הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חשיפת הובלה קסנוביוטית והשפעות במיטוכונדריה מבודדת: תובנות מבדיקות רספירומטריות ואנזימטיות

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67146

⸱

7 במרץ 2025

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג מתודולוגיה לחקר השפעות קסנוביוטיות על תפקוד המיטוכונדריה באמצעות בדיקות ספירומטריות ואנזימטיות. הוא בוחן אפנון שרשרת הובלת אלקטרונים במינים שונים, ומציע תובנות לפיתוח ממוקד של חומרי הדברה ביולוגיים נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים של חרקים.

תקציר

מיטוכונדריה מכונים לעתים קרובות תחנת הכוח של התא בשל תפקידם המכריע בייצור אנרגיה באמצעות שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC). עם זאת, משמעותם משתרעת הרבה מעבר לייצור אנרגיה. חוסר ויסות של ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית יכול לעורר מפלים תוך-תאיים המשפיעים על הבריאות ותפקוד התאים. בהתחשב בחשיבותם הפיזיולוגית, יש עניין גובר לחקור את הפוטנציאל הפרמקולוגי של תפקוד המיטוכונדריה לפיתוח טיפולים ומוצרים ביולוגיים חדשים. אפנון ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית יכול לספק גישות חדשניות להתמודדות עם אתגרים כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, מחלות מטבוליות וסרטן, כמו גם לפתח מוצרים ביולוגיים להדברת מזיקים ומחלות המועברות על ידי וקטורים.

עבודה זו מציגה שיטה להערכת ההשפעות של קסנוביוטיקה על שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) באמצעות מצעים שונים, כולל גלוטמט ו- NADH עבור קומפלקס I, סוקצינאט עבור קומפלקס II, וציטוכרום c (הן מחומצן והן מופחת) עבור קומפלקסים III ו- IV. מתודולוגיה זו מאפשרת הפעלה או עיכוב של העברת אלקטרונים דרך קומפלקסים מיטוכונדריאליים להערכה באמצעות רספירומטר וספקטרופוטומטר. מקורם של המיטוכונדריה במיטוכונדריה מבודדים, תאים מפוצלים או רקמות הומוגניות ממינים שונים.

במעבדה, תפקוד המיטוכונדריה נותח בחולדות Aedes aegypti ו-Wistar, אך שיטה זו ישימה גם למינים אחרים, כגון Rhipicephalus microplus ו-Rhodnius prolixus. גישה זו מספקת את הבסיס לתיאוריה על קיומם של חלבונים בלתי מצומדים והעדפות מצע חמצני חמצון ספציפיות למין המושפעות מדרישותיהם האנרגטיות הייחודיות. ממצאים אחרונים מציעים תובנות חשובות לגבי אסטרטגיות חדשניות לתכנון קוטלי חרקים ביולוגיים המכוונות לתפקוד המיטוכונדריה, וטומנות בחובן פוטנציאל משמעותי לשליטה יעילה במחלות המועברות על ידי וקטורים ובהתפשטות מזיקים.

מבוא

מיטוכונדריה תמיד נקראו תחנת הכוח של התאים בשל ייצור האנרגיה הכימית שלהם במהלך תהליך הזרחן החמצוני 1,2. מעבר לתפקודי חילוף החומרים העיקריים שלהם, מיטוכונדריה מעורבים גם בתהליכים תאיים רבים אחרים, החל מרמות ויסות Ca2+ תוך-תאיות, תהליכים דלקתיים וייצור מיני חמצן תגובתי ועד לתהליכי השראת מוות תאי3. ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית וחוסר הוויסות שלה נקשרו לתהליכים תוך-תאיים המשפיעים על תפקוד התאים ועל הבריאות הכללית. זה עורר עניין גובר בחקר הפוטנציאל הפרמצבטי של התמקדות בתפקוד המיטוכונדריה לפיתוח טיפולים חדשניים ומוצרים ביולוגיים בטוחים 4,5,6. בנוסף, הבנת יחסי הגומלין המורכבים בין תהליכים מיטוכונדריאליים והשפעתם על תפקוד התאים חיונית לפיתוח טיפולים ממוקדים ולהצגת הזדמנויות לתכנון מוצרים ביולוגיים לשליטה במחלות המועברות על ידי וקטורים ובמזיקים 7,8.

התמקדות ברכיבים ספציפיים של שרשרת הובלת האלקטרונים באמצעות קסנוביוטיקה התפתחה כאסטרטגיה לווסת את תפקוד המיטוכונדריה לייצור חומרי הדברה ביולוגיים. תרכובות טבעיות וסינתטיות הכלולות בפורמולציות של חומרי הדברה, כגון חומרי הדברה ממוקדים במיטוכונדריה המבוססים על ננו-חלקיקים, הוכחו כמשפיעות על תפקוד המיטוכונדריה על-ידי הפחתת הפוטנציאל המיטוכונדריאלי וסינתזה של ATP ב-S. frugiperda9.

בנוסף, רוב הקרבמטים והמוצרים מבוססי פירתרואידים דווחו כמעכבי I מורכבים ביתושים; עם זאת, החשיפה הממושכת שלהם יצרה כמה אוכלוסיות עמידות לפירתרואידים בגמביה אנופלס, הקשורות לעתים קרובות לרמות גבוהות של P450s שיכולות לעכל מצעים אלה10,11. באופן דומה, צמחים והשמנים האתריים שלהם, תמציות ומטבוליטים משניים תועדו כקוטלי חרקים פוטנציאליים בעלי טווח רחב של תמותה בשלבי חרקים שונים12,13. פעילות קוטלי החרקים של תרכובות טבעיות אלה עשויה להיות קשורה לעיכוב העברת אלקטרונים בנקודה מסוימת בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית על ידי ויסות ייצור מיני חמצן תגובתי, פוטנציאל מיטוכונדריאלי ΔΨm, וסינתזה ATP שיכולים לעורר תהליכי מוות של תאים 6,8.

תרכובות טבעיות, כמקורות ליצירת חומרי הדברה, והשפעתן על המיטוכונדריה ממלאות תפקיד מכריע בתכנון חומרי הדברה ביולוגיים חדשים ובטוחים. בהקשר זה, כתב יד זה מתאר מתודולוגיה לזיהוי היכולת של קסנוביוטיקה להפעיל או לעכב העברת אלקטרונים דרך קומפלקסים מיטוכונדריאליים. גישה מקיפה זו מאפשרת מדידה מדויקת של השפעות הקסנוביוטיקה על תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מגוון מצעים, תוך שימוש הן בשיטות ספירומטריה והן בשיטות ספקטרופוטומטריה. מתודולוגיה זו יושמה כדי לנתח את הפונקציה המיטוכונדריאלית של מיני וקטורים מרכזיים, כולל Aedes aegypti, מה שהוביל לתיאוריה של נוכחות חלבונים uncoupler והעדפות מצע חמצון ייחודיות ספציפיות לכל מין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האתיקה "Comité de ética en investigación científica CEINCI": ועדת האתיקה של המחקר המדעי של האוניברסיטה התעשייתית של סנטנדר. יתר על כן, בדיקות אלה עמדו בהנחיות Arrive ועקבו אחר החוק הקולומביאני 84 משנת 1989 (פרק IV, סעיף 23-26) והחלטה 8430 (1993, פרק IV, סעיף 83-93) המסדיר מחקר בבעלי חיים בקולומביה.

הערה: מומלץ מאוד לקרוא את פרק הזרחן החמצוני של כל ספר ביוכימיה לפני תחילת פרוטוקול זה.

1. ריאגנטים ופתרונות

  1. כדי לבודד מיטוכונדריה של כבד חולדה, הכינו 250 מ"ל של מאגר בידוד מיטוכונדריה: 250 מילימול D-מניטול, 10 מ"מ HEPES pH 7.2 ו-1 מ"מ EGTA. הוציאו 50 מ"ל של מאגר בידוד (זה ייקרא מאגר בידוד ללא BSA) ולאחר מכן הוסיפו 0.2 גרם BSA ל-200 מ"ל האחרים (זה ייקרא מאגר בידוד עם BSA).
  2. כדי הומוגניזציה של זחלי Aedes aegypti , להכין 100 מ"ל של חיץ: 250 mM סוכרוז, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA pH 7.2.
  3. הכן מאגר תגובה: תמיסת מאגר נתרן פוספט 80 mM, pH 7.4, 50 μM EDTA.
  4. הכינו מלאי של ריאגנטים המשמשים לפעילות אנזימטית ב-pH 7.2 כמתואר להלן: 25 mM NADH (מוכן טרי לכל בדיקה), 2 M נתרן סוקצינאט, 4 mM cytochrome c (מוכן טרי לכל בדיקה), 200 μM רוטנון, 0.5 mM KCN, 6 mM 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP), 100 mM phenazine methosulfate (PMS), ו 60 mM אשלגן ferricyanide.
    הערה: מים טהורים במיוחד עם התנגדות של 18.2 MΩ·cm ב 25 ° C שימשו לכל הניסויים והכנת ריאגנטים. מים אלה נוצרו באמצעות מערכת טיהור Milli-Q, המבטיחה הסרה של מזהמים אורגניים, אנאורגניים ומיקרוביאליים לרמות נמוכות מהגבולות הניתנים לזיהוי, מה שהופך אותם למתאימים ליישומים ביוכימיים וביולוגיים מולקולריים בעלי רגישות גבוהה.

2. דיסקציה של הכבד, הומוגניזציה ובידוד מיטוכונדריה מכבד חולדה

  1. לפני שמתחילים, הניחו את כל החומרים והמאגרים על קרח, וודאו שכל החומרים קרים כקרח במהלך כל הבדיקה כדי למנוע נזק למיטוכונדריה.
  2. יש להניח 10 מ"ל של מאגר בידוד מיטוכונדריה בצינור חרוטי קר כקרח.
  3. הרדימו את חולדת הוויסטאר הזכרית על ידי עריפת ראשים של צוואר הרחם, והימנעו משימוש ב-CO2 שיכול להפריע לבדיקות הנשימה. לשם כך, הוועדה לאתיקה במחקר מדעי של האוניברסיטה התעשייתית של סנטנדר (CEINCI) אישרה את השיטות בהחלטה 13 של 2022.
    הערה: חולדות צריכות לשקול לא יותר מ 170 גרם; שומן יכול גם להשפיע על ניתוחי נשימה.
  4. בצע חתך (כ 4-5 ס"מ) עם אזמל סטרילי דרך החלק חולדה בטן.
  5. נתחו את הכבד לחלוטין ברגע שאזור הבטן גלוי. כבד החולדה הוא איבר רב-לובולי, אדום כהה כ-10X5 ס"מ.
  6. הניחו בזהירות את הכבד בתוך מאגר הבידוד הקר כקרח ושטפו פעמיים עם מדיום זה.
  7. טחון דק את הכבד (גודל פחות מ 1 ס"מ) עם מספריים חדים בצלחת פטרי עם 10 מ"ל של מדיום בידוד.
  8. הכנס את התמיסה לתוך צינור הומוגנייזר רקמת פוטר Elvehjem בזהירות הומוגניזציה לפחות עשר פעמים, מהירות נמוכה (~ 390 סל"ד).
  9. העבר את התמיסה לתוך צינור חרוטי וצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  10. לאחר הצנטריפוגה, יוצקים בזהירות את supernatant לתוך צינור חרוטי חדש. יש להשליך את הגלולה עם חלק מהרקמה, הדם ורכיבים תאיים שלמים.
  11. מלא את הצינור עם יותר חיץ בידוד (~ 35 מ"ל) וצנטריפוגה ב 6000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  12. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות בזהירות את הגלולה (מיטוכונדריה) במאגר בידוד חדש ללא BSA.
    הערה: עבור תרחיף מיטוכונדריאלי, מומלץ להשתמש במברשת רכה.
  13. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 7000 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את המיטוכונדריה המבודדת ב 2 מ"ל של חיץ בידוד ללא BSA.
  14. קבע את ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד אודומה 14.

3. הומוגניזציה של Aedes aegypti והזחלים.

הערה: לצורך הליך זה הוחזקה מושבת Ae. aegypti בתוך כלובי רבייה (40 ס"מ × 40 ס"מ × 40 ס"מ) בתנאי חרקים כמו לחות (70% ± 5%), פוטופריוד (12:12) וטמפרטורה (27 ± 5 מעלות צלזיוס). הביצים נאספו על נייר פילטר.

  1. יש לוודא שהביצים בוקעות במגשים עם מים מסוננים ונטולי כלור שבוע לפני הניסוי. זהה את הכוכב על ידי תהליך ההתכה במחזור הזחלים. התבונן בכל תהליך התכה כדי לאמת את מצבו L1, L2 ו- L3. כאשר הזחל נכנס L3, המתן מקסימום 12 שעות כדי לאסוף את החומר.
  2. לאסוף לפחות 100 Ae. זחלי aegypti ב instar L3-L4 במים ללא כלור (~ 30 מ"ל מים). קח את הזחלים עם פיפטה פסטר.
  3. סננו את הזחלים באמצעות נייר פילטר, שטפו את הזחלים שנאספו והשעו אותם מחדש במאגר ההומוגניזציה Aedes aegypti (~2 מ"ל).
  4. להעביר את הפתרון עם הזחלים לתוך צינור הומוגנייזר רקמת פוטר Elvehjem בזהירות הומוגניזציה לפחות עשר פעמים ב ~ 390 סל"ד.
  5. מעבירים את הרקמה ההומוגנית ומסננים אותה דרך מזרק צמר זכוכית כדי להסיר שאריות שלד חיצוני גדול.
  6. קבע את ריכוז החלבון באמצעות שיטת ברדפורד אודומה 15.
    הערה: אין צורך לבודד מיטוכונדריה מזחלי יתושים; ניתן להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה באמצעות תמצית החלבון המתקבל בשלב זה.

4. קביעת השפעות קסנוביוטיקה על שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה

הערה: פרוטוקול זה נועד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית על מיטוכונדריה מבודדים מכבד חולדה ומרקמת חרקים הומוגנית.

הבדיקות מחולקות לשניים: פולארוגרפיה (NADH וסוקצינאט אוקסידאז) וספקטרופוטומטרית (NADH dehydrogenase - קומפלקס I, סוקצינאט דהידרוגנאז - קומפלקס II, ציטוכרום c רדוקטאז - קומפלקס III וציטוכרום c אוקסידאז - קומפלקס IV).

  1. בדיקות פולארוגרפיות: לשם כך, השתמשו ברספירומטריה ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את החמצון המלא של NADH וסוקצינאט על ידי צריכת O2 , ודווחו על התוצאות כ-NADH ו-succinate oxidase.
    1. כייל את המכשיר כל יום לפני תחילת הבדיקות. שלב זה עשוי להשתנות בהתאם לאוקסיגרף שבו נעשה שימוש. בצע את הוראות היצרן.
      1. עבור כיול Oroboros, להוסיף מדיום תגובה לתוך התאים עם עודף של לפחות 0.2 מ"ל מעל נפח תא הניסוי (2 מ"ל), כדי למלא את החדר ואת נימי ההזרקה עם בינוני.
    2. מפעילים את הבוחשנים לאחר תוספת בינונית.
    3. המתן עד שאות ריכוז החמצן יתייצב ורשום אותו.
    4. לכיול אפס חמצן, הוסיפו מיטוכונדריה, תרחיפים של תאים, שמרי אפייה או דיתיוניט (מומלץ להשתמש בשמרי בייקר) שמאפשרים את דלדול החמצן, ורשמו אותו. המתן עד שהאות יגיע לרמות הרקע (בדרך כלל ± 2 pmol/mL/s עבור מערכת O2k).
    5. בצעו פעילויות NADH ו-succinate oxidase על-ידי ניטור צריכת החמצן בעת הוספת חיץ תגובה, 0.1 מ"ג חלבון (מיטוכונדריה או זחלים הומוגניים), והמצע (0.17 mM NADH או 10 mM נתרן סוקצינאט) לתא.
    6. השתמש במעכבי חלבון הובלת אלקטרונים כדי לאשר שצריכת החמצן שנצפתה נובעת משרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית. הנפוצים הם רוטנון 1 מיקרומטר ו- KCN 1mM16. בתא אוקסיגרף מוסיפים את הריאגנטים לפי טבלה 1 (הרצף חשוב).
  2. בדיקות ספקטרופוטומטריות
    הערה: כדי להעריך את מעבר האלקטרונים דרך קומפלקסים מיטוכונדריאליים, נערכו ונמדדו בדיקות אנזימטיות באמצעות ספקטרופוטומטר וקולטי אלקטרונים מלאכותיים כגון PMS, DCPIP וציטוכרום c. מומלץ למדוד אנזים אחד ביום. הכינו מאגרים וריאגנטים לפחות יום אחד לפני הבדיקות. תרכובות מסוימות ניתנות לפוטוסנציה; ראה טבלה 2 להמלצות נוספות.
    1. עבור פעילות NADH דהידרוגנאז, מערכות התגובה מכילות תמיסת חיץ פוספט של 50 מילימטר pH 7.4, 2 mM EDTA, 0.1 מ"ג/מ"ל חלבון מיטוכונדריאלי, 1 מיקרומטר רוטנון ו-1 mM KCN. בתא הספקטרופוטומטר מוסיפים את הריאגנטים לפי טבלה 2 (הרצף חשוב)17. השלבים המומלצים הם כדלקמן:
      1. הכינו 100 מ"ל של חיץ פוספט מעורבב עם EDTA, ובדקו שוב שה- pH אינו משתנה. שמור את המאגר במקרר, אך חובה לשמור אותו בטמפרטורת החדר (RT; כ -25 ° C) במהלך הבדיקות.
      2. הכינו תמיסות טריות של רוטנון, KCN, NADH ואשלגן פריציאניד (יציב עד 4 שעות). הנפח המוצע הוא 1 מ"ל של תמיסות מרוכזות (ראה עמודה ראשונה של הטבלה).
      3. אם לתרכובת הנבדקת יש מסיסות נמוכה במים, כלול בקרה נוספת לפעילות האנזים בתכנון הניסוי באמצעות הממס של התרכובת בלבד.
      4. ראשית, עקוב אחר פעילות NADH dehydrogenase על-ידי הפחתת אשלגן פריציאניד ב-420 ננומטר. חישוב ריכוזו לפי מקדם ההכחדה המולרי שלו של 1.04 mM-1·cm-1. לספקטרופוטומטר יש אפשרות לחשב את הפעילות המקסימלית בתגובה; עיין במדריך למשתמש. לאחר מכן, חלק את הפעילות המדווחת בריכוז החלבון המשמש להשגת הפעילות הספציפית של האנזים.
    2. להעריך את פעילות succinate dehydrogenase על ידי הוספת 20 mM נתרן succinate ו 1 mM phenazine methosulphate (PMS) עם 60 μM 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP) כקולטי אלקטרונים מלאכותיים. בתא הספקטרופוטומטר מוסיפים את הריאגנטים לפי טבלה 3 (הרצף חשוב)17. להלן ההמלצות:
      1. הכינו את אותו חיץ המשמש לדהידרוגנאז NADH. שמור אותו באותם תנאים.
      2. הכן פתרונות מלאי טריים של Succinate, PMS ו- DCPIP. הנפח המוצע הוא 1 מ"ל של פתרונות מרוכזים. הכן פתרונות PMS ו- DCPIP באותו יום של הבדיקה.
      3. אם לתרכובת שנבדקה יש מסיסות נמוכה במים, כלול בקרה נוספת לפעילות האנזים בתכנון הניסוי.
      4. נטר את חמצון סוקצינאט על ידי הפחתת DCPIP ב 600 ננומטר. מחשבים את ריכוזו לפי מקדם ההכחדה המולרי שלו של 21.0 mM−1·cm−1, תוך יישום חוק הבירה. לאחר מכן, חלק את הפעילות המדווחת בריכוז החלבון המשמש להשגת הפעילות הספציפית של האנזים.
    3. מדוד את פעילות Cytochrome c reductase (קומפלקס III) באמצעות NADH או succinate כמצעים הניתנים לחמצון. עם אנזים זה, העברת האלקטרונים מקומפלקס I (באמצעות NADH) או קומפלקס II (באמצעות סוקצינאט) עוברת ליוביקינון ולאחר מכן לקומפלקס III, אשר מעביר את האלקטרונים לציטוכרום c. תגובה זו מלווה בהפחתת ציטוכרום c. הכינו את מערכת התגובה המכילה תמיסת חיץ פוספט של 50 mM pH 7.4, 2 mM EDTA, 0.1 מ"ג חלבון מיטוכונדריאלי, 50 μM NADH ו-0.1 mM KCN. בתא הספקטרופוטומטר מוסיפים את הריאגנטים לפי טבלה 4 (הרצף חשוב)18. להלן ההמלצות:
      1. הכינו את אותו חיץ המשמש לדהידרוגנאז NADH. שמור אותו באותם תנאים.
      2. השתמשו באותם NADH ו-KCN מ-NADH דהידרוגנאז.
      3. אם לתרכובת שנבדקה יש מסיסות נמוכה במים, כלול בקרה נוספת לפעילות האנזים בתכנון הניסוי.
      4. יש לעקוב אחר הפחתת הציטוכרום c ב-550 ננומטר ולחשב את ריכוזו לפי מקדם ההכחדה המולרי שלו של 19.8 מילימטר-1.1·ס"מ-1, תוך יישום חוק באר. לאחר מכן, חלק את הפעילות המדווחת בריכוז החלבון המשמש להשגת הפעילות הספציפית של האנזים.
    4. למדוד cytochrome c oxidase (קומפלקס IV) מבוטא כפעילות cytochrome c oxidase. לשם כך, הכינו תגובת מערכת המכילה תמיסת חיץ פוספט של 50 mM, pH 7.4, 2 mM EDTA ו-0.1 מ"ג חלבון מיטוכונדריאלי (טבלה 5). עבור בדיקות אנזימטיות אלה, להפחית cytochrome c על ידי ערבוב כמויות שוות ערך של cytochrome c ונתרן dithionite, הבטחת הפחתה מלאה של cytochrome c.
    5. לאחר מכן, העבירו את התערובת המתקבלת דרך עמודת ג'ל דקסטרן צולבת באמצעות אותה תמיסה חוצצת פוספט כמו הפאזה הניידת. לאחר מכן, כמת את השברים שנאספו באמצעות ספקטרופוטומטר ב 550 ננומטר19. להלן ההמלצות:
      1. השתמש באותו מאגר המשמש עבור NADH dehydrogenase. שמור אותו באותם תנאים.
      2. אם לתרכובת הנבדקת יש מסיסות נמוכה במים, יש לכלול בקרה נוספת לפעילות האנזים בתכנון הניסוי.
      3. נטרו את חמצון הציטוכרום c ב-550 ננומטר וחשבו את ריכוזו לפי מקדם ההכחדה המולרי שלו של 19.8 mM−1·cm−1, תוך יישום חוק באר. לאחר מכן, חלק את הפעילות המדווחת בריכוז החלבון המשמש להשגת הפעילות הספציפית של האנזים.
        הערה: קובץ גיליון אלקטרוני המציג את תהליך חישוב הפעילות הספציפית של אנזימים, הנמדדת על-ידי צריכת חמצן וספקטרופוטומטריה, נכלל כקובץ משלים 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לפני ניתוח התוצאות המתקבלות עם פרוטוקול זה, חיוני לזכור קצת על הביוכימיה של שרשרת הובלת אלקטרונים במיטוכונדריה. ראשית, NADH מספק זוג אלקטרונים למרכזי חמצון הממוקמים בקומפלקס I. שם, הוא מתחיל את העברת האלקטרונים העוברים מקומפלקס I ליוביקינון, לאחר מכן לקומפלקס III, אשר תורם אותם לציטוכרום c, ולבסוף לקומפלקס IV, שבו חמצן הוא מקבל האלקטרונים הסופי, ומקטין אותו למים. מצד שני, סוקצינאט מספק אלקטרונים לקומפלקס II (המכונה גם סוקצינאט דהידרוגנאז). האלקטרונים עוברים מקומפלקס II ליוביקינון, ומשם ממשיכים באותו נתיב שתואר לעיל. יובי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה ספקטרופוטומטרית ופולרוגרפית עם O2 ברזולוציה גבוהה שימשה לחקר ההשפעות של קסנוביוטיקה על תפקוד המיטוכונדריה. המחקר העריך באופן ספציפי את ההשפעה של שמן אתרי Cymbopogon flexuosus וקרבקרול על NADH וחמצון סוקצינאט, כמו גם הובלת אלקטרונים דרך שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, באמצעות שני מודלים ביולוגיים שונים: מיטוכונדריה מבודדת מכבד חולדה וזחלי Aedes aegypti הומוגניים. בנוסף, חסימות אלקטרונים פוטנציאליות בנקודות ספציפיות בשרשרת הובלת האלקטרונים נבדקו באמצע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

המחברים מודים ל-Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" של Universidad Industrial de Santander על מימון המענק מספר 3739 המתאים לפרויקט "ניסוח קוטל קרציות ואיקסורפלנט שתוכנן במעבדה ואומת בשטח למניעת התפשטות קרציות בבקר".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,6-דיכלורופנולינדופנולMerck119814יש להכין באותו יום השימוש.
מגיב ברדפורדMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Cytochrome cMerckC2506conver רגיש לאור מכסים אותו בנייר אלומיניום. בתמיסה יש לאחסן אותו במקפיא.
D-מניטולMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid טטרסודיום מלח דיהידרטMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178בתמיסה עובד היטב למשך שבועיים.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC MicroplatePhotometer Thermo Scientific 
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Phenazine methosulphate MerckP9625הכן באותו יום שימוש.
אשלגן פריציאניד Merck244023יש להכין באותו יום שימוש.
הומוגנייזר רקמות פוטר Elvehjem
רוטנוןMerck557368מסיס באתנול. קונבר רגיש לאור מכסים אותו בנייר אלומיניום. בתמיסה יש לאחסן אותו במקפיא.
נתרן סוקסינטMerckS9637בתמיסה יש לאחסן אותו במקפיא.
סוכרוזMerckS0389
β-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, מלח דיסודיום מופחת הידרטMerckN8129קונבר רגיש לאור מכסים אותו בנייר אלומיניום. בתמיסה יש לאחסן אותו במקפיא.
51119100צינור

מקורות

  1. Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. Mitochondria in health and diseases. Cells. 9 (5), 1177(2020).
  2. Kummer, E., Ban, N. Mechanisms and regulation of protein synthesis in mitochondria. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (5), 307-325 (2021).
  3. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2), 85-100 (2019).
  4. Fulda, S., Galluzzi, L., Kroemer, G. Targeting mitochondria for cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 9 (6), 447-464 (2010).
  5. Liu, Y., Shi, Y. Mitochondria as a target in cancer treatment. MedComm. 1 (2), 129-139 (2020).
  6. Duque, J. E., et al. Insecticidal activity of essential oils from American native plants against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): an introduction to their possible mechanism of action. Sci Rep. 13 (1), 2989(2023).
  7. Kesari, K. K., et al. Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria. Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).
  8. Vanegas-Estévez, T., Duque, F. M., Urbina, D. L., Vesga, L. C., Mendez-Sanchez, S. C., Duque, J. E. Design and elucidation of an insecticide from natural compounds targeting mitochondrial proteins of Aedes aegypti. Pestic Biochem Physiol. 198, 105721(2024).
  9. Hao, Y., et al. Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda. Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).
  10. Lees, R. S., et al. New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids. Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).
  11. Leung, M. C. K., Meyer, J. N. Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies. Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).
  12. Al-Harbi, N. A., et al. Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae. Plants. 10 (5), 829(2021).
  13. Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis. J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).
  14. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  15. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).
  16. Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).
  17. Gonçalves, M. J., et al. Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate. Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).
  18. Somlo, M. Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l). Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).
  19. Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast. J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).
  20. Nelson, D. L., Cox, M. Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. 120, e54985(2017).
  22. Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells. J Vis Exp. (134), e57225(2018).
  23. Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10. Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).
  24. Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial. Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).
  25. Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).
  26. Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death. Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).
  27. Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria. Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).
  28. Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae. Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).
  29. Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).
  30. Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics. J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שרשרת העברת האלקטרוניםביואנרגטיקה מיטוכונדריאליתבדיקה רספירומטריתבדיקה אנזימטיתבידוד מיטוכונדריהצריכת חמצןפעילות NADH דהידרוגנאזציטוכרום C אוקסידאז
חשיפת הובלה קסנוביוטית והשפעות במיטוכונדריה מבודדת: תובנות מבדיקות רספירומטריות ואנזימטיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.