אופטימיזציה של הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה מעשית המשתמשת ב-Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה לטיפול בהתפלגות חלקיקים לא אחידה באמצעות אופטימיזציה של הכנת הדגימה, ומספק התייחסות לחוקרים להבהיר ביעילות מבנים מקרומולקולריים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM).

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM) חולל מהפכה בביולוגיה מבנית בכך שאפשר לחקור מבנים מקרומולקולריים בתנאים כמעט טבעיים, תלויים בקרח זגוגי. טכניקה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים וביו-מולקולות אחרות ללא צורך בהתגבשות, ומציעה תובנות משמעותיות לגבי תפקודם ומנגנוןם. ההתקדמות האחרונה בניתוח חלקיקים בודדים, יחד עם עיבוד נתונים חישובי משופר, הפכו את cryo-EM לכלי הכרחי בביולוגיה מבנית מודרנית. למרות האימוץ ההולך וגובר שלו, cryo-EM מתמודד עם אתגרים מתמשכים שיכולים להגביל את יעילותו, במיוחד פיזור חלקיקים לא אחיד. בעיה זו מובילה לעתים קרובות לרזולוציה ירודה ולדיוק מופחת במבני חלבון משוחזרים. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומעשית להתמודדות עם אתגר זה, תוך שימוש בחלבון הלם חום קטן מ- Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) כדוגמה. השיטה מייעלת את הכנת הדגימה כדי למזער ספיחה מועדפת, ומבטיחה פיזור חלקיקים הומוגני יותר ומבני cryo-EM חלבון איכותיים יותר. טכניקה זו מציעה הדרכה חשובה לחוקרים השואפים להתגבר על אתגרים דומים במחקרים מבניים.

Introduction

עם ההתקדמות האחרונה הן בחומרת המכשיר ^1,2 והן בתוכנת עיבוד תמונה ^3,4,5, מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM) התגלה ככלי פופולרי ורב-עוצמה בביולוגיה מבנית מודרנית. למרות פריצות הדרך הללו, צווארי בקבוק נמשכים בהשגת מבנים מקרומולקולריים ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-EM. אתגר משמעותי אחד כזה הוא התפלגות החלקיקים הלא אחידה, כולל תופעת העדפת הכיוון, הנצפית בעיקר בממשק אוויר-מים 6,7,8,9.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. טיהור חלבונים

1. לגרום לביטוי של MjsHSP16.5 רקומביננטי ב-E. coli BL21(DE3) ולטהר את החלבון באמצעות עמודת כרומטוגרפיה של ניקל-כלאט כפי שתואר קודם לכן²⁶. לאחר הטיהור בעמודה²⁶ של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC), בחנו את טוהר החלבון על ידי העמסת 5 מיקרוליטר של שברי שיא על ג'ל SDS-PAGE 12.5% והדמיה על ידי צביעה כחולה סטנדרטית של Coomassie²⁸ (איור 2).
2. רכז את שברי המאגר המכילים MjsHSP16.5....

Results

כדי לזהות תנאי רשת אופטימליים עבור MjsHSP16.5, נערכה סריקה ראשונית של cryo-EM, שהתמקדה בעיקר בבחינת תנאי חיץ חלבונים שונים: (1) מאגר הטיהור הסופי, המבטיח את היציבות וההומוגניות של MjsHSP16.5 וחשוב להתגבשותו³⁰; (2) מאגרים המותאמים לתנאים הדרושים לגידול גבישי MjsHSP16.5 באיכות עקיפה^{גבוהה 30}; ו-(3) מאגרים ששימשו בעבר במחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) של MjsHSP16.5^31,32.

במקביל לאופטימיזציה של .......

Discussion

כל מחקרי מבני החלבון מתחילים בטיהור חלבון, תהליך איטרטיבי להשגת איזון בין בידוד מטרות חלבון עם טוהר והומוגניות גבוהים תוך שמירה על הפונקציונליות הטבעית שלהם. למרות שהרכבי החיץ לטיהור ושימור דגימות חלבון נבחרים בקפידה במהלך תהליך הטיהור, מאגרים אלה מהווים לעתים קרובות אתגרים במהלך הכנת דגימת cryo-EM והדמיה⁶. בעיה זו נובעת מחוסר התאמה בין רכיבי המאגר לבין התנאים המוקדמים לניתוח cryo-EM אופטימלי, ובכך מחייבת צעד מכריע: אופטימיזציה של מאגר אחסון החלבון עבור אחד התואם .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינור תחתון עגול 14 מ"ל	SPL מדעי החיים	40114
250 ומיקרו; מזרק אטום לגז L דגם 1725 LTN	המילטון	81100	מחט מלט, מד 22 שניות, 2 אינץ', סגנון נקודה 2
50 ומיקרו; L כפתור דיאליזה	המפטון מחקר	HR3-326
זכוכית 50 מ"ל	יהלום	HA.1010D.50
Ä KTA טהור 25 ליטר	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 יחידת סינון צנטריפוגלי	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
ברדפורד ריאגנט	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
מיקרו צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל	HD מיקרו	H23015
PCR צינורות 0.2 מ"ל, מכסה שטוח	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow זוהר פריקה יחידה	טד פלה	91000
PELCO TEM רשת מחזיק בלוק טד	פלה	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 רשת,	Cu אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעים	Q2100CR1.3
ספקטרה/פור 3 RC צינורות ממברנה דיאליזה	פישר סיינטיפיק	086705B	3500 דלטון MWCO
Superose 6 הגדלת 10/300 GL	Cytiva	29091596
אורניל אצטט	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase ערכת הקרנת מאגר וחומרי ניקוי	ThermoFisher Scientific	A49856