פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין

Summary

פרוטוקול זה מתאר את התכנון, היצירה והיישום של פוספטאזות מווסתות רפמיצין. שיטה זו מספקת ספציפיות גבוהה ובקרה זמנית הדוקה של הפעלת phosphatase בתאים חיים.

Abstract

טירוזין פוספטאזים הם משפחה חשובה של אנזימים המווסתים תפקודים פיזיולוגיים קריטיים. לעתים קרובות הם אינם מווסתים במחלות אנושיות, מה שהופך אותם למטרות מפתח של מחקרים ביולוגיים. כלים המאפשרים ויסות של פעילות phosphatase הם אינסטרומנטליים בדיסקציה של תפקידם. גישות מסורתיות, כגון ביטוי יתר של מוטציות שליליות פעילות או דומיננטיות, או הפחתת רגולציה באמצעות siRNA, חסרות שליטה זמנית. מעכבי Phosphatase לעתים קרובות יש ספציפיות ירודה, והם רק מאפשרים לחוקרים לקבוע אילו תהליכים מושפעים עיכוב של phosphatase.

פיתחנו גישה כימוגנטית, מערכת רפמיצין מווסתת (RapR), המאפשרת ויסות אלוסטרי של תחום קטליטי של פוספטאז המאפשר בקרה זמנית הדוקה של הפעלת פוספטאז. מערכת RapR מורכבת מתחום iFKBP המוכנס לאתר אלוסטרי בפוספטאז. הדינמיקה המבנית הפנימית של תחום RapR משבשת את התחום הקטליטי, מה שמוביל להשבתה של האנזים. תוספת של רפמיצין מתווכת את היווצרות קומפלקס בין iFKBP לבין חלבון FRB מבוטא במשותף, אשר מייצב את iFKBP ומחזיר את הפעילות לתחום הקטליטי של הפוספטאז.

מערכת זו מספקת ספציפיות גבוהה ובקרה זמנית הדוקה של הפעלת phosphatase בתאים חיים. יכולותיה הייחודיות של מערכת זו מאפשרות זיהוי אירועים חולפים וחקירת מסלולי איתות בודדים במורד הזרם של פוספטאז. פרוטוקול זה מתאר קווים מנחים לפיתוח RapR-phosphatase, אפיונו הביוכימי וניתוח השפעותיו על איתות במורד הזרם וויסות מורפודינמיקה של תאים. הוא גם מספק תיאור מפורט של אסטרטגיה של הנדסת חלבונים, בדיקות במבחנה המנתחות את פעילות פוספטאז, וניסויי הדמיה של תאים חיים המזהים שינויים במורפולוגיה של התא.

Introduction

חלבון טירוזין פוספטאזות הם משפחה קריטית של חלבונים המעורבים בשפע של אירועי איתות תאי. הוכח כי הם ממלאים תפקיד מפתח בוויסות התפשטות תאים, נדידה ואפופטוזיס ^1,2,3. כתוצאה מכך, חוסר ויסות של חלבון טירוזין פוספטאז מוביל למגוון של מחלות מתישות^{והפרעות} 4,5,6,7. חקר התפקוד הפיזיולוגי של פוספטזות טירוזין ותפקידן בהתפתחות פתולוגיות אלה עוכב היסטורית על ידי מחסור בכלים הדרושים לחקירת המורכבות של איתות פוספטאז⁸.

באופן מסורתי, פוספטזות נלמדות באמצעות שיטות שאין להן את הספציפיות הרצויה ו / או אינן מספקות שליטה זמנית על פעילותן. מגבלות קריטיות אלה של הכלים הזמינים מקשות על ניתוח תפקידים ספציפיים של פוספטזות במסלולי איתות. ביטוי יתר של מוטציות שליליות פעילות ודומיננטיות או הפחתת ויסות הביטוי של הפוספטאז מספקים ספציפיות אך חסרים שליטה זמנית ולעתים קרובות יכולים להפעיל מנגנוני פיצוי שיסתירו את הפונקציה האמיתית של האנזים.

מעכבים פרמקולוגיים מאפשרים ויסות זמני של פוספטאזות. עם זאת, מעכבי פוספטאז רבים ידועים לשמצה שאינם ספציפיים בשל ההרכב השמור היטב של האתר הפעיל בטירוזין פוספטאז⁹. בנוסף, בשל אילוצי תכנון, מעכבים המכוונים לאתר הקטליטי מפגינים חדירות נמוכה של קרום התא¹⁰. מגבלה נוספת של מעכבים היא שהם מאפשרים רק בדיקה של ההשפעות של הפעלת phosphatase¹¹. לפיכך, יש צורך בכלים המאפשרים הפעלה ספציפית, מווסתת זמנית של פוספטאזות. כלים אלה יאפשרו לחוקרים לזהות את ההשפעות הישירות של הפעלת פוספטאז, ולהפריד אותם ממפל איתות מקבילי מרובים המופעלים לעתים קרובות על ידי גירויים ביולוגיים. חשוב לציין, שליטה זמנית הדוקה בפעילות מאפשרת זיהוי אירועים חולפים הנגרמים על ידי פוספטאז ומפרידה בין ההשפעות של פעילות פוספטאז חריפה וממושכת. שילוב של ויסות זמני עם ניתוח מוטציות יאפשר ניתוח מפורט של תפקידים ספציפיים של תחומים בודדים של הפוספטאז וחקירה של איתות במורד הזרם^{שלו 12}.

כדי להתמודד עם היעדר היכולות הרצויות בכלים הקיימים, קבוצת קרגינוב פיתחה את מערכת Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. מערכת RapR משתמשת בתחום מתגים מהונדס, iFKBP, המאפשר ויסות אלוסטרי של חלבון הריבית (POI). החדרת תחום iFKBP במיקום אלוסטרי צמוד לאתר הקטליטי של נקודת העניין הופכת אותו לרגיש לוויסות על ידי רפמיצין. בהיעדר רפמיצין, iFKBP משבש את האתר הקטליטי עקב הדינמיקה המבנית הגבוהה במהותה של iFKBP ובכך משבית את נקודת העניין. התוספת של רפמיצין גורמת לאינטראקציה של iFKBP עם החלבון FRB (איור 1). זה גורם לייצוב של תחום המתג, אשר כתוצאה מכך משחזר את המבנה והתפקוד של התחום הקטליטי של נקודת העניין. ככזה, הכלי מאפשר הפעלה ספציפית וניתנת לוויסות זמני של נקודת העניין.

איור 1: סכמטי של מערכת רפמיצין מווסתת RapR-Shp2. RapR מאפשר הפעלה אלוסטרית של החלבון המעניין בתוספת רפמיצין. נתון זה שונה מ- Fauser et ^al.12. קיצורים: iFKBP = FKBP12 הניתן להכנסת; FRB = תחום מחייב FKBP-רפמיצין; R = רפמיצין; Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הכלי RapR יכול להיות מיושם על משפחות חלבונים שונות. ניתן להשתמש בו כדי לווסת קינאזות חלבון, כמו גם פוספטאזות^12,14. פרוטוקול זה יתמקד ביישום של כלי RapR כדי לשלוט Shp2 phosphatase. Shp2 הוא חלבון טירוזין פוספטאז המתבטא בכל מקום ומעורב בתהליכי איתות כגון התפשטות, הגירה, אימונומודולציה והתמיינות 1,16,17,18. דיסרגולציה של Shp2 נקשרה למספר סוגי סרטן מוצקים, לוקמיה מיאלואידית והפרעות התפתחותיות ^5,7. עם זאת, Shp2 נפל קורבן לאותם חסרונות כלים כפי שתואר לעיל. כדי להילחם במגבלות אלה, RapR-Shp2, מבנה Shp2 ספציפי וזמני הניתן לווסת, פותח ואופיין¹².

לפני הפיתוח של RapR-Shp2, היה ידוע כי Shp2 היה מעורב בנדידת תאים ^19,20,21. עם זאת, תפקידו הספציפי באיתות המעורב בתהליך זה לא היה ידוע. כמו כן, לא היה ידוע באיזה סקאלת זמן Shp2 מווסת את נדידת התאים ואילו שינויים מורפודינמיים ספציפיים הוא גורם בנקודות זמן שונות של הפעלתו. יתר על כן, לא היה ברור אם הפעלה חריפה וממושכת של Shp2 תגרום להשפעות שונות. באמצעות RapR-Shp2 נמצא כי הפעלה חריפה של Shp2 גורמת להתפשטות תאים חולפים, עלייה בבליטות, קיטוב תאים ונדידה. מסלולים ספציפיים במורד הזרם של Shp2 המווסתים שינויים מורפודינמיים מובהקים זוהו גם הם¹². פרוטוקול זה מספק פרטים לתכנון ואפיון RapR-Shp2, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להנחות את הפיתוח והיישום של פוספטזות RapR אחרות.

Protocol

1. תכנון של RapR-phosphatases

1. תכנון
   הערה: באמצעות RapR-Shp2 כדוגמה, פרוטוקול זה מפרט את השלבים החשובים ליצירת טירוזין פוספטאז מווסת רפמיצין. הפרוטוקול המתואר ממוטב עבור Shp2 וייתכן שיהיה צורך בשינויים נוספים כדי להתאים לתכונות ספציפיות של פוספטזות בודדות.
   1. כדי להבטיח שהפעילות הקטליטית של Shp2 נשלטת אך ורק על ידי רפמיצין ולא על ידי מנגנונים אנדוגניים, הכניסו מוטציה לתוך הפוספטאז כדי לשמור אותו בקונפורמציה פעילה מכוננת. במקרה של Shp2, הציגו את מוטציית D61A.
      הערה: אם מוטציה מפעילה אינה מוצגת עבור PTPase ספציפי, אז גרסת RapR שלה תתפקד כמערכת מגודרת AND המווסתת על ידי אותות אנדוגניים ורפמיצין.
   2. זהה אתרי החדרת iFKBP בתחום הקטליטי של הפוספטאז באמצעות המבנה הגבישי כדי להנחות את הבחירה כפי שתואר קודם לכן¹³. אם מבנה אינו זמין, בצעו יישור רצף חומצות אמינו עם התחום הקטליטי של Shp2 phosphatase כדי לזהות את אתרי ההחדרה (איור 2A). ודא שאתר ההחדרה ממוקם בלולאה גמישה המצומדת מבנית לכיס הקטליטי אך ממוקמת הרחק מהכיס כדי למנוע הפרעה סטרית של קשירת המצע על ידי iFKBP.
      הערה: פרטים נוספים על ההוספה נדונים בדיון.
   3. שקול את סוג רצף המקשר שישמש בין תחום iFKBP שהוכנס לבין phosphatase של עניין. בחירת רצף המקשר האופטימלי חשובה ביותר להצלחת כלי ה-RapR, והיא נידונה בהמשך הדיון (איור 2B).

איור 2: סכמטיות של שיקולים בעת תכנון RapR-phosphatase. (A) יישור של Shp2 (סגול), PTP1B (ירוק) ו-PTP-PEST (ורוד) כאשר אתרי ההחדרה השמורים מסומנים. (B) ייצוג של הכנסת מקשר בין Shp2 ו-iFKBP. (C) תחום פוספטאז של Shp2 בצבע בז' עם אתרי החדרה המסומנים בכחול. נתון זה שונה מ- Fauser et ^al.12. קיצורים: Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase; iFKBP = FKBP12 הניתן להכנסת; PTP = חלבון טירוזין פוספטאז; RapR = רפמיצין-מוסדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. יצירת RapR-phosphatase

1. החדרת iFKBP לתוך phosphatase של עניין באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר שונה
   1. צור "megaprimer" קידוד iFKBP באמצעות PCR.
      1. תכננו פריימרים לסינתזה של "מגה-פריימר" המכילים 20-25 נוקלאוטידים המתחשלים לקצה 5' או 3' של iFKPB, רצף מקשר שיחבר את iFKPB לפוספטאז המעניין, ו-28-32 נוקלאוטידים המתאימים לאתר ההחדרה (איור 3). אשר כי המוצר המתקבל מכיל את iFKPB משני צדדיו שברים חישול לפני ואחרי אתר החדרת phosphatase של עניין.
      2. סנתז את iFKBP המכיל "megaprimer" באמצעות PCR (10 μL של 5x פולימראז buffer, 1 μL של 50 ng/μL תבנית DNA המכיל iFKBP, 2 μL של 10 mM dNTP, 0.5 μL של מלאי 100 μM של כל פריימר "megaprimer" [קדימה ואחורה], 35 μL של מים, 1 μL DNA פולימראז). פצל תגובת PCR זו לשתי תגובות נפרדות של 25 μL לפני הפעלת ה- PCR. הפעל את מחזור ה-PCR בהתאם להמלצות יצרן ה-DNA פולימראז או למחזור ה-PCR הסטנדרטי הבא: (i) 98°C למשך 2 דקות, (ii) 98°C למשך 30 שניות, (iii) 55-70°C למשך 30 שניות, (iv) 72°C למשך 30 שניות, (v) חזור על שלבים ii-iv 25x, (vi) 72°C למשך 2 דקות.
      3. לטהר את "megaprimer" באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose. יש לטעון את תכולת ה-PCR מהשלב הקודם לג'ל אגרוז 1% ולמרוח 120 וולט למשך כ-30 דקות. חפשו את ה"מגה-פריימר" באורך 400 נוקלאוטידים בג'ל, הוציאו את השבר וטיהרו באמצעות ערכת מיצוי ג'ל (ראו טבלת חומרים).
         הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
   2. מוטגנזה מכוונת אתר שונה
      1. הכן את תגובת המוטגנזה מכוונת האתר השונה באמצעות פלסמיד המכיל את הגן של phosphatase של עניין כמו התבנית (5 μL של 5x חיץ פולימראז, 2 μL של 50 ng / μL תבנית, 2 μL של 10 mM dNTP, 10 μL של "megaprimer" חולץ, 2.5 μL של מים, 2.5 μL של DMSO, 1 μL של DNA פולימראז).
         הערה: הוספת DMSO בתערובת התגובה מורידה את טמפרטורת החישול²².
      2. הפעל את מחזור ה- PCR הבא: שלב דנטורציה ראשוני ב- 98 ° C למשך 3 דקות, ואחריו 18 מחזורים של שלבים רצופים של דגירה ב- 98 ° C למשך 30 שניות, 65 ° C עבור 20 שניות, 60 ° C עבור 20 שניות, 55 ° C עבור 20 שניות, 50 ° C עבור 20 שניות, 72 ° C במשך 18 דקות. הפעל את המחזור במשך הלילה (זמן המחזור הוא 7 שעות). לאחר השלמת המחזור, אחסן את תגובת ה- PCR ב- 4 מעלות צלזיוס.
         הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
      3. לאחר סיום המחזור, יש להוסיף 1 μL של אנזים DpnI ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
         הערה: DpnI יעכל את התבנית השיורית ויגדיל את התפוקה של המוצר המסונתז החדש.
      4. הפוך את המוצר המעוכל ל- DH5α תאים מתאימים בהתאם להוראות היצרן. צלחת את השינוי על לוחות אגר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה לבחירה (carbenicillin עבור pcDNA RapR-Shp2 לבנות). לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה. לאחר שהמושבות גדלו, אחסנו את צלחות LB ב 4 °C למשך עד חודש אחד.
         הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. בידוד מבנה DNA רצוי המכיל RapR-phosphatase
   1. ביצוע בדיקת PCR של מושבות חיידקים²³. מכיוון שלא כל המושבות הגדלות על צלחת LB יכילו את הפלסמיד הרצוי, הקפד לסנן לפני בידוד ה- DNA של פלסמיד.
      הערה: השתמש בפריימרים עבור המסך שיתאים לתבנית ולגן iFKBP. ניתן לבצע את המסך באמצעות Taq polymerase mastermix (ראה טבלת חומרים).
   2. לאחר זיהוי מושבות חיוביות, יש לחסן מושבה חיובית אחת ב-3 מ"ל של מרק LB כולל אנטיביוטיקה מתאימה, לדגור ולנער בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
   3. הפקת DNA פלסמיד מהתרבית הנוזלית בהתאם להוראות היצרן עבור ערכת מיצוי ה- DNA של פלסמיד (ראה טבלת חומרים)
      הערה: מומלץ לרצף את מבנה RapR PTPase החדש שנוצר לפני המשך הערכה חוץ גופית .

איור 3: סכמה של עיצוב פריימר ואסטרטגיית שיבוט מוטגנזה מכוונת אתר שונה. שלב 1 הוא סינתזה של iFKBP המכיל "megaprimer" עם "קצוות דביקים" חישול לאתר החדרת phosphatase של עניין, ושלב 2 הוא החדרת "megaprimer" לתוך phosphatase של עניין. נתון זה שונה מ Karginov et ^al.13. קיצור: iFKBP = FKBP12 הניתן להכנסת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הערכה של RapR-PTPase על ידי בדיקת פעילות חוץ גופית

הערה: פרוטוקול זה משמש להערכת הרגולציה של הפעילות של RapR-PTPase מהונדס. להלן מתואר ניתוח של Shp2 immunoprecipitated באמצעות שבר N-terminal פוספורילציה של פקסילין כמצע. ייתכן שיהיה צורך לבחור מצע אחר עבור PTPase ספציפי של עניין.

1. יום 1
   1. צלחת 800,000 תאי HEK293T / באר בצלחת תרבית רקמה 6 בארות במדיה DMEM בתוספת תוספת L-גלוטמין (ריכוז סופי של 2 mM) ו 10% FBS על ידי נפח. מניחים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך הלילה.
2. יום 2
   1. ברגע שהתאים הם ~60-80% מתמזגים, העבר אותם בהתאם לפרוטוקול היצרן המועדף של עוצר הטרנספקציה (ראה טבלת חומרים).
      1. דוגמה לפרוטוקול טרנספקציה: הוסף 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (pcDNA-mCherry-FRB ו- pcDNA-flag-RapR-Shp2, כל אחד) ל- 200 μL של DMEM ללא סרום ו- 6 μL של מגיב טרנספקציה ודגור על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסף 100 μL של תערובת transfection לכל באר של תאים. כלול דגימות נגועות במבני Shp2 שליליים פעילים ודומיננטיים כבקרה. יש לדגור למשך הלילה באינקובטור של 37°C ו-5%_CO2 .
3. יום 3
   1. הכנת חלבון-G ספארוז
      הערה: הכינו קצוות פיפטה חתוכים לפני הטיפול בספארוז. יש להשתמש בטיפים לחיתוך בכל שלב שבו מטפלים בספארוז. Sepharose צריך להיות resuspended ביסודיות בכל שלב לפני pipetting.
      1. יש להשהות מחדש ולקחת את הכמות המתאימה של Protein-G Sepharose לתוך צינור של 1.5 מ"ל. עבור כל באר בצלחת 6 בארות, להשתמש 10 μL של חלבון G Sepharose. לקבלת צלחת מלאה של 6 בארות, השתמש 60 μL של Sepharose.
      2. לשטוף את Sepharose עם 1 מ"ל של חיץ Lysis (ראה טבלה של חומרים). מיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,000 × גרם ולהסיר בזהירות את מאגר הליזיס. חזור על הפעולה פעמיים.
      3. להשהות מחדש את Sepharose ב 380 μL של חיץ Lysis. הוסף BSA לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ונוגדן (0.5 μL לכל דגימת IP, נוגדן נגד דגל [ראה טבלת חומרים]). הפוך על מסובב ב 4 ° C במשך 1.5 שעות.
         הערה: יש לקבוע את כמות הנוגדנים האופטימלית באופן ניסיוני עבור כל נוגדן בו נעשה שימוש.
   2. הכינו תאים למשקעים חיסוניים.
      1. הוסף כמות מתאימה של רפמיצין (תמיסת מלאי של 1 מ"מ באתנול) לריכוז סופי של 1 מיקרומטר או הוסף את אותו נפח אתנול (בקרה שלילית) לדגימות. דגירה במשך שעה אחת באינקובטור של 37°C ו-5%_CO2 .
      2. מניחים את צלחת 6-באר עם תאים על קרח בעדינות לשטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS קר. לשאוף את PBS ולהוסיף 300 μL של חיץ ליזה (עם 1 מיקרומטר רפמיצין עבור דגימת phosphatase פעיל או נפח שווה ערך של אתנול בדגימת הבקרה השלילית) ולגרד עם מגרד התא. העבירו את הדגימות לצינורות של 1.5 מ"ל ולמיקרו-צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם ב-4°C.
      3. העבר 20 μL של supernatant לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל כדי לבדוק את רמות הביטוי. הוסף 20 μL של 2x Laemmli buffer עם 5% β-mercaptoethanol לכל צינור כדי לשמש לבדיקת ביטוי ולדגור ב 95-100 ° C במשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט הנותר עבור המשקעים החיסוניים בשלב 3.3.3.3.
   3. משקעים חיסוניים של RapR-Shp2
      1. שטפו את החלבון-G ספארוז משלב 3.3.1.3. עם 1 מ"ל של חיץ ליזיס. מיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,000 × גרם ב-4°C בכל פעם ושאפו בזהירות את חיץ הליזיס. חזור על שלב זה 2x.
      2. באמצעות קצוות חתוכים, להשהות מחדש את Sepharose ב Lysis Buffer (50 μL לכל דגימה, כך עבור צלחת 6 באר, resuspend ב 300 μL של Lysis Buffer). פיפטה 50 μL של תערובת Sepharose מרחף לתוך צינור חדש נפרד 1.5 מ"ל עבור כל דגימה.
         הערה: יישאר ספרוז מושהה בתמיסת חיץ ליזיס עקב נפח הספארוז.
      3. הוסף את הסופרנאטנט שנותר מהתאים המוכנים משלב 3.3.2.3 לכל צינור של ספרוז. סובבו ב-4°C למשך 1.5-2 שעות.
   4. בדיקת פעילות פוספטאז
      הערה: מצע Shp2 צריך להיות מוכן על ידי זרחון מטוהר N-terminal קטע של פקסילין באמצעות קינאז Src פעיל באופן מכונן בעקבות פרוטוקול תגובת קינאז^{שתואר קודם לכן 12}.
      1. לקראת סוף שלב 3.3.3.3, הכינו את תמיסת פוספו-פקסילין. לכל דגימה, הוסף תמיסת פוספו-פקסלין (ריכוז סופי של 3 מיקרוגרם/מ"ל) ל-40 מיקרוליטר של חיץ אימידזול כולל (ראה טבלת חומרים). הוסף רפמיצין לריכוז הסופי של 1 מיקרומטר לאליציטוט של תמיסת פוספו-פקסלין עבור דגימות RapR-Shp2 מופעלות ונפח שווה ערך של אתנול לתמיסה עבור דגימות לא מופעלות.
      2. כוונו את שייקר החימום ל-32°C.
         הערה: פוספטזים אחרים עשויים להזדקק לטמפרטורה שונה לפעילות מיטבית.
      3. לשטוף Sepharose עם דגימות משלב 3.3.3.3 2x עם 0.5 מ"ל של חיץ Lysis (ראה טבלה של חומרים). שטפו את הדגימות 2x עם 0.5 מ"ל של Wash Buffer. כל חיץ צריך להכיל רפמיצין ב 1 מיקרומטר עבור דגימות מופעלות או נפח שווה ערך של אתנול עבור דגימות לא מופעלות. הסירו כמה שיותר חיץ לאחר השטיפה הסופית.
         הערה: ברגע שמגיעים לשלב זה, כדאי להשתמש בפיפט כדי להסיר כמויות סופיות של חיץ לאט ובזהירות כדי לוודא שאף אחד מהספארוז אינו שואף. כל חיץ שנותר ישפיע על ריכוז פוספו-פקסילין ויוביל לקריאה לא מדויקת.
      4. הוסף 40 μL של תערובת חיץ פוספו-פקסילין מוכן Imidazole לכל דגימה, עם או בלי רפמיצין (תלוי דגימה). מערבבים בעדינות רבה ומכניסים מיד לשייקר החימום ודגרים במשך 40 דקות בחום של 32°C. כוונו את שייקר החימום למינימום של 1,000 סל"ד כדי לוודא שהדגימה נסערת לחלוטין למשך הדגירה.
      5. עצור את התגובה על ידי הוספת 40 μL של 2x Laemmli Buffer לכל דגימה. לדגור את הדגימות ב 95-100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. מצננים את הדגימות.
      6. טען 15 μL מכל דגימה (כולל דגימות הליזט משלב 3.3.2.3.) על ג'ל SDS-polyacrylamide הדרגתי של 4-15% והפעל פרוטוקול כתם מערבי סטנדרטי באמצעות ממברנות PVDF.
      7. כתם באמצעות נוגדן anti-Flag כדי לזהות את מבנה RapR-Shp2, anti-mCherry כדי לזהות mCherry-FRB, ו-anti-pY118 או anti-pY31 paxillin כדי לזהות זרחן פקסילין.
         הערה: הכתמים המערביים המתקבלים צריכים להיראות דומים לאיור 4.

4. ניתוח פעילות RapR-Shp2 בתאים חיים

הערה: פרוטוקול זה משמש לקביעת היכולת של RapR-Shp2 לפרק מצעים אנדוגניים ולגרום לאיתות במורד הזרם. RapR-PTPases אחרים ידרשו ניתוח של המצע והמסלולים הספציפיים שלהם.

1. יום 1
   1. צלחת 198,000 תאי A431 / באר בצלחת תרבית רקמה 6 בארות במדיה DMEM בתוספת 10% FBS ו- L-גלוטמין (ריכוז סופי של 2 mM). מניחים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך הלילה.
2. יום 2
   1. להדביק תאים עם מבנים אדנו-ויראליים המבטאים RapR-Shp2 ו FRB על ידי הוספת אדנווירוס ישירות למדיה כבר בצלחת. השאירו את אדנו-וירוס על התאים באינקובטור של 37°C ו-5%_CO2 למשך הלילה. השתמש בתאים נגועים ב- FRB רק כבקרה שלילית.
      הערה: כמויות אדנווירוס יצטרכו להיקבע על בסיס כל מקרה לגופו תלוי titer.
3. יום 3
   1. הרעיבו תאי A431 על ידי דגירה ב-DMEM עם 0.5% FBS במשך 4 שעות לפני הניסוי.
   2. הוסף רפמיצין לריכוז סופי של 1 מיקרומטר או לאותו נפח אתנול (בקרה שלילית) לתאים למשך 2-4 שעות.
      הערה: הדגירה יכולה להיות שונה עבור פוספטזות אחרות.
   3. מניחים את צלחת 6-באר עם תאים על קרח בעדינות לשטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS קר. שאפו את PBS, הוסיפו 300 מיקרוליטר של חיץ ליזיס (ראו טבלת חומרים), וגרדו במרץ עם מגרד תאים. העבירו את הדגימות לצינורות של 1.5 מ"ל ולמיקרוצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 2,000 × גרם ב-4°C.
   4. העבר 250 μL מכל דגימה לצינור חדש של 1.5 מ"ל. הוסף 250 μL של חיץ 2x Laemmli עם 5% β-מרקפטואתנול ודגור ב 95-100 ° C במשך 5 דקות.
   5. טען 25 μL מכל דגימה על ג'ל SDS-PAGE הדרגתי של 4-15% והפעל פרוטוקול כתם מערבי סטנדרטי באמצעות ממברנות PVDF.
   6. הערך את הזרחן בתיווך RapR-Shp2 של EGFR ו-PLCγ באמצעות נוגדנים נגד pY992 EGFR ונוגדנים נגד pY783 PLCγ. הערך את ההפעלה במורד הזרם של MAP kinase Erk1/2 על ידי הערכת הזרחן שלו על שאריות pT202/pY204.
      הערה: הכתמים המערביים המתקבלים צריכים להיראות דומים לאיור 5.

5. ניתוח שינויים מורפודינמיים הנגרמים על ידי הפעלת RapR-Shp2 בתאי HeLa באמצעות דימות תאים חיים

הערה: פרוטוקול זה משמש לקביעת ההשפעה של הפעלת RapR-Shp2 על היווצרות בליטות תאים, התפשטות תאים ונדידה.

1. יום 1
   1. צלחת 700,000 תאי HeLa בצלחת תרבית תאים 35 מ"מ ומניחים באינקובטור 37 ° C ו 5% CO₂ . אפשר לתאים להיצמד לצלחת (~ 2-3 שעות).
   2. בצע טרנספבקט של התאים בהתאם לפרוטוקול היצרן המועדף של מגיב טרנספקציה (ראה טבלת חומרים).
      1. פרוטוקול טרנספקציה לדוגמה: הוסף 0.5 מיקרוגרם של DNA (פלסמידים pcDNA-mCherry-FRB ו- pcDNA-Venus-RapR-Shp2, כל אחד) ל- 100 μL של DMEM ללא סרום ו- 6 μL של מגיב טרנספקציה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאים ודגרים לילה באינקובטור_CO2 של 37°C ו-5%. השתמש בתאים נגועים pcDNA-mCherry-FRB רק כבקרה שלילית.
   3. ציפוי הדמיה חיה #1.5 25 מ"מ זכוכית עגולה מכסה עם פיברונקטין (5 מ"ג / ליטר) על ידי דגירה במשך 1 שעה ב 37 ° C.
2. יום 2
   1. שטפו את מכסה הזכוכית המצופה עם PBS.
   2. לוחים את תאי HeLa הנגועים על מכסה הזכוכית המצופה במדיה DMEM בתוספת 10% FBS ו- L-גלוטמין (ריכוז סופי של 2 mM) כדי להשיג מפגש של 30% 4 שעות לפני ההדמיה.
   3. שעתיים לאחר הציפוי, העבירו בעדינות את המדיה שבצלחת למדיה שחוממה מראש ללא סרום Leibovitz L-15 למשך שעתיים.
   4. הכתימו את התאים בכתם קרום פלזמה אדום עמוק CellMask בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   5. הניחו את המכסה בתא הדמיה נקי (ראו טבלת חומרים). הוסף 1 מ"ל של מדיה L-15 שחומם מראש ולכסות עם 1 מ"ל של שמן מינרלי שחומם מראש כדי למנוע אידוי. שמור על התא בטמפרטורה של 37°C עד להדמיה.
   6. דמיינו את התאים בטמפרטורה של 37°C באמצעות שלב מחומם.
      1. בחר ערוצים מתאימים להדמיה של מבנה RapR ו- CellMask להדמיית אפיפלואורסצנטיות. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במטרה 40x שאליה בוצעה הפניה (ראה טבלת חומרים) ובערכות המסננים הבאות: מסנני עירור 514/10 ומסנני פליטה 540/21 עבור הדמיית Venus-RapR-Shp2, מסנני עירור 561/10 ומסנני פליטה 595/40 עבור הדמיית mCherry-FRB, ומסנני עירור 640/20 ופליטת 655LP עבור הדמיית CellMask Deep Red. השתמש במראה פוליכרואית מרובת פסים לכל התעלות הפלואורסצנטיות (ראה טבלת חומרים).
      2. צלם תמונות כל 2 דקות במשך 4-4.5 שעות.
         הערה: שינויים מורפודינמיים מהירים יותר ידרשו רכישה תכופה יותר.
      3. לאחר שעה של הדמיה, הוסף רפמיצין לריכוז סופי של 1 מיקרומטר כדי לעורר RapR-Shp2.

6. ניתוח תמונות

הערה: פרוטוקול זה יתאר את היצירה של מסיכות תא בהתבסס על . קבצי מחסנית TIF שנאספו מניסויי הדמיה חיים. לאחר מכן הוא יתאר כיצד ליצור מאקרו ב- ImageJ כדי לנתח את המסכות, מה שיביא לגיליון אלקטרוני של אזור התא שלאחר מכן ינותח לשינויים לאורך זמן. לבסוף, הפעילות הבולטת והנסוגה של התא תנותח באמצעות Metamorph.

1. צור מסיכה בינארית של תמונות CellMask באמצעות הפונקציה MovThresh מחבילת התוכנה^{CellGeo 24}.
2. העתק את התיקיה MovThresh לתיקיית ניתוח התמונות.
3. העתק את CellMask או תמונות ערוץ סמן ממברנה אחרות לתיקייה MovThresh.
   1. אם צולמו תאים מרובים במיקום אחד, חתכו את התמונות כדי ליצור קבצים הכוללים תא אחד בלבד לפני יצירת המסיכה ב- MatLab.
4. ודא שהספרייה מוגדרת כראוי לתיקייה MovThresh ב- MatLab.
5. הפעל את MovThresh.
6. ייבא ערימות תמונות אחת בכל פעם.
7. בחר Smoothed Curve ולאחר מכן הפעל את Rethreshold.
8. שמור כמספר Mask_Image בתיקיה חדשה בשם 'מסיכות'.
9. לאחר שכל אוספי התמונות יומרו למסיכות, פתחו את אוספי התמונות בתוכנת ImageJ²⁵.
   1. ניתוח אזור התא ב- ImageJ
      1. פתחו את כל אוספי התמונות של 'מסיכות' ב-ImageJ.
      2. התאימו את קביעת המידות לשטח.
      3. לחץ על תוספים | פקודות מאקרו | שיא.
      4. קליק תהליך | בינארי | הפוך בינארי.
         1. בחר באפשרות ברירת המחדל .
            הערה: אל תלחץ על שום דבר נוסף בעת הקלטת המאקרו. אם שלבים נוספים כלולים, מומלץ להפעיל מחדש משלב 6.9.1.3.
      5. לחץ על נתח | לנתח חלקיקים.
         1. בטל את הסימון של כל התיבות מלבד סיכום.
      6. סיים להקליט ולחץ על צור את המאקרו.
      7. לחץ על הפעל עבור כל אוסף תמונות לאחר בחירתו ושמור את טבלת התוצאות עבור כל אוסף תמונות. אפשרות ברירת המחדל תישמר כקובץ csv.
      8. שמור את המאקרו והשתמש בו שוב לניתוחים עתידיים (אופציונלי).
   2. עיבוד נתוני אזור בגיליון אלקטרוני
      1. עבור כל תא מנותח, ממוצע את שטח התא מתמונות שצולמו לפני ההפעלה עם רפמיצין.
      2. חלק את כל ערכי השטח בשטח הממוצע של התא שקדם לחיבור רפמיצין.
      3. חשב את הערך הממוצע עבור כל נקודת זמן עבור כל התאים המצולמים וקבע את מרווחי בר-סמך של 90%. התווה את הנתונים.
   3. ניתוח פעילות בולטת של תאים
      1. העתק את התיקייה ProActive לתיקיית ניתוח התמונות.
      2. העתק את אוספי התמונות עם מסיכה מ- MovThresh לתיקיית ProActive החדשה שנוצרה.
      3. פתח את MatLab והגדר את הספרייה לתיקייה ProActive.
      4. הפעל את ProActive.
      5. יבא את קובצי אוסף התמונות של התאים עם מסיכה לממשק המשתמש הגרפי ProActive.
      6. הגדר את סוג הפעילות. ניתוח פעילות בולטת יפיק נתונים שנצברו באזור ; ניתוח פעילות פסילה יפיק נתונים שאבדו באזור ; והפעילות הכוללת תפיק נתוני שינוי שטח כוללים (הן אבודים והן רווחים).
      7. הגדר אזור להגדרת נורמליזציה.
      8. החלקה על העקומה באמצעות ערכי הסף המוצעים או באמצעות ממוצע לסף מחדש בכל נקודת זמן. פעולה זו ממוצעת את ערכי הסף על פני חלון מסוים, וממזערת את חוסר העקביות בערכי הסף בין נקודות זמן.
      9. לחץ על קובץ | שמירה בשם | תוצאות ( .mat)
         1. אם אתה מעבד את כל שלושת סוגי פעילות האזור, תן לקובצי הנתונים המעובדים את השם הבא: ProResultData #, RetResultData # או ResultData #.
            הערה: כלול את הרווח לפני המספר ומספר את הנתונים החל מ - 1.
      10. חזור על הפעולה משלב 6.9.3.6. לכל אוספי התמונות עם מסיכה שיובאו.
      11. לאחר שכל התאים עובדו, סגור את ממשק המשתמש הגרפי הפרואקטיבי.
      12. פתח את DataToFileTotalArea בעורך Matlab כדי לעבד קבצי "ResultData" של הפעילות הכוללת.
      13. שנה את מספר התאים כך שיתאים למספר קבצי התוצאות שנוצרו. אם 7 תאים עובדו בשלבים 6.9.3.5–6.9.3.10, ודא ששלוש השורות הראשונות של קובץ ה- Script הן כדלקמן:
          filename='נתוני תוצאה ';
          תאים=1:7;
          פיגור = 1;
      14. לחץ על הפעל וחזור על פעולה זו עבור DataToFileProtArea ו- DataToFileRetArea לעיבוד נתונים בולטים ופסילות, בהתאמה. ניתוח זה יפיק שלושה קבצי טקסט "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" ו- "AllCellsRet.txt"
      15. פתח את קבצי .txt בגיליון אלקטרוני ונרמל כמו בסעיף 6.9.2. חשב את הערך הממוצע עבור כל נקודת זמן עבור כל התאים המצולמים וקבע רווחי סמך של 90%. התווה את הנתונים.
          הערה: החלקות המתקבלות מהשלבים לעיל אמורות להיראות דומות לאיור 6.

Results

איור 4 מדגים תוצאות שניתן לצפות להן מבדיקת פעילות פוספטאז המבוססת על פקסילין. בניסוי זה, פעילות פוספטאז שלילית פעילה ודומיננטית של Shp2 הושוותה לזו של RapR-Shp2 פעיל ולא פעיל באמצעות פוספו-פקסילין כקריאה. מבני Shp2 עברו זירוז חיסוני ונתונים לבדיקת הפעילות כמתואר בפרוטוקול. קריאות הפוספו-פקסילין עבור Shp2 פעיל ו-RapR-Shp2 פעיל היו דומות, מה שמצביע על כך שה-RapR-Shp2 הפעיל לא הושפע לרעה מהכנסת תחום RapR והוא שמר על פעילות מלאה לאחר הפעלתו. Shp2 שלילי דומיננטי ו-RapR-Shp2 לא פעיל היו דומים גם הם, מה שמצביע על כך שלמבנה RapR-Shp2 אין פעילות כאשר אינו פעיל. זה מצביע על העיצוב המוצלח של RapR-phosphatase. מצע הפוספו המשמש לבדיקה זו עשוי להשתנות בהתאם לפוספטאז המעניין.

איור 5, בדומה לאיור 4, משווה בין שלילי פעיל ודומיננטי לבין RapR-Shp2 פעיל ולא פעיל. ניסוי זה נערך ללא משקעים חיסוניים של המבנים. במקום זאת, הוא תוכנן לאפיין את השפעות האיתות במורד הזרם של מבנה RapR-Shp2 בתוך תאים. כאן, מבני Shp2 באו לידי ביטוי בתאי HEK293T. אפקט במורד הזרם ERK1/2 הוכח כמגביר את הזרחן בתגובה להפעלת RapR-Shp2, בדיוק כמו במדגם הפעיל באופן מכונן. RapR-Shp2 הלא פעיל לא גרם לשינוי זה. זה מצביע על כך שהאיתות במורד הזרם של Shp2 נשמר עם שילוב תחום RapR. באופן דומה, מצעי פוספו ידועים EGFR ו-PLCγ עברו דה-פוספורילציה בתגובה להפעלת RapR-Shp2 בתאי A431.

לבסוף, איור 6 מציג את התוצאות של הפעלת RapR-Shp2 במורפודינמיקה של תאי HeLa. ברגע ש-RapR-Shp2 הופעל, התאים הראו עלייה בפעילות הבולטת כמו גם בשטח התא. זה מצביע על כך שהפעלת RapR-Shp2 מספיקה כדי לגרום לשינויים מורפודינמיים בתאי HeLa ועשויה לאפשר לחוקרים לחקור מסלולי איתות ספציפיים במורד הזרם האחראים להשפעה זו.

איור 4: תוצאות מבדיקת הפעילות המבוססת על פקסילין: פעילות קונסטיטוטיבית, שלילית דומיננטית ו-RapR-Shp2 עברו זירוז חיסוני והיו כפופות לבדיקת הפעילות באמצעות הפרוטוקול המתואר. רמות pY31 paxillin הן ב-CA והן ב-RapR-Shp2 היו דומות, מה שמצביע על כך שלמבנה RapR-Shp2 הייתה פעילות דומה בהשוואה ל-CA Shp2 לאחר שהופעל. לדגימת RapR-Shp2 שלא הופעלה לא הייתה פעילות, בדומה לדגימת ה-DN, מה שמעיד על כך שהיא לא הייתה "דולפת". נתון זה שונה מ- Fauser et ^al.12. קיצורים: RapR = רפמיצין-מוסדר; Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase; DN = שלילי דומיננטי; CA = פעיל באופן מכונן; FRB = תחום מחייב FKBP-רפמיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תוצאות מבדיקת ליזט של כל התא: פעיל באופן קונסטיטוטיבי, שלילי דומיננטי ו-RapR-Shp2 באו לידי ביטוי בתאי HEK293T ופרוטוקול הליזט של כל התא הושלם. כאשר RapR-Shp2 לא היה פעיל, הוא לא הפעיל את ERK1/2 באמצעות זרחון, בדומה לדגימת DN Shp2. הדבר מצביע על כך של- RapR-Shp2 אין פעילות כאשר אינו פעיל. לאחר ההפעלה, רמת הזרחן ERK1/2 הייתה דומה לזו של דגימת CA Shp2, מה שמצביע על הפעלה מוצלחת ואיתות במורד הזרם של Shp2. באופן דומה, תאי A431 המבטאים RapR-Shp2 הראו ירידה בזרחון הן של EGFR והן של PLCγ, שניהם מצעים ידועים של Shp2. נתון זה שונה מ- Fauser et ^al.12. קיצורים: RapR = רפמיצין-מוסדר; Shp2 = Src homology-2 תחום המכיל חלבון טירוזין phosphatase; DN = שלילי דומיננטי; CA = פעיל באופן מכונן; ERK = קינאז מווסת אות חוץ-תאי; GAPDH = גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז; EGFR = קולטן גורם גדילה אפידרמלי; PLCγ = פוספוליפאז C גמא; FRB = תחום מחייב FKBP-רפמיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: ניתוח נתוני שטח התא והפעילות הבולטת בהתבסס על הדמיה חיה: תאי HeLa הודבקו ב-RapR-Shp2 ועברו את פרוטוקול ההדמיה החיה המתואר. הנתונים נותחו כמתואר בפרוטוקול ניתוח הנתונים. לאחר שהופעלו (מסומן על ידי הקו האפור האנכי), תאי HeLa הראו עלייה הן בפעילות הבולטת של התא והן בשטח התא. בדגימות השליליות שביטאו רק FRB, פעילות זו לא הייתה נוכחת. זה מצביע על כך שהפעלת RapR-Shp2 גורמת לשינויים מורפודינמיים מהירים בתוך תאי HeLa ומעודדת התפשטות תאים ובליטתם. נתון זה שונה מ- Fauser et ^al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים לפיתוח, אפיון ויישום של פוספטאזות מבוקרות כימוגנטית. הכלי RapR-Shp2 מסתמך על מתג מווסת רפמיצין המוכנס לתחום הקטליטי Shp2. כוחו של כלי זה הוא הספציפיות ואת השליטה הטמפורלית הדוקה של פעילות phosphatase. הכלי ישים לפוספטזות אחרות, ובשילוב עם טכנולוגיית RapR-TAP שתוארה קודם לכן, מאפשר שחזור של מסלולי איתות בודדים במורד הזרם²⁶. היכולות הייחודיות של גישת RapR אפשרו לחוקרים לזהות אירועים חולפים הנגרמים על ידי הפעלת Shp2 ולנתח מסלולי איתות ספציפיים במורד הזרם המווסתים תהליכים מורפודינמיים בודדים.

מספר גורמים קריטיים משפיעים על העיצוב של פוספטאז RapR. מבנה גבישי פתור היטב של התחום הקטליטי של phosphatase של עניין הוא מאוד מועיל בהנחיית הבחירה של אתר החדרה עבור iFKBP. אולם בשל דמיון מבני גבוה בין טירוזין פוספטאזות, יישור רצפי חומצות האמינו של התחומים הקטליטיים יכול לספק מספיק מידע לזיהוי אתר ההחדרה, כפי שמודגם על-ידי היישור של Shp2 ל-PTP1B ול-PTPPest (איור 2). עבור RapR-Shp2, Val406, הממוקם באתר המחובר ללולאת WPD הקטליטית הקריטית דרך גדיל β, נבחר כאתר ההחדרה האופטימלי ביותר. אותו אתר החדרה עשוי לגרום לוויסות מוצלח של PTPases אחרים, כפי שהודגם עבור PTP1B ו-PTP-PEST¹² (איור 2A).

אם phosphatase של עניין הוא חלבון multidomain, מידע מבני על הארגון של תחומים יסייע למנוע הפרעה פונקציות אחרות של PTPase. גורם נוסף המשפיע על העיצוב של RapR-PTPase אופטימלי הוא כמה חומצות אמינו יש להחליף על ידי iFKBP מוכנס. לולאות החדרה גדולות וגמישות יותר ב- PTPase עשויות לדרוש קיצור נוסף כדי להבטיח ויסות הדוק של הפעילות הקטליטית על ידי iFKBP. באופן דומה, אורך והרכב המקשרים המחברים את iFKBP ל- PTPase ישפיעו על יעילות הרגולציה. מקשרים קצרים המורכבים משאריות Gly בודדות יספקו ויסות הדוק יותר, אך עשויים להפחית את הפעילות המרבית של האנזים אם הם מציגים עיוות מבני מתמשך גם כאשר iFKBP קשור לרפמיצין ו- FRB. מקשרי Gly-Ser-Gly באורך בינוני מספקים גמישות רבה יותר, אך ייתכן שלא יהיו קשיחים מספיק עבור PTPases מסוימים. מקשרים ארוכים המורכבים מ- Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly יסייעו למנוע היווצרות של מבנים משניים לא מכוונים שעשויים להשפיע על ויסות PTPase. RapR-Shp2 נבדק עם כל שלושת סוגי המקשרים; מקשר Gly-Ser-Gly נמצא כאופטימלי ביותר.

היבט קריטי הקובע את הפיתוח המוצלח של כלי RapR הוא הקמת בדיקת phosphatase חזקה ונוכחות של פקדים מתאימים. השוואה של פעילות RapR-phosphatase לפעילות של גרסאות דומיננטיות-שליליות ופעילות באופן מכונן של POI מספקת הערכה של דליפת מבנה RapR ומידת ההפעלה. יתר על כן, היעדר דה-פוספורילציה על ידי הפוספטאז הפעיל באופן מכונן או זרחן מופחת על ידי המוטציה השלילית הדומיננטית יצביעו על תנאי תגובה לא נאותים.

עבור בדיקת phosphatase, תנאי התגובה ידרשו אופטימיזציה עבור כל PTPase. התאמת הטמפרטורה, זמן התגובה ותנאי המאגר תהיה תלויה ב- PTPase המעניין. תסיסה נמרצת של דגימות היא קריטית כדי להבטיח ערבוב מספיק של PTPase הקשור לספארוז והמצע שלו. לבסוף, אם בדיקת phosphatase המתוארת אינה אופטימלית עבור PTPase מסוים של עניין, אז תגובת phosphatase באמצעות פוספט p-nitrophenyl כמצע יכול לשמש כבדיקה חלופית²⁷.

בניסויי הדמיה של תאים חיים, יש לקחת בחשבון מספר קריטריונים בעת הכנת דגימה. הפרוטוקול המתואר משתמש במדיה L-15 המבוססת על חיץ HEPES, שאינו רגיש לריכוז CO₂ . אם רוצים להשתמש במדיה מבוססת ביקרבונט, יש להשלים HEPES כדי לשמור על ה- pH של הדגימה או להשתמש בתא הדמיה סביבתית המשלים CO₂ . הפרוטוקול ממליץ למרוח שכבה של שמן מינרלי על גבי הדגימה כדי למנוע אידוי ולפשט את תוספת הרפמיצין. ניתן להשתמש בתצורות אחרות המשתמשות בתא הדמיה סביבתי או בתא סגור, אך תוספת של רפמיצין עשויה להיות מאתגרת יותר. בעת הוספת רפמיצין לתאים בזמן ההדמיה, ודא כי השלב אינו זז והתאים אינם מופרעים. כל תזוזה נוספת של הדגימה במהלך תהליך ההדמיה תחסום את איסוף הנתונים. עוצמת ההארה וזמן החשיפה צריכים להישמר נמוכים כדי להפחית את רעילות האור, במיוחד עבור הדמיה לטווח ארוך. יעילות טרנספקציה נאותה של התאים היא גם קריטית. יחס של 1:1 בין FRB ל- RapR-Shp2 DNA מספק ביטוי הולם, אך עבור מבנים חדשים, יחס זה ידרוש התאמה. כדי להבטיח הפעלה יעילה, FRB צריך לבוא לידי ביטוי ברמה גבוהה יותר מאשר phosphatase RapR.

מגבלה של כלים מבוססי RapR היא חוסר היכולת להשבית במהירות. שינוי מדיה מסיר רפמיצין חוץ-תאי, אך השבתה של מבני RapR יכולה להימשך שעות בשל הקשירה ההדוקה מאוד של רפמיצין למבנה RapR. ניתן להשיג השבתה מהירה על ידי הוספת מעכב אתר פעיל של PTPase. עם זאת, השפעות פוטנציאליות מחוץ למטרה של המעכב יכולות להפוך את הפרשנות של התוצאות למאתגרת. יתר על כן, אפילו בשילוב עם מעכב PTPase, גישת RapR אינה יכולה לשמש לניסויי הפעלה / אינטרקטיבציה מחזוריים. מגבלה נוספת של מערכת RapR היא היעדר שליטה מרחבית. מבני RapR באים לידי ביטוי גלובלי ולכן מופעלים בכל מקום בתא. פתרון אפשרי אחד הוא יישום של רפמיצין בכלוב שיכול להשתחרר על ידי אור UV קרוב באופן מקומי בתא^28,29. יתר על כן, הכלי RapR יכול להיות שונה כדי להשיג הפעלה של phosphatase של עניין בקומפלקס חלבון מסוים או במיקום תת-תאי מסוים. על ידי הצמדת שותף קושר או תג תת-תאי ל- FRB, RapR-PTPase יהיה ממוקד לחלבון או למיקום הספציפי בתא. לבסוף, רפמיצין הוא מדכא חיסוני מאופיין היטב באמצעות עיכוב mTOR ויכול להשפיע על איתות תאי, מה שעלול לשבש את האיתות של PTPase המעניין. כדי להתגבר על חשש זה, אנלוגים שאינם חיסוניים של רפמיצין (iRap ו- AP21967) מייצגים חלופה טובה. שתי התרכובות הוכחו כמווסתות מבני RapR¹⁴.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 כיסויי זכוכית 25 מ"מ עגולים	Warner Instruments	64-0715
צינורות 1.5 מ"ל	ארה"ב Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			עבור 500 מ"ל: 5.18 גרם Tris-HCL, 131.5 מ"ל גליצרול, 52.5 מ"ל 20% SDS, 0.5 גרם כחול ברומופנול, pH סופי 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומי	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 תאים	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor תא	תאים invitrogen	A7816
Benchmark סרום בקר עוברי (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	משולש 0.1 ומיקרו; m בריג מסונן סטרילי
35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	פורסם ב 10.1083/jcb.201306067
CellMask צבע ממברנת פלזמה אדום עמוק	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a מוכשר תאים	NEB	C2987H
DMEM	קורנינג	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
סולם DNA	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI אנזים	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, ריאגנטים של קלילנד
EGTA	Acros	409910250
פיברונקטין מפלזמת בקר	סיגמא	F1141
FuGENE(R) 6 מגיב טרנספקציה	Promega	E2692	מיצוי ג'ל מגיב טרנספקציה
Thermo	Scientific	K0692	ערכת מיצוי ג'ל GeneJET
ג'ל כתם חומצת גרעין ירוקה	GoldBio	G-740-500
ג'ל טעינת צבע סגול 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 מ"ל
תאי HEK 293T ATCC		CRL-11268
תאי HeLa	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ תוכנה לעיבוד	N/A	N/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
מאגר			25 מ"מ אימידזול pH 7.2, 2.5 מ"מ EDTA, 50 מ"מ NaCl, 5 מ"מ DTT
KCl	סיגמא	P-4504
L-15 1x	קורנינג	10-045-CV
LB אגר	פישר	BP1425-2
מאגר			ליזה20 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8, 50 מ"מ KCl, 1 מ"מ EGTA, 1% NP40
	עדכון MATLAB MathWorks	N/A	R 2022b שימש להפעלת פונקציות CellGeo
אוטומציה וניתוח תמונות Metamorph Microscopy	N/A	N/A
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
שמן מינרלי	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene בחירה	96-308
Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים 12 באר	Bio-Rad	4561085
ביולוגיה מולקולרית כיתה	קורנינג	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	Chroma Technology	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanSAPO 40x אובייקטיבי	אולימפוס	N / A
PBS w/o Ca ו- Mg	Corning	21-031-CV
צינורות PCR labForce		1149Z65	0.2 מ"ל 8 רצועות צינורות וכובעים, רצועה קשיחה מחוברת בנפרד מכסי כיפה
Phusion בתוספת DNA פולימראז	תרמו מדעי	F630S
פריימרים	IDT
חלבון-G Sepharose	Millipore	16-266
PVDF ממברנות	BioRad	1620219	Immun-Blot כריכי נייר PVDF/פילטר
רפמיצין	פישר	AAJ62473MF
0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ EDTA, 1x [-] נתרן	קורנינג	25-053-CI
Tris-אצטט-EDTA (TAE) 50x	פישר	BP1332-1	לאלקטרופורזה
מאגר			20 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8, 50 מ"מ KCl, 100 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EGTA, 1% NP40
β-מרקפטואתנול	פישר כימיקל	O3446I-100
<נוגדנים חזקים>
אנטי EGFR	איתות תאי	2232
אנטי-ERK 1/2 איתות	תאי	9102
נוגדן נגד דגל	Millipore-Sigma	F3165
נוגדן נגד GAPDH	invitrogen	AM4300
נוגדן נגד GFP	Clontech	632380
נוגדן נגד mCherry	invitrogen	M11217
נוגדן נגד פקסילין	תרמו פישר	BDB612405
אנטי-פוספו-EGFR Y992 איתות תא נוגדן		2235
אנטי-פוספו-ERK 1/2 T202/Y204 איתות	תאי	9101
אנטי-פוספו-פקסילין Y31 נוגדן	Millipore-Sigma	05-1143
אנטי-פוספו-PLC וגמא; Y783 איתות	תאי	14008
אנטי-PLC וגמא;	איתות תאי נוגדנים	5690