדים במורד הזרם26. היכולות הייחודיות של גישת RapR אפשרו לחוקרים לזהות אירועים חולפים הנגרמים על ידי הפעלת Shp2 ולנתח מסלולי איתות ס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחברים מודים לד"ר ג'ורדן פאוזר על תרומתה לפיתוח RapR-Shp2 והפרוטוקולים הקשורים אליו. העבודה נתמכה על ידי פרס 5R35GM145318 מ-NIGMS, פרס R33CA258012 מ-NCI, ופרס P01HL151327 מ-NHLBI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#1.5 כיסויי זכוכית 25 מ"מ עגוליםWarner Instruments64-0715
צינורות 1.5 מ"לארה"ב Scientificcc7682-3394
2x Laemmli Bufferעבור 500 מ"ל: 5.18 גרם Tris-HCL, 131.5 מ"ל גליצרול, 52.5 מ"ל 20% SDS, 0.5 גרם כחול ברומופנול, pH סופי 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומיBiorad4561096
5x Phusion Plus BufferThermo ScientificF538L
A431 תאיםATCCCRL-1555
AgarsoseGoldBiotechA-201
Attofluor תאתאים invitrogenA7816
Benchmark סרום בקר עוברי (FBS)Gemini Bio-products100-106משולש 0.1 ומיקרו; m בריג מסונן סטרילי
35,30 w/v %Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN/AN/Aפורסם ב 10.1083/jcb.201306067
CellMask צבע ממברנת פלזמה אדום עמוקinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMixGenesee42-138
DH5a מוכשר תאיםNEBC2987H
DMEMקורנינג15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
סולם DNAGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI אנזיםNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, ריאגנטים של קלילנד
EGTAAcros409910250
פיברונקטין מפלזמת בקרסיגמאF1141
FuGENE(R) 6 מגיב טרנספקציהPromegaE2692מיצוי ג'ל מגיב טרנספקציה
ThermoScientificK0692ערכת מיצוי ג'ל GeneJET
ג'ל כתם חומצת גרעין ירוקהGoldBioG-740-500
ג'ל טעינת צבע סגול 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 מ"ל
תאי HEK 293T ATCCCRL-11268
תאי HeLaATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
ImageJ תוכנה לעיבודN/AN/A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
מאגר25 מ"מ אימידזול pH 7.2, 2.5 מ"מ EDTA, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ DTT
KClסיגמאP-4504
L-15 1xקורנינג10-045-CV
LB אגרפישרBP1425-2
מאגרליזה20 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8, 50 מ"מ KCl, 1 מ"מ EGTA, 1% NP40
עדכון MATLAB MathWorksN/AR 2022b שימש להפעלת פונקציות CellGeo
אוטומציה וניתוח תמונות Metamorph MicroscopyN/AN/A
MgCl2Fisher ChemicalM33-500
שמן מינרליSigmaM5310
MiniPrep KitGene בחירה96-308
Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים 12 בארBio-Rad4561085
ביולוגיה מולקולרית כיתהקורנינג46-000-CV
Multiband Polychroic MirrorChroma Technology89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanSAPO 40x אובייקטיביאולימפוסN / A
PBS w/o Ca ו- MgCorning21-031-CV
צינורות PCR labForce1149Z650.2 מ"ל 8 רצועות צינורות וכובעים, רצועה קשיחה מחוברת בנפרד מכסי כיפה
Phusion בתוספת DNA פולימראזתרמו מדעיF630S
פריימריםIDT
חלבון-G SepharoseMillipore16-266
PVDF ממברנותBioRad1620219Immun-Blot כריכי נייר PVDF/פילטר
רפמיציןפישרAAJ62473MF
0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ EDTA, 1x [-] נתרןקורנינג25-053-CI
Tris-אצטט-EDTA (TAE) 50xפישרBP1332-1לאלקטרופורזה
מאגר20 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8, 50 מ"מ KCl, 100 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EGTA, 1% NP40
β-מרקפטואתנולפישר כימיקלO3446I-100
<נוגדנים חזקים>
אנטי EGFRאיתות תאי2232
אנטי-ERK 1/2 איתותתאי9102
נוגדן נגד דגלMillipore-SigmaF3165
נוגדן נגד GAPDHinvitrogenAM4300
נוגדן נגד GFPClontech632380
נוגדן נגד mCherryinvitrogenM11217
נוגדן נגד פקסיליןתרמו פישרBDB612405
אנטי-פוספו-EGFR Y992 איתות תא נוגדן2235
אנטי-פוספו-ERK 1/2 T202/Y204 איתותתאי9101
אנטי-פוספו-פקסילין Y31 נוגדןMillipore-Sigma05-1143
אנטי-פוספו-PLC וגמא; Y783 איתותתאי14008
אנטי-PLC וגמא; איתות תאי נוגדנים5690
ערכת מידזול תוכנת מים כביסה נוגדנים נוגדן נוגדנים נוגדנים

מקורות

  1. Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
  2. Niogret, C., et al. Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  3. Wang, Y. -C., et al. Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling. J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).
  4. Yu, M., et al. The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK. Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).
  5. Lauriol, J., et al. Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines. J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).
  6. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 29, 465-468 (2001).
  7. Xu, R., et al. Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia. Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).
  8. Mustelin, T., et al. Protein tyrosine phosphatases. Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).
  9. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma. Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).
  10. Guo, M., et al. Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials. Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).
  11. Weiser, D. C., Shenolikar, S. Use of protein phosphatase inhibitors. Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).
  12. Fauser, J., et al. Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity. J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).
  13. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).
  14. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).
  15. Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineering proteins for allosteric control by light or ligands. Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).
  16. Wang, Y., et al. Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth. EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).
  17. Wang, L., et al. SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation. FASEB J. 35, e21106(2021).
  18. Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).
  19. Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials. Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).
  20. Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration. Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).
  21. Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion. J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).
  22. Kramer, M. F., Coen, D. M. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).
  23. Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies. Biotechniques. 7, 689-690 (1989).
  24. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  26. Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. Kinase Signaling Networks. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).
  27. Mercan, F., Bennett, A. M. Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).
  28. Karginov, A. V., et al. Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP. J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).
  29. Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. Optochemical activation of kinase function in live cells. Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בקרת רפמיציןכלים כימוגנטייםהפעלת פוספטאזבקרה אלוסטריתפוספטאז SHIP-2תאי HEK-293Tבדיקת שיקוע חיסוניWestern Blotמורפודינמיקה של תאים
פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.