הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67214

⸱

8 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Trauma and Transfusion Medicine Research Center, Department of Surgery, University of Pittsburgh

במאמר זה

סיכום

ניתן להעריך את תפקוד טסיות הדם תחת זרימה ולדמות החייאה המוסטטית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, שיש לו יישומים ברפואת טראומה ועירוי.

תקציר

מיקרופלואידיקה משלבת מצעים וזרמים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית המחקים את כלי הדם ולכן הם כלי רב ערך לחקר היבטים של פקקת והמוסטאזיס. בסביבות בעלות גזירה גבוהה המדמות זרימה עורקית, בדיקה מיקרופלואידית מאפשרת את המחקר של תפקוד טסיות הדם, כאשר טרומבי עשיר בטסיות דם נוצר באזור סטנוטי מקומי של ערוץ זרימה. שימוש במכשירים המאפשרים נפח דגימה קטן יכול גם לסייע בהערכת תפקוד טסיות הדם תחת זרימה מדגימות חולים מוגבלות נפח או מודלים של בעלי חיים. חקר דגימות או דגימות של מטופלי טראומה לאחר עירוי טסיות עשוי לסייע בהכוונת אסטרטגיות טיפוליות לאוכלוסיות חולים בהן תפקוד טסיות הדם הוא קריטי. השפעות של עיכוב טסיות באמצעות סוכנים פרמקולוגיים ניתן ללמוד גם במודל זה. מטרת פרוטוקול זה היא להקים פלטפורמה מיקרופלואידית המשלבת זרימה פיזיולוגית, משטחים ביולוגיים ומנגנונים המוסטטיים רלוונטיים להערכת תפקוד טסיות הדם עם השלכות לחקר קוגולופתיה הנגרמת על ידי טראומה ורפואת עירוי.

מבוא

טראומה היא גורם עולמי מוביל למוות ונכות. פציעה חמורה מסובכת לעתים קרובות על ידי הפרעה ייחודית ואנדוגנית של המוסטזיס ופקקת, המכונה קוגולופתיה הנגרמת על ידי טראומה (TIC)1. טסיות הדם ממלאות תפקיד קריטי ב-TIC, והן תוארו כבעלות פונקציות אדפטיביות ולא מסתגלות2. המנגנונים של תפקוד לקוי של טסיות הדם לאחר פציעה עדיין אינם ברורים, ויש צורך קריטי להבין טוב יותר את התגובה התאית כדי להנחות את הפיתוח של החייאה וטיפול משופרים. בעיה מטרידה נוספת בנוגע לתפקוד טסיות הדם לאחר פציעה היא חוסר הוודאות לגבי אמינות הקריאות הנוכחיות של תפקוד טסיות הדם אצל מטופל הטראומה.

מחקרים רבים הראו כי אפילו חולים פצועים קל, ללא פנוטיפ דימום קליני ידוע, יש תפקוד טסיות חריג באמצעות בדיקות תפקודי טסיות קונבנציונליות כגון aggregometry 3,4. עם זאת, מגבלות באגרגומטריה להערכת תפקוד טסיות הדם במצב פציעה כוללות היעדר משטח פציעה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, גישה רדוקציוניסטית לגירוי אגוניסט, דילול דגימה עם אגרגומטריה של עכבת דם שלמה, הפרדת פלזמה עם אגרגומטריה של העברת אור אופטית, והערכת דגימה עומדת. בנוסף, עדיין לא ברור אם רגישות זו של תפקוד טסיות הדם מייצגת תפקוד לקוי אמיתי של התא או ממצא מדידה, כגון עכבה חשמלית בסיסית מוגברת, במצב של פציעה2. לפיכך, חקר תפקודי טסיות רלוונטיים בהקשר של טראומה הוא חיוני להבנת TIC, ויש מקום משמעותי לחדשנות ושיפור בתחום זה.

פלטפורמות המשמשות באופן מסורתי לחקר תפקוד טסיות הדם אינן כוללות דינמיקה של נוזלים וזרימה, אשר עשויים להיות קריטיים להבנת תפקוד לקוי של טסיות הדם הקשור לטראומה וקוגלופתיה הנגרמת על ידי טראומה5. מנגנונים של המוסטאזיס התלויים בזרימה כוללים התארכות גורם פון וילברנד (VWF) בגזירה גבוהה, מעל קצב גזירה קריטי, ולכידת טסיות באמצעות גליקופרוטאין 1b 6,7,8, שאינם נלכדים באמצעות בדיקות תפקוד טסיות עומדות. בנוסף, טסיות הדם מעדיפות לקשור VWF או פיברינוגן בהתאם למשטר הזרימה ומעוררות תפקידים דיפרנציאליים בפקקת עורקים לעומת פקקת ורידית 9,10. טרומבי עורקי מורכב בעיקר מטסיות בעוד תרומבי ורידי מורכב בעיקר מכדוריות דם אדומות, המבוססות, בחלקן, על משטרי זרימה11. בדיקות המשלבות משטרי זרימה יכולות לסייע בהבהרת תפקודים לקויים הנוגעים לספקטרום של פנוטיפים של TIC, החל מהיפוקוגולביליות ופנוטיפים מדממים ועד קרישיות יתר ופנוטיפים טרומבוטיים. לבסוף, אילוצי דגימת נפח דם עם אוכלוסיות מטופלי טראומה עשויים להפוך את בדיקת תפקודי הטסיות המסורתית למאתגרת. בעוד שבדיקות כגון ציטומטריית זרימה יכולות וצריכות לשמש בנסיבות אלה, התוצאות מתארות לעתים קרובות אפיון פיזי של מדגם ולא הערכה תפקודית המוסטטית.

בעוד מנגנונים של תפקוד לקוי של טסיות הדם עשויים שלא להיות מובנים לחלוטין בטראומה, מודלים של תפקוד לקוי של טסיות במבחנה, עם אנטגוניסטים P2Y12 למשל, יכול גם לעזור להנחות את המחקר של התערבויות טיפוליות. החייאה המוסטטית היא בעלת חשיבות קריטית בחולי טראומה שבהם מוצרי הדם עוברים טרנספוזיה בגישה מאוזנת לטיפול בהלם, קרישת דם ופגיעה אנדותל עם דם שלם או מרכיבי דם (תאי דם אדומים, פלזמה ותרכיזי טסיות) ביחס יחידה של 1:1:1 12,13,14. בחולי טראומה, שימוש מוקדם במוצרי דם קשור לשיפור בהישרדות15,16. כדי להאריך את חיי המדף, מוצרי טסיות מאוחסנים קר נחקרו יותר ויותר. בדיקה של טסיות דם מאוחסנות בקור מראה פעילות המוסטטית מוגברת, כמו גם בטיחות בעת transfused לאחר פציעה17,18.

האבולוציה של החייאה טסיות המאוחסנת בקור מדגישה את הצורך בבדיקות נוספות כדי להבין את מוצר הטסיות היעיל ביותר הזמין לטראומה. עם זאת, בדיקות מסורתיות של תפקוד טסיות הדם הן לעתים קרובות מוגזמות או חסרות עוצמה כדי לזהות תפקוד לקוי, המתרחשות הן במטופל הטראומה המקבל עירוי טסיות טיפולי, כמו גם במוצר הטרנספוזיה עצמו שנראה בנגעים של אחסון טסיות. קביעת מקור התפקוד הלקוי יכולה להיות מאתגרת, בהתחשב במגבלות בבדיקות תפקוד טסיות הדם הנוכחיות, כולל האופי הסטטי של רוב הבדיקות הללו. לכן, כאשר חוקרים החייאה המוסטטית במבחנה, הפלטפורמה ושיטות הזיהוי הן עבור אוכלוסיית טסיות הדם המושתל והן עבור אוכלוסיית טסיות המוצר הן בעלות חשיבות קריטית בקביעת התערבויות טיפוליות אופטימליות.

בדיקות מיקרופלואידיות מציעות פרופילי זרימה ומשטחים ביופידליים כדי ליצור בדיקה רלוונטית פיזיולוגית שעליה ניתן לחקור טסיות. התקנים מיקרופלואידים יכולים להיות מותאמים אישית כדי לחקור פתופיזיולוגיה או סוגי פציעה מסוימים, כגון ניקוב כלי דם19 או נזק אנדותל20. התקנים אלה מורכבים בדרך כלל מפולידימתילסילוקסאן (PDMS) המחוברים למגלשת מיקרוסקופ זכוכית עם שינויים בפני השטח, כגון קולגן, כדי לחקות תת-אנדותל ופגיעה ברקמות. שימוש במכשירים מבוססי זרימה מסוג זה יכול לסייע בהנחיית מחקר הקשור לטראומה בתפקוד לקוי של טסיות הדם ולסייע בבחינת גישות מיטביות של רפואת עירוי לשיפור תפקוד לקוי של טסיות. אסטרטגיות אלה עשויות לעזור להבהיר את הבלבול הקיים לגבי הרלוונטיות של בדיקות טסיות סטטיות כגון אגרגומטריה אצל המטופל הפגוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיים. התקבל אישור מהמשרד להגנת המחקר האנושי באוניברסיטת פיטסבורג והתקבלה הסכמה מדעת של מתנדבים אנושיים בריאים.

1. הכנת מכשיר מיקרופלואידי

  1. כדי לייצר את החלק PDMS של המכשיר, להכין תבנית אב באמצעות פליז באמצעות מיקרו-עיבוד שבבי של בקרה נומרית ממוחשבת (CNC).
    הערה: בהתאם למידות הערוץ, ניתן להשתמש בטכניקות פוטוליתוגרפיה ליצירת תבנית אב. ההתקן המשמש בפרוטוקול זה כולל שמונה תעלות מיקרו-מכונות מקבילות ברוחב של כ-480 מיקרומטר, בגובה של 140 מיקרומטר בכניסה וביציאה של המכשיר, ובגובה של 40 מיקרומטר בהיצרות המכשיר, עם אורך רמפה מ/אל האזור הסטנוטי של כ-0.3 מ"מ. אורכי התעלה הם כ-6 מ"מ.
  2. לאחר שהושגה תבנית מאסטר, יוצקים את בסיס האלסטומר סיליקון (המתקבל מערכת האלסטומר) לצלחת שקילה. הוסיפו את חומר ריפוי הסיליקון (המתקבל מערכת האלסטומרים), המאפשר קישור צולב של שרשראות פולימר הסיליקון כדי להפוך את PDMS הנוזלי למוצק עמיד וגמיש, ביחס של 10:1 (סוכן בסיס) וערבבו היטב את התערובת.
  3. מניחים את התבנית לתוך צלחת פטרי ויוצקים את PDMS uncured על התבנית. הניחו את צלחת הפטרי בתוך מייבש ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות.
  4. סיים לרפא את PDMS בתבנית האב על ידי הכנסתו לתנור להגדיר 70 ° C למשך 90 דקות.
  5. לאחר ריפוי PDMS מלא, לחתוך את הגבס microfluidic באמצעות סכין גילוח או אזמל. חורי ניקוב בשולי התעלות (קוטר 1.5 מ"מ משני הצדדים).
  6. בעזרת סרט מעבדה, נקו את פני השטח של מגלשת זכוכית ואת הצד החרוט של הגבס המיקרופלואידי. השתמש באוויר דחוס לפי הצורך כדי להסיר את הפסולת שנותרה.
  7. הניחו את מגלשת הזכוכית ואת הגבס המיקרופלואידי עם הצד החרוט כלפי מעלה לתוך מנקה פלזמה. הפעילו את משאבת הוואקום, אטמו את התא והפעילו את שואב הפלזמה למצב גבוה. השאירו את המגלשה ואת PDMS בשואב הפלזמה למשך 30 שניות, ואז כבו את שואב הפלזמה והוציאו את שואב האבק.
  8. קשרו את הגבס והזכוכית שעברו ניקוי פלזמה יחד על ידי לחיצה עדינה יחד על הצדדים שהיו עם הפנים כלפי מעלה במנקה הפלזמה. לאחר מכן, הניחו את המכשיר המיקרופלואידי בתנור/פלטה חמה בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות.
    הערה: אין להפעיל לחץ רב מדי בעת חיבור הגבס והזכוכית יחד, מכיוון שהדבר עלול להוביל לאובדן מורפולוגיית הערוץ.
  9. יש לשטוף כל תא עם 10-30 μL של אתנול 70% כדי לעקר ולאפשר למכשיר המיקרופלואידי להתייבש על פלטה חמה של 70°C.
    הערה: יש להכין מכשירים לפחות 24 שעות מראש, אך ניתן להכין אותם שבועות עד חודשים מראש. יש לאחסן את המכשירים במיכל אטום או בצלחת פטרי מכוסה בטמפרטורת החדר.
  10. יום לפני הניסוי עם המכשיר microfluidic, לשטוף מחדש כל תא עם 10-30 μL של אתנול 70% כדי לעקר ולאפשר את המכשיר microfluidic להתייבש על פלטה 70 מעלות צלזיוס.
  11. צפו את התא בריאגנט קולגן פיברילרי מסוג 1 סוסים (1 מ"ג/מ"ל), מדולל ב-0.9% NaCl ביחס נפחי של 1:5 דרך שקע ייעודי לכניסה ייעודית. ודא שהכיווניות נשמרת במהלך ניסוי. אחסנו את המכשיר בכלי סגור חם ולח כדי למנוע אידוי של הקולגן המצופה בתוך התעלה.
  12. לאחר שעה, יש לשטוף במי מלח חוצצים פוספט (PBS) כדי לשטוף את תמיסת הקולגן. סומקים בכיוון ההפוך לציפוי. כאשר המכשיר אינו בשימוש, יש לאחסן אותו שוב במיכל חם, לח וסגור.

2. הכנת דגימת דם

  1. קבל דגימת דם ציטרציה מלאה באמצעות venipuncture. לדגור על דם שלם ציטראטי עם תמיסת חסימת קולטן FC (1:600).
    הערה: דגימות דם מאוחסנות בטמפרטורת החדר לפני ובמהלך הניסוי.
  2. לדגור דם שלם ציטרציה עם פלואורסצנטיות מצומדת (באמצעות פלואורופור לבחירה) נוגדן CD41 (1:600). כתם במשך 30 דקות על נדנדה אגוזית.
  3. כבקרה חיובית לעיכוב טסיות, הוסף Ticagrelor, אנטגוניסט קולטן P2Y12 שנוצר מחדש בתמיסה של 30% w/v 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) ב- PBS.
    הערה: יש להכין מלאי של Ticagrelor עד 6.4 mM ודילול נוסף של מלאי Ticagrelor בתמיסת HP-β-CD (30% HP-β-CD מומס ב-PBS) לפני הניסויים (מומלץ ריכוז מלאי של פי 1,000).
  4. דגרו על הדגימה הציטרטית עם טיקרלור (ריכוז סופי עד 6.4 מיקרומטר) למשך 30 דקות כדי לצפות בעיכוב טסיות.
  5. אם מערבבים את מוצר הדם עם דגימת הציטרציה, יש להכתים את מוצר הדם בתמיסת חסימת קולטן FC (1:600) ובנוגדן CD41 מצומד פלואורסצנטי (באמצעות פלואורופור נפרד ומובהק לדגימה המצטרת) CD41 (1:600).
    1. מערבבים מקבילה נפחית של יחידות המוצר transfused עם הדגימה ציטרציה. לדוגמה, כדי לדמות 2 יחידות של מוצרי טסיות דם שהועתקו לאדם מדמם (כ-250 מ"ל למוצר לנפח דם כולל של 5,000 מ"ל), ערבבו 100 מיקרוליטר של מוצר דם לתוך 1,000 מיקרוליטר של דגימת דם ציטרת.
  6. מיד לפני הניסוי, סננו את דגימת הדם דרך מסנן 40 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל.

3. בדיקת תפקוד טסיות תחת זרימה (שיטה 1)

  1. הפעל את המיקרוסקופ ואת התוכנה המשויכת.
  2. הגדר רמת משאבת מזרק נסיגה עם שלב המיקרוסקופ. התאם את ההגדרות במשאבת המזרק.
    1. חשב קצב זרימה נפחי (Q) עבור קצב גזירה ממוצע רצוי (γ) של 3,500 s-1 באזור הסטנוטי של התעלה באמצעות משוואות (1) ו- (2)21.
      figure-protocol-1(1)
      figure-protocol-2(2)
      כאשר A הוא שטח החתך של התעלה, P הוא ההיקף הרטוב, λ הוא גורם הצורה, b הוא הצד הקצר של המלבן (גובה), ו-a הוא הצד הארוך של המלבן (רוחב).
      הערה: הערך של 3,500 s-1 נבחר עקב גזירה קריטית של VWF ונמצא במשטר העורקים 7,22,23.
  3. הניחו את המכשיר המיקרופלואידי על במת המיקרוסקופ. הדביקו את קצוות המכשיר המיקרופלואידי לבמה כדי למנוע תנועה. ודא שהשקע פונה לחלק האחורי של המיקרוסקופ.
  4. חבר קצה אחד של צינור זיהוי בגודל 1/16 אינץ' (באורך של כ-30 ס"מ) למחבר מרפק ואת הקצה השני למזרק בנפח 10 מ"ל עם מחבר מזהה בגודל 1/16 אינץ'.
  5. ממלאים את המזרק ב-PBS סטרילי ומחברים אותו למשאבת המזרק.
  6. הכנס את מחבר המרפק לשקע המכשיר.
  7. הכינו קווי כניסה באורך של כ-10 ס"מ כאשר מחבר המרפק בקצה אחד והחתך הזוויתי בקצה השני.
  8. חבר את מחבר מרפק הכניסה לכניסת ההתקן.
  9. מקם את קו הכניסה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה פסולת על מחזיק זוויתי.
  10. השתמש במטרה 10x עבור מידות ערוץ ברוחב של כ- 500 מיקרומטר והתמקד בקצוות הערוץ של ההתקן המיקרופלואידי.
  11. מקדמים את הקווים עם PBS ומנקים את התעלה מכל PDMS/פסולת על ידי קידום משאבת המזרק באופן ידני. הקפד לבדוק ליד הכניסה והשקע של הערוץ.
  12. פתח את הגדרות לכידת התמונה שנשמרו או צור הליך לכידת תמונה עבור תמונות מסדרות זמן שצולמו כל 1-2 שניות עם ערוץ שדה בהיר ותעלות פלואורסצנטיות המתאימות לנוגדנים הפלואורסצנטיים CD41 המשמשים בדגימת הדם.
  13. קבל את דגימת הדם הציטר המסונן וערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה ממש לפני הניסוי. מניחים את הדגימה על מחזיק מיקרוצנטריפוגה זוויתית.
  14. מקם את קו הכניסה בדגימה.
  15. התחל להקליט את לכידת התמונה.
  16. לאט, למשוך את המזרק כדי למלא את נפח מת בצינורית. ברגע שהדם מגיע לערוץ, לחץ מיד על הפעל על משאבת המזרק כדי לחדש את הזרימה בקצב הגזירה הרצוי.
  17. התאם את המיקוד במידת הצורך.
  18. הפעל את הניסוי עד שהטסיות הסתירו לחלוטין את האזור הסטנוטי של המכשיר המיקרופלואידי או עד לנקודת סיום ניסיונית (כלומר, 10 דקות).
  19. ודא שצינורית הכניסה שקועה בדגימת הדם למשך הניסוי.
  20. לאחר השלמת הניסוי, עצור את לכידת התמונה ועצור את משאבת המזרק. שמור את לכידת התמונה.
  21. הסר את מחבר מרפק הכניסה ורוקן את תכולת הצינור לחרוט פסולת. רוקנו גם את תכולת המזרקים וקווי היציאה לחרוטיות פסולת.
  22. החלף את מחברי הכניסה והיציאה ואת הצינורות לפי הצורך עבור הדגימות הבאות.

4. בדיקת תפקוד טסיות בזרימה עם דגימות בנפח נמוך (מתחת ל-1 מ"ל) (שיטה 2)

  1. חזור על שלבים 1.1 עד 1.4 כמפורט לעיל.
  2. ניקבו פתח בקוטר 1.5 מ"מ ובכניסה בקוטר 3 מ"מ בשולי התעלות.
  3. חזור על שלבים 1.6 עד 3.6 כמפורט לעיל.
  4. השתמש במטרה 10x עבור מידות ערוץ ברוחב של כ- 500 מיקרומטר והתמקד בקצוות הערוץ של ההתקן המיקרופלואידי.
  5. נקו את התעלה מכל PDMS/פסולת על ידי הקדמת משאבת המזרק באופן ידני וניקוי נוזל גישה באמצעות מגבון מעבדה. הסר את כל הלכלוך עם סרט מעבדה בחלק העליון של המכשיר microfluidic.
  6. קדם ידנית את המשאבה כדי למלא את מאגר הכניסה 3 מ"מ עם PBS.
  7. פתח את הגדרות לכידת התמונה שנשמרו או צור הליך לכידת תמונה עבור תמונות מסדרות זמן שצולמו כל 1-2 שניות עם ערוץ שדה בהיר ותעלות פלואורסצנטיות המתאימות לנוגדנים הפלואורסצנטיים CD41 המשמשים בדגימת הדם.
  8. התחל את המשיכה במשאבת המזרק (ידנית או במהירות מוגדרת) וברגע ש- PBS מתקדם לתוך התעלה וקו המילוי במאגר יורד, השהה את המשיכה במשאבה.
  9. הסר עודף PBS מהמאגר עם פיפטה.
  10. התחל את לכידת התמונה.
  11. פיפטה את דגימת הדם לתוך המאגר (כ 40 μL) ומיד להתחיל מזרק נסיגה. ודא שהזרימה מתחילה.
    הערה: אם מנוע משאבת המזרק לנסיגה לא היה דרוך בשלב 4.8, הזרימה לא תתחיל מיד, ויש לחזור על הניסוי.
  12. מלאו מחדש את מאגר הדם למשך הניסוי, כדי לוודא שלא נכנסים כיסי אוויר לתעלה.
  13. הפעל את הניסוי עד שהטסיות הסתירו לחלוטין את האזור הסטנוטי של המכשיר המיקרופלואידי או עד לנקודת סיום ניסיונית (כלומר, 10 דקות).
  14. לאחר השלמת הניסוי, הפסק את לכידת התמונה ועצור את משאבת המזרק. שמור את לכידת התמונה.
  15. הסר עודפי דם במאגר על ידי pipetting. רוקנו את תכולת צינור הגמילה לתוך צינור חרוטי פסולת.
  16. החלף את המחברים והצנרת לפי הצורך עבור הדגימות הבאות.

5. טיהור

  1. נקו את קווי הכניסה והיציאה של הדם על ידי שטיפה לתמיסת אקונומיקה 10%.
  2. אם נעשה שימוש בכל התעלות במכשיר המיקרופלואידי, השליכו את המכשיר במיכל הפסולת הביולוגית המסוכנת של שארפ.
    הערה: יש להשליך את כל הפסולת הביולוגית לפסולת מסוכנת ביולוגית כראוי.

6. ניתוח תמונות

  1. ייצא את התמונות מניסויים קינטיים באמצעות תוכנה על ידי לחיצה על קובץ | ייצוא/ייבוא | ייצוא.
  2. בחר את הפרמטרים הבאים: סוג קובץ: Tagged Image File Format (TIFF); דחיסה: LZW; סמן את הנתונים המקוריים ואת Shift Pixel; בטל את הסימון של האפשרות החל עקומת תצוגה וצבע ערוץ; סמן ' הגדר תת-ערכה (אזור, אזור מלבן', ובחר באזור הערוץ עם מדידת רוחב וגובה לשימור בין תנאים). ייצא לתיקיה הרצויה וסמן את צור תיקיה.
  3. שים לב לערכי הניסוי הבאים בתוכנה: התחל מסגרת כאשר הדם נכנס לערוץ; קצב פריימים (מידע, סדרת זמן).
  4. למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת המנורמלת של כל מסגרת בניסוי באמצעות קוד Matlab שסופק כקובץ משלים 1, תוך שינוי הקלטים הבאים עבור כל ניסוי: מסגרת התחלה/מסגרת סיום בהתבסס על אורך הניסוי (ודא שאורך הניסוי נשמר בין התנאים); שם הניסוי/שם התיקייה; חיתוך פרמטרים X, Y, H ו- W. הפעל את הקוד פעם אחת עבור ערוץ הפלואורסצנטי של טסיות הנמען ופעם אחת עבור ערוץ הפלואורסצנטי של טסיות המוצר. דווח על ערכי MFI מנורמלים (עמודה 2) וערכי AUC מנורמלים (מנורמלים למסגרת התחלה). הפחת את ערך אורך הניסוי מערך AUC המנורמל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניסויים מיקרופלואידים בעקבות השימוש בשיטה זו אמורים להראות היווצרות תרומבי עשירה בטסיות באזור ההיצרות של ערוץ הזרימה (איור 1). איור 1A מדגים תוצאות מייצגות שבהן טסיות דם תפקודיות יצרו פקקת באזור הסטנוטי של התעלה כדי לחסום את זרימת הדם דרך הערוץ. עקומות של עוצמה פלואורסצנטית ממוצעת (MFI) של תמונות קינטיות שצולמו במשך הניסוי מדגימות פיגור, צמיחה ושלב מישורי של שילוב טסיות בפקקת הגדלה (איור 2A,C). הגדלת הריכוזים של אנט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול לעיל כולל כמה צעדים קריטיים כדי להבטיח את האמינות ואת יכולת השחזור של ניסויים. ראשית, יש לשקול היטב נוגדנים פלואורסצנטיים. הנוגדנים המשמשים לזיהוי טסיות הדם בדגימה אינם אמורים לחסום את תפקודו של קולטן טסיות הגליקופרוטאין Ib (GPIb). התאמת לוט, במידת האפשר בין ניסויים, היא גם קריטית כדי להבטיח את יכולת השחזור של האות הפלואורסצנטי. שלב קריטי נוסף בפרוטוקול זה הוא שימוש בחומרים מתכלים סטריליים ותמיסות ודגימות מסוננות במידת האפשר. סינון דגימות דם מיד לפני הניסוי ימנע מפסולת או גושי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

המחברים מודים ומודים לכל תורמי הדם שהשתתפו, כמו גם לפלבוטומיסטים של מעבדת המחקר לרפואת טראומה ועירוי ולמרכז המחקר הקליני והתרגומי של UPMC מונטיפיורי על הסיוע באוספים. SMS נתמך על-ידי K25HL161401. MDN נתמך על-ידי 1R01HL166944-01A1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
Axio ObserverZeiss491917-0001-000
בל-ארט שומר חלל מייבש ואקוםפישר סיינטיפיק08-594-15A
פישרברנד איזוטמפ בוחש פלטה דיגיטליתפישרFB30786161
מיקסר נוטותפישר סיינטיפיק88-861-043
OHAUS סקאוט איזון סולםUlineH-5852
תנורפישר סיינטיפיק15-103-0520
מנקה פלזמהHarrickPDC-32G (115V)
משאבת מזרק (PHD ULTRA CP, I/W ניתן לתכנות)הרווארד מכשירים883015
Zen 3.4ZeissBlue Editionתוכנה
<חזק>חומר
1/16 אינץ' מזהה - מחברי מרפק דוקרנייםQosina11691
מזרק 10 מ"לFischer Scientific14-955-459
2-הידרוקסיפרופיל-ובטא;-ציקלודקסטריןקיימן כימיקלים1616930% מומס במסנני מלח חוצץ פוספט
40 מיקרוןפישר סיינטיפיק
NC1469671 נוגדן CD41Novus Biologicals  NB100-2614יחס של 1:600 בדם מלא
Chrono-Par מגיב קולגןChrono Log Corporation385יחס של 1:5 ב-0.9%
מיקרוסקופיה אלקטרונית מלוחה מדעי מילטקס ביופסיה אגרוף עם בוכנה, 3.0 מ"מFisher ScientificNC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 מ"לFisher Scientific05-402-25
Essendant 121oz. קלורוקס קוטל חיידקים אקונומיקהפישר מדעי50371500
אתנולפישר סיינטיפיק07-678-00570%
פלקון בטיחות אבק כבוי DPSXLRCP גז דחוססופרה1381978
אנושי TruStain Biolegend422302יחס של 1:600 בדם מלא
LevGo smartSpatula מרית פוליפרופילן חד פעמיתפישר סיינטיפיק18-001-017
שקופיות מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-550-A3
פוספט חוצץ מלחGibco10010-023
אזמל בטיחותפישר סיינטיפיק22-079-718
מלחMillipore5674420.90%
סירות שקילה פוליסטירן Sartorius פישרסיינטיפיק13-735-744
תלושי כיסוי Superslip - Superslip מס' 1.5Fisher Scientific12-541-055
SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקוןFisher ScientificNC9285739Polydimethylsiloxane (PDMS)
TicagrelorCayman Chemicals15425
Tygon PVC צינורות שקופים 1/16 אינץ' ID, 1/8 אינץ' OD, אורך 50 רגלMcMaster-Carr6516T11
פליז 360 ניתן לעיבוד אולטרה ברמקמאסטר-קאר8954K721לייצור עובש מאסטר
ואקוטיינריםBD363083
מכשיר דיוק עולמי אגרוף ביופסיה לשימוש חוזר, 1.5 מ"מפישר סיינטיפיקNC1215626

מקורות

  1. Moore, E. E., et al. Trauma-induced coagulopathy. Nat Rev Dis Primers. 7 (1), 1-23 (2021).
  2. Vulliamy, P., et al. Alterations in platelet behavior after major trauma: adaptive or maladaptive. Platelets. 32 (3), 295-304 (2021).
  3. Starr, N. E., et al. Identification of injury and shock driven effects on ex vivo platelet aggregometry: A cautionary tale of phenotyping. J Trauma Acute Care Surg. 89 (1), 20-28 (2020).
  4. Kutcher, M. E., et al. Characterization of platelet dysfunction after trauma. J Trauma Acute Care Surg. 73 (1), 13-19 (2012).
  5. Yakusheva, A. A., et al. Traumatic vessel injuries initiating hemostasis generate high shear conditions. Blood Adv. 6 (16), 4834-4846 (2022).
  6. Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
  7. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (19), 7899-7903 (2007).
  8. Savage, B., Almus-Jacobs, F., Ruggeri, Z. M. Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow. Cell. 94 (5), 657-666 (1998).
  9. Savage, B., Saldívar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84 (2), 289-297 (1996).
  10. Ruggeri, Z. M., Mendolicchio, G. L. Adhesion mechanisms in platelet function. Circ Res. 100 (12), 1673-1685 (2007).
  11. Chernysh, I. N., et al. The distinctive structure and composition of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli. Sci Rep. 10 (1), 5112(2020).
  12. Holcomb, J. B., et al. Transfusion of plasma, platelets, and red blood cells in a 1:1:1 vs a 1:1:2 ratio and mortality in patients with severe trauma: The PROPPR randomized clinical trial. JAMA. 313 (5), 471-482 (2015).
  13. Shea, S. M., et al. Doing more with less: low-titer group O whole blood resulted in less total transfusions and an independent association with survival in adults with severe traumatic hemorrhage. J Thromb Haemost. 22 (1), 140-151 (2024).
  14. Cardenas, J. C., et al. Platelet transfusions improve hemostasis and survival in a substudy of the prospective, randomized PROPPR trial. Blood Adv. 2 (14), 1696-1704 (2018).
  15. Sperry, J. L., et al. Prehospital plasma during air medical transport in trauma patients at risk for hemorrhagic shock. N Engl J Med. 379 (4), 315-326 (2018).
  16. Meyer, D. E., et al. Every minute counts: Time to delivery of initial massive transfusion cooler and its impact on mortality. J Trauma Acute Care Surg. 83 (1), 19-24 (2017).
  17. Shea, S. M., et al. Cold-stored platelet hemostatic capacity is maintained for three weeks of storage and associated with taurine metabolism. J Thromb Haemost. 22 (4), 1154-1166 (2024).
  18. Sperry, J. L., et al. Early cold stored platelet transfusion following severe injury: a randomized clinical trial. Ann Surg. 280 (2), 212-221 (2024).
  19. Schoeman, R. M., et al. A microfluidic model of hemostasis sensitive to platelet function and coagulation. Cell Mol Bioeng. 10 (1), 3-15 (2017).
  20. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  21. Miller, C. Predicting non-Newtonian flow behavior in ducts of unusual cross section. Ind Eng Chem Fundamentals. 11 (4), 524-528 (1972).
  22. Kim, D., Bresette, C., Liu, Z., Ku, D. N. Occlusive thrombosis in arteries. APL Bioeng. 3 (4), 041502(2019).
  23. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
  24. Sorrells, M. G., Neeves, K. B. Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays. Micromachines. 11 (1), 62(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בדיקה במיקרופלואידיקהזרימה פיזיולוגיתתרומבוזה והמוסטזהאגרגציה של טבקיותדגימות מחולי טראומהעיכוב פעילות טבקיותציפוי קולגןמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתמשאבת מזריקה
מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.