מאמר שיטה

שילוב מבנה חלבון מטרה, גמישות ודינמיקה בגילוי תרופות חישוביות באמצעות ניתוח עגינה מבוסס אנסמבל

DOI:

10.3791/67174

⸱

20 ביוני 2025

 , 
1Bioinformatics Programme, Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre of Research in Systems Biology, Structural Bioinformatics and Human Digital Imaging (CRYSTAL), Universiti Malaya

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות חישוביות טומנות בחובן הבטחות לזירוז גילוי תרופות, אך לעתים קרובות הן מתעלמות מהאופי הדינמי של מבני חלבונים. כאן, אנו דנים בניתוח עגינה מבוסס אנסמבל כדי לשלב בעקיפין גמישות חלבון, מה שעשוי לשפר את הדיוק והאמינות של מאמצי גילוי תרופות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך גילוי התרופה הוא פעולה קפדנית, גוזלת זמן ויקרה. הגישה החישובית בגילוי תרופות מאפשרת לחוקרים לתעדף את התרכובות המבטיחות ביותר לבדיקות נוספות, מה שיפחית מאוד את המשאבים הנדרשים, מה שיוביל לעלייה ביעילות הכוללת בצינורות גילוי התרופות. גילוי תרופות מבוסס מבנה הוא גישה נפוצה הדורשת מידע מבני של חלבון המטרה בפורמט תלת מימדי. עם זאת, המגבלה הנוכחית של רוב אסטרטגיות גילוי התרופות בעזרת מחשב היא חוסר היכולת שלהן להציג את הגמישות והדינמיקה של מבנה חלבון המטרה במהלך סימולציית העגינה של ליגנד-חלבון. בעוד שגם עגינה בהתאמה מושרית וגם עגינה מבוססת אנסמבל שואפות לטפל בגמישות החלבון בהליך העגינה, האחרונה יכולה לספק מבט מקיף יותר על התנהגות חלבון דינמית על ידי שילוב קונפורמציות מרובות לאורך הסימולציה. בדוח זה, אנו מדגימים ודנים ביישום של טכניקה הנקראת ניתוח עגינה מבוסס אנסמבל המציגה בעקיפין את הגמישות והדינמיקה של מבנה חלבון המטרה בתהליך העגינה המולקולרית. החלבון והליגנד שנבחרו למחקרי עגינה מבוססי אנסמבל היו ליזוזים ו-Flovokawain B (FB), בהתאמה. בעבר דווח על פעילות קשירה של FB עם ליזוזים. סימולציה של דינמיקה מולקולרית (MD) בוצעה על ליזוזים בנוכחות מים, ונבדקו האנרגיה הכוללת, סטיית שורש ממוצע ריבועי (RMSD) ותנודות שורש ממוצע ריבועי (RMSF). אשכולות קונפורמציה נוצרו על סמך מספר ערכי חיתוך אשכולות ונבחרו לניתוח עגינה נוסף עם FB. אשכול מס' 2 נותן את אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר ב-29.37 kJ/mol. תמונות עגינה מולקולרית נוצרו כדי לצפות את נוכחותם של כוחות קשירה. על ידי שילוב הדינמיקה המבנית של החלבון, גישת העגינה מבוססת האנסמבל יכולה ללכוד טוב יותר את מגוון תרחישי הקישור האפשריים, מה שמוביל לתחזיות אמינות יותר של תוצאות קשירה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בגילוי תרופות חישוביות (CDD), משולבות טכניקות ממדעי המחשב, כימיה, ביולוגיה ופיזיקה כדי לחקור מרחב כימי עצום, לחזות אינטראקציות בין תרופות למטרה ולייעל מועמדים לתרופות ביעילות גבוהה יותר ובעלויות נמוכות יותר בהשוואה לשיטות ניסוי מסורתיות בלבד. זוהי גישה רבת עוצמה הממנפת שיטות ואלגוריתמים חישוביים כדי להאיץ את הגילוי והאופטימיזציה של תרכובות טיפוליות חדשות 1,2,3. CDD חולל מהפכה בגילוי תרופות. עם זאת, ישנן מגבלות הקשורות לדינמיקה של מבנה תלת מימדי (תלת מימד) של חלבון שיכולות להשפיע על הדיוק והאמינות של תחזיות חישוביות4. מבני חלבון תלת מימדיים משמשים כתבניות ב-CDD לתכנון או אופטימיזציה של מועמדים לתרופות על סמך אינטראקציות חלבון-תרופת היעד. בעוד שמודלים של קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן של מבני חלבון מספקים מידע מבני רב ערך על חלבון, חיוני להכיר את האופי הדינמי של מבני חלבון ואת המגבלות של מודלים סטטיים 5,6,7. בנוסף, ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryo-EM) ותחזיות חישוביות כגון AlphaFold הרחיבו מאוד את הזמינות של נתונים מבניים בלכידת הספקטרום המלא של גמישות ודינמיקה של חלבונים 8,9,10,11,12.

סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) מדמות את התנועה והאינטראקציות של אטומים ומולקולות לאורך זמן, ומספקות תובנות לגבי ההתנהגות הדינמית והגמישות של מבנה תלת מימד של חלבון13,14. סימולציות MD משמשות ליצירת מבנים תלת מימדיים של חלבון המייצגים מצבי קונפורמציה שונים, המשמשים כקלט לניתוח עגינה מבוסס אנסמבל. באמצעות דגימה של קונפורמציות חלבון מגוונות, ניתוח עגינה מבוסס אנסמבל מביא בחשבון את הגמישות והדינמיקה האינהרנטית של מטרות ביולוגיות, ומאפשר חקירה מקיפה יותר של מצבי קשירת ליגנד ואינטראקציות3.

הבנת גמישות החלבון היא חיונית, מכיוון שהיא משפיעה על האופן שבו תרופות מפעילות את ההשפעות הביולוגיות שלהן, קובעת את המיקום והכיוון של אתרי הקישור ומשפיעה על קינטיקה של קשירה, חילוף חומרים והובלה15,16. לכידת האופי הדינמי הזה יכולה לשפר משמעותית את הדיוק והאמינות של תחזיות העגינה. בשנת 1994, קירסלי ועמיתיו הציגו טכניקת עגינה גמישה, מסגרת המדמה את הגמישות של ליגנדים וחלבונים. גישה זו מאפשרת לקונפורמציה של החלבון להסתגל במהלך העגינה, ומשפרת את התחזיות של אינטראקציות ליגנד-קולטן על ידי התחשבות בגמישות מבנית17. באופן דומה, בשנת 1999, קרלסון ועמיתיו דיווחו על עגינת אנסמבל, המיישמת מודלים פרמקופוריים גמישים על מודלים סטטיים ודינמיים של אינטגראז HIV-1, מה שמדגיש עוד יותר את החשיבות של התחשבות בדינמיקת חלבונים במחקרי עגינה18. יתר על כן, Cavasotto et al. דיווחו גם על שיפור דיוק העגינה של ליגנד על ידי שילוב גמישות הקולטן בתהליך העגינה באמצעות ניתוח מצב רגיל19. לאחרונה, טכניקות מבוססות אנסמבל 20,21,22,23,24,25,26,27 הרחיבו את גילוי התרופות על ידי זיהוי אתרי קשירת ליגנד פוטנציאליים חדשים ומתן הערכות מדויקות יותר של אנרגיית קשירת קולטני ליגנד חופשיים. התקדמות זו יושמה על מטרות כגון DNA מרובע-דופלקס20, גורם גדילה אנדותל כלי דם 165 (VEGF-165)21, אנזים המטרה SARS-CoV-222, אנזימי ציטוכרום P450 בכבד אנושי23 וחלבונים אנטי-סרטניים24.

Flavokawain B (FB), המסווג כפלבונואיד, תועד כמציג תכונות פרמקולוגיות שונות 28,29,30. בהתבסס על ניתוח ניסיוני וחישובי, דווח כי FB יוצר קומפלקס יציב עם ליזוזים (LYZ)31, חלבון המוכר באופן נרחב בפעילותו האנטי-מיקרוביאלית וזוהה גם כטרנספורטר ליגנד 32,33,34. בדוח זה, אנו מנתחים עוד את אופי האינטראקציה של FB עם LYZ באמצעות ניתוח עגינה מבוסס אנסמבל כדי לשלב את ההשפעה של גמישות החלבון בהיווצרות קומפלקס FB-LYZ. מטרת שיטה זו היא לספק לחוקרים תהליך צעד אחר צעד, הניתן לחזרה לניתוח עגינה מבוסס אנסמבל. בנוסף, מומלץ לחוקרים לבחור את מבני החלבון מאורגניזם המטרה למחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מבנה ליגנד Flavokawain B

  1. פתח את אתר האינטרנט של PubChem. חפש את Flavokawain B. בחר הורד ובחר שמור למבנה דו-ממדי של SDF כ- Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL SDF.
  2. פתח את תוכנת Avogadro. העבר את ה-SDF file לחלל הריק של התוכנה. לחץ על כן.
    הערה: תוכנת Avogadro תבנה אוטומטית גיאומטריה תלת מימדית (3D).
  3. בכרטיסייה, לחץ על הסמל, כפי שמוצג באיור 1. בכרטיסיית התפריט השמאלית, שנה את שדה הכוח ל-MMFF94 35,36. התאם את השלבים לכל עדכון ל- 15. הגדר את האלגוריתם ל- Steepest Descent ולחץ על Start.
    הערה: אין להזיז אטומים בזמן הסיבוב. לאחר שתסיים, לחץ על עצור. MMFF94 מתאים למגוון רחב של ליגנדים של מולקולות קטנות (כולל ניטרלי וטעון כאחד) ונמצא בשימוש נרחב למזעור אנרגיה ומידול מולקולרי37. שיטת הירידה התלולה ביותר נבחרה למזעור אנרגיה ראשוני מכיוון שהיא פשוטה, יעילה מבחינה חישובית ויעילה להסרת מתחים מבניים גדולים והשגת מצב מזעור בסיסי 38,39,40.
  4. בכרטיסיית התפריט, עבור אל קובץ ולחץ על שמירה בשם. כאשר מופיעה תיקיית Save Molecule As , כתוב את שם הקובץ כ - ligand.pdb ולחץ על Save.

2. הכנת מבנה חלבון ליזוזים

  1. פתח את אתר מאגר נתוני החלבון RCSB. חפש lysozyme, קוד: 1LYZ. לחץ על הורד קבצים ובחר פורמט PDB. שמור כ- 1lyz.pdb.
  2. פתח את תוכנת Chimera. בכרטיסיה, לחץ על קובץ ופתח. בתיקיה, בחר קובץ 1lyz.pdb.
    הערה: מבנה תלת מימדי של ליזוזים ייבנה באמצעות תוכנה.
  3. בכרטיסיה, לחץ על בחר שאריות > > HOH. לאחר מכן לחץ על פעולות > Atom/Bonds > Delete. לחץ על בחר ונקה בחירה.
    הערה: זה יסיר מים מהחלבון.
  4. בכרטיסיה, לחץ על בחר שרשרת > > A. לאחר מכן לחץ על כלים > עריכת מבנה > AddH. תיבת פרמטרים תצא ותשאיר אותה כברירת מחדל. לחץ על OK. לחץ על בחר ונקה בחירה (איור 2).
    הערה: זה יוסיף מימן לחלבון. שאריות ההיסטידין עוברות גם פרוטונציה ליצירת מערכת ניטרלית. התוכנה יכולה לבצע חישובי pKa על ידי שילוב PROPKA 41,42.
  5. בכרטיסיה ולאחר מכן לחץ על כלים, עריכת מבנה והוסף תשלום. תצא תיבת פרמטרים; בחר Gasteiger. לחץ על OK. הערה: זה יוסיף מטענים חלקיים לחלבון.
  6. כדי לשמור את הקובץ, בכרטיסייה לחץ על קובץ > שמור PDB. שמור כחלבון.pdb.
    הערה: במחקר זה, מבנה הליזוזים נבחר להשוואה עם תוצאה31 שדווחה בעבר. מומלץ לקוראים לבחור בקפידה מבני חלבון מאורגניזם היעד שמעניין אותם.

3. הדמיית MD של ליזוזים במים

הערה: המחשבים המותאמים אישית לסימולציית דינמיקה מולקולרית (MD) המשמשים במחקר זה הם Intel CORE i711 th Gen עבור CPU, NVIDIA Geforce RTX 2060 עבור GPU וזיכרון DDR4 128 GB. מערכת ההפעלה היא אובונטו 22.04.4 LTS. סימולציית MD משתמשת בתוכנת GROMAKS. התמיכה ב-GPU היא CUDA.

  1. הורד את כל המסמכים הנדרשים מקישור זה: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (GROMACS Tutorial, Lysozyme in Water)43.
    הערה: המסמכים הדרושים הם em.mdp, ions.mdp, md.mdp. npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff ו-protein.pdb (משלב 2.5). עבור הגדרת המערכת, em.mdp מיועד למזעור אנרגיה, ו - ions.mdp הוא להוסיף יונים ולנטרל את המערכת. עבור שיווי משקל, nvt.mdp מיועד לשיווי משקל טמפרטורה, בעוד npt.mdp מיועד לשיווי משקל לחץ. לייצור, md.mdp מיועד לסימולציה. Charmm36 ff מיועד לטופולוגיה.
  2. לחץ לחיצה ימנית על השטח הריק בתיקייה (ספריית העבודה) ולחץ על פתח מסוף. הקלד gmx כדי לפתוח את תוכנת GROMAKS. הערה: ל-GROMACS אין ממשק משתמש גרפי; הכל מהפקודה שנכתבה בטרמינל.
  3. ליצירת טופולוגיית חלבון, סוג gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh. ניתנת רשימה של שדות כוח, וסוג 1 עבור שדה כוח כל אטום CHARMM44, ואחריו סוג 1 עבור TIP3P עבור מודל המים.
    הערה: הגרסה המעודכנת, CHARMM36, זמינה גם היא וניתנת להורדה החל מ-http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml45.
  4. הגדירו קופסה מעוקבת שתכסה את כל מבנה החלבון. סוג gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt מעוקב. הערה: החלבון ממוקם לפחות 1 ננומטר מקצה הקופסה. ודא שגודל קופסת המים גדול מספיק עבור חלבון, ממס ויונים. בנוסף, קופסת המים צריכה להיות מספקת כדי למנוע אינטראקציות בין תמונות תקופתיות של החלבון. המרחק המינימלי המומלץ בין החלבון לקצה הקופסה הוא לפחות 1.0-1.5 ננומטר.
  5. לתצורת ממס46, סוג gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
  6. הוסף יונים כגון נתרן ו/או כלוריד על ידי הקלדת gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
    הערה: יוני נתרן ו/או כלוריד משמשים/משמשים לנטרול המערכת.
  7. לנטרל את המערכת על ידי הקלדת gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral. בחר 13 עבור הקבוצה SOL.
    הערה: עבור ליזוזים, 8 מולקולות מומסות הוחלפו ביוני כלוריד (איור 3).
  8. בקובץ CHARMM 36, חפש את התיקיה ions.itp . הקיצור של יון כלוריד הוא CLA.
  9. פתח topol.top file, הוסף CLA ומספר 8 כפי שמוצג באיור 4.
  10. פתח את קובץ solv_ions.gro והחלף את כל CLA ל-CLA.
    הערה: ודא שלקבצים solv_ions.gro ו-topol.top יש את אותו קיצור של יונים מתאימים, אחרת תופיע אזהרה. שינוי שם היון הוא בהתאם לגרסת הקובץ CHARMM 36 ff. מכיוון שהקיצור של כלוריד הוא כבר CL, אין צורך לשנות את שמות היונים בגרסה הישנה יותר. עם זאת, בדוק תמיד את קיצור היונים.
  11. הרפו את מבנה החלבון על ידי מזעור אנרגיית הירידה התלולה ביותר עם מספר מרבי של 50,000 צעדים. לשם כך, הקלד gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr ואחריו gmx mdrun -v -deffnm em.
    הערה: הממס והיונים מאוזנים סביב החלבון בשני שלבים: (i) מספר החלקיקים (N), נפח המערכת (V) והטמפרטורה (T) קבועים (NVT), ו-(ii) מספר החלקיקים (N), לחץ המערכת (P) והטמפרטורה (T) קבועים (NPT). צימוד הטמפרטורה (שלב NVT) נקבע על 300 K בהתבסס על תרמוסטט ברנדסן שונה, בעוד שצימוד לחץ (שלב NPT) מוגדר על 1 בר על בסיס Parrinello-Rahman. האינטראקציות האלקטרוסטטיות ארוכות הטווח וחיפוש השכן הקרוב ביותר מחושבים אוטומטית באמצעות שיטת רשת החלקיקים Ewald (PME) ואלגוריתם Verlet, בהתאמה.
  12. לשיווי משקל של NVT, סוג gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr ואחריו gmx mdrun -v -deffnm nvt.
    הערה: הזמן שלוקח לאיזון טמפרטורה הוא בסביבות 5 דקות, תלוי במעבד וב-GPU. עבור שיווי משקל מערכתי, זמן הסימולציה הוא 100 ps.
  13. לשיווי משקל של NPT, סוג gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr ואחריו gmx mdrun -v -deffnm npt.
    הערה: הזמן שלוקח לאיזון לחץ הוא בסביבות 5 דקות, תלוי במעבד וב-GPU. עבור שיווי משקל מערכתי, זמן הסימולציה הוא 100 ps.
  14. בקש מהמערכת לעבור ריצות שיווי משקל עבור ns 1 ולאחר מכן את ריצת הייצור באמצעות הפונקציה mdrun עם משך של ns 100. פתח את הקובץ md.mdp . ב-n צעדים, שנה ל-50000000; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns).
  15. לייצור דינמיקה מולקולרית, סוג gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr ואחריו gmx mdrun -v -deffnm md.
    הערה: הזמן לכך הוא בסביבות ~ 2 ימים. מסגרות המסלול שנוצרו מסימולציית MD נלכדות במרווחים של 10 ps ומשמשות לניתוח אשכולות מבוסס סטיית ריבוע ממוצעת שורש (RMSD).

4. ניתוח אשכולות מבוסס RMSD

  1. לאחר סימולציית MD, המשך בניתוח הפקודה. חלבון יתפזר דרך תא היחידה ועשוי להיראות "שבור" או "לקפוץ" לצד השני של הקופסה. סוג gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -הקומפקטי שלך. סוג 1 עבור מרכוז החלבון ו-0 עבור תפוקת המערכת. הקלד vmd em.gro כדי לדמיין את החלבון.
  2. לניתוח אנרגיה כוללת, הקלד gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg, והמשך להקליד 14 עבור האנרגיה הכוללת.
    הערה: ניטור האנרגיה הכוללת הוא בסיסי להבטחת האמינות והנכונות של סימולציות MD47,48.
  3. לניתוח RMSD, הקלד gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns. המשך להקליד 3 עבור ה-C-alpha של התאמת הריבועים הפחותים ו-3 עבור ה-C-alpha של חישוב RMSD (איור 5).
  4. לניתוח RMSF, הקלד gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res. המשיכו לסוג 1 לחלבון.
  5. לשימוש בחסד, הקלד פקודה זו xmgrace totalenergy.xvg. התאם את הצירים על ידי לחיצה כפולה על קו תיבת הגרף. תופיע התיבה חסד: צירים . לחץ על קבל.
  6. בתפריט הכרטיסיות, לחץ על קובץ Print_setup. חסד: תופיע הגדרת המכשיר. שנה את ההתקן מ- PostScript ל- JPEG. לחץ על קבל. כעת לחץ על הדפס בתפריט הקובץ. שמור כ-totalenergy.jpg.
  7. חזור על שלבים 4.5 ו-4.6 עבור xmgrace rmsd.xvg ו-xmgrace rmsfxvg.
  8. לניתוח אשכולות, סוג gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0. המשך לסוג 1 (קבוצת חלבונים) כדי לחשב את התאמת הריבועים הפחותים ואת RMSD וסוג 1 (קבוצת חלבון) עבור פלט המערכת.
    הערה: התאם את ערך החיתוך בהתאם לתוצאת האשכולות. פקודה -cl מייצגת פלטים של ממוצע עבור כל אשכול.
  9. פתח את cluster-size.xvg.
    1. בהתבסס על המידע שסופק, הגדל את ערך החיתוך של RMSD אם מספר האשכולות נמוך או הקטן את ערך החיתוך של RMSD אם מספר האשכולות גבוה.
  10. חזור על שלב 4.8 עם ערכי חיתוך שונים.
    הערה: אשכולות עם ערכי חיתוך שונים עד שנקבע ערך חיתוך RMSD אופטימלי על סמך הקריטריונים הבאים: (1) יש להגביל את המספר הכולל של האשכולות לפחות מ-30. (2) עדיף למזער את נוכחותם של אשכולות עם איבר אחד בלבד. (3) רצוי שיותר מ-90% מהמסלול יהיה מיוצג בפחות מ-10 אשכולות.
  11. פתח את תוכנת Chimera וחפש את cluster.pdb.
    הערה: cluster.pdb מכיל ממוצע עבור כל קבוצת אשכולות.
  12. לחץ על מתנות ופרסום 1 (צללית, סרט מעוגל).
  13. לאחר מכן, עבור אל קובץ > שמור תמונה > שמור.
  14. לחץ על בחר > שרשרת > (ללא מזהה) > cluster.pdb (# 1). לחצו על Select > Invert (כל הדגמים). לחץ על פעולות > אטומים/קשרים > מחיקה.
    הערה: פעולה זו תסיר את כל אשכולות הקבוצה למעט אשכול 1.
  15. לאחר מכן, עבור אל קובץ > לשמור PDB > לשמור. שמירה כ - cluster1.pdb.
  16. חזור על שלבים 4.11-4.15 עבור אשכולות שונים. שמור כ - cluster2.pdb, cluster3.pdb ו- cluster4.pdb.
    הערה: מכיוון שהמספר הכולל של 4 האשכולות המובילים הוא יותר מ-90% מכלל המסלולים, כל נציג של 4 האשכולות המובילים מחולץ ונתון לניתוח עגינה מולקולרית באמצעות כימרה (ראה איור 6).

5. עגינה מבוססת אנסמבל

  1. לחץ פעמיים על התוכנה Autodock Tools .
    הערה: לצורך עגינה, מחקר זה השתמש בתוכנת הכלים AutoDock ו-AutoDock 13,49,50,51.
  2. מקם את הקבצים cluster1.pdb ו - ligand.pdb בתיקיה חדשה.
  3. בתפריט, לחץ על קובץ > העדפות > הגדר. תופיע תיבה Set User Preferences . העתק את הכתובת של "התיקיה החדשה" כטקסט. הדבק את הכתובת בספריית ההפעלה בתיבה הגדר העדפות משתמש . לחץ על Set.
    הערה: זהו שלב חשוב בעת שימוש במערכת ההפעלה Windows.
  4. לחץ על תמונת התיקייה הכחולה. תיקיית מולקולות קריאה תופיע. בחר cluster1.pdb.
    הערה: כלי Autodock יקראו את המבנה המולקולרי של החלבון.
  5. לחץ על ערוך חיובים > > הוסף חיובי קולמן. לאחר מכן לחץ על OK. לחץ על ערוך > מימן > מיזוג לא קוטבי.
    הערה: מטעני קולמן מתווספים לחלבון.
  6. לחץ על Grid > Macromolecules > Choose. תופיע תיבה בחר מקרומולקולות . בחר cluster1 ולחץ על בחר מולקולות. לחץ על OK. יופיע קובץ מקרומולקולה AutoDock4 שונה . שמור כ - cluster1.pdbqt.
  7. רוקן את סביבת העבודה על-ידי לחיצה על Edit > Delete > Delete All Molecules. לחץ על המשך.
  8. לחץ על Ligand > קלט > פתח.   יופיע קובץ Ligand עבור תיקיית Autodock4 . בחר All Files, בחר ligand.pdb ולחץ על Open. לחץ על OK.
    הערה: ליגנד ההתקנה יכלול שילוב של מטעני גסטייגר ומיזוג של מימן לא קוטבי.
  9. לחץ על Ligand > Torsion Tree > Detect Root.
  10. לחץ על Ligand > פלט > שמור כ-PDBQT. תופיע תיקיית מולקולות Autotors מעוצבות . שמור כ - ligand.pdbqt.
  11. רוקן את סביבת העבודה על-ידי לחיצה על Edit > Delete > Delete All Molecules. לחץ על המשך.
    הערה: בצע את אותו הליך כמתואר בשלב 5.6.
  12. לחצו על Grid > Macromolecules > Open. בחר cluster1.pdbqt ולחץ על פתח. לחץ על כן. לחץ על אישור.
  13. לחץ על רשת > הגדר סוגי מפות > פתח ליגנד. בחר ligand.pdbqt ולחץ על פתח.
    הערה: בסביבת העבודה ישנם חלבונים וליגנדים.
  14. לחץ על Grid and Grid Box. תופיע התיבה אפשרויות רשת. במספר נקודות בממד x, התאם את הפרמטר ל-120, והגדר את מספר הנקודות בממד y ל-120, הגדר את מספר הנקודות בממד z ל-120. הגדר את המרווח (אנגסטרום) ל-0.375. השאר את הפרמטרים של תיבת רשת מרכזית כברירת מחדל. לחץ על File וסגור את Saving Current.
    הערה: קופסת הרשת מכסה את כל החלבון, מה שאומר שזו עגינה עיוורת.
  15. לחץ על Grid > Output > Save GPF. יופיע קובץ פלט פרמטר רשת . בשם הקובץ, הקלד grid.gpf ולחץ על שמור.
  16. לחץ על הפעל והפעל AutoGrid. תופיע התיבה הפעל רשת אוטומטית . בכרטיסיה שם קובץ פרמטר , לחץ על עיון. יופיע קובץ פרמטר Autogrid . בחר grid.gpf. לחץ על פתח. ב - Program Pathname > עיון. יופיע קובץ autogrid4 . חפש autogrid4.exe ולחץ על פתח > הפעל.
    הערה: ודא ששם התיקייה אינו מכיל רווחים, מכיוון שהדבר עלול לגרום לשגיאה במהלך ההפעלה. ניתן להתקין את autogrid4.exe התיקיות https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  17. לחץ על Docking > Macromolecules > הגדר שמות קבצים קשיחים. יופיע קובץ מקרומולקולות PDBQT . בחר cluster1.pdbqt ולחץ על פתח.
  18. לחץ על עגינה > Ligand > בחר. מופיעה התיבה בחר ליגנדים . בחר את הליגנד ולחץ על בחר ליגנד. תופיע תיבת פרמטר ליגנד AutoDpf4 . לחץ על קבל.
  19. לחץ על עגינה > פרמטר חיפוש > אלגוריתם גנטי. תופיע תיבת פרמטרים של אלגוריתם גנטי . שנה את מספר ריצות ה-GA ל-100. השאר את הפרמטרים הנותרים כברירת מחדל. לחץ על קבל.
  20. לחץ על Docking > Output >- Lamarckian GA(4.2). יופיע קובץ פלט של פרמטר עגינה Autodock4.2 GALS . עבור שם הקובץ, הקלד docking.dpf ולחץ על שמור.
  21. לחץ על הפעל > הפעל את AutoDock. תופיע התיבה הפעל עגינה אוטומטית . תחת שם קובץ פרמטר , לחץ על עיון. מופיע קובץ פרמטר autodock4 . בחר docking.dpf. לחץ על פתח. תחת שם נתיב תוכנית , לחץ על עיון. יופיע קובץ autodock4 . חפש autodock4.exe ולחץ על פתח. לחץ על הפעל.
    הערה: ודא ששם התיקייה אינו מכיל רווחים, מכיוון שהדבר עלול לגרום לשגיאה במהלך ההפעלה. הזמן שלוקח הוא ~30 דקות. ניתן להתקין את autodock4.exe התיקייה באמצעות הקישור: https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  22. מחק את כל המולקולות כמתואר בשלב 5.7.
  23. חזור על שלבים מ- 5.1-5.22 עבור cluster2.pdb, cluster3.pdb ו-cluster4.pdb.
    הערה: כל 4 קבוצות העגינה ישמשו לניתוח.

6. ניתוח עגינה מבוסס אנסמבל

  1. השתמש בתוכנת כלי AutoDock כדי להמשיך בניתוח. לחץ על Analyze > Docking > Open. יופיע קובץ יומן עגינה. בחר docking.dlg ולחץ על פתח. לאחר מכן, לחץ על אישור.
  2. לחץ על נתח > מקרומולקולות > פתוח.
  3. לחץ על נתח קונפורמציות > > משחק, מדורגות לפי אנרגיה. תופיע תיבת ליגנד.
  4. בתיקיה החדשה, פתח את התיקיה docking.dlg באמצעות פנקס רשימות. חפש ניתוח אשכולות של קונפורמציה. מהמידע שניתן, חפש את ריצת הקונפורמציה (המוצהרת כ-Run), שיש לה את אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר.
    הערה: מכיוון שיש 100 קונפורמציות רצות, רק לאחת יש את הזיקה החזקה ביותר בין ליגנד לחלבון. המונח לאנרגיית הקישור הנמוכה ביותר מוגדר כבעל זיקה מחייבת חזקה יותר 52,53,54.
  5. משלב 6.3 (תיבת ליגנד ), הזן את ריצת הקונפורמציה (משלב 6.4) ולחץ על Enter.
    הערה: הליגנד ימקם את עצמו בהתאם בתוך החלבון.
  6. בתיבת הליגנד , לחץ על הכפתור פתח את החלונית כדי לשנות את אפשרות ההפעלה. תופיע תיבה Set Play Options. לחץ על כתיבה מורכבת. יופיע קומפלקס כתיבה של תיקיית קולטנים . שמור כ - complex.pdb.
    הערה: מאחר שקיימות 4 קבוצות אשכולות, ניתן לתת שם לקובץ complex.pdb בהתאם, כגון complex1.pdb עבור קבוצת אשכול 1.
  7. פתח את תוכנת Chimera וחפש את complex.pdb (כמו בשלב 6.6).
  8. לחץ על קביעות מוגדרות מראש > אינטראקטיבי 1 (רצועות כלים) > פרסום 1 (צללית, סרט מעוגל).
  9. לאחר מכן עבור אל קובץ ולחץ על שמור תמונה.
    הערה: התמונה שנשמרה היא מבנה הסרט של מתחם FB-LYZ.
  10. לחץ על קביעות מוגדרות מראש > אינטראקטיבי 3 (משטח הידרופובי) > פרסום 1 (צללית, סרט מעוגל).
    הערה: התמונה שנשמרה היא מבנה הבלון של מתחם FB-LYZ.
  11. פתח את תוכנת Discovery Studio.
  12. גרור את complex.pdb לשטח הריק של התוכנה.
  13. לחץ על הכרטיסייה כלים ובחר הצג דיאגרמה דו-ממדית.
    הערה: התוכנה תיצור אוטומטית את המבנה הדו-ממדי של המתחם (איור 7).
  14. לחץ על קובץ ושמור בשם. כתוב את שם הקובץ ולחץ על Save.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המבנה הכימי והייצוג המבני התלת-ממדי של FB לאחר אופטימיזציה מוצגים באיור 8A. איור 8B מציג את המבנה התלת-ממדי של ליזוזים עם קוד pdb 1LYZ במצב ההתחלתי לפני סימולציית MD. על מנת לחקור את הדינמיקה והגמישות של מבנה תלת מימד של ליזוזים, נערכה סימולציית MD עבור 100 ns. האנרגיה הכוללת של מבנה החלבון הייתה יציבה במהלך הסימולציה, כפי שמוצג באיור 9A. 20 ה-ns הראשונים של סימולציית MD חשפו עלייה של ערך ה-RMSD, ולא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יישום מבוסס אנסמבל בגילוי תרופות חישוביות כרוך בשימוש בהרכבים קונפורמטיביים רבים שמקורם במבני גביש, מחקרי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או סימולציות דינמיקה מולקולרית26. ניצול של קונפורמציות חישוביות מרובות יאפשר לניתוח לשלב את הדינמיקה והגמישות של מבנה חלבון, מה שיוביל לשיפור הדיוק והאמינות בזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות.

כדי ליישם ניתוח עגינה מבוסס אנסמבל, יש לבצע מספר שלבים מרכזיים. ראשית, קבוצה מגוונת של קונפורמציות חלבון מנתונים נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים שיכולים היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק RMF של אוניברסיטת מלאיה, פרויקט מספר RMF1392-2021 מאוניברסיטת מלאיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AutoDockמכון המחקר סקריפס, ארה"בגרסה 4.2.6
כלי AutoDockמכון המחקר סקריפס, גרסת ארה"ב1.5.6
אבוגדרוג'פרי ר. האצ'יסון, המחלקה לכימיה, אוניברסיטת פיטסבורג, פיטסבורג, ארה"בגרסה 1.95
Discovery StudioDassault Systè מס, מסצ'וסטס, ארה"בגרסת 2021
GROMACsאוניברסיטת חרונינגן
המכון המלכותי לטכנולוגיה
אוניברסיטת אופסלה, שוודיה		גרסה 2023
משאב כימרה UCSFלמחשוב ביולוגי, הדמיה ואינפורמטיקה
אוניברסיטת קליפורניה		גרסה 1.16

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Niazi, S. K., Mariam, Z. Computer-aided drug design and drug discovery: a prospective analysis. Pharmaceuticals (Basel). 17 (1), 22(2023).
  2. Sadybekov, A. V., Katritch, V. Computational approaches streamlining drug discovery. Nature. 616 (7958), 673-685 (2023).
  3. Sliwoski, G., Kothiwale, S., Meiler, J., Lowe, E. W. Jr Computational methods in drug discovery. Pharmacol Rev. 66 (1), 334-395 (2014).
  4. Adelusi, T. I., et al. Molecular modeling in drug discovery. Informatics Med Unlocked. 29, 100880(2022).
  5. Durrant, J. D., McCammon, J. A. Computer-aided drug-discovery techniques that account for receptor flexibility. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 770-774 (2010).
  6. Korb, O., et al. Potential and limitations of ensemble docking. J Chem Inf Model. 52 (5), 1262-1274 (2012).
  7. Strecker, C., Meyer, B. Plasticity of the binding site of renin: optimized selection of protein structures for ensemble docking. J Chem Inf Model. 58 (5), 1121-1131 (2018).
  8. Pak, M. A., et al. Using AlphaFold to predict the impact of single mutations on protein stability and function. PLoS One. 18 (3), e0282689(2023).
  9. Jumper, J. M., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  10. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  11. Nakane, T., Kimanius, D., Lindahl, E., Scheres, S. H. Characterisation of molecular motions in cryo-EM single-particle data by multi-body refinement in RELION. eLife. 8, e36861(2018).
  12. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  13. Zhao, H., Caflisch, A. Molecular dynamics in drug design. Eur J Med Chem. 91, 4-14 (2015).
  14. Meng, X. Y., Zhang, H. X., Mezei, M., Cui, M. Molecular docking: a powerful approach for structure-based drug discovery. Curr Comput Aided Drug Des. 7 (2), 146-157 (2011).
  15. Broughton, H. B. A method for including protein flexibility in protein-ligand docking: improving tools for database mining and virtual screening. J Mol Graph Model. 18 (3), 247-257 (2000).
  16. Teague, S. J. Implications of protein flexibility for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2 (7), 527-541 (2003).
  17. Kearsley, S. K., Underwood, D. J., Sheridan, R. P., Miller, M. D. Flexibases: a way to enhance the use of molecular docking methods. J Comput Aided Mol Des. 8 (5), 565-582 (1994).
  18. Carlson, H. A., Masukawa, K. M., McCammon, J. A. Method for including the dynamic fluctuations of a protein in computer-aided drug design. J Phys Chem A. 103 (49), 10213-10219 (1999).
  19. Cavasotto, C. N., Kovacs, J. A., Abagyan, R. A. Representing receptor flexibility in ligand docking through relevant normal modes. J Am Chem Soc. 127 (26), 9632-9640 (2005).
  20. Akbari, Z., et al. HOMO-LUMO analysis and ensemble docking studies of Zn(II) complexes of bidentate and tetradentate Schiff base ligands as antileukemia agents. J Mol Struct. 1301, 137400(2024).
  21. Go, Y. J., Kalathingal, M., Rhee, Y. M. An ensemble docking approach for analyzing and designing aptamer heterodimers targeting VEGF165. Int J Mol Sci. 25 (7), 4066(2024).
  22. Ismail, C. M. K. H., et al. An ensemble docking-based virtual screening and molecular dynamics simulation of phytochemical compounds from Malaysian Kelulut Honey (KH) against SARS-CoV-2 target enzyme, human angiotensin-converting enzyme 2 (ACE-2). J Biomol Struct. , (2024).
  23. Roy, P., et al. Elucidating the mechanism of metabolism of cannabichromene by human cytochrome P450s. J Nat Prod. 87 (4), 639-651 (2024).
  24. Garai, S., Thomas, J., Dey, P., Das, D. LGBM-ACp: an ensemble model for anticancer peptide prediction and in silico screening with potential drug targets. Mol Divers. 28 (4), 1965-1981 (2024).
  25. Broughton, H. B. A method for including protein flexibility in protein-ligand docking: improving tools for database mining and virtual screening. J Mol Graph Model. 18 (3), 247-257 (2000).
  26. Amaro, R. E., et al. Emerging methods for ensemble-based virtual screening. Curr Top Med Chem. 10 (1), 3-13 (2010).
  27. Amaro, R. E., et al. Ensemble docking in drug discovery. Biophys J. 114 (10), 2271-2278 (2018).
  28. Chlipała, P., et al. Multienzymatic biotransformation of flavokawain B by entomopathogenic filamentous fungi: structural modifications and pharmacological predictions. Microb Cell Fact. 23 (1), 65(2024).
  29. Kuo, Y. -F., et al. Flavokawain B, a novel chalcone from Alpinia pricei Hayata with potent apoptotic activity: involvement of ROS and GADD153 upstream of mitochondria-dependent apoptosis in HCT116 cells. Free Radic Biol Med. 49 (2), 214-226 (2010).
  30. Mohd Sakeh, N., et al. Melanogenic inhibition and toxicity assessment of flavokawain A and B on B16/F10 melanoma cells and zebrafish (Danio rerio). Molecules. 25, (2020).
  31. Feroz, S. R., et al. Interaction of flavokawain B with lysozyme: a photophysical and molecular simulation study. J Luminescence. 160, 101-109 (2015).
  32. Ding, F., et al. Potential toxicity and affinity of triphenylmethane dye malachite green to lysozyme. Ecotoxicol Environ Saf. 78, 41-49 (2012).
  33. Paramaguru, G., Kathiravan, A., Selvaraj, S., Venuvanalingam, P., Renganathan, R. Interaction of anthraquinone dyes with lysozyme: evidences from spectroscopic and docking studies. J Hazard Mater. 175 (1), 985-991 (2010).
  34. Ding, F., Zhao, G., Huang, J., Sun, Y., Zhang, L. Fluorescence spectroscopic investigation of the interaction between chloramphenicol and lysozyme. Eur J Med Chem. 44 (10), 4083-4089 (2009).
  35. Halgren, T. A. Merck molecular force field. II. MMFF94 van der Waals and electrostatic parameters for intermolecular interactions. J Comput Chem. 17 (5-6), 520-552 (1996).
  36. Sulimov, A. V., et al. Evaluation of the novel algorithm of flexible ligand docking with moveable target-protein atoms. Comput Struct Biotechnol J. 15, 275-285 (2017).
  37. Ehrman, J. N., et al. Improving small molecule force fields by identifying and characterizing small molecules with inconsistent parameters. J Comput Aided Mol Des. 35 (3), 271-284 (2021).
  38. Chaudhuri, D., Majumder, S., Giri, K. Repurposing of drugs targeting heparan sulphate binding site of dengue virus envelope protein: an in silico competitive binding study. Mol Divers. 29 (1), 87-101 (2024).
  39. Wu, N., et al. Elucidation of protein-ligand interactions by multiple trajectory analysis methods. Phys Chem Chem Phys. 26 (8), 6903-6915 (2024).
  40. Brooks, B. R., et al. CHARMM: a program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations. J Comput Chem. 4 (2), 187-217 (1983).
  41. Li, H., Robertson, A. D., Jensen, J. H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. Proteins. 61 (4), 704-721 (2005).
  42. Powers, N., Jensen, J. H. Chemically accurate protein structures: validation of protein NMR structures by comparison of measured and predicted pKa values. J Biomol NMR. 35 (1), 39-51 (2006).
  43. Lemkul, J. A. From proteins to perturbed Hamiltonians: a suite of tutorials for the GROMACS-2018 molecular simulation package [Article v1.0]. Living J Comput Mol Sci. 1 (1), 5068(2018).
  44. Best, R. B., et al. Optimization of the additive CHARMM all-atom protein force field targeting improved sampling of the backbone ϕ, ψ and side-chain χ1 and χ2 dihedral angles. J Chem Theory Comput. 8 (9), 3257-3273 (2012).
  45. Huang, J., et al. CHARMM36m: an improved force field for folded and intrinsically disordered proteins. Nat Methods. 14 (1), 71-73 (2017).
  46. Bondi, A. van der Waals volumes and radii. J Phys Chem. 68 (3), 441-451 (1964).
  47. Shukla, R., Tripathi, T. Computer-aided drug design. , Springer Singapore. Singapore. (2020).
  48. Vlachakis, D., Bencurova, E., Papangelopoulos, N., Kossida, S. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. , Elsevier, Academic Press. Swansea. (2014).
  49. Forli, S., Olson, A. J. A force field with discrete displaceable waters and desolvation entropy for hydrated ligand docking. J Med Chem. 55 (2), 623-638 (2012).
  50. Cosconati, S., et al. Virtual screening with AutoDock: theory and practice. Expert Opin Drug Discov. 5 (6), 597-607 (2010).
  51. Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  52. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 3502514(2018).
  53. Ivanova, L., Karelson, M. The impact of software used and the type of target protein on molecular docking accuracy. Molecules. 27 (24), 9041(2022).
  54. Mohapatra, R. K., et al. Comparison of the binding energies of approved mpox drugs and phytochemicals through molecular docking, molecular dynamics simulation, and ADMET studies: an in silico approach. J Biosaf Biosecur. 5 (3), 118-132 (2023).
  55. Mude, L., et al. Molecular insights in repurposing selective COX-2 inhibitor celecoxib against matrix metalloproteinases in potentiating delayed wound healing: a molecular docking and MMPB/SA based analysis of molecular dynamic simulations. J Biomol Struct Dyn. 42 (5), 2437-2448 (2024).
  56. Uttarkar, A., Rao, V., Bhat, D., Niranjan, V. Disaggregation of amyloid-beta fibrils via natural metabolites using long timescale replica exchange molecular dynamics simulation studies. J Mol Model. 30 (3), 61(2024).
  57. Liang, J. J., Pitsillou, E., Hung, A., Karagiannis, T. C. A repository of COVID-19 related molecular dynamics simulations and utilisation in the context of nsp10-nsp16 antivirals. J Mol Graph Model. 126, 108666(2024).
  58. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  59. Polikar, R. Ensemble based systems in decision making. IEEE Circ Syst Mag. 6 (3), 21-45 (2006).
  60. Ballester, P. J., Mitchell, J. B. A machine learning approach to predicting protein-ligand binding affinity with applications to molecular docking. Bioinformatics. 26 (9), 1169-1175 (2010).
  61. Yang, X., Huang, K., Yang, D., Zhao, W., Zhou, X. Biomedical big data technologies, applications, and challenges for precision medicine: a review. Global Chall. 8 (1), 2300163(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ensemble Based DockingProtein Structure FlexibilityMolecular Dynamics SimulationStructure Based Drug DiscoveryProtein Conformation ClusteringLigand DockingRoot Mean Square DeviationFlavokawain B BindingElectrostatic Surface MappingComputational Drug Discovery

מאמרים קשורים