מאמר שיטה

תרבית גליה אנטרית סוסים ויישום לחקר מנגנון דלקתי עצבי בקוליק סוסים

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67244

⸱

4 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

במאמר זה

סיכום

גליה אנטרית הופכים מוכרים יותר ויותר על תפקידם בהומאוסטזיס מעיים ובתהליכי מחלה, כולל סיבוכים לאחר הניתוח. חולי סוסים המתאוששים מלפרוטומיה גישושית חירום סובלים מסיכון גבוה למצבים דלקתיים לאחר הניתוח, מה שמדגיש את החשיבות של הקמת תרבית תאים ראשונית של גליה אנטרית סוסים חוזרת למחקר.

תקציר

מצבים דלקתיים לאחר הניתוח של קוליק סוסים (בטן חריפה) תורמים לא רק לעלות מוגברת ללקוח, אי נוחות למטופל וזמן אשפוז, אלא במקרים רבים, מתגלים כמסכני חיים. אוכלוסייה ייחודית של תאי מעי, גליה אנטרית, מוכרת יותר ויותר בזכות תפקידם בחישה של סביבת מערכת העיכול ובתקשורת עם סוגי התאים הסובבים אותה. אינטראקציות בין גליה אנטרית ואפיתל מעיים עשויות להיות קריטיות בקביעת האופן שבו גליה אנטרית של סוסים יכולה לשנות את מחסום הרירית כדי לווסת דלקת בבריאות ובקוליק.

כדי לחקור אינטראקציה זו, אנו מציגים שיטה לביסוס תרביות גליה אנטרי ראשוניות של סוסים מג'ג'ונום סוסים וחשיפת התרבויות למצבים דלקתיים הידועים כקיימים בקוליק. תרביות גליה אנטריות ראשוניות התקבלו מסוסים בוגרים שהומתו מסיבות שאינן קשורות לקוליק. וילי מעיים ולמינה פרופריה נותחו במיקרו כדי לחשוף את התת-רירית. התת-רירית המבודדת עברה עיכול אנזימטי עם קולגן, פרוטאז ואלבומין בסרום בקר במשך 2-3 שעות. לאחר מכן, עיכול מכני שכלל צנטריפוגה, פיפטינג ומסננות תאים (40-100 מיקרומטר), הניב גלולה ששימשה לציפוי על בארות מצופות פולי-L-ליזין בריכוז של ~400,000 תאים / 300 מיקרוליטר מדיה.

לאחר המפגש והמעבר הראשון, תאי הגליה האנטרית נחשפו לרקומביננטי של סוסים IL-1β (0, 10, 25 ננוגרם) במשך 24 שעות. כדי למדל אינטראקציות אפיתל-גליה בזמן קוליק, תווך המותנה על ידי בקרה או טיפול בגליה אנטרית נוסף ישירות למונושכבות ג'ג'ונל של סוסים משולבים תוך מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) באמצעות תא EndOhm בעל אלקטרודה כפולה. נתונים אלה מדגימים רק אחד מיישומים פוטנציאליים רבים בעלי השפעה של תרבית גליה אנטרית של סוסים.

מבוא

קוליק סוסים הוא התלונה הרפואית הנפוצה ביותר לייעוץ חירום1. כאשר עד 17% מהסוסים הללו זקוקים לתיקון כירורגי, המאמצים להגדיל את התוצאות לאחר הניתוח צריכים להיות בחזית המחקר הרפואי של סוסים2. כיום, חולי קוליק לאחר הניתוח חווים סיכון גבוה למספר הפרעות מסכנות חיים, כולל אלח דם/הלם אנדוטוקסמי (12.3% מהחולים) ואילאוס לאחר הניתוח (13.7% מהחולים)3. למרות התקדמות הטיפול בסיבוכים לאחר הניתוח, עדיין יש צורך בטיפולים מתקדמים למניעה או לטיפול במצבים אלה.

מחקרים אחרונים הדגישו את המצב הדלקתי המקומי והמערכתי של חולי קוליק4. לדוגמה, חלבונים מעודדי דלקת כגון גורם נמק הגידול (TNF) אלפא, אינטרלוקין 1β (IL-1β), אינטרלוקין 6 (IL-6) וחלבון כימואטרקנט-1 מונוציטים, הוכחו כולם כבעלי ביטוי מוגבר באופן משמעותי ברירית המעי לעומת רקמת מעי רגילה4. מנקודת מבט מערכתית, הוכח כי עלייה TNF אלפא ברקמת המעי מתואמת עם סיכון מוגבר של ריפלוקס nasogastric לאחר הניתוח גדול מ 2 L, מדידה כללית של dysmotility לאחר הניתוח4. זה ידוע גם כי הממשל של interleukin IL-1β ו TNF אלפא מסוגל לגרום סימנים קליניים של הלם ספיגה5.

הסבר אפשרי למצב הדלקתי של רקמת המעי הקוליק ולקשר שלו לסיבוכים לאחר הניתוח הוא מחסום האפיתל של המעי. בבריאות, מתחמי הצמתים הצפופים המקשרים בין השכבה היחידה של אפיתל העמודים המרפד את מערכת העיכול מספקים מחסום פונקציונלי המגביל את תכולת הלומינל ומרכיביו החיידקיים מלהגיע לחלל התת-רירית ולזרם הדם. עם זאת, התנפחות ונזק הנגרמים על ידי חסימת מעיים הקשורים לקוליק ומניפולציה במעיים במהלך הניתוח עלולים לשבש את תפקוד מחסום המעי הזה.

במונחים של המרכיבים הפונקציונליים של דופן המעי בכללותה, רשת הגליה האנטרית התת-רירית בתוך מערכת העצבים האנטרית הוכחה כחיונית בהתפתחות הפתופיזיולוגית של סיבוכים לאחר הניתוח הקשורים למסלולים דלקתיים ועשויה לספק יעד טיפולי ספציפי 6,7,8,9 . לא רק גליה אנטרית נוכחים בכל מערכת העיכול, אבל הם פועלים כמו חיישנים של סביבת המעי, להשפיע על איתות עם סוגים רבים של תאים של דופן המעי, ישירות לווסת את מחסום המעי6. לכן, מוצדק להניח כי חיישנים חזקים אלה של המעי יופעלו על ידי פציעה ודלקת ויכולים לייצר תגובה חריפה כגון שינויים בחדירות המחסום.

מחקר זה הוא הראשון לתאר את התרבות של גליה אנטרית סוסים, ובאופן ספציפי יותר, את התפקיד של גליה אנטרית סוסים דלקתית על תפקוד מחסום המעי. כאן, אנו מציגים שיטות של תרבית ראשונית של גליה אנטרית תת-רירית של סוסים ותגובתם לחשיפה ל- IL-1β דלקתי, הערכת ההשפעה של מוצרי גליה אנטריים לאחר חשיפה ל- IL-1β על החדירות של חד-שכבות אנטרוציט סוסים, ומצור אפשרי באמצעות יישום סרום סוסים.

פרוטוקול

תרביות ראשוניות של גליה אנטרית של סוסים התקבלו משלושה סוסים שעברו המתת חסד אנושית עם מנת יתר של ברביטוראט מסיבות שאינן קשורות למחקר זה. הסוסים שנבחרו ללימודי התרבות היו סוסים בוגרים ללא היסטוריה עדכנית של מחלות במערכת העיכול.

1. סוסים תת-ריריים תרבות ראשונית של גליה אנטרית

  1. לגדל monolayers אפיתל סוסים מ crypts jejunal המתקבלים משלושה סוסי סוסים בוגרים נפרדים.
    1. מצפים צלחות 24 בארות בתמיסת ציפוי למשך שעתיים ב-37°C או לילה בטמפרטורת החדר, שוטפים אותן 2x במים סטריליים ומאחסנים אותן בטמפרטורת החדר עד שהתאים מוכנים לציפוי.
    2. לאחר המתת חסד הומנית, תוך 60 דקות, הסירו חלק מהג'ג'ונום והניחו אותו בתמיסה קרה של רינגר על קרח.
    3. הסר חלק של 10 ס"מ מהג'ג'ונום ופתח אותו בגבול האנטיאנטרי כדי לשמור על אזורים שאינם לימפואידים במרכז הרקמה. חותכים את החלק לחתך בגודל של כ-7X7 ס"מ. יש לשטוף היטב את הרקמה בתמיסה טרייה של רינגר לפני הנתיחה.
    4. נעצו את הרקמה על צלחת פטרי מצופה אלסטומר סיליקון בתמיסת רינגר קרה או בצד הרירית PBS כלפי מעלה, ומתחו את הרקמה ככל האפשר (איור 1A).
    5. הסירו את וילי המעי בעזרת מלקחיים מעוקלים (איור 1B), ולאחר מכן את שכבת הלמינה פרופריה (lamina propria) מהאזור הלא-לימפואידי בגודל של כ-5X5 ס"מ (איור 1C).
      הערה: השכבות האלה נפרדות בקלות מהתת-רירית (איור 1B).
    6. הסירו את התת-רירית ביריעה אחת על-ידי שחרורה עם מספריים מיקרודיסקציה בפינה אחת, והתבוננו בהפרדה הטבעית תוך כדי קילוף התת-רירית הרחק משכבת השריר המעגלית הפנימית של הג'ג'ונום (איור 1D).
    7. טחנו את השכבה התת רירית שנאספה לחתיכות של 2-5 מ"מ והכניסו אותן לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של "אורגנו-FBS" (טבלה 1), 0.825 מ"ג קולגן, 5 מ"ג פרוטאז ו-20 מ"ג אלבומין בסרום בקר. לדגור על הרקמה במשך 2-3 שעות ב 37 ° C לעיכול אנזימטי.
    8. לאחר הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של טמפרטורת החדר "אורגנו + FBS" כדי לעצור את פעולת האנזים. פיפטה תערובת הרקמה למעלה ולמטה בערך 15x עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל כדי לנתק תאים מהרקמה ולאחר מכן צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה עם PBS בטמפרטורת החדר של 10 מ"ל על ידי פיפטציה מעלה ומטה שוב בערך פי 15 עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי לנתק תאים מהרקמה.
    10. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 10 מ"ל של טמפרטורת החדר "אורגנו + FBS" על ידי פיפטציה למעלה ולמטה בערך פי 15 עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי לנתק תאים מהרקמה.
    11. סנן את התאים באופן סדרתי דרך 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, ולאחר מכן מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר בגודל נקבוביות.
    12. צנטריפוגה את התאים והמדיה המסוננים ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל של "אורגנו + FBS".
    13. כתם עם כחול טריפאן כדי לזהות תאים חיים ולספור אותם עם המוציטומטר.
    14. זרעו כ-400,000 תאים ב-300 מיקרוליטר של "אורגנו + FBS" בכל באר של צלחת בת 24 בארות והוסיפו גורמי גדילה לכל באר: N2 5 μL/well, G5 5 μL/well, ו-B27 10 μL/well. הניחו את צלחת 24 הבארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי לאפשר לתאים להידבק. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, שנו את המדיה ל"גליה מדיה" (טבלה 1) עם גורמי הגדילה לעיל ושנו כל 48 שעות (איור 2).

2. ציטולוגיה אימונופלואורסצנטית

  1. לגדל את תאי הגליה האנטרית מהתרבית הראשונית (P0) (שלב 2.1.14) למפגש של 70-80% ולעבור אותם פעם אחת (P1).
  2. תקן את תאי התרבית הראשונית (P0) בבארות באמצעות 4% paraformaldehyde במשך 5 דקות לפני היישום של 0.1% PBS azide.
  3. הכינו תמיסת רוויה המורכבת מ-PBS azide, 4% נסיוב חמורים ו-0.5% Triton-X. הוסף 300 μL של תמיסת רוויה לבארות כדי לחלחל את התאים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  4. הוסף את הנוגדן העיקרי לסמן גלייה, חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), ואת הנוגדן העיקרי לסמן הפיברובלסט, אקטין שריר חלק אלפא, בדילול 1:1,000 בתמיסת רוויה לדגירת לילה ב 4 מעלותצלזיוס.
  5. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS לפני הוספת נוגדן משני לחמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594 ונגד עכבר עיזים IgG Alexa Flour 488 בדילול 1:500 בתמיסת רוויה למשך 2-3 שעות.
  6. הכתימו את הגרעינים עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בדילול של 1:1,000 ב-PBS למשך 5 דקות.
  7. לאחר שלוש שטיפות עם PBS, אחסנו את התאים ב-0.1% PBS azide.

3. סוסים תת-ריריים בתרבית ראשונית גליה אנטרית IL-1β חשיפה

  1. כאשר תאים מהמעבר הראשון (P1) מגיעים למפגש של 70-80%, בצעו את ניסוי החשיפה IL-1β. חשוף את הבארות ל- 0 ננוגרם, 10 ננוגרם ו- 25 ננוגרם של IL-1β למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, בנק ואחסן את המדיה מכל באר ב -80 ° C.

4. תרבות אורגנואידים סוסים לייצור monolayers enterocyte

הערה: בעקבות פרוטוקול Stewart et al. שפורסם בשנת 2018, קריפטות מעיים של סוסים בנקאיים וניצנים שהוקפאו הורחבו למחקרי אנטרואידים דו-ממדיים10.

  1. השתמש בכ-700-1,000 ניצנים/קטעי קריפטה (40,000-50,000 תאים כאשר הם מנותקים לתאים בודדים) לכל תוספת טרנסוול. מצפים את תוספות transwell עם 42 μL של 0.05% Matrigel לפני הוספת enterocytes. יש לקבע את המטריגל על האינסרט על ידי דגירה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לשאוף את התווך הנוסף ולאפשר לטרנסוולים להתייבש במשך 30 דקות ללא כיסוי. הוסף 200 μL של מדיום DMEM-F12 לכל תוספת transwell ואחסן את הצלחת ב 37 ° C עד לשימוש.
  2. שטפו את קציצות המטריגל המכילות את האורגנואידים עם PBS ולאחר מכן חשפו אותן ל-500 מיקרוליטר של שחזור תאים בזמן שהן על קרח. פיפטה אותם שוב ושוב כדי להבטיח אוסף מלא של תאים לתוך צינור 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C., להסיר את supernatant, ולהשעות את גלולת התא בנפח היעד של תא גזע אפיתל המעי (IESC) תווך. חישוב נפח היעד על ידי הכפלת המספר הרצוי של monolayers על ידי 200 μL של בינוני. (טבלה 1).
  4. מצפים מראש מזרק 1 מ"ל במדיה IESC ושאפו את תרחיף התא דרך מחט 16 גרם. החליפו את מחט 16 גרם במחט 28 גרם והוציאו דרכה את תרחיף התא כדי לעודד הפרדה של האורגנואידים.
  5. מקם 200 μL של תרחיף התא שנוצר לתוך הצד האפי של transwells מצופה ו 500 μL של IESC, כמו גם גורמי גדילה שתוארו קודם בצד הבסיסי של transwell להוסיף10. שנה את המדיה ואת גורמי הצמיחה כל 24-48 שעות עד שתגיע למפגש. הגדר מפגש כצפיפות התא המתאימה ל- TEER של 1,000 ohmsxcm 2,11. למדידה, ראה שלב 5.1.

5. חדירות חד-שכבתית של אנטרוציט סוסים בעקבות חשיפה לציטוקינים דלקתיים ומוצרי גליה אנטריים של סוסים

  1. השתמש בתא מדידה TEER בעל אלקטרודה כפולה כדי לכמת את ה-TEER על פני החד-שכבות וליצור קריאת בסיס על פני כל קרום חדיר לטרנסוול. ודא שלמדיה ולטרנסוול של IESC יש 15 דקות להגיע לטמפרטורת החדר לפני ביצוע המדידות. מלא את התרבית ב- 1.5 מ"ל של מדיית IESC וודא שבדיוק 200 מיקרוליטר של מדיה נמצאים בתוך תוספת הטרנסוול, כך שקווי הנוזל יתאימו בזמן המדידה.
  2. יש לחשוף את האספקט הבזולטרלי של תוספות הטרנסוול לציטוקינים דלקתיים של 25 ng IL-1β, 10 ng ו-25 ng interleukin 6 (IL-6) לכל באר, או לתוצרי גלייה של תרביות שנחשפו ל-10 ng או 25 ng IL-1β. חשוף את ההיבט הבזולטרלי של החדרת טרנסוול הבקרה למדיית גליה, ומדיה גליה מתרביות שלא נחשפו ל- IL-1β.
  3. מדדו את ה-TEER במשך 45 דקות במרווחים של 10-15 דקות על ידי הכנסת כל טרנסוול לכוס התרבית.

6. סטטיסטיקה

  1. חשב את שינוי הקיפול של TEER של כל טרנסוול עבור נקודות הזמן: 0, 10, 20, 30 ו- 45 דקות.
  2. תוך שימוש בתוכנה המועדפת (ראה טבלת חומרים), השווה את המתאמים בין ירידה ב-TEER לבין חשיפה בזולטרלית ל-IL-1β (25 ננוגרם), IL-6 (10 ננוגרם, 25 ננוגרם ו-100 ננוגרם) ומדיית גליה (חשופה ל-0 ננוגרם IL-1β, 10 ננוגרם IL-1β ו-25 ננוגרם IL-1β) כדי לשלוט במדיה באמצעות בדיקת t חד-זנבית לא מזווגת.

תוצאות

מיקרודיסקציה של סוסים ג'ג'ונום לשכבה התת-רירית (איור 1) עם עיכול אנזימטי ומכני נוסף, יכולה לייצר תרביות תאים בנות קיימא של גליה אנטרית של סוסים. התאים הדגימו פלומורפיזם עם דומיננטיות של תאים בצורת ציר התואמים את הגליה האנטרית של מינים אחרים (איור 2A). התרביות היו חיוביות עבור סמן גליה סלקטיבי, חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), עם זיהום פיברובלסטים נמוך (אלפא SMA, איור 2B). במקרים מסוימים, מיקרודיסקציה של השכבות התת-ריריות לא נשלטה במידה גבוהה מספיק, ותרביות היו מזוהמות באחוזים גבוהים של פיברובלסטים שנצפו באמצעות אימונופלואורסנציה של סמן פיברובלסט אקטין שריר חלק (איור 3).

לאחר מכן, כדוגמה לתועלת של תרבית גליה אנטרית סוסים, הוערכה ההשפעה של גליה אנטרית החשופה ל- IL-1β על תפקוד מחסום האפיתל של המעי. חשיפה בזולטרלית למדיה מתרבית גליה אנטרית תת-רירית של סוסים שנחשפה ל-10 ננוגרם ו-25 ננוגרם IL-1β במשך 24 שעות הגדילה משמעותית את החדירות (p = 0.05 ו-0.04, בהתאמה, ממוצע מדיית בקרה = 0.9, ממוצע קבוצת גליה 10 ng IL-1β = 0.8, רווח בר-סמך 95% = -0.2 עד 0.02, ממוצע קבוצת גליה 25 ng IL-1β = 0.8, רווח בר-סמך של 95% = -0.1995 עד 0.01060, n = 3-4) (איור 4A). עם זאת, חשיפה של חד-שכבות אפיתל של סוסים ל-IL-6 של סוסים בזולטרליים של 10-25 ננוגרם, ציטוקין דלקתי שהודגם גם כמיוצר על-ידי גליה אנטרית שנחשף ל-IL-1β וגם כגורם לחדירות מוגברת של אנטרוציט במודלים של מכרסמים12, לא הגדילה באופן משמעותי את החדירות החד-שכבתית של אנטרוציט סוסים (איור 4B)

figure-results-1
איור 1: בידוד של גליה אנטרית מג'ג'ונום של סוסים על-ידי מיקרודיסקציה ועיכול אנזימטי ומכני. (A) הג'ג'ונום נחתך לאורך הגבול האנטיאנטרי ונעץ את הרירית כלפי מעלה. (B) וילי המעי הודגם במיקרוסקופ והוסר עם גירוד עדין עד להדמיה של למינה פרופריה דקיקה. (C) שכבת הלמינה פרופריה הוסרה עד שסיבי השריר החלקים נראו רק דרך הרירית השקופה. (D) התת-רירית אוהלה וקולפה בחזרה מהשכבה השרירית, תוך ביצוע חתכים לתגים סיביים לפי הצורך. התמונות התקבלו במיקרוסקופ דיסקציה 10x (B,C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הדמיה של תרביות גליה אנטרית תת-רירית של סוסים. (A) המורפולוגיה של הסטלט (חיצים), פוזיפורם (ראש חץ פתוח) והגנגליונים (ראש חץ סגור) של הגליה האנטרית של הסוסים הוערכה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. (B) טוהר התרביות הוערך על ידי צביעה עבור GFAP, ועבור סמן פיברובלסט, אקטין שריר חלק מוטות סולם = 100 מ"מ (A), 400 מ"מ (B). קיצורים: GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הדמיה של תרביות גליה אנטרית תת-רירית של סוסים שלא הצליחו. טוהר התרביות הוערך על ידי צביעה עבור GFAP (אדום), ועבור סמן פיברובלסט, אקטין שריר חלק (ירוק), המדגים אחוז גדול של זיהום פיברובלסט. ראש חץ צהוב מציין GFAP ואקטין שריר חלק של ראש חץ לבן. סרגל קנה מידה = 400 מ"מ. קיצור: GFAP = חלבון גליה פיברילרי חומצי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: שכבת TEER חד-שכבתית של אפיתל סוסים בעקבות חשיפה לציטוקינים דלקתיים ולתוצרי גלייה דלקתיים. (A) חשיפה בזולטרלית למדיה מתרבית גליה אנטרית תת-רירית של סוסים, שנחשפה ל-10 ננוגרם ו-25 ננוגרם של IL-1β במשך 24 שעות, הגדילה משמעותית את החדירות (*p = 0.05 ו-0.04, בהתאמה, n = 3-4). (B) חשיפה חד-שכבתית של סוסים אנטרוציט ל-25 ננוגרם של IL-1β ו-10-25 ננוגרם של סוס IL-6 לא הגדילה באופן משמעותי את החדירות החד-שכבתית של אפיתל הסוסים (n = 2-4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ריאגנטים לבידוד ולתרבות. הריאגנטים הבאים שימשו לגיבוש מדיה לבידוד גליה אנטרית של סוסים, תרבית גליה אנטרית ותרבית תאי גזע אפיתל של מעי סוסים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה חוזרת של תרבית ראשונית של גליה אנטרית תת-רירית של סוסים ולהדגים את יישומה למודל אינטראקציות אפיתל-גליה בזמן כאבי בטן. בידוד ותרבות גליה אנטרית, שהיא חדשנית בסוס, הוכחה כמועילה בהבנת מסלולי מחלות מעיים במודלים של חזירים ומכרסמים ובבני אדם 6,7,13,14. חקר אוכלוסיית תאים זו עשוי להיות חשוב בגלל תפקידם כחיישנים תת-אפיתליאליים של סביבת המעי, כמו גם יכולתם לתקשר עם התאים הסובבים אותם בתוך דופן המעי ולתקשר איתם. עם יכולת החישה החדה שלהם, לא קשה לדמיין תפקיד קריטי פוטנציאלי של גליה בקוליק סוסים, שם רקמת המעי נלחצת על ידי התנפחות, איסכמיה, ומניפולציה כירורגית פוטנציאלית6.

עבודה קודמת של Lisowski et al. הדגימה את המצב הדלקתי המוגבר של רקמת מעיים סוסים בזמן ניתוח קוליק. החשיבות של מיתון סביבה דלקתית זו מודגשת על ידי תרביות גליה אנטרית מכרסמים שהוכחו כמסוגלות לסנתז מוצרים עם היכולת לשבש את תפקוד מחסום המעי 7,12. דליפה של תוכן לומינלי במעי לתוך דופן המעי תוביל לא רק לתגובה דלקתית אלא גם לחדירה פוטנציאלית למחזור הדם, אשר עלולה לגרום להלם אנדוטוקסמי / אלח דם. חולי קוליק סוסים לאחר הניתוח סובלים למרבה הצער מסיבוכים דלקתיים רבים לאחר הניתוח, כולל אלח דם ואילאוס לאחר הניתוח, שלא רק מפחיתים את ההישרדות ואת נוחות המטופל, אלא גם מגדילים את עלויות הלקוח ואת המצוקה הרגשית3. הקמת מודל של אינטראקציות אפיתל-גליה בזמן קוליק עשויה להבהיר מסלול אפשרי של חדירות מחסום מעיים סוסים בקוליק, ומניעה אפשרית.

התרבות של גליה אנטרית תת-רירית של סוסים כרוכה בהתאמות ומגבלות בשל מאפייני המין. והכי חשוב, משך הזמן הדרוש לעיכול אנזימטי יעיל דרש טיטרציה. החוקרים מצאו כי דגירה עם האנזימים במשך 2-3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס הייתה הכרחית לבידוד מוצלח של גליה אנטרית של סוסים. בנוסף, נראה כי מתן אפשרות לתרביות אנטריות של סוסים להגיע למפגש של יותר מ-80% לפני המעבר מזיק לכדאיות התרבות. המגבלה העיקרית של שיטה זו במועד זה היא גודל המדגם. מחקר זה כלל רק רקמות/תאים שהתקבלו מסוסים שעברו ניתוח קוליק או המתת חסד מסיבות שאינן קשורות למחקר. המשך תרבית של גליה אנטרית סוסים מנבדקים נוספים, כמו גם פיתוח פרוטוקול להקפאה ואחסון של גליה אנטרית סוסים יגדיל מאוד את כוחו של מחקר זה.

מחקר זה מציג את התועלת החדשה של תרבית גליה אנטרית תת-רירית של סוסים ותרבות ראשונית של אנטרוציטים של סוסים כמתודולוגיות פוטנציאליות המסייעות בהבנת קוליק סוסים ומחלות במערכת העיכול. בנוסף, בעוד שחד-שכבות אפיתל של סוסים שגדלו מקריפטות מעי מבודדות ואורגנואידים התבססו היטב בעבר, מחקר זה לא רק המשיך להציג את התועלת שלהם כמודל, אלא גם עודד מחקרים נוספים הבוחנים את האינטראקציה עם אנטרוציט המעי של הסוסים וסוגי תאים אחרים הנמצאים בתוך דופן המעי.

אינטראקציות שנצפו בין סוגי תאים אלה מכילות יישומים פוטנציאליים הן לכאבי בטן והן להפרעות דלקתיות אחרות במערכת העיכול, כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וקוליטיס. בנוסף, המשך שכלול שיטות התרבית עבור גליה אנטרית ואנטרוציטים יאפשר הקמת מחקרי קוקולטורה בעתיד. יתר על כן, בעוד המחקר הנוכחי מתמקד באוכלוסיית הגליה האנטרית התת-רירית בשל קרבתה לחד-שכבה האפיתל וההתמקדות בתפקוד מחסום המעי, ניתן לבצע עבודה נוספת לתרבית ולהעריך את תפקוד הגליה האנטרית של הסוסים מהפלקסי המיאנטרי של דופן המעי, מה שעשוי לסייע בקביעת ההשפעה של גליה אנטרית דלקתית של סוסים על תנועתיות15.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לקרן מוריס לבעלי חיים על המימון לפרויקט זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ' מאגר HEPESGibco15630-080
10 מ"מ HEPESLife Technologies15630-106
2 מ"מ GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Diaminidino-2-PhenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
נוגדן אקטין שריר חלקאלפא Abcam7817
Amphotericin BSigmaAA95294.4 גרם/מ"ל מניות, ריכוז סופי 1.1 ומיקרו; גרם/מ"ל
אנטי אנטי-מיקרוקוטי 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
בקר סרום אלבומיןסיגמאAA3311
BSA 50 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאיסיגמאA3311
CaCL2ACROS אורגניים206791000רכיב של צלצול סוסים ' s מלאי 1: שלב עם מרכיבים אחרים, ואז הוסף 100 מ"ל מהציר הזה לגליל מדורג ודלל ל -1 ליטר במים נטולי יונים. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5% CO2.
שלבו עם צלצול סוסים' s מלאי 2 כדי להשלים " צלצול" s פתרון".
קולגנאזסיגמא9891
DMEM-F12 מדיהתרמו פישר11320033
חמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm תא מדידת אלקטרודה כפולה תא מדידת TEERWorld Precision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM מדריך למדידת TEERמכשירי דיוק עולמייםEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
תמיסת GentamicinSigmaG1272ריכוז סופי 20 ומיקרו; g/mL
נוגדן GFAPAbcam4674
עיזים נגד עכבר IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500רכיב של Equine Ringer' s מלאי 1: שלב עם מרכיבים אחרים, ואז הוסף 100 מ"ל מהציר הזה לגליל מדורג ודלל ל -1 ליטר במים נטולי יונים. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5% CO2.
שלבו עם צלצול סוסים' s מלאי 2 כדי להשלים " צלצול" s פתרון".
תמיסת L-גלוטמיןCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500רכיב של Equine Ringer' s מלאי 1: שלב עם מרכיבים אחרים, ואז הוסף 100 מ"ל מהציר הזה לגליל מדורג ודלל ל -1 ליטר במים נטולי יונים. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5% CO2.
שלבו עם צלצול סוסים' s מלאי 2 כדי להשלים " צלצול" s פתרון".
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1רכיב של צלצול סוסים' s מלאי 2: שלב עם מרכיבים אחרים, ואז הוסף 100 מ"ל מהציר הזה לגליל מדורג ודלל ל -1 ליטר במים נטולי יונים. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5% CO2.
שלבו עם צלצול סוסים' s מלאי 1 כדי להשלים " צלצול" s פתרון".
NaClThermo FisherS271-10רכיב של Equine Ringer' s מלאי 1: שלב עם מרכיבים אחרים, ואז הוסף 100 מ"ל מהציר הזה לגליל מדורג ודלל ל -1 ליטר במים נטולי יונים. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5% CO2.
שלבו עם צלצול סוסים' s מלאי 2 כדי להשלים " צלצול" s פתרון".
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500רכיב של Equine Ringer' s מלאי 2: שלב עם מרכיבים אחרים, ואז הוסף 100 מ"ל מהציר הזה לגליל מדורג ודלל ל -1 ליטר במים נטולי יונים. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5% CO2.
שלבו עם צלצול סוסים' s מלאי 1 כדי להשלים " צלצול" s פתרון".
NaHCO3Thermo FisherS637-212רכיב של Equine Ringer' s מלאי 2: שלב עם מרכיבים אחרים, ואז הוסף 100 מ"ל מהציר הזה לגליל מדורג ודלל ל -1 ליטר במים נטולי יונים. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם 5% CO2.
שלבו עם צלצול סוסים' s מלאי 1 כדי להשלים " צלצול" s פתרון".
תמיסת עט/סטרפטוקוקוסג'מיני400-109
פולי-L-ליזיןסיגמאP26360.5 מ"ג/מ"ל במאגר בוראט 1x
תוכנת פריזמהGraphPad
פרוטאזסיגמאP4630
תמיסת נתרן ביקרבונטסיגמאS87617.5% תמיסת מלאי

מקורות

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

1Ein
תרבית גליה אנטרית סוסים ויישום לחקר מנגנון דלקתי עצבי בקוליק סוסים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.