המחקר הנוכחי מדגיש את היתרונות של שימוש בשיטה שפיתחו ג'פרי והאמפרי למיצוי וכימות פיגמנטים מסיסי שומן ממיקרו-אצות. שיטה זו משמשת כלי רב ערך להערכת ההשפעה של גורמי גדילה על ייצור הכלורופיל ותכולת התאים באורגניזמים אלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת ההשפעה של גורמי גדילה על ייצור כלורופילים A ו-B ממיקרו-אצות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיקרו-אצות מכילות שתי קבוצות עיקריות של פיגמנטים: כלורופילים וקרוטנואידים. כלורופיל הוא פיגמנט ירוק הסופג אנרגיית אור והופך אותה לאנרגיה כימית כדי להקל על הסינתזה של תרכובות אורגניות. פיגמנט זה משמש כמקור ראשוני רב ערך למוצרי קלט ביוטכנולוגיים בתעשיות המזון, התרופות והקוסמטיקה בשל תכונותיו נוגדות החמצון הגבוהות ויכולות הצביעה שלו. מטרת מחקר זה הייתה להעריך את ההשפעה של גורמי גדילה (ריכוז CO2, צבע אור ועוצמת אור) באמצעות תכנון ניסויי Taguchi L4 על גדילת תאים ותכולת התאים של כלורופיל a ו-b בכלורלה סורוקיניאנה, ולאחר מכן אימות השיטה באמצעות Haematococcus pluvialis מיקרו-אצות כמודל מחקר נוסף. גדילת התאים כומתה באמצעות טכניקה ספקטרופוטומטרית של צפיפות אופטית באורך גל של 550 ננומטר. לצורך כימות הכלורופילים התקבלה תמצית תאים באמצעות תמיסת אצטון טהורה 90%, ולאחר מכן כומתו ריכוזי הכלורופילים a ו-b בטכניקות ספקטרופוטומטריות באורכי גל של 647 ננומטר ו-664 ננומטר, על פי השיטה שתוארה על ידי ג'פרי והאמפרי. תוצאות הניסוי הצביעו על כך ששליטה בתנאים של תוספת נמוכה שלCO2, אור סגול ועוצמת אור נמוכה מגבירה הן את גדילת התאים והן את ריכוז הכלורופילים a ו-b בתוך התאים. יישום שיטת כימות כלורופיל זו מאפשר קביעה מהירה, פשוטה ומדויקת של תכולת הכלורופיל, שכן אורכי הגל בהם נעשה שימוש נמצאים בשיאי הבליעה של שני סוגי הכלורופילים, מה שהופך טכניקה זו לניתנת לשחזור בקלות עבור כל מיקרו-אצות הנחקרות.
מבוא
בשנים האחרונות, הבעיות הסביבתיות הגוברות הנגרמות על ידי פעילויות אנתרופוגניות והשפעותיהן השליליות על הבריאות והאיזון של מערכות אקולוגיות הניעו את החיפוש אחר מערכות ייצור יעילות וידידותיות יותר לסביבה. זה האיץ תהליכים בתעשיות וטיפח את היישום של טיפולים bioremediation ופיתוח של תרכובות ביולוגיות כדי למתן את ההשפעות המזיקות האלה1.
הקשר זה הוביל לגידול משמעותי בחקר המיקרו-אצות, המונע על ידי הצורך למצוא פתרונות חדשניים לאתגרים סביבתיים וכלכליים עכשוויים. מיקרו-אצות משגשגות בסביבות ימיות, תוך שימוש באור השמש ובפחמן דו-חמצני כמקורות אנרגיה ופחמן, בהתאמה. מאפיין זה הופך אותם לחלופה בת קיימא ומבטיחה לייצור מוצרים יקרי ערך שונים. המחקר בתחום זה התמקד בהבנת הפיזיולוגיה והמטבוליזם של תאים אלה, וכן בפיתוח טכנולוגיות יעילות לגידולם ולעיבודם2.
יש צורך ברור לפתח כלים נגישים ואמינים לחקר מיקרו-אצות כדי להאיץ תהליכי מחקר ולהעמיק את ההבנה של הפיזיולוגיה שלהן, חילוף החומרים והיישומים הפוטנציאליים שלהן. כלים אלה אמורים לאפשר ניתוח מהיר של השפעת גורמי סביבה וייצור על פרמטרים מרכזיים, כגון ריכוז הכלורופיל, המהווה אינדיקטור בסיסי לבריאותם ולהתפתחותם של אורגניזמים אלה. ירידה בתכולת הכלורופיל עשויה להצביע על עקה סביבתית, חוסרים תזונתיים או מחלות.
פיגמנטים ירוקים אלה ממלאים תפקיד מכריע בפוטוסינתזה, לוכדים אנרגיית אור שמש כדי להמיר פחמן דו חמצני ומים לגלוקוז וחמצן ומהווים בין 0.5% ל -5% מהביומסה של מיקרו-אצות3. מעבר לתפקידם החיוני בקיום תהליכי חיים, כלורופילים מצאו יישומים בתעשיות שונות. תמציות כלורופיל משמשות בעיבוד מזון ומשקאות כצבעי מאכל טבעיים, המקנות גוונים ירוקים עזים למוצרים תוך הענקת תכונות נוגדות חמצון. יתר על כן, תוספים המבוססים על כלורופיל צוברים פופולריות במגזר הבריאות ואיכות החיים, בזכות ההשפעות האנטי-דלקתיות וניקוי הרעלים לכאורה שלהם. על ידי רתימת התכונות הרבגוניות של כלורופיל, תעשיות יכולות לפתח מוצרים חדשניים התורמים הן למשיכה חזותית והן לרווחת הצרכן1.
בהקשר זה, מיקרו-אצה אחת בעלת רלוונטיות ביוטכנולוגית רבה היא C. sorokiniana. מיקרואורגניזם זה בולט בקצב הצמיחה המהיר שלו, מה שהופך אותו יעיל מאוד בייצור ביומסה. בנוסף, C. sorokiniana מציג תוכן מגוון של תרכובות תזונתיות מאוד, כולל חלבונים, שומנים וויטמינים, מה שהופך אותו בעל ערך עבור יישומים שונים במזון, מזון, ייצור דלק ביולוגי2. יתר על כן, נמצא כי זן מיקרו-אצות זה מייצר אנזימים חוץ-תאיים בעלי תפקידים מגוונים, מה שפותח אפשרויות ליישומים ביוטכנולוגיים כגון טיפול בשפכים, טיפול ביולוגי ותרופות4. בנוסף לצמיחה המהירה שלו וליישומים הרב-תכליתיים שלו, C. sorokiniana גם מדגים פוטנציאל משמעותי לייצור כלורופיל. כמיקרואורגניזם פוטוסינתטי, C. sorokiniana בעל המכונות הדרושות לסינתזה של כלורופיל, המהווה בין 0.5% ל -5% מהביומסה של מיקרו-אצות3. יכולת זו הופכת את C. sorokiniana למועמד אטרקטיבי לייצור כלורופיל בקנה מידה מסחרי ומבטיחה להיות פתרון בר-קיימא לאתגרים סביבתיים ותזונתיים דחופים5.
מצד שני, מין מיקרו-אצות נוסף בעל עניין משמעותי הוא H. pluvialis. מיקרו-אצה זו ידועה בייצור אסטקסנטין, פיגמנט נוגד חמצון רב עוצמה עם יישומים תעשייתיים רבים. אסטקסנטין משמש כמנגנון הגנה עבור מערכת פוטוסיסטם H. pluvialis , ומגן עליו מפני עקה חמצונית הנגרמת על ידי גורמים סביבתיים. פיגמנט זה מבוקש מאוד בתעשיות הקוסמטיקה, התזונה והחקלאות הימית, בשל תכונותיו נוגדות החמצון והיתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלו. עם יכולתו השופעת לייצר אסטקסנטין, H. pluvialis מציג אפיק מבטיח לפיתוח מוצרים חדשניים המספקים צרכים תעשייתיים וצרכניים שונים6.
מחקרים אחרונים גם הדגישו את הפוטנציאל של H. pluvialis1 לייצור כלורופיל, מה שמגביר עוד יותר את המשמעות התעשייתית שלו. לדוגמה, מחקר בדק את תכולת הכלורופיל של H. pluvialis בתנאי גידול משתנים ומצא כי תחת פרמטרים אופטימליים של גידול, H. pluvialis הציג שיעורי ייצור כלורופיל מדהימים, העולים על אלה של מיני מיקרו-אצות אחרים7. ממצא זה מדגיש את הפוטנציאל של H. pluvialis כמקור בר-קיימא של כלורופיל, ומציע הזדמנויות חדשות לשימוש בו במגזרי תעשייה שונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מדיה תרבותית והכנת חיסונים
- הכן 1 ליטר של מדיום גידול 3N-BBM+ V(CCAP) (מקרונוטריאנטים: NaNO3 [0.75 גרם L-1], CaCl2 [0.019 גרם L-1], MgSO4 [0.019 גרם L-1], K2HPO4 [0.057 גרם L-1], NaCl [0.025 גרם L-1], KH2PO4 [0.175 גרם L-1]; מיקרונוטריאנטים: Na2 EDTA [0.0186 גרם L-1], FeCl3 [0.0024 גרם L-1], MnCl2 [0.001 גרם L-1], ZnCl2 [1.25 x 10-4 גרם L-1], CoCl2 [5 x 10-5 גרם L-1], Na2MoO4 [9.98 x 10-5 גרם L-1])8 ולעקר אותו במשך 15 דקות ב 121 ° C ו 1.5 psi.
- לחסן בקבוק עם 1 L של מדיום צמיחה בריכוז משוער של 3 x 106 תאים mL-1 עבור microalga C. sorokiniana; או להוסיף 5% עד 10% (V/V) של חיסון למדיום הגידול.
הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים, מומלץ להשתמש במכסה מנוע זרימה למינרית, כפפות, מעיל מעבדה ומסכת פנים. - לדגור על הבקבוק המחוסן תחת מקורות אור אדום בעוצמה משוערת של 3,600 עד 4,200 לוקס, בטמפרטורה שבין 22-26 מעלות צלזיוס, עם פוטו-תקופה של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך עבור C. sorokiniana ופוטו-תקופה של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך עבור H. pluvialis, ולהתסיס ידנית כל 24 שעות, בערך 7 ימים לשני הזנים.
הערה: יש לשמור בתנאי גידול לפחות 7-10 ימים (עד לקבלת צבע ירוק עז) עבור C. sorokiniana ו-10-12 ימים עבור H. pluvialis. כדי להשיג את תרכיז המיקרו-אצות שישמש כחיסון בקינטיקה, יש צורך להסיר את התווך העל-טבעי מהאצות המיוצרות. - בסביבה סטרילית, מלא צינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל בכ- 10 מ"ל של תווך מחוסן וצנטריפוגה ב- 3,000 x גרם למשך 20 דקות מתחת ל- 25-30 ° C.
- בתנאים סטריליים, הסר את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה או על ידי מזיגה וריכוז של הביומסה בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
- חזור על תהליך זה לפי הצורך עד לקבלת נפח החיסון הנדרש עבור הקינטיקה.
- מדדו את הצפיפות האופטית (OD550 ננומטר) של החיסון כדי לקבוע את ריכוז התא של המיקרו-אצות ואחסנו אותו בטמפרטורה של 3-4 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.
הערה: ספירה תאית ישירה בוצעה בתחילה כדי לקשר בין ריכוז התאים לספיגה. לאחר הספירה, ניתן לאחסן את החיסון בקירור לא יותר מ -4 ימים.
2. חקר קינטיקה של צמיחה
- הכינו את הנפח הנדרש של 3N-BBM+ V(CCAP) המתאים לכל ניסוי (8 ליטר לבדיקות ברמת הפוטוביוריאקטור עבור C. sorokiniana ו-0.5 ליטר לבדיקות ברמת הצלוחית עבור H. pluvialis) על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים, תוך הבטחת עיקור נאות.
- הן עבור פוטוביוריאקטור והן עבור צלוחיות, הגדר את מקור האור לספקטרום הצבעים הרצוי (כחול ב- 460 ננומטר, סגול, תערובת של 460 ננומטר ו- 630 ננומטר עבור C. sorokiniana ואדום ב- 630 ננומטר עבור H. pluvialis); כסה את שתי המערכות כדי למנוע הפרעות אור חיצוניות.
הערה: בשל השונות באורך הגל הנפלט מכל דיודה פולטת אור, הספקטרורדיומטריה בוצעה באמצעות ספקטרורדיומטר על מקורות האור כדי לקבוע את אורך הגל ועוצמת הפליטה של כל דיודה9. האור הסגול הושג על ידי שילוב נורות LED אדומות וכחולות, וכתוצאה מכך אורכי גל של 460 ננומטר עם עוצמת פליטה של 1.65 W nm-1 עבור נורות ה- LED הכחולות ו- 630 ננומטר עם עוצמת פליטה של 0.6 W nm-1 עבור נורות ה- LED האדומות. מדידות אלה שימשו לבדיקות שנערכו באור כחול ואדום בלבד. - תכנת את הטיימר לסירוגין בין מחזורי אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך עבור C. sorokiniana ו-16 שעות אור ו-8 שעות מחזורים כהים עבור H. pluvialis.
- חבר את מערכת אוורור CO2 לכלי התרבית הפוטוביוריאקטור כדי לספק אספקת פחמן דו חמצני במרווחים של 12 שעות עבור C. sorokiniana.
- לחסן את כלי התרבית עם נפח מספיק של pre-inoculum כדי להשיג צפיפות תאים התחלתית של 3 x 105 תאים mL-1 או שווה ערך שלה בצפיפות אופטית (OD550 ננומטר) = 0.180.
הערה: יש להקפיד על טכניקה אספטית במהלך החיסון כדי למנוע זיהום. - דגמו את התרבית במרווחי זמן קבועים של 12 שעות עבור C. sorokiniana ו-8 שעות עבור H. pluvialis כדי לעקוב אחר גדילת התאים ופרמטרים פיזיולוגיים. לאסוף דגימות באמצעות טכניקות סטריליות כדי לשמור על שלמות התרבית.
3. כימות כלורופילים
הערה: נתונים לכימות סלולרי מופיעים בקובץ משלים 1.
- מניחים 40 מ"ל של הדגימה לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטית פלסטיק.
- צנטריפוגה ב 3,000 x גרם למשך 20 דקות ב 15 ° C ולהשליך את supernatant על ידי decantation או באמצעות פיפטה פסטר.
- העבירו את גלולת התא לתוך צינור זכוכית מכוסה ברדיד אלומיניום ומכסה בורג למניעת חמצון.
- השהה מחדש את גלולת התא עם 3 מ"ל של תמיסת אצטון טהורה 90% באמצעות מערבולת.
- סוניק את הדגימה המרחפת באמבט קרח במשך שני מחזורים של 5 דקות כל אחד ולתת לו לנוח ב 4 ° C במשך 16 שעות10.
- לאחר 16 שעות, סוניק שוב באותם תנאים שהוזכרו בשלב הקודם (שלב 3.5) וצנטריפוגה שוב בתנאים שתוארו קודם לכן (שלב 3.2).
- מפרידים את תמצית הפיגמנט באמצעות פיפטה של פסטר ומעבירים אותה לצינור נקי אחר המוגן מפני אור.
- הניחו את תמצית הפיגמנט בתא קוורץ כדי לקרוא בספקטרופוטומטר באורכי גל של 630 ננומטר, 647 ננומטר ו-664 ננומטר.
הערה: כייל את הספקטרופוטומטר מראש עם 90% אצטון. - כדי לחשב ריכוזי כלורופיל, השתמש במשוואותהבאות 11:
כלורופיל A = 11.93 A664 - 1.93 A647
כלורופיל b = 20.36 אמפר647 - 5.50 אמפר664
הערה: התוצאות מבוטאות במיקרוגרם mL-1 של תמצית, אשר מוכפלים בנפח התמצית ומחולקים במספר מ"ל הדגימה כדי לקבל ריכוזי כלורופיל במיקרוגרם mL-1 של תרבית. - כדי לקבל ערכים בתא chl μg -1, השתמש בנוסחה הבאה:
μg chl cell-1 = μg chl ב 1 מ"ל של תרבית / [תאים mL-1] ריכוז תאים בתרבית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לבחון את יעילות הטכניקה המזהה שינויים בריכוז תאי הכלורופיל ולהעריך את ההשפעה של גורמי גדילה ב- C. sorokiniana, נקבע תכנון ניסויי Taguchi L4 , המעריך תוספת נפח CO2 , צבע אור ועוצמת אור. כל גורם הוערך ברמות נמוכות וגבוהות, כפי שמוצג בטבלה 1, בתנאים שהוגדרו על ידי תכנון הניסוי בטבלה 2.
לאחר סיום תהליך הניסוי, התוצאות הראו כי השילוב של תוספת נמוכה של CO2, אור סגול, ועוצמת אור גבוהה (C1, P, I2) המת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המחקר ההשוואתי בין H. pluvialis ו - C. sorokiniana גילה הבדלים משמעותיים בדינמיקה של ייצור כלורופיל. בעוד H. pluvialis הראה ירידה בריכוז הכלורופיל לאורך כל הניסוי, C. sorokiniana הראה עלייה מתמדת. בנוסף, בתחילה היה שיעור נמוך יותר של כלורופיל a בשני המינים, אך יחס זה התהפך בתנאי גידול מסוימים, מה שעשוי לתת אינדיקציות להשראת הייצור של הכלורופילים האמורים באמצעות סלקטיביות או חשיפה של אורכי גל ספציפיים. ממצאים אלה מצביעים על תגובה ייחודית של כל ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים בהכרת תודה על המימון החלקי של TecNM במסגרת הקול הקורא למחקר מדעי, פיתוח טכנולוגי וחדשנות (16898.23-P) עבור Institutos Tecnologicos Federales. הם גם מעריכים את תמיכתו של המכון לסיאנסיה, Tecnología e Innovación del Estado de Michoacán de Ocampo (FCCHTI23_ME-4.1.-0001).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| C3H6O | מאייר | 67-64-1 | אצטון 90% |
| 15 מ"ל שפופרת | Biologix | 10-9502 | מבחנה |
| 2510-DTH | ברנסון | D-73595 | סוניקטור |
| 5 מ"ל מבחנה מכסה בורג | Kimax | 45066-13100 | מבחנה |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה 50 מ"ל | Biologix | 10-9151 | מבחנה |
| רדיד אלומיניום | ריינולדס | 611 סטנדרטי, 12 אינץ' x 1000 רגל | כיסוי מבחנה |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | סידן כלוריד |
| צנטריפוגה מקוררת | Dynamica | 14 R | |
| CoCl2 | Merck | 1057-100 | קובלט דיכלוריד |
| FeCl3 | Merck | 157740 | ברזל(III) כלוריד |
| K2HPO4 | Meyer | 2051-250 | דיפוטסיום פוספט |
| KH2PO4 | Meyer | 2055-250 | מונופוטסיום פוספט |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | מגנזיום סולפט |
| מיקרופיפט | LabNet | דגם בטא-פטה | מיקרופיפטה |
| MnCl2 | Merck | 429449 | מנגן(II) כלוריד |
| Na2 EDTA | Merck | 200-449-4 | Edatamil, Dedetato מלח דיסודיום דיהידרט |
| Na2MoO4 | Merck | 243655 | נתרן מוליבדט |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | נתרן כלורי |
| NaNO3 | Meyer | 2465-250 | נתרן חנקתי |
| RGB LED stripe | Steren | GAD-LED2 | אור מקור |
| ספקטרופוטומטר | PerkinElmer | דגם Lambda35 | ספקטרופוטומטר |
| ספקטרורדיומטר | Gigahertz-Optik | דגם BTS256 | |
| Vortex | Scientific Industries | Vortex-Genie® 2 | Vortex |
| ZnCl 2 | Merck | 208086 | אבץ כלוריד |
מקורות
- Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306 (2013).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microb Cell Fact. 17 (1), 36(2018).
- Otero-Paternina, A. S. M., Cruz-Casallas, P. Effect of the hydrocarbon phenanthrene on Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) growth. Acta Biol Col. 18 (1), 87-98 (2013).
- Pancha, I., et al. Salinity-induced oxidative stress enhanced the biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077. Bioresour Techno. 189, 341-348 (2015).
- Ortiz, M. L., Cortés, C. E., Sánchez, J., Padilla, J., Otero, A. M. Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions. Orinoquia. 16 (1), 11-20 (2012).
- Camacho Kurmen, J. E., González, G., Klotz, B. Astaxanthin production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions. Nova. 11 (19), 94-104 (2013).
- Pérez Zambrano, E., Ayala Agudelo, Y. Production of chlorophyll and astaxanthin from Haematococcus pluvialis under nitrogen deficiency stress in a 5-liter Biostat Aplus bioreactor. , Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735 (2019).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. University of Texas. 6318, 95(1963).
- Cerezo, R. LED characterization through the use and programming of a spectrometer. Universidad Politécnica de. 22323, (2013).
- Arredondo, B. O. Analytical methods and tools for microalgal biomass evaluation. , CIBNOR. México. http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403 (2017).
- Couso, I., Vila, M., Vigara, J., Cordero, B. F., Vargas, M. Á Synthesis of carotenoids and regulation of the carotenoid biosynthesis pathway in response to high light stress in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii. Eur J Phycol. 47 (3), 223-232 (2012).
- Vera-López, F., Martínez, A. Pigments in microalgae: Functions, applications, and overproduction techniques. BioTechnology. 25 (5), 35-51 (2021).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
