Method Article

הקלטות חד-אלקטרודות חד-אלקטרודות חד-פעמיות חריפות מגזע המוח של עכברים בעלי ראש קבוע

DOI:

10.3791/67205

⸱

October 11th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשגת הקלטות של נוירון יחיד בצפיפות גבוהה מגזע המוח של עכברים בעלי ראש קבוע. גישה זו מיושמת כדי למדוד את פוטנציאל הפעולה של ירי נוירונים באפור פריאקוודוקטלי וונטרולטרלי - אזור בגזע המוח שאינו פעיל במהלך שנת REM (Rapid Eye Movement) - לפני ובמהלך הרדמה כללית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקלטות מבוססות סיליקון רב-אלקטרודות פופולריות יותר ויותר לחקר פעילות עצבית ברזולוציה הטמפורלית של פוטנציאלי פעולה באזורים רבים במוח. עם זאת, רישום פעילות עצבית ממבנים קאודליים עמוקים כמו גזע המוח באמצעות בדיקות רב-ערוציות נותר מאתגר. חשש משמעותי הוא מציאת מסלול החדרת בדיקה שימנע כלי דם גדולים, כגון הסינוס הוורידי העליון והסינוס הורידי הרוחבי. פגיעה בוורידים הגדולים הללו עלולה לגרום לדימום נרחב, נזק לרקמת המוח הבסיסית ואולי אף למוות. גישה זו מתארת מיקוד מבנים בגזע המוח על ידי צימוד קואורדינטות קדמיות עם גישה זוויתית, המאפשרת לגשושית ההקלטה לחדור למוח מתחת למבני כלי דם בסיכון גבוה. בהשוואה לגישה אנכית לחלוטין, הגישה הזוויתית ממקסמת את מספר אזורי המוח שניתן לכוון. באמצעות אסטרטגיה זו, ניתן לגשת לאפור פריאקוודוקטלי וונטרולטרלי (vlPAG), אזור בגזע המוח הקשור לשנת REM, באופן משוחזר ואמין כדי להשיג הקלטות מרובות אלקטרודות ביחידה אחת בעכברים קבועי ראש לפני ובמהלך הרדמה סבופלורנית. היכולת לרשום פעילות עצבית ב-vlPAG ובגרעינים הסובבים אותו ברזולוציה טמפורלית גבוהה היא צעד קדימה בקידום הבנת הקשר בין שנת REM להרדמה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקלטות מבוססות סיליקון מבוססות אלקטרודות הופכות פופולריות יותר ויותר למדידת פעילות עצבית באזורים רבים במוח עם רזולוציה פוטנציאלית של פעולה יחידה 1,2,3,4. במהלך העשור האחרון, טכנולוגיית הקלטה בצפיפות גבוהה גדלה במידה ניכרת. אלקטרודות הקלטה מבוססות סיליקון נוכחיות יכולות להכיל ספירות ערוצים גבוהות, סיבים אופטיים והתקני הקלטה אלקטרוקורטיקוגרפיה (ECoG) 5,6. יתר על כן, השתלה כרונית של אלקטרודות אלה מאפשרת הקלטות ארוכות טווח 7,8.

למרות ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה, התמקדות במבנים קאודליים עמוקים כמו גזע המוח באמצעות גשושיות רב-ערוציות נותרה מאתגרת. כאשר מתמקדים במבנים בגזע המוח כגון האפור הפריאקוודוקטלי הוונטרולטרלי (vlPAG), מכשול משמעותי אחד הוא זיהוי מסלול בדיקה הנמנע מכלי דם מרכזיים, למשל, הסינוס הוורידי העליון והסינוס הורידי הרוחבי. פגיעה בוורידים גדולים אלה עלולה לגרום לדימום נרחב, נזק לרקמת המוח הבסיסית ואפילו למוות 9,10. אנו מציעים לכוון מבנים של גזע המוח מקואורדינטות קדמיות בזווית, מה שיאפשר לגשושית ההקלטה לחדור למוח מתחת למבנים וסקולריים בסיכון גבוה כאלה (ראו איור 1). גישה זוויתית זוויתית, בהשוואה לגישה אנכית, ממקסמת את מספר אזורי המוח הנגישים להקלטה. בנוסף, בנסיבות ניסיוניות שבהן יש צורך בהקלטות ECoG, הגישה הקדמית הזוויתית מאפשרת יותר משטח גולגולת זמין להשתלת אוזניות ECoG, מכיוון שחלון הקרניוטומיה להחדרת בדיקה ממוקם קדמית יותר10,11.

זיהוי קבוצות התאים והמעגלים הספציפיים האחראים לשינויים בשנת REM הנגרמים על ידי הרדמה נותר מטרה עיקרית של מחקר הרדמה. לפיכך, המטרה כאן הייתה לגשת באופן משוחזר ואמין ל-vlPAG - אזור בגזע המוח הקשור לשנת REM - כדי להשיג רישומים חד-יחידתיים, מרובי אלקטרודות בעכברים קבועי ראש לפני ובמהלך הרדמה סבופלורנית12,13. מחקרים קודמים השתמשו במדידות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) של vlPAG בעכברים ערים כדי לזהות שינויים במצב העצבי הקשורים להרדמה14,15. עם זאת, מדידות LFP רגישות בעיקר לפעילות סינפטית, ולא לפוטנציאלי פעולה, בתוך האזור המתועד16. כתוצאה מכך, נותרה הבנה מוגבלת של האופן שבו חומרי הרדמה משפיעים ישירות על דפוסי הפעילות העצבית המיוצרים על-ידי נוירוני vlPAG. כאן, מתוארת שיטה להשגת הקלטות נוירון יחיד בצפיפות גבוהה מגזע המוח של עכברים קבועי ראש. שיטה זו יכולה גם להיות מותאמת לרישום פעילות נוירון יחיד ממבנים שונים אחרים בגזע המוח העמוק והאחורי.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה (שרלוטסוויל, וירג'יניה). נעשה שימוש בחמישה עכברי C57BL/6J זכרים בגילאי 3-7 חודשים, במשקל 25-30 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש כאן מפורטים בטבלת החומרים.

1. השתלת לוחית ראש ואוזניות

  1. צרו אוזניות ECoG על-ידי הלחמת חוט נירוסטה מצופה פרפלואורואלקוקסי (PFA) לראש מחבר של 3 פינים (איור 2A).
  2. זהה את קואורדינטות ההכנסה בהתבסס על אטלס סטריאוטקסי של עכבר17. שימוש במשפט פיתגורס כדי לחשב את הזווית והעומק של החדרת הגשושית – במיוחד כאשר יש מעט מידע בספרות – הוא נקודת התחלה סבירה (איור 1)18.
    הערה: בסופו של דבר, הקואורדינטות יותאמו באמצעות ניסוי וטעייה. כדי להתמקד ב-vlPAG השתמשו בקואורדינטות הבאות בעכברים בוגרים: אנטרופוסטריור (AP) -3.6 מ"מ, בינוני (ML) +0.5 מ"מ, דורסו-ונטרלי (DV) -4 מ"מ. הגשושית הוכנסה בזווית של 20° (AP).
  3. יש לגרום להרדמה כללית על ידי הנחת העכבר בתא האינדוקציה (1.5%-3% איזופלורן בחמצן). לאחר הרדמה, מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית, הניח את אפו של בעל החיים בחרוט האף וייצב את הראש עם מוטות הראש.
  4. החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע נזק הקרנית. השתמש במערכת בקרת טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ° C.
  5. יש למרוח קרם להסרת שיער או לגלח פרווה על הקרקפת, ולאחר מכן לחטא עם יוד פובידון ואלכוהול 70%. השתמש בטכניקה אספטית 'טיפים בלבד' כדי לשמור על שדה כירורגי סטרילי.
  6. בצע בדיקת צביטת בוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
  7. מתן שיכוך כאבים: קרפרופן 2.5 מ"ג/ק"ג, ניתן תת עורית בגב.
  8. בצע חתך קרקפת 5 מ"מ כדי להסיר כתם עגול של העור מעל עצמות הקודקוד והעורף. הסר בעדינות את קרומי המוח על ידי גירודם עם להב האזמל.
  9. השתמש בלהב האזמל כדי לחתוך חיבורי שרירים ולחשוף את עצמות הקודקוד והעורף19. יש למרוח מי חמצן לפי הצורך כדי לשלוט בדימום ולייבש את פני הגולגולת. חיוני למרוח מלט דנטלי ושרף על גולגולת יבשה כדי להשיג קשר חזק.
  10. ראשית, זהה את ציוני הדרך ברגמה ולמבדה על הגולגולת20. לאחר מכן, התאימו את מיקום חרוט האף כדי ליישר את המיקום הקדמי-אחורי של הגולגולת, וודאו שלא קיים הפרש גובה של יותר מ-100 מיקרומטר בין שני ציוני הדרך.
  11. כדי ליישר את המיקום המדיאלי-לטרלי של הגולגולת, בחר שתי נקודות מנוגדות בין ברגמה ללמדא, כל אחת 1 מ"מ מתפר הקשת ובדוק את רמתן. אם יש הפרש גובה של יותר מ-100 מיקרומטר ביניהם, התאימו את המיקום האמצעי-לטרלי של הגולגולת על ידי מניפולציה של מוטות הראש.
  12. מדדו את המרחק בין ברגמה ללמדא והשוו אותו למרחק שדווח באטלס הסטריאוטקסי של פרנקלין-פקסינוס (בדרך כלל 4.2 מ"מ)17. השתמש בהפרש בין המרחק הנמדד למרחק המדווח כדי לשנות את קנה המידה של נקודת הגישה באופן פרופורציונלי. סמן קואורדינטות קרניוטומיה על הגולגולת עם עיפרון מעוקר.
    הערה: אם המרחק הנמדד bregma-lambda שונה מ 4.2 מ"מ, אז הקואורדינטות צריכות להיות בקנה מידה פרופורציונלי. כל קואורדינטות AP המדווחות באטלס סטריאוטקסי תואמות למרחק ברגמה-למדא סטנדרטי. מכיוון שגודל גולגולת העכבר משתנה, חשוב להתאים את הקואורדינטות בהתאם.
  13. באמצעות מיקרומניפולטור סטריאוטקסי, מקמו את לוחית הראש ישירות על גבי תפר הלמדא, והדקו אותה לגולגולת על-ידי מריחת מלט דנטלי על לוחית הראש ומסביבה (איור 3A,B). יש להמתין לפחות 10 דקות לייבוש המלט.
  14. קדח חורים (בקוטר 0.5 מ"מ) עבור שתי אלקטרודות קליפת המוח (קליפת המוח הקדמית והקודקודית) ועבור אחת שתשמש כאלקטרודת ייחוס (המוח הקטן). הניחו את הקצוות המופשטים (0.5 מ"מ) של אלקטרודות חוטי כסף מצופות בתוך חורי הבור והדקו באמצעות שרף המופעל על ידי אור אולטרה סגול.
  15. כסו לחלוטין את חוטי הנירוסטה המצופים במלט דנטלי כך שאף חוט לא ייחשף. כסו את החלק התחתון והצדדים של האוזנייה במלט דנטלי כך שהוא יהיה יציב במקומו. ודאו שתפרי ברגמה ולמבדה נשארים גלויים ברגע שהאוזנייה מאובטחת במקומה (איור 2B).
  16. תן לעכבר להתאושש במשך מינימום של 7 ימים, לבחון את החיה ואת האתר כירורגי מדי יום עבור כל חריגות. מתן משככי כאבים (קרפרופן 2.5 מ"ג/ק"ג, SC) לפי הצורך.

2. מיקום והקלטה של גשושית סיליקון

  1. הרגילו את העכבר למתקן ההקלטה ולקיבוע הראש (לפחות שעה וחצי בשני ימים נפרדים) (איור 2D).
  2. ביום ההקלטה יש להכניס את העכבר לתא ההרדמה (איזופלורן 1.5%-3% בחמצן).
  3. מקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית, התאם את חרוט האף ואת מוטות הראש כמתואר ב- 1.3. לשמור על הרדמה (איזופלורן 1.5%-3% בחמצן) לאורך כל הניתוח הסטריאוטקסי. בצע בדיקת צביטת בוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
  4. החל משחה אופתלמית על העיניים ולשמור על טמפרטורת הגוף נאותה.
  5. זהה ברגמה ולמבדה, וודא שלא קיים הפרש גובה של יותר מ -100 מיקרומטר בין שני ציוני הדרך האנטומיים.
  6. מצא וסמן את הקואורדינטות המחושבות על הגולגולת בעיפרון סטרילי, ולאחר מכן צור מתאר של חלון קרניוטומיה בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ סביב הקואורדינטות.
  7. בצע בדיקת צביטת בוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
  8. השתמש במקדחה במהירות גבוהה כדי ליצור חלון קרניוטומיה בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ. יש למרוח 0.5-1 מ"ל של מי מלח רגילים כדי למנוע התייבשות של פני המוח. מוציאים את הדורה בעזרת מחט מזרק ומלקחיים עדינים.
    הערה: שימו לב לכלי דם עיקריים (סינוס סגיטלי עליון, סינוס רוחבי) כדי למנוע דימום יתר (איור 3).
  9. השתמש במקדחה במהירות גבוהה כדי ליצור חור בור נפרד לאלקטרודת הייחוס של גשושית הסיליקון, בדרך כלל ~ 1-2 מ"מ מחלון הגולגולת.
  10. החל 0.2 מ"ל רעילות נמוכה דבק סיליקון על הגולגולת כדי לאטום לחלוטין את craniotomy, באמצעות המוליך המצורף.
  11. תן לעכבר להתאושש במשך כשעה אחת.
  12. הצמידו את ראש העכבר למתקן ההקלטה האלקטרופיזיולוגי באמצעות לוחית הראש והברגים (איור 2D).
  13. צפו את שוק החללית סיליקון בצבע הפלואורסצנטי DiI (1:4 DiI:Ethanol) כך שניתן יהיה לשחזר את מסלול הגשושית לאחר הניסוי.
  14. הרכיבו את הגשושית על המניפולטור וקבעו את הזווית הרצויה. כדי לכוון את vlPAG, הוחלה זווית AP של 15-20°.
  15. הורידו את גשושית ההקלטה לפני השטח של המוח במרכז חלון הגולגולת. ראשית, הכנס ידנית את הגשושית לעומק של ~300 מיקרומטר. לאחר החדרתה לעומק הזה, הורידו את הגשושית באופן אוטומטי (למשל, 200 מיקרומטר/דקה) לעומק הממוקד כדי למזער את הנזק לרקמה21 (איור 2C).
    הערה: בתחילה מומלצת הכנסה ידנית של הבדיקה. החדרת בדיקה ידנית מבטיחה את היכולת לעצור ולמשוך את הגשושית אם היא מתכופפת עם הכנסתה הראשונית. ברגע שהגשושית חודרת במלואה לרקמה, בדרך כלל בטוח להמשיך לרדת בבדיקה במצב אוטומטי.
  16. יש למרוח שמן מינרלי על משטח המוח בתוך חלון הקרניוטומיה כדי למנוע התייבשות.
  17. הניחו לבדיקת ההקלטה להסתפק ב-10 דקות לאחר ההכנסה.
  18. הקלט נתונים מגשושית הסיליקון ומ- ECoG במהירות של 30kHz באמצעות בקר הקלטה Intan.
  19. 1-2 שעות לאחר ההקלטה, השתמש בטכניקת זילוח הלב כדי לתקן את המוח ב 4% paraformaldehyde22.
    הערה: בגלל המלט, ייתכן שיהיה קשה להסיר את החלק הרוסטרלי של הגולגולת. לכן עדיף להוציא את המוח על ידי הסרת החלקים הגביים של הגולגולת.
  20. ערפו את ראשו של העכבר, חתכו את העור בעקבות קו האמצע בצד הגבי, מהצוואר ועד הלסת התחתונה. הסר שרירים ורקמות המחוברים לגולגולת, חתוך את הלסת התחתונה לגישה קלה יותר למוח.
  21. אם הזלוף נעשה כראוי המוח צריך להתכווץ קצת, משאיר מספיק מקום כדי להכניס מספריים עדינים בחלק הגבי של מגנום foramen. בצע חתך מדיאלי אחד, אחד לרוחב ואחד קונטרלטרלי, בגודל של כ -1 מ"מ, בעצם העורפית.
  22. בזהירות להסיר את החלק הגבי של הגולגולת באמצעות מלקחיים אופתלמיים. התחל בעצם העורפית, הסר את כל שברי הגולגולת עד שכל החלק הגבי של המוח נחשף.
  23. החליקו מרית מיקרו מתחת למוח, התחילו בנורות הריח כדי להוציא את המוח החוצה.
  24. לאחר ניקוב והסרה, המוח יכול להיות מאוחסן 4% paraformaldehyde ב 4 ° C במשך 24-48 שעות.

3. היסטולוגיה לשחזור מסלול בדיקה

  1. חלק את המוח למקטעים קורונליים של 70 מיקרומטר באמצעות ויברטום.
  2. הרכבה של המקטעים בשקופיות באמצעות אמצעי הרכבה DAPI שמכתים גרעיני תאים. מכסים ואוטמים את המגלשות בלק שקוף.
  3. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כוונן את הניגודיות/בהירות כך שרצועות הבדיקה יהיו גלויות בבירור. ודאו שגודל קובץ תמונת tiff המתקבל קטן מ- 10MB, כך שקודי MATLAB יפעלו בצורה חלקה. שחזר את רצועות הגשושית באמצעות קוד MATLAB23.

4. ניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים

  1. נתח אותות עצביים מוקלטים מגשושית הסיליקון באמצעות תוכנת זיהוי ומיון אוטומטי (Kilosort)24.
  2. סווג ידנית אשכולות שזוהו עם Phy כיחידות מרובות או בודדות25. לסווג אשכולות כיחידות בודדות כאשר יש להם צורת גל ספייק פיזיולוגית, להראות תקופה עקשנית בקורלוגרמה הצולבת, והתפלגות נורמלית של תצוגת משרעת.
  3. ייבאו נתוני יחידה בודדת ל-MATLAB ונתחו23.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חמישה גברים C57BL/6J הושתלו עם אוזניות ECoG ולוחית ראש (איור 4A). לאחר ההתאוששות, עכברים הורגלו לקיבוע ראש ולמתקן ההקלטה האלקטרופיזיולוגי במהלך שני מפגשים של שעה וחצי בימים נפרדים (איור 4B). לאחר מכן, נוצר חלון קרניוטומיה בגודל 2 מ"מ על 2 מ"מ (איור 4C) וגשושית סיליקון הוכנסה כשהעכבר ער וראשו קבוע (איור 4D). נעשה שימוש בשני סוגים של בדיקות סיליקון UCLA: (1) 64 M: בדיקה חד-שוקית, 64 אלקטרודות; ו-(2) 256 ANS: בדיקה בעלת ארבעה שוקים, 256 אלקטרודות. סבופלורן וחמצן ניתנו באמצעות חרוט אף המקובע למתקן האלקטרופיזיולוגיה. רמות החמצן והסבופלורן נוטרו כל 5 דקות באמצעות אנלייזר גז מוטבע. בעקבות זילוח דרך הלב המוח נקצר (איור 4E) והוערך כמסלול בדיקה (איור 4F). פוטנציאלי פעולה מוקלטים נאספו לאחר מכן לנתוני יחידה אחת (איור 4G).

בוצעו חמש הקלטות שבהן מיקום הגשושית אומת באמצעות אלגוריתמים זמינים לשחזור הגשושית שפותחו ב-MATLAB23. באמצעות האלגוריתמים האלה, כל אלקטרודה של גשושית הסיליקון הייתה ממוקמת למבנה מוח מסוים, כך שנרכשה פרספקטיבה תלת-ממדית של מיקום הגשושית בתוך המוח (איור 5). אלגוריתמי השחזור האלה הוצמדו לסמנים אימונוהיסטוכימיים כדי לאמת עוד יותר את מסלולי הגשושיות (איור 6). לאחר מכן הנתונים הותאמו ליחידות בודדות שנאספו (איור 7).

בסך הכל נלכדו 64 תאי עצב בודדים, מתוכם 13 היו ממוקמים ב-vlPAG. 51 תאי העצב הנותרים היו בגרעינים סמוכים: המוח האמצעי, גרעין הרשתית של המוח האמצעי, גרעין הצנחן, גרעין כתב היתדות, גרעין טגמנטל לטרודורסדאלי, גרעין פרברכיאלי ופדונקים צרבלריים עליונים. פעילות הירי של תאי עצב בכל עכבר מוצגת כמפות חום (איור 7). עכבר 3 לא נכלל בניתוח בגלל איכות ירודה של הקלטה יחידה אחת. רוב תאי העצב שתועדו הפחיתו את הירי שלהם במהלך הרדמה סבופלורנית.

ירי ממוצע של נוירוני vlPAG הושווה עבור כל עכבר בקו בסיס של 5 דקות (כלומר, 10-15 דקות לתוך ההקלטה) ו-5 דקות במהלך sevoflurane (כלומר, 40-45 דקות לתוך ההקלטה). ירי vlPAG היה מופחת באופן משמעותי (איור 8A), ויתר על כן, העלייה הזו הייתה עקבית בכל תאי העצב של vlPAG (איור 8B).

figure-results-1
איור 1: חישוב קואורדינטות סטריאוטקסיות להחדרת בדיקה. לוח שמאלי: שימוש בגיאומטריה לחישוב גישה זוויתית להכנסת בדיקה. זוהו המרכיבים הבאים של משולש ישר: (א) עומק DV של מבנה המטרה מפני השטח של המוח (שנרכש באמצעות האטלס הסטריאוטקסי), (ב) מרחק בין קואורדינטת AP בהנחה של ירידה אנכית בלבד לבין קואורדינטת AP של מבנה המטרה. לוח ימני: עם (a) ו-(b), ניתן להשתמש במשפט פיתגורס כדי לחשב את זווית AP (β) ואת האורך (c) של החדרת הבדיקה. הקואורדינטות הבאות שימשו למיקוד vlPAG: (AP) -3.6 מ"מ, (ML) +0.5 מ"מ, (DV) -4 מ"מ. נעשה שימוש בזווית AP (β) של 20°. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: השתלת לוחית ראש והקלטה של יחידה אחת. (A) מיקום חוט אוזניות ECoG במהלך ההשתלה. (B) מבט מלמעלה על גולגולת העכבר לאחר השתלת אוזניות ECoG ולוחית הראש. (C) שוקי סיליקון המוחדרים למוח. (D) עכבר מקובע ראש במהלך הקלטה של גשושית סיליקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מיקום חלון הגולגולת ביחס לכלי דם מרכזיים. ייצוג סכמטי של כלי הדם על פני השטח של מוח העכבר עם סינוס sagittal העליון סינוס רוחבי מסומן. הריבוע הלבן מציין את מיקום חלון הגולגולת והנקודה האדומה מייצגת את נקודת החדרת הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תכנון ניסויי. חמישה עכברי C57BL/6J זכרים הושתלו עם אוזניות ECoG ולוחית ראש (A). לאחר ההתאוששות, הם הורגלו לקיבוע ראש ולמתקן ההקלטה (B). לאחר מכן, בוצעה קרניוטומיה (C) וגשושית סיליקון הוחדרה עם העכבר ער ובמצב קבוע לראש. חומרי הרדמה נדיפים וחמצן ניתנו באמצעות חרוט אף (D). לאחר ההקלטה, המוח נקצר (E) ונותח באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיות כדי לשחזר את מסלול הגשושית (F). פוטנציאלי פעולה מוקלטים נאספו לאחר מכן לנתוני יחידה אחת (G). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מודל תלת-ממדי של המוח עם מסלולי בדיקה משוחזרים. כל קו צבעוני ישר מייצג מסלול גשושית. כל נקודה מסמנת את המיקום של צבע DiI הנראה על פרוסות מוח קורונליות. מסלול הגשושית משוחזר עבור כל שוק של גשושית הסיליקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: שחזור פוסט-הוק של מיקום הגשושית בתוך ה-vlPAG. פרוסת מוח קורונלית מייצגת עבור כל עכבר מוקלט (1-5) מוכתמת ב-DAPI (כחול) המציגה מסלולי בדיקה (DiI, אדום, מסומן בחצים ירוקים) עם מתאר של אזורי מוח. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. עכבר 1-3 תועד עם גשושיות סיליקון חד-שוקיות (כלומר, 64 ערוצים), ואילו עכבר 4 ו-5 תועדו עם גשושיות סיליקון בעלות ארבעה שוקים (כלומר, 256 ערוצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: פעילות ירי מאוגדת לפני ובמהלך הרדמת סבופלורן. מפות חום מייצגות את מספר פוטנציאלי הפעולה שנורו על ידי 64 תאי עצב בודדים במרווחים של דקה אחת. לתאי עצב בודדים הוקצה מבנה מקור המבוסס על שחזור מסלול הגשושית. קו מקווקו לבן מציין תחילת מתן סבופלורן, n = 4 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: ביטול הירי של נוירוני vlPAG במהלך הרדמה סבופלורנית. (A) מספר ממוצע של פוטנציאלי פעולה שנורו לפני ובמהלך ההרדמה עבור כל עכבר. (B) מספר פוטנציאלי הפעולה שנורו על-ידי כל נוירון vlPAG (B). מבחן t-student זוגי, **P = 0.0036, P = 0.0053 בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: דוגמה לאופן שבו מיקום לא אחיד של לוחית הראש יכול להשפיע על מסלול הבדיקה. (A) מיקום לא אחיד של לוחית הראש על ראש העכבר. (B,C) שחזור מוח עכבר תלת-ממדי עם מסלול בדיקה מעובד שבו יש זווית בינונית לא מכוונת הנגרמת על ידי מיקום לא אחיד של לוחיות ראש על ראש העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרעיני גזע המוח מתווכים תפקודים בסיסיים כגון נשימה, תודעה ושינה 26,27,28. מיקומו של גזע המוח (עמוק ואחורי) מהווה אתגר בחקר פעילותו העצבית in vivo באמצעות טכניקות סטנדרטיות. כאן מוצגת גישה קדמית זוויתית המאפשרת הקלטה של יחידה אחת הניתנת לשחזור בעכברים קבועי ראש.

החדרה זהירה של בדיקת סיליקון מרובת אלקטרודות היא קריטית כדי להבטיח מיקוד עקבי של מבני גזע המוח הקשורים לשנת REM, תוך הימנעות מנזק לכלי דם מרכזיים. נדרשת מידה ניכרת של עדינות, ריכוז וסבלנות כדי לפתור את הקואורדינטות והמסלול הטובים ביותר של כניסה13.

בגלל מסלול הגשושית הזוויתית והמרחק הנדרש כדי לכוון למבנים עמוקים, אפילו חוסר עקביות קל בקואורדינטות ובמיקום לוחית הראש יגרום ככל הנראה להחמצת מבנה המטרה. חשוב שברגמה ולמבדה יהיו באותה רמה במהלך השתלת לוחית הראש ושהמרחק ביניהם יימדד במדויק. יש לציין כי מכיוון שהניתוחים מבוצעים על מסגרת סטריאוטקסית וההקלטות מבוצעות על מתקן אלקטרופיזיולוגי נפרד, קריטי שלוחות הראש יהיו מקובעים לגולגולת מפולסת. החדרת זוויות נוספות (כלומר, ראש מוטה) מגבירה את הסיכון לטעות, שהוא גבוה במיוחד עבור מבני מוח קטנים ועמוקים (איור 9).

מכיוון שגשושיות סיליקון הן שבירות, חשוב להסיר את הדורה מפני השטח של המוח ולוודא שאין שברי עצם שחוסמים את חלון הגולגולת. דימום קל עלול להתרחש לאחר הסרת דורה, ולכן חשוב לנקות את משטח הקרניוטומיה של דם דחוס שעלול לגרום לבדיקה להתכופף. אם החדרת גשושית הסיליקון למוח מתגלה כקשה (למשל, הגשושית מתכופפת), חשוב לבדוק אם נותרו דורה או אם פני השטח של המוח התייבשו, שכן קרום דק יכול להיווצר כאשר נותר עם מעט נוזלים או ללא נוזלים. בבני אדם27, באזורים הקרובים לכלי הדם יש דורה עבה יותר, ובעיה דומה נמצאת בעכברים, שם הסרת הדורה ללא קריעת כלי הדם יכולה להיות מאתגרת. למרות שהסרה זהירה של הדורה גורמת בדרך כלל להחדרה חלקה, זוויות החדרה גדולות יותר עשויות להציג קשיים נוספים.

תפוקת ההקלטות יכולה להשתנות במידה ניכרת בין בעלי חיים ותלויה במשתנים רבים. גורם משמעותי אחד הוא צפיפות הנוירונים במבנה הממוקד; אזורים עם צפיפות נוירונים נמוכה (למשל, קליפת המוח) נוטים להיות בעלי תפוקה נמוכה יותר של תאי עצב בודדים מתועדים. בנוסף, נזק לרקמות, כגון קריעת כלי דם מתחת לפני השטח של המוח, יכול להוביל למוות עצבי או פציעה, מה שמפחית עוד יותר את התשואה21,29. איכות ההקלטות היא גם קריטית, שכן הקלטות באיכות גבוהה יותר מקלות על הבחנה בין נוירונים בודדים. מסלול בדיקה מחוץ למטרה יכול גם לגרום לתשואות נמוכות יותר. למרות שפותח עבור הקלטות ב-vlPAG, פרוטוקול זה יכול לשמש להקלטה ממבנים סמוכים בגזע המוח.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים בעקבות עבודה זו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1, איור 3, איור 4, איור 8 ואיור 9 נוצרו עם BioRender.com. ברצוננו להודות לסקוט קיליאנסקי על העזרה עם קוד MATLAB ושיתוף הסקריפטים שלו. אנו מודים לאנה גרייס קרנס על עזרתה בשחזור מסלול הגשושית.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
בקר הקלטה RHD 1024 ערוציםIntan Technologies, לוס אנג'לס, קליפורניה, ארה"הקלטת בדיקה סיליקון C3008חומרה ותוכנה להקלטה
24 מ"מ x 50 מ"מ מס' 1.5 כיסוי VWRVWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"48393-081היסטולוגיה
4% PFA ב- PBSThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"J61899. AKHistology; תמיסת זלוף
C& Bmetabond Patterson Dental, ריצ'מונד, וירג'יניה, ארה"באבקה: 5533559, בסיס מהיר: 5533492, זרז: 55335007לוחית ראש & השתלת אוזניות
C57/6J עכברים 4-6 שבועות, זכריםמעבדת ג'קסון, בר הרבור, מיין, ארה"ב000664
Capnomac UltimaDatex, הלסינקי, פינלנד מנתח גז ULT-SVi-27-07; הופסק; ניתן לרכוש מנתח גז חלופי מ-Bionet America 
CM-DiIThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"בV22888צבע פלואורסצנטי אדום לציפוי
כותרת מחברDigiKey, Thief River Falls, מינסוטה, ארה"ב1212-1788-NDECoG אוזניות
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, ברמינגהאם, אלבמה, ארה"ב0100-20היסטולוגיה
iBOND אוניברסליפטרסון דנטל, ריצ'מונד, וירג'יניה, ארה"ב044-1113לוחית ראש & השתלת אוזניות; בעד  אבטחת חוטי נירוסטה לגולגולת
דבק סיליקון רעיל נמוךWorld Precision Instruments, סרסוטה, פלורידה, ארה"KWIK-SIL
מערכת מיקרו-מניפולטורטכנולוגיות בקנה מידה חדש, ויקטור, ניו יורק, ארה"במניפולטור רב בדיקות: XYZ מכלול במה: 06464-0000, ערכת מערכת MPM: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, טבעת MPM לזרועות ידניות MPM, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000הקלטת בדיקה מסיליקון; החדרת הגשושית למוח
MicroprobesUCLA, לוס אנג'לס, קליפורניה, ארה"ב256 ANS, 64Mהופסק; ניתן לרכוש בדיקות סיליקון חלופיות מ- Neuropixels
Mineral OilSigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USAM8410-100MLהקלטת בדיקת סיליקון; מניעת התייבשות הרקמה במהלך ההקלטה
Normal SasaltThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAZ1376לוחית ראש & השתלת אוזניות; מניעת התייבשות המוח במהלך הניתוח
מצופה PFA קוטר חוט נירוסטה 0.008 אינץ' מצופה בקצוות מפוספסיםמערכות A-M, סקווים, וושינגטון, ארה"ב791400אוזניות ECoG ואלקטרודת ייחוס ל-ECoG 
חוט פלטינה 24AWG World Precision Instruments, סרסוטה, פלורידה, ארה"בPTP201אלקטרודת ייחוס להקלטת בדיקת הסיליקון 
שקופיות מיקרוסקופ Shandon Colorfrost PlusThermoFisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב99-910-01היסטולוגיה
נירוסטה ראשכוכב ראפיד, סיןחלק בהתאמה אישיתלוח ראש & השתלת אוזניות; עיצוב זמין על פי בקשה
מכשיר סטריאוטקסיKOPF, טוג'ונגה, קליפורניה, ארה"בדגם 940 מכשיר סטריאוטקסי לבעלי חיים קטנים עם לוח ראש קונסולת תצוגה דיגיטלית& השתלת אוזניות
ב ; ב ב הסיליקון ב ללוח ראש

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
  2. Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).
  3. Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).
  4. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  5. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opinion Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  6. Nunez-Elizalde, A. O., et al. Neural correlates of blood flow measured by ultrasound. Neuron. 110 (10), 1631-1640.e4 (2022).
  7. Yang, L., Lee, K., Villagracia, J., Masmanidis, S. C. Open source silicon microprobes for high throughput neural recording. J Neural Eng. 17 (1), 016036(2020).
  8. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  9. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protoc. 1 (3), 100194(2020).
  10. Dias, M., et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 8 (4), (2021).
  11. Gao, Z. R., et al. Tac1-expressing neurons in the periaqueductal gray facilitate the itch-scratching cycle via descending regulation. Neuron. 101 (1), 45-59.e9 (2019).
  12. Atluri, N., et al. Anatomical substrates of rapid eye movement sleep rebound in a rodent model of post-sevoflurane sleep disruption. Anesthesiology. 140 (4), 729-741 (2023).
  13. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature. 538 (7623), 51-59 (2016).
  14. Frontera, J., et al. Bidirectional control of fear memories by cerebellar neurons projecting to the ventrolateral periaqueductal grey. Nat Commun. 11 (1234567890), (2020).
  15. Weber, F., et al. Regulation of REM and Non-REM sleep by periaqueductal GABAergic neurons. Nat Commun. 9 (1), 354(2018).
  16. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  17. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier, AP. Amsterdam. (2008).
  18. Pythagorean theorem. , Available from: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pythagorean_theorem&oldid=1222259845 (2024).
  19. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/chapters/skeleton.shtml (2024).
  20. Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
  21. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Sci Rep. 9, 111(2019).
  22. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).
  23. Peters, A. petersaj/AP_histology. , https://github.com/petersaj/AP_histology (2024).
  24. Pachitariu, M., Sridhar, S., Stringer, C. Solving the spike sorting problem with Kilosort. , (2023).
  25. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Sci Rep. 9 (1), 3521(2019).
  26. Leiras, R., Cregg, J. M., Kiehn, O. Brainstem circuits for locomotion. Ann Rev Neurosci. 45 (2022), 63-85 (2022).
  27. Benarroch, E. E. Brainstem integration of arousal, sleep, cardiovascular, and respiratory control. Neurology. 91 (21), 958-966 (2018).
  28. Guyenet, P. G., Bayliss, D. A. Neural control of breathing and CO2 homeostasis. Neuron. 87 (5), 946-961 (2015).
  29. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. J Neural Eng. 9 (4), 046020(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Electrode RecordingsBrainstem RecordingsHead Fixed MiceSilicon ProbesSingle Unit RecordingStereotaxic SurgeryCraniotomy ProcedureNeuronal ActivitySevoflurane AnesthesiaVentrolateral Periaqueductal Gray

Related Articles