מאמר שיטה

תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותלים ומערכת החיסון שמקורה ב-iPSC כדי להדגים את שלמות מחסום דרכי הנשימה בבריאות ומחלות ריאות

DOI:

10.3791/67247

⸱

6 בדצמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 2Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את היצירה של מודל מחסום דרכי נשימה מורכב ורב-תאי המורכב מאפיתל ריאות שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC), מזנכימה, תאי אנדותל ומקרופאגים בתרבית ממשק אוויר-נוזל.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת הריאה האנושית מורכבת מרשת מחוברת של אפיתל, מזנכימה, אנדותל ותאי חיסון מדרכי הנשימה העליונות של הלוע האף ועד לשק המכתשית הקטן ביותר. אינטראקציות בין תאים אלה חיוניות להתפתחות ריאות ומחלות, ופועלות כמחסום מפני כימיקלים מזיקים ופתוגנים מודלים נוכחיים של תרבית משותפת במבחנה משתמשים בקווי תאים אימורטליים עם רקע ביולוגי שונה, שאולי אינם מייצגים במדויק את הסביבה התאית או את האינטראקציות של הריאה. הבחנו iPSCs אנושיים לאורגנואידים תלת-ממדיים של הריאות (המכילים גם אפיתל וגם מזנכימה), תאי אנדותל ומקרופאגים. אלה עברו תרבית משותפת בפורמט ממשק אוויר-נוזל (ALI) ליצירת מחסום אפיקלי אפיתלי/מזנכימלי שהושקע במקרופאגים ומחסום אנדותל בסיסי (iAirway). iAirways שמקורו ב-iPSC הראה ירידה בשלמות המחסום בתגובה לזיהום בנגיפי נשימה ורעלני סיגריות. מערכת תרבית ריאות רב-שושלת זו מספקת פלטפורמה לחקר אינטראקציות תאיות, מסלולי איתות ומנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס התפתחות הריאות, הומאוסטזיס והתקדמות מחלות. iAirways מחקה באופן הדוק את הפיזיולוגיה האנושית ואת האינטראקציות התאיות, יכול להיווצר מ-iPSC שמקורו במטופל, וניתן להתאים אותו כך שיכלול סוגי תאים שונים של דרכי הנשימה. בסך הכל, מודלים של iAirway שמקורם ב-iPSC מציעים כלי רב-תכליתי ורב-עוצמה לחקר שלמות המחסום כדי להבין טוב יותר את המניעים הגנטיים למחלות, תגובת פתוגנים, ויסות חיסוני וגילוי תרופות או ייעוד מחדש במבחנה, עם פוטנציאל לקדם את ההבנה והטיפול שלנו במחלות דרכי הנשימה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחסום הדם-אוויר בדרכי הנשימה הגדולות כולל את קנה הנשימה, הסמפונות והסימפונות. הוא ממלא תפקיד מכריע בשמירה על בריאות דרכי הנשימה ומורכב מאפיתל דרכי הנשימה, קרום הבסיס, כלי הדם ותאי האנדותל ותאי החיסון. תאי האפיתל העיקריים בדרכי הנשימה כוללים תאי בסיס, תאי מועדון, תאים ריסניים ותאי גביע. תאי בסיס, הפועלים כתאי גזע של אפיתל דרכי הנשימה, הם אבות מולטיפוטנטיים עם יכולות שגשוג וחידוש עצמי גבוהות, מה שמוליד תאי אפיתל בוגרים של דרכי הנשימה1. תאי מועדון הם תאים מפרישים שאינם ריסניים התורמים לתחזוקת רירית דרכי הנשימה על ידי הפרשת חלבונים מגנים ופעילי שטח2. תאי גביע, הממוקמים בלומן ובבלוטות התת-ריריות, מפרישים מוצינים כדי ללכוד פסולת ולהגן על דרכי הנשימה3. תאים ריסניים הם חלק בלתי נפרד ממנגנון הדרגנוע הרירי, ומונעים הצטברות של מיקרואורגניזמים מזיקים4. קרום המרתף מורכב ממטריצה חוץ-תאית, המספקת תמיכה מבנית5. קנה הנשימה ושאר דרכי הנשימה מוקפים ברשת עשירה של כלי דם, המרופדים בתאי אנדותל הממלאים תפקיד חיוני בתמיכה בתפקוד קנה הנשימה על ידי אספקת חומרים מזינים וחמצן, הסרת פסולת, ויסות דלקת ותרומה לתיקון רקמות ואנגיוגנזה6. לבסוף, מקרופאגים בדרכי הנשימה הם תאים חיסוניים ספציפיים לרקמה, החיוניים להגנה על מערכת הנשימה מפני זיהומים, פינוי חלקיקים נשאפים ושמירה על תגובה חיסונית מאוזנת7.

הפעולות המתואמות של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותל ותאי מקרופאגים הן קריטיות לתגובה חיסונית יעילה לפתוגנים בדרכי הנשימה8. תאי אפיתל מהווים את קו ההגנה הראשון מפני זיהומים נגיפיים בכך שהם פועלים כמחסום פיזי, עם צמתים הדוקים המגבילים את מעבר החומרים המזיקים. הפעולה המתואמת של תאים ריסניים ותאי גביע עוזרת ללכוד ולהסיר חלקיקים נשאפים, פתוגנים ופסולת4. בנוסף, תאי אפיתל של דרכי הנשימה מייצרים ציטוקינים וכימוקינים כדי לגייס תאי חיסון9. תאי אנדותל שומרים על שלמות כלי הדם, מונעים התפשטות של חלקיקים נגיפיים בזרם הדם, מווסתים מולקולות הידבקות (VCAM-1) כדי להקל על הידבקות תאי החיסון ולייצר ציטוקינים פרו-דלקתיים כדי לגייס תאי חיסון מזרם הדם לאתר הזיהום10. מקרופאגים בדרכי הנשימה בולעים ומעכלים חלקיקים נגיפיים, תאים נגועים ופסולת, מציגים אנטיגנים נגיפיים לתאי T ומייצרים ציטוקינים כדי להפעיל ולגייס תאים חיסוניים אחרים, יחד עם אינטרפרונים מסוג I כדי לעכב שכפול ויראלי11. הפעולות המתואמות של תאי אפיתל, מזנכימלי, אנדותל ומקרופאגים יוצרות מערכת הגנה חזקה ודינמית המגנה על דרכי הנשימה מפני זיהומים נגיפיים ושומרת על בריאות הנשימה.

הבנת האינטראקציות הדינמיות בין סוגי תאים שונים בריאה האנושית חיונית להבנת תגובת הריאה לזיהומים ויראליים, מחלות דלקתיות ומתן תרופות. תרביות משותפות במבחנה מאפשרות לחקור איתות תא-תא בין האפיתל, תאי האנדותל ותאי החיסון המולדים12. פיתחנו את מודל הריאות האותנטי הראשון מסוג רב-תאים שנגזר מ-hiPSCs13 ספציפיים למטופל. זה משלב אוכלוסיות תאים אפיתל ומזנכימליות, שנוצרו באוריינטציה תלת מימדית. לאחר מכן, ניתן להתמיין את תאי האב של הריאות ל"אורגנואיד של דרכי הנשימה"14, לתרבית על תוספות תרבית תאים סטריליות, ולחשוף אותם לממשק אוויר-נוזל (ALI), ולשכפל את התנאים של דרכי הנשימה האנושיות 15,16,17. תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC מתורבתים בצד הבסיסי של הממברנה, ומחקים את הכיוון שלהם בדרכי הנשימה האנושיות, הממוקם מתחת לשכבת האפיתל/מזנכימלית בקרום הבסיס. לבסוף, מקרופאגים שמקורם ב-iPSC מתווספים לצד האפיקלי של הממברנה, מקיימים אינטראקציה עם תאי אפיתל וממתינים לאותות הפעלה (איור 1A). מודל זה משחזר במדויק את הביולוגיה והתפקוד של דרכי הנשימה. אנו מניחים כי תרביות iWayway מסוג מרובה תאים אותנטיות שמקורן ב-hiPSC, ספציפיות למטופל, מתאימות ביותר להבהיר את התגובה הפנימית והחריפה של מחסום דרכי הנשימה ופתוגנים, כולל זיהומים ויראליים. לדוגמה, ניתן להשתמש במודל זה כדי (1) לחקור כניסה ושכפול של נגיף, (2) לחקור את התגובה החיסונית הראשונית על ידי תאי חיסון ספציפיים לאפיתל ולרקמות, (3) לבחון את שלמות המחסום ותפקודו, (4) לבדוק את יעילותם של חומרים טיפוליים, ו-(5) לחקור מנגנונים תאיים ומולקולריים של פתוגנזה במודל ספציפי לחולה.

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להכנת תרביות ריאה רב-תאיות לחקר תגובות תאיות לזיהומים ויראליים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של תוכנית הגנת המחקר האנושי של UCSD (181180). פרוטוקול זה משתמש במולקולות קטנות ובגורמי גדילה כדי לכוון את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאי דרכי הנשימה, תאי אנדותל ומקרופאגים. תאים אלה עוברים תרבית משותפת על תוספות תרבית תאים ומקוטבים בממשק אוויר-נוזל. פרטי הריאגנטים, החומרים המתכלים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים. קומפוזיציות המדיה והמאגר מופיעות בקובץ משלים 1.

1. יצירת אורגנואידים בדרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC (יום 1 - 30)

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים ליצירת אורגנואידים בדרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC (איור 1B), בהתאם למתודולוגיה המתוארת ב-Leibel et al.13. התהליך כולל אינדוקציה של אנדודרם סופי (ימים 1-3), יצירת אנדודרם קדמי של המעי הקדמי (ימים 4-6), והתמיינות לאבות ריאה (ימים 7-16). מתודולוגיה מפורטת ניתן למצוא בפרסום הקודם13. השלבים הבאים מפרטים את יצירת האורגנואידים של דרכי הנשימה מאבות הריאות.

  1. מיצוי ופירוק ספרואידים של אבות ריאות מפולימר ECM (יום 17)
    1. להפשיר פולימר מטריצה חוץ-תאית (ECM) (8-9 מ"ג/מ"ל) על קרח.
    2. שאיבה משומשת מדיה, באמצעות שואב ואקום, מאורגנואידים ריאתיים המוטבעים ב-ECM.
      הערה: לשלבי השאיפה הבאים, השתמש בשואב ואקום אלא אם כן צוין אחרת.
    3. הוסף לתאים 1 מ"ל של 2 U/mL dispase בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב ROCK1 (ROCKi) והשתמש בפיפטה P1000 כדי להשעות ידנית את אבות הריאות ב-ECM. יש לדגור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולהשעות מחדש את התערובת כל 15 דקות כדי לשפר את יעילות הדיסוציאציה באמצעות עיבוד מכני.
    4. 15 דקות לפני השימוש, הכניסו 45 מ"ל PBS בטמפרטורת החדר למקפיא של -20 מעלות צלזיוס לצינון. ודא ש-PBS קר יותר מ-4 מעלות צלזיוס לדה-פולימריזציה אופטימלית של ECM בשלבים הבאים.
    5. לאחר 30 דקות של דגירה דיספאז, העבירו את תמיסת האורגנואיד והדיספאז לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    6. הוסף PBS צונן (2 מ"ל לכל 1 מ"ל פרוטאז) כדי לשטוף ולאסוף שאריות אורגנואיד וחומר ECM מהצלחת. השעו מחדש אורגנואידים באמצעות פיפטה P1000 וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות.
      הערה: כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת בפרוטוקול זה.
    7. לאחר צנטריפוגה, כדור ECM מעונן עם אורגנואידים אמור להיות גלוי לעין. שאפו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, הימנעו מכדור ה-ECM.
    8. בצע שטיפת PBS שנייה עם PBS צונן, השהה מחדש באמצעות פיפטה P1000 וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, והשאירו ~100 מיקרוליטר של תמיסה שיורית.
    9. הוסף 2 מ"ל של פרוטאז דמוי טריפסין לאורגנואידים בצינור החרוטי של 15 מ"ל. השעיה באמצעות פיפטה P1000. יש לדגור למשך 10-12 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך היפוך או תנועה של הצינור כדי להשהות מחדש את התערובת באמצע הדגירה.
      הערה: בצע 10-12 דקות של דיסוציאציה של פרוטאז דמוי טריפסין כדי להעביר אורגנואידים כאגרגטים.
    10. לאחר 12 דקות, עצרו את תגובת הפרוטאז דמוית הטריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של 2% FBS במדיה הבסיסית (Stop Media, ראו קובץ משלים 1). השעו מחדש את התמיסה בעזרת פיפטה P1000 וצנטריפוגה בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות.
    11. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את האורגנואידים ב-Stop Media בתוספת 10 מיקרומטר של ROCKi. קח דגימה של 10 מיקרוליטר לספירת תאים באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול. שמור אורגנואידים על קרח במהלך הספירה.
    12. חשב את הנפח הדרוש להשגת 100,000 תאים לבאר. תא Aliquot מצטבר לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם. הסר עודף סופרנטנט והשאיר 10 מיקרוליטר של שאריות מדיה.
    13. השעו מחדש את גלולת התא ב-200 מיקרוליטר של פולימר ECM קר (הימנעו מבועות ועבדו במהירות כדי למנוע פילמור מוקדם). מוסיפים 200 מיקרוליטר מתערובת ה- ECM והתאים לתחתית כל באר בצלחת של 12 בארות. אפשר ל-ECM להתפלמר חלקית בטמפרטורת החדר בארון הבטיחות הביולוגית למשך 5 דקות.
    14. העבירו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות להשלמת פילמור ECM. לאחר מכן, הוסף 1.5 מ"ל של מדיום אינדוקציה אורגנואיד בדרכי הנשימה (קובץ משלים 1).
    15. שנה את המדיום כל יומיים למשך 14 יום עד היום ה-30. אם המדיום הופך לצהוב תוך 24 שעות, הגדל את הנפח ל -2 מ"ל.

2. יצירת תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC (יום 1 - 14)

הערה: ההליך הבא מפרט את היווצרות תאי האנדותל מ-iPSCs (איור 1C), המבוסס על Patsch et al.18. שיטה זו כוללת הכנת צלחות, התמיינות של iPSCs, השראת תאי אנדותל, מיון והרחבה. טבלה 1 מפרטת את הנוגדנים ששימשו במחקר זה.

  1. ציפוי iPSCs עבור התמיינות אנדותל (יום 0)
    1. התחל את התמיינות תאי האנדותל כאשר hiPSCs מגיעים למפגש של 70%-80%. הוסף 10 מיקרומטר של ROCKi Y-27632 לכל באר שעה לפני הדיסוציאציה.
    2. שאפו את המדיה, שטפו בארות עם 1 מ"ל PBS ואז נתקו את iPSCs על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לכל באר של צלחת של 12 בארות. יש לדגור למשך 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    3. נטרול תמיסת ניתוק תאים על ידי הוספת 2 מ"ל של Stop Media לבארות. פיפטה לקבלת מתלה חד-תא. העבירו תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם.
    4. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש iPSCs בתרבית iPSC בתוספת 10 מיקרומטר של ROCKi, ובצעו ספירת תאים. צלחת 100,000 hiPSCs לבאר של צלחת 12 בארות מצופה ECM ב-1 מ"ל של מצע תרבית iPSC עם 10 מיקרומטר של ROCKi. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: צפיפות הזריעה עבור התמיינות iPSC-אנדותל עשויה להזדקק לאופטימיזציה לכל קו תאים. העריכו את יעילות ההתמיינות באמצעות זרימה ציטומטרית עבור CD31 ביום 6.
  2. אינדוקציה לזודרם לרוחב (ימים 1-3)
    1. שאפו מדיית תרבית iPSC מ-iPSCs מצופים והוסיפו 3 מ"ל של מדיית בסיס N2B27 בתוספת 6 מיקרומטר של CHIR ו-25 ננוגרם/מ"ל BMP4 לבאר (קובץ משלים 1). מחממים את המדיה לפני הוספתה לתאים. אל תחליף את המדיה במשך 3 ימים.
  3. השראת תאי אנדותל (ימים 4-5)
    1. ביום הרביעי, שאפו את המדיה N2B27 והוסיפו 2 מ"ל של אמצעי התמיינות אנדותל (EDM) בתוספת 200 ננוגרם/מ"ל VEGF165 ו-2 מיקרומטר של פורסקולין לבאר. החליפו את המדיה ביום החמישי.
  4. מיון וציפוי מחדש של תאי אנדותל (יום 6)
    1. ביום 5 או 6, הכינו בקבוק T75 מצופה פיברונקטין להעשרת מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) על ידי בנייה מחדש של 1 מ"ג פיברונקטין במים סטריליים ליצירת 100 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת פיברונקטין. מצפים את בקבוק T75 ב -6 מ"ל מתמיסת הפיברונקטין ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. שאפו את תמיסת הפיברונקטין ושטפו במים סטריליים. תן לבקבוק T75 להתייבש בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן צלוחיות נוספות המיוצרות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הכן אמצעי תחזוקה אנדותל (EMM)18.
    3. ביום השישי, העשירו תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC באמצעות FACS באמצעות נוגדן CD3118.
    4. הוסף 10 מיקרומטר של ROCKi Y-27632 לכל באר שעה לפני הדיסוציאציה ב-37 מעלות צלזיוס. שואבים את המדיום ושוטפים עם PBS. הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים מחוממת מראש לכל באר של צלחת של 12 בארות ודגירה למשך 8-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    5. פיפטה בעדינות כדי להבטיח ניתוק של תא בודד. העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל והוסיפו נפח שווה של Stop Media. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
    6. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את תאי האנדותל ב-1 מ"ל Stop Media בתוספת 10 מיקרומטר של ROCKi.  העבירו תאים דרך מסנן 70 מיקרומטר על ידי הוספת 1 מ"ל של אמצעי עצירה כדי להרטיב את המסנן, ולאחר מכן פיפטה את התאים דרך המסנן. קח דגימה של 10 מיקרוליטר לספירת תאים באמצעות המוציטומטר וטריפן כחול. שמור על תאים על קרח במהלך הספירה.
    7. ביצוע ספירת תאים. הכן מינוי של 200,000 תאים כבקרה שלילית לא מוכתמת. העבירו את התאים הנותרים לתוך צינור אפנדורף של 1.5 מ"ל והוסיפו 10 מיקרוליטר של CD31-APC לכל מיליון תאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS. דגירה למשך 30 דקות על מסובב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    8. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה את צינור אפנדורף עם תאים למשך 5 דקות ב-300 x גרם, שטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל PBS. חזור על שלב הכביסה והצנטריפוגה פעמיים. הסר ידנית את הנוזל בין כביסות.
    9. השעו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מאגר FACS ותמיסת DAPI של 5 ug/mL לצביעה כדאיות, 5 דקות לפני המיון. מיון לפי הנחיות מוסדיות.
    10. אסוף תאים ממוינים ב-FACS בצינור חרוטי של 15 מ"ל עם 2 מ"ל של EMM. צנטריפוגה הצינור החרוטי של 15 מ"ל עם תאים למשך 5 דקות ב-300 x גרם. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את תאי האנדותל ב-10 מ"ל של EMM בתוספת 10 מיקרומטר של ROCKi Y-27632 ופניצילין סטרפטומיצין (1%).
    11. העבר את תאי האנדותל שמקורם ב-iPSC המועשרים ב-FACS לבקבוק המצופה פיברונקטין. מחלקים תאים באופן שווה ומניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: השתמש במינימום של 500,000 תאים ובמקסימום של 2,000,000 תאים לכל בקבוק T75.
  5. הרחבה ושימור בהקפאה של תאי אנדותל ממוינים (יום 7+)
    1. החלף את מדיית ה-EMM כל 2-3 ימים לאחר העשרת ה-FAKS. ברגע שבקבוק T75 הופך למתכנס (כ-7 ימים לאחר FACS, תלוי בצפיפות הזריעה), ניתן להשתמש בתאי האנדותל שמקורם ב-iPSC לתרבית משותפת או לשימור בהקפאה ליישומים עתידיים.
    2. הכן תמיסת הקפאת אנדותל פי 2 לפני דיסוציאציה של תאים (80% Endo-CM2, 20% DMSO, 20 מיקרומטר של ROCKi).
    3. סמן צינורות קריוביאליים בעט חסין אתנול עם המידע המתאים. מזהה קו, מספר מעבר, אמצעי תרבות, 'הפשרה לבאר 6', תאריך הקפאה.
    4. כאשר תאי האנדותל הממוינים שמקורם ב-iPSC מתלכדים, התחל דיסוציאציה.
    5. שטפו את בקבוק T75 עם 5 מ"ל PBS -/-.
    6. נתק תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC עם 5 מ"ל של פרוטאז דמוי טריפסין לכל T75. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, בדקו את ה-T75 מעת לעת כדי לוודא שהתאים התרוממו.
    7. נטרל את התגובה על ידי הוספת 5 מ"ל של Stop Media. העבירו 10 מ"ל תאים בתמיסה לצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
    8. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש תאי אנדותל במדיה E-CBM, והוציאו דגימה של 10 מיקרוליטר לספירה באמצעות המציטומטר.
    9. לאחר ספירת תאים, יש למנות מיליון תאים לכל 0.5 מ"ל של מדיה EGM2.
      הערה: השלב הבא הוא תלוי זמן. הכן קריוביאלים וכלי הקפאה לשימוש מיידי.
    10. Aliquot נפח שווה של תמיסת הקפאה פי 2 לתאי אנדותל. הריכוז הסופי הוא 90% Endo-CM2, 10% DMO ו-10 מיקרומטר של ROCKi (1 מ"ל/1 מיליון תאים).
    11. העבירו את הבקבוקונים המכוסים מיד לתא הקפאה והניחו ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ואז לחנקן נוזלי (-180 מעלות צלזיוס) למחרת לאחסון לטווח ארוך.

3. יצירת מקרופאגים שמקורם ב-iPSC (יום 1 - 26)

הערה: הליך זה מתאר את השלבים ליצירת מקרופאגים מ-iPSCs (איור 1D), המותאם מ-van Wilgenburg et al.19 ו-Pouyanfard et al.20. הוא מכסה הסתגלות של תא בודד של iPSCs, התמיינות גוף עוברי, היווצרות אב מקרופאגים והתבגרות מקרופאגים.

  1. הסתגלות תא בודד של iPSCs
    1. כאשר iPSCs מגיעים למפגש של ~70%-90% ללא סימני התמיינות נראים לעין, התחילו במעבר של תא בודד עם פרוטאז דמוי טריפסין.
    2. שאפו מדיה משומשת ושטפו עם PBS. הסר PBS והוסף פרוטאז דמוי טריפסין (1 מ"ל / באר של צלחת של 6 בארות, 500 מיקרוליטר / באר של צלחת של 12 בארות). יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות עד שמושבות iPSC מתנתקות מהצלחת.
    3. לנטרל פרוטאז דמוי טריפסין עם נפח שווה של Stop Media (1 מ"ל/באר של צלחת של 6 בארות, 500 מיקרוליטר/באר של צלחת של 12 בארות). צנטריפוגה של התאים ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    4. שאפו את הסופרנטנט והשעו בעדינות תאים במצע תרבית iPSC עם 10 מיקרומטר של ROCKi. מעבר ללוחות מצופים ECM חדשים. חזור על הפעולה במשך 2-3 קטעים לפני שימור בהקפאה או שימוש ב-iPSCs המותאמים לתא יחיד.
      הערה: התאם את יחס המעבר מ-1:2 ל-1:10 בהתבסס על בריאות התא והסתגלותו. בנוסף, iPSCs שעברו לפחות שלושה מעברים של תא בודד ונמצאים במעבר נמוך מניבים התמיינות מקרופאגים אופטימלית.
  2. היווצרות גוף עוברי (ימים 0-6)
    1. כאשר iPSCs מותאמים לתא בודד מגיעים למפגש של ~75%, עוברים iPSCs עם פרוטאז דמוי טריפסין לפי שלבים 3.1-3.4.
    2. השעו מחדש תאים ב-Stop Media והעבירו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל כדי להסיר גושים. השעו מחדש תאים וקחו דגימה של 10 מיקרוליטר לספירת תאים באמצעות המציטומטר.
    3. ליצירת גוף עוברי (EB), 8,000-50,000 תאים מצופים לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד (ULA) של 96 בארות. חשב את המספר הכולל של התאים הדרושים לזריעה של 60 בארות של צלחת ULA של 96 בארות.
      הערה: צפיפות הזריעה של iPSCs עשויה לדרוש אופטימיזציה לכל שורת תאים.
    4. צנטריפוגות iPSCs ב-15 מ"ל חרוטי ב-200 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט.
    5. עבור 480,000 iPSCs (8,000 תאים/באר ב-60 בארות), יש להשעות ב-6 מ"ל (100 ul/well ב-60 בארות) במדיית אינדוקציה EB.
    6. הוסף 150 מיקרוליטר של PBS ל-36 הבארות החיצוניות של צלחת ULA עם 96 בארות עם תחתית עגולה.
    7. השעיה והעברה של קובצי iPSC במדיית EB לשוקת מדיה. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר/באר של תרחיף תאים לתוך 60 הבארות המרכזיות של צלחת ULA בת 96 הבארות. השהה מחדש iPSCs במדיית EB לסירוגין כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
    8. צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (אם זמין). מעבירים את הצלחות לחממה של 37 מעלות צלזיוס.
    9. לאחר 48-72 שעות, החלף 50 מיקרוליטר של המדיה (חצי החלפת מדיה). בדוק אם יש היווצרות ציסטה לאחר 6 ימים.
      הערה: קווי iPSC מסוימים יוצרים EBs מוקדם יותר או בקלות רבה יותר מאחרים. עקוב אחר היווצרות EB וודא ש-EBs מועברים בנקודת הזמן המתאימה (הם אמורים לפתח ציסטות).
  3. ציפוי ג'לטין והעברת EB ליצירת אבות מקרופאגים (ימים 6-19)
    1. הכינו שתי צלחות 6 בארות מצופות ג'לטין 0.1%. מוסיפים 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין לבאר ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שאפו את תמיסת הג'לטין והניחו לצלחות להתייבש במכסה המנוע למשך 30-60 דקות.
    2. מעבירים EBs מלוח 96 הבארות לצלחות 6 הבארות המצופות בג'לטין באמצעות פיפטה סרולוגית של 2 מ"ל. מחלקים כ 8-10 EBs לבאר של צלחת מצופה ג'לטין עם 6 בארות.
    3. הסר בזהירות את שאריות מדיית ה-EB ששימשו מההעברה. הוסף 2 מ"ל של מדיית תרבית מקרופאגים 1 (Mac-CM1) לבאר. דגירה ללא הפרעה של EB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 5-7 ימים.
      הערה: באופן אידיאלי, ניתן לפצל צלחת אחת של 96 בארות של גופים עובריים לשתי צלחות של 6 בארות. אם ה-EBs מפותחים בצורה גרועה, ניתן להתאים את מספר ה-EBs המועברים לכל צלחת של 6 בארות כדי לייעל את שלב ההתמיינות של iPSC לגוף עוברי.
  4. יצירת אב מקרופאגים
    1. החלף 2/3 מהמדיה פעמיים בשבוע, והגדל את עוצמת הקול ל-3 מ"ל אם צבע המדיה משתנה.
    2. בדוק תרביות בין הימים 8-19 כדי לקבוע אם הן מוכנות לקצירת אבות מקרופאגים. אם EBs מתנתקים, העבירו את ה-EBs לצלחת מצופה טרייה עם Mac-CM1 ודגרו ללא הפרעה למשך 7 ימים.
      הערה: התחזוקה של קומפלקס יצירת אבות המקרופאגים חיונית להתפתחות ויצירה רציפה של אבות מקרופאגים. קומפלקסים אופטימליים ליצירת אבות מקרופאגים ייצרו ללא הרף אבות מיאלואידים למשך 2-6+ חודשים.
  5. קצירת אבות מיאלואידים (יום 19-26+)
    1. כאשר יש תאי אב מקרופאגים בתרחיף, קצרו את המדיה עם תאים והעבירו לצינור חרוטי של 50 מ"ל. צנטריפוגה בחום של 200 x גרם למשך 5 דקות והסר בזהירות את הסופרנטנט.
    2. השעו מחדש את אבות המקרופאגים ב-Mac-CM2 והעבירו לצלחת/בקבוק תרבית סטרילית לא מטופלת. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 3-4 ימים.
      הערה: בהתאם למספר התאים שנקטפו, העבירו לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ (3-4 בארות של צלחת 6 בארות), בקבוק T25 (1-2 בארות של צלחת 6 בארות), או בקבוק T75 (צלחת מלאה של 6 בארות) עם נפח המדיה המתאים. השתמש ב-5-6 מ"ל של מדיה עבור בקבוק T25, 10-12 מ"ל של מדיה בצלחת פטרי ו-12-15 מ"ל של מדיה עבור בקבוק T75. עבור הקציר הבא, ניתן לאסוף אבות מיאלואידים ותאי מקרופאגים מקצירים קודמים אם הם מאותו קו/קומפלקסים היוצרים מיאלואידים. רק ודא שהבקבוק מספיק כדי לשמור ולהזין את מספר התאים בבקבוק/ים. מקרופאגים אינם מתרבים; הם נוצרים מאבות מקרופאגים. ניתן לאגד ולשמור על מקרופאגים במשך 2-6 שבועות מבלי לאבד סמני ביטוי.
  6. קצירת מקרופאגים
    הערה: לאחר 14 יום של התמיינות מקרופאגים במדיה Mac-CM2, תרביות מקרופאגים מוכנות לתרבית משותפת או לניתוח ציטומטריית זרימה.
    1. אסוף מדיה משומשת והעביר לצינור חרוטי של 50 מ"ל. שטפו את הבקבוק/צלחת עם PBS כדי להסיר שאריות מדיה ותאים.
    2. הוסף מדיית בסיס לבקבוק (3 מ"ל עבור T25 ו-5 מ"ל עבור T75) והשתמש במגרד תאים סטרילי כדי לנתק תאים מתחתית הבקבוק/צלחת. העבירו תאים לצינור חרוטי וחזרו על הגירוד במידת הצורך.
    3. צנטריפוגה בחום של 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים במדיה או במאגר מתאים לשימוש נוסף.

4. תרבית משותפת של תאי דרכי הנשימה, תאי אנדותל ומקרופאגים

הערה: הליך זה מתאר את השלבים לתרבית משותפת של תאי דרכי הנשימה, תאי אנדותל ומקרופאגים (איור 1A) באמצעות תוספות תרבית תאים, מותאמות מ-Costa et al.12.

  1. ציפוי ECM של תוספות תרבית תאים לתרבית משותפת (יום 0 של תרבית משותפת)
    1. מצפים תוספות תרבית תאים פוליאסטר נקבוביות 3.0 מיקרומטר (PET) בתמיסת ECM של 4 מ"ג/מ"ל. מצפים בקצרה את הצד האפיקלי של תוספות תרבית התאים בתוך הצלחת ב-4 מ"ג/מ"ל של תמיסת ECM. שחרר את תמיסת ה-ECM השיורית. מניחים את הצלחת בחממה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    2. השג צלחת פטרי גדולה (100 מ"מ על 20 מ"מ או 150 מ"מ על 20 מ"מ). בעזרת פינצטה נקייה, העבירו באופן סטרילי תוספות תרבית תאים מצלחת 12 הבארות לצלחת הפטרי הגדולה. הפוך את התוספות כך שהצד הבסיסי יהיה זקוף.
    3. יש לצפות את הצד הבסיסי בתמיסת ECM של 4 מ"ג/מ"ל. שחרר את תמיסת ה-ECM השיורית. מניחים את צלחת הפטרי עם תוספות תרבית תאים מצופות ECM לתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לייבוש למשך הלילה.
  2. דיסוציאציה וציפוי של תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC (יום 1 של תרבית משותפת)
    1. שוטפים את בקבוק T75 עם PBS ותמיסת שאיפה. הוסף 5 מ"ל של פרוטאז דמוי טריפסין לבקבוק T75 ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. להעריך חזותית שתאי אנדותל התרוממו מהבקבוק.
      הערה: הגדל את הזמן של דיסוציאציה של פרוטאז דמוי טיפזין אם תאי האנדותל שמקורם ב-iPSC לא התרוממו מהבקבוק.
    2. הקש על בקבוק כדי להבטיח ניתוק של תאי אנדותל והעברת תאים לחרוט של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של Stop Media כדי לעצור דיסוציאציה. תאי צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
    3. שאפו סופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מצע תרבית אנדותל עם 10 מיקרומטר של ROCKi. השג 10 מיקרוליטר של תמיסה מושעה לספירת תאים והנח תאים על קרח במהלך הספירה.
    4. השתמש ב-150,000 תאי אנדותל iPSC לכל תוספת תרבית תאים של 12 מ"מ ב-100 מיקרוליטר של מצע תרבית אנדותל. התאם את עוצמת המדיה המתאימה כדי להגיע למספר התאים הרצוי לכל הוספה.
    5. השג צלחת פטרי עם תוספות תרבית תאים מצופות ECM של 3.0 מיקרומטר מהחממה (ראה שלבים 4.1-4.3).
    6. השעו מחדש תאי אנדותל iPSC ופיפטה 100 מיקרוליטר עם 150,000 תאים על תוספת תרבית התאים ההפוכה (הצד הבסיסי פונה כלפי מעלה). חזור על הפיפטינג עבור כל אחד מתוספות תרבית התאים המוכנות
    7. העבירו בזהירות תאים לאינקובטור והשאירו אותם ללא הפרעה למשך 3 שעות.
    8. בצלחת של 12 בארות, הוסף 1 מ"ל של מצע תרבית אנדותל בכל באר (למספר המתאים של תוספות תרבית תאים שהוכנו).
    9. הוציאו את צלחת הפטרי עם תאי אנדותל מהחממה. בעזרת פינצטה נקייה, העבירו בזהירות את תוספות תרבית התאים לתוך הצלחת עם מצע תרבית אנדותל (הפכו את התוספת כך שהתחתית פונה כעת כלפי מטה לתוך המדיה).
    10. ודא ויזואלית במיקרוסקופ שתאי אנדותל נדבקו. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. דיסוציאציה וציפוי של אורגנואידים בדרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC (יום 2 של תרבית משותפת)
    הערה: עיין בשלבים 1.1.1-1.1.15 לבידוד אורגנואידים בדרכי הנשימה מפולימר ECM. שנה את משך הדיסוציאציה של פרוטאז דמוי טריפסין (שלב 1.1.10) ל-15-20 דקות כדי להשיג תרחיף של תא בודד.
    1. לאחר 15-20 דקות, עצור את תגובת הפרוטאז דמוי הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של Stop Media. השעו מחדש את התמיסה בעזרת פיפטה P1000 וצנטריפוגה בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות.
    2. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את האורגנואידים של דרכי הנשימה במדיית הרחבת דרכי הנשימה של 1 מ"ל עם 10 מיקרומטר של ROCKi. קח דגימה של 10 מיקרוליטר לספירת תאים של המציטומטר והנח תאים על קרח במהלך הספירה.
    3. זרע 300,000 תאי דרכי נשימה iPSC ב-500 מיקרוליטר של אמצעי הרחבת דרכי הנשימה לכל תוספת תרבית תאים של 12 מ"מ. התאם את עוצמת המדיה המתאימה כדי להגיע למספר התאים הרצוי לכל תוספת מוכנה.
    4. הסר את הצלחת עם תוספות תרבית תאים עם תאי אנדותל (שנזרעו בצד הבסיסי) מהחממה של 37 מעלות צלזיוס.
    5. השעו מחדש תאי דרכי נשימה iPSC ופיפטה 500 מיקרוליטר עם 300,000 תאים לתוך התא האפיקלי של כל תוספת תרבית תאים. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות עם התאים האפיקליים בתנאים נוזליים-נוזליים.
  4. תרבית משותפת להרמת אוויר (יום 4 של תרבית משותפת)
    1. הסר את המדיה מהצד האפיקלי של תוספת תרבית התאים. שנה את המדיה הבסיסית למדיה של בידול דרכי הנשימה 1:1 ומדיה של תרבית אנדותל. החזירו את הצלחת לחממה.
  5. דיסוציאציה וציפוי של מקרופאגים שמקורם ב-iPSC (יום 5 של תרבית משותפת)
    1. נתק מקרופאגים שמקורם ב-iPSC מהבקבוק באמצעות מגרד תאים (ראה שלבים 3.22-3.24). צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות ולשאוף את הסופרנטנט.
    2. השעו מחדש מקרופאגים iPSC ב-1 מ"ל של Mac-CM2. קחו דגימה של 10 מיקרוליטר לספירת תאים והניחו תאים על קרח במהלך הספירה. מספר המקרופאגים ישקף את מספר תאי דרכי הנשימה שנזרעו (יחס של 1:1 בין מקרופאגים לתאי דרכי הנשימה).
    3. לאחר ספירת התאים, יש להכיל 300,000 מקרופאגים במדיה של 35 מיקרוליטר לכל באר של תרבית תאים מוכנה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
    4. לאחר הצנטריפוגה, יש להוציא את הסופרנטנט. השעו מחדש מקרופאגים ב-Mac-CM2 בהתאמה מהחישובים.
    5. הסר תוספות עם תרביות משותפות של תאי אנדותל ודרכי הנשימה מהחממה. זרע 300,000 מקרופאגים ב-35 מיקרוליטר של Mac-CM2 על הצד האפיקלי של תוספת תרבית התא. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
      הערה: כדי לאשר את היצמדות התאים החיסוניים iPSC לתוספת תרבית התאים, ניתן לתייג תאים באמצעות בדיקה פלואורסצנטית. אשר היצמדות באמצעות מיקרוסקופיה לאות פלואורסצנטי 48 שעות לאחר ציפוי מקרופאגים.
  6. תרבות משותפת משולשת (היום השביעי של התרבות המשותפת)
    1. ודא שהתרבות המשותפת מוכנה ליישומים במורד הזרם כגון מחקרי זיהום, מדידות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית (TEER) ומבחני תקינות מחסום.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר שלבים שבהם ניתן להעריך את ההתמיינות של אורגנואידים בדרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC, תאי אנדותל, תאי חיסון ותרביות משותפות שהושלמו בהצלחה. ניתן לבצע הבדלים בקווי iPSC שונים, ופרוטוקול זה נבדק בחמישה קווים שונים לפחות. יש להתאים את הפרוטוקול לכל קו iPSC חדש, במיוחד על ידי שינוי ואופטימיזציה של צפיפות הזריעה.

ניתן להעריך את התפוקה המוצלחת של אורגנואידים בדרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC באמצעות שדה בהיר ויהיו לה ארבעה מאפיינים: גבולות/קצוות מוגדרים, מורפולוגיה שקופה/ציסטית, יכולת התרבות/התרחבות והיעדר תאים נמקיים. אורגנואידים של דרכי הנשימה שנראים מטושטשים אינם גדלים בגודלם במהלך השבועיים של התרבית, ואין להשתמש בנמק לניסויים בתרבית משותפת. אורגנואידים עם שכבת לומינל עבה בפריפריה לעומת האורגנואידים השקופים/ציסטיים עדיין יכולים לשמש לניסויים הבאים. עם זאת, האורגנואידים השקופים/ציסטיים של דרכי הנשימה מורכבים בעיקר מתאי בסיס, ואילו האורגנואידים העבים של הממברנה הכפולה מורכבים בעיקר מתאי מועדון. מכיוון שתאי בסיס מתרבים ומתרחבים בקלות, הם מתאימים יותר לתרבית וקיטוב בין פאזות אוויר-נוזל. שיטות אחרות להערכת התפוקה המוצלחת של אורגנואידים ריאתיים שמקורם ב-iPSC הן ניתוח זרימה-ציטומטריה בשלב אב הריאה (יום 16 להתמיינות) עבור CPM של סמן פני השטח (טבלה 1), תפוקת התמיינות מוצלחת >50% תאי CPM+.

עבור דיסוציאציה של אורגנואידים בדרכי הנשימה ותרבית אינטרפאזה אוויר-נוזלית, ודא שכל פולימר ה-ECM הוסר, אחרת זה ימנע מהתאים להתרחב על הממברנה. התאים צריכים להיות מתכנסים עד היום השלישי של התרבית, לפני ההרמה האווירית. ניתן להעריך את אישור סוגי התאים ב-iAirways על ידי צביעה עבור סמנים ספציפיים לסוג התא המתאימים: תאי בסיס (p63+), תאי מועדון (SCGB1A1+), תאי גביע (MUC5AC+) ותאים ריסניים (AcTub+). אפיון וסמנים ספציפיים לסוג תאי ריאה מאומתים ב-LungMAP21. ניתן לזהות מזנכימה עם נוגדנים נגד וימנטין או אקטין שריר חלק. כדי ליצור תאים ריסניים יותר, התרביות עשויות לדרוש הרמת אוויר לפרק זמן ארוך יותר או תוספת של DAPT.

ניתן להעריך את התפוקה המוצלחת של תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC באמצעות שדה בהיר, המראה מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת (יום 6 של התמיינות האנדותל שמקורה ב-iPSC). תרבית אנדותל מוצלחת שמקורה ב-iPSC תכיל >50% תאי CD31+, ויש לייצר מספיק תאים כך שלאחר המיון, התשואה צריכה להיות יותר מ-500,000 תאים. ניתן להעביר תאים או לשמר אותם בהקפאה, ויש לבדוק את סמן CD31 באמצעות זרימה עם כל מעבר או תרבית חדשה. אין לעבור תאים מעבר ל-P4. לעיון, ראו תאי אנדותל שמקורם ב-iPSC לפני/אחרי מיון CD31 (איור 1C). תאי אנדותל יהיו שטוחים עם גוף תא גדול עם מורפולוגיה מוארכת וצורת ציר.

לצורך התמיינות מקרופאגים, גופים עובריים צריכים להישאר בתחתית באר ה-ULA, ורק EB אחד צריך להיות בכל באר. הם אמורים להראות שינויים ציסטיים עד יום 5-7. אם הם לא יוצרים EB לאחר צנטריפוגה, זרעו את ה-iPSCs לתוך צלחת ULA של 96 בארות מבלי להסתובב. ייתכן שיהיה צורך להגדיל את מספר ה-iPSCs. התפוקה המוצלחת של תאי חיסון שמקורם ב-iPSC תלויה לחלוטין ביכולתם של גופים עובריים (EBs) להתפתח לציסטות (יום 7 להתמיינות). EBs חיסוניים שמקורם ב-iPSC שאינם מפתחים ציסטות לא ייצרו סטרומה כאשר הם מצופים על ג'לטין ולא ייצרו אבות מיאלואידים. לאחר ההעברה לצלחת המצופה ג'לטין, ה- EBs צריכים להישאר מחוברים לתחתית הצלחת. תנועת הצלחת צריכה להיעשות בזהירות כדי לא לעקור אותם. יש להחליף צלחות פעמיים בשבוע באופן ידני, ולהעביר את התאים התלויים ל-Mac-CM2 או לשמר בהקפאה. בנוסף, לאחר קצירת האבות המיאלואידים התלויים, עליהם להיצמד לבקבוק הפלסטיק הלא מצופה, וליצור תאים בהירים מתחת לשדה בהיר עם ואקואולים, מה שמעיד על מקרופאגים. הסמן למונוציטים, CD14+, צריך להיות >90% בתאים התלויים. סמן המקרופאגים, CD68, אמור לעלות עם הזמן, כאשר ~50% מהמקרופאגים מבטאים CD68+ לאחר שבועיים (איור 1D). יש לקבוע יעילות הידבקות עבור כל קו תאים. אנו משיגים יעילות הידבקות ממוצעת של 20%. לצורך קיטוב, מקרופאגים M0 מקוטבים למקרופאגים M1 (iPSC-M1) או M2 (iPSC-M2) למשך 48 שעות במדיום התמיינות II בתוספת גירויים שונים: 100 ננוגרם/מ"ל LPS ו-20 ננוגרם/מ"ל IFN-g עבור קיטוב M1 או 50 ננוגרם/מ"ל IL-4 ו-20 ננוגרם/מ"ל IL-13 עבור קיטוב M2. הסמן לקיטוב M1 הוא CD80+, וקיטוב M2 הוא CD206+.

ניתן להעריך יצירה מוצלחת של התרבות המשולשת באמצעות אימונופלואורסצנציה עבור סמני צומת הדוקים אפיתל EPCAM, ECAD או ZO-1, או סמן צומת הדוק אנדותל CD31 (איור 2C, טבלה 1). ניתן להעריך את הפונקציונליות של התרבות המשולשת גם באמצעות התנגדות אפיתל/אנדותל טרנס-חשמלית (TEER). תרבויות אורגנואידים ואנדותל של דרכי הנשימה המורכבות היטב יהיו בעלות התנגדות חשמלית גדולה יותר, מה שמעיד על תקשורת וחיבור תאים אופטימליים. עלבונות סביבתיים, כמו למשל סיגריות אלקטרוניות או אתגר ויראלי, יפגעו בשלמות מחסום האפיתל והאנדותל, וכתוצאה מכך ההתנגדות החשמלית המופחתת של התרבות המשותפת (איור 3A,B) וצמתים הדוקים לא מאורגנים (איור 3C).

figure-results-1
איור 1: בידול ואפיון של אפיתל דרכי הנשימה שמקורו ב-iPSC, אנדותל ותרביות חיסוניות. (A) סכמטי של התמיינות מכוונת iPSC עבור הרכבת ה-iAirway. (B) אורגנואידים של אפיתל דרכי הנשימה שמקורם ב-iPSC המאופיינים בשדה בהיר (משמאל) וניתוח ציטומטריית זרימה (מימין) עבור EPCAM ו-ECAD. (C) אנדותל דרכי הנשימה שמקורו ב-iPSC המאופיין בשדה בהיר (משמאל), אימונופלואורסצנציה וניתוח ציטומטריית זרימה (מימין) עבור CD31. שדה הבהירות המתאים לאחר מיון CD31 מוצג בצד ימין. (D) מקרופאגים שמקורם ב-iPSC מאופיינים בניתוח שדה בהיר (משמאל) וניתוח ציטומטריית זרימה (מימין) עבור הסמן ההמטופויאטי הפאן CD45, יצרן המונוציטים CD14 וסמן המקרופאגים CD68. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תרבית משותפת של תאי אפיתל, מזנכימליים, אנדותל ומקרופאגים שמקורם ב-iPSC. (א) שרטוט של מכלול נתיב האוויר האווירי. (B) תמונות שדה בהירות של המונוקולטורה של האפיתל והאנדותל בהתאמה, הדו-תרבות של האפיתל והאנדותל, והתרבות המשותפת של האפיתל, האנדותל והמקרופאגים. מקרופאגים מתויגים ב-Cytotracker אדום. מוטות קנה מידה: 100 מיקרומטר. (C) צביעה אימונו-פלואורסצנטית לסמן צומת הדוק ZO-1 בצד האפיקלי של תוספת תרבית התא ו-CD31 בצד הבסיסי. מוטות קנה מידה: 100 מיקרומטר. (D) חתך רוחב של הכנסת תרבית התא עם אורגנואידים מנותקים של דרכי הנשימה בצד האפיקלי, שבוע לאחר הרמת האוויר. הפאנל השמאלי עם צביעת H&E עם החץ השחור מראה תאים ריסניים. הפאנל האמצעי, עם הדמיה אימונופלואורסצנטית, מראה את סמן האפיתל E-cadherin (ECAD). הפאנל הימני, עם הדמיה אימונופלואורסצנטית, מראה סמנים מזנכימליים כגון וימנטין (VIM) ואקטין שריר חלק (SMA). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שינויים בתפקוד מחסום דרכי הנשימה של נתיבי האוויר החשופים לסיגריות אלקטרוניות ווירוסים. (A) סכמטי של כלי מדידת התנגדות אפיתל/אנדותל טרנס-חשמלית (TEER). (ב) גרף עמודות של TEER לאחר 7 ימים של הוספת סיגריה אלקטרונית מנטול למדיה. רווח בר-סמך ממוצע +/- 95%. N = 5 שכפולים ביולוגיים ו-3 שכפולים טכניים; ערך p <0.001. (C) צביעה אימונו-פלואורסצנטית לחלבון צומת הדוק ZO-1 לפני ואחרי הדבקה ב-SARS-CoV-2. שימו לב לפריסה הלא מסודרת של ZO-1 לאחר ההדבקה. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדןיישוםדילול
תקליטור 31 PECAM-1 (נגמ"ש)ציטומטריית זרימה (FC)10 מיקרוליטר במאגר 100 UL
EPCAM/CD 326 (נגמ"ש)מועדון הכדורגל1:500
E-CAD/CD 324 (נגמ"ש)מועדון הכדורגל5 מיקרוליטר במאגר 100 UL
עלות לאלף הופעותמועדון הכדורגל1:200
תקליטור 45מועדון הכדורגל5 מיקרוליטר במאגר 100 UL
תקליטור 14 (FITC)מועדון הכדורגל5 מיקרוליטר במאגר 100 UL
תקליטור 68מועדון הכדורגל5 מיקרוליטר במאגר 100 UL
ZO-1אימונופלואורסצנציה (IF)1:300
וימנטיןאם1:200
SMAאם1:100

טבלה 1: נוגדנים המשמשים ב-FACS ואימונופלואורסצנטיות.

קובץ משלים 1: קומפוזיציות מדיה ומאגר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח ויישום מודל של מחסום דם-אוויר בדרכי הנשימה הגדולות לחקר זיהומים נגיפיים ורעלים אחרים דורש תשומת לב קפדנית לפרטים כדי להבטיח התמיינות ותפקוד מוצלחים של סוגי התאים השונים המעורבים. דיון זה יעסוק בגורמי מפתח לבידול מוצלח, אתגרים פוטנציאליים, יישומים חלופיים והשלכות על חקר מחלות אנושיות.

כדי להבטיח התמיינות מוצלחת, חשוב לשים לב לסוג הכנסת תרבית התאים וגודל הנקבוביות. יש להשתמש בנקבוביות גדולות כדי להבטיח תקשורת בין תאים דרך שכבות ה-ECM. הבטחת צפיפות הזריעה האופטימלית עבור קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) היא קריטית. צפיפות נכונה מאפשרת התמיינות אחידה ומונעת היווצרות גושי תאים לא רצויים, מה שמוביל לשכבת אפיתל הומוגנית ופונקציונלית יותר. כדי לשמור על שכבת אפיתל בריאה ומתפקדת, חשוב לשטוף את המשטח האפיקלי לפני הוספת תרכובות, רעלים או וירוסים. זה עוזר להסיר ריר שהצטבר, תאים מתים ופסולת אחרת, ובכך מקדם סביבת תרבית יציבה ובת קיימא ומאפשר גישה לתאי האפיתל.

עבור מרכיב האנדותל, חיוני לוודא שהתאים ממוינים כראוי והומוגניים. ניתן להשיג זאת באמצעות טכניקות כמו FACS, המבטיחה שימוש רק בתאי האנדותל הרצויים, ובכך שומרת על עקביות ותפקוד.

עבור מרכיב המקרופאגים, למרות היצמדות לפלסטיק בקלות, מקרופאגים אינם נצמדים היטב לתאי אפיתל אפיקליים. הגדלת מספר המקרופאגים עשויה להועיל להבטחת אוכלוסייה גדולה של מקרופאגים בדרכי האוויר. מקרופאגים דבקים ממוקמים טוב יותר לאינטראקציה עם פתוגנים ותאים חיסוניים אחרים, ובכך משפרים את הרלוונטיות של המודל. אם מחקר האיתות החיסוני של האנדותל מועדף, ניתן לזרוע את המקרופאגים בצד הבסיסי של תרבית התאים במדיה כדי לחקות את אוכלוסיית המונוציטים במחזור22.

למודל iAirway יש מספר יישומים משמעותיים נוספים, כולל חקר התפתחות הריאות של דרכי הנשימה. המודל יכול לשמש לחקר התהליכים המורכבים המעורבים בהתפתחות הריאות, הכוללים איתות רב-תאי בין אוכלוסיות שונות של תאים, המספקים תובנות לגבי מצבים נורמליים ופתולוגיים. כדי לחקור התפתחות ומחלות מכתשית, ניתן להחליף אורגנואידים של דרכי הנשימה באורגנואידים ריאתיים דיסטליים (DLOs)23,24 זה מאפשר לחוקרים לחקור את הריאה הדיסטלית, כולל התפתחות ותפקוד המכתשית. זה שימושי במיוחד לייצור ולחקר מקרופאגים מכתשית, הממלאים תפקיד מפתח בחסינות הריאות.

פיתוח מודל אמין וניתן לשחזור של מחסום הדם-אוויר בדרכי הנשימה הגדולות מלווה במספר אתגרים. תאי אב ריאה חייבים לבטא יותר מ-50% NKX2-1 כדי להצליח בהתמיינות. אם התשואה לא מושגת, תרביות ה-ALI עלולות להכיל יותר מזנכימה או להיות מזוהמות בתאי אפיתל שאינם ריאות. שמירה על סטריליות במהלך הציפוי של תאי אנדותל היא אתגר משמעותי מכיוון שהם מתורבתים בצד הבסיסי של תוספת תרבית התאים. זה מונע ממכסה הצלחת לסגור את הסביבה הסטרילית, ולכן יש להשתמש בצלחות אחרות במהלך זריעת תאי האנדותל. מזהמים עלולים לשבש את התרבות ולפגוע בשלמות הדגם. רוב תרביות ה-ALI מודגרות במשך 3 שבועות לפחות כדי לייצר את רוב תאי דרכי הנשימה, כולל תאים ריסניים. רוב הפרוטוקולים זורעים תאי בסיס, ולכן חייבים לאפשר זמן למנגנוני איתות להבדיל בין תאי דרכי הנשימה האחרים. הפרוטוקול הנוכחי מנתק אורגנואידים של דרכי הנשימה, שכבר מכילים רבים מתאי דרכי הנשימה, אם כי בכמויות נמוכות יותר בהשוואה ל-ALI בוגר שמקורו ב-HBEC. מעט תאים ריסניים נראים יחד עם סוגי תאים אפיתל ומזנכימליים (איור 2D). כדי ליצור תאים ריסניים יותר, ניתן להוסיף DAPT לתרביות האורגנואידים של דרכי הנשימה ו/או למדיה ALI25. פלטפורמה זו גם בדקה רק את הכדאיות לטווח קצר של התאים האפיקליים והבסיסיים לאחר הרמה אווירית, כאשר המדיה הבסיסית משתנה למדיה אפיתל ואנדותל 1:1. יש צורך במחקר נוסף כדי לבדוק את הכדאיות לאורך תקופה של שבועות, מה שעשוי להגביר את מורכבות התאים ב-ALI.

למודל מחסום הדם-אוויר יש השלכות עמוקות על חקר מחלות אנושיות ופיתוח התערבויות טיפוליות. ניתן להשתמש במודל כדי לסנן ולייעל חומרים טיפוליים, כולל תרופות אנטי-ויראליות, על ידי מתן סביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית המחקה את דרכי הנשימה האנושיות, במיוחד עם חשיפת תאי דרכי הנשימה לאוויר. ניתן להשתמש בטכניקות נוקאאוט של גנים כדי לחקור מנגנונים ספציפיים של תפקוד לקוי של מחסום ואינטראקציות מארח-פתוגן. המודל מציע פלטפורמה לחקר היבטים שונים של מחלות נשימה אנושיות, מזיהומים נגיפיים ועד למצבים כרוניים כמו אסתמה ו-COPD. הבנה זו יכולה להוביל לפיתוח טיפולים יעילים וממוקדים יותר.

לסיכום, מודל מחסום הדם-אוויר של דרכי הנשימה הגדולות (iAirway) מייצג כלי רב עוצמה לחקר תפקוד לקוי של מחסום עקב זיהומים נגיפיים ומחלות נשימה אחרות. הבטחת בידול מוצלח של סוגי תאים, התמודדות עם אתגרים התפתחותיים ובחינת יישומים חלופיים ישפרו את התועלת והדיוק של מודל זה. יישומו במחקרי מיקוד טיפולי ונוקאאוט גנים מדגיש את הפוטנציאל שלו בקידום ההבנה והטיפול שלנו במחלות נשימה אנושיות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי CIRM (DISC2COVID19-12022).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 צלחות בארקורנינג3512
מוסיף 12 בארות, 0.4 ומיקרו; m, שקוף VWR10769-208
2-מרקפטואתנול Sigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
Activin AR& D Systems338-AC
חומצה רטינואית All-trans (RA) Sigma-AldrichR2625
SigmaA4544
B27 ללא חומצה רטינואית;ThermoFisher12587010
BMP4 מו"פ D Systems314-BP/CF
אלבומין בסרום בקר (BSA) Fraction V, תמיסה של 7.5% Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1(APC)R& D SystemFAB3567A
CD 45 (PE)BD Biosciences560975
CD 68 (PE)BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
דקסמתזון סיגמא-אולדריץ'D4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 גיבקו10565042
דורסומורפיןמו"פ D Systems3093
E-CAD/CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR& D Systems236-EG
EGM2 MediumLonzaCC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS ג'יבקו10082139
FGF10מו"פ D Systems345-FG/CF
FGF7מו"פ D Systems251-KG/CF
פיברונקטיןפישר356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax לייף טכנולוג'יז35050061
חם s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove' s Modified Dulbecco' s בינוני (IMDM) + גלוטמקס Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
מונותיוגליצרול ערכת SigmaM6145
mTeSR plus (10 למארז)Stem Cell Tech5825
N2 ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
עט/סטרפטוקוקוסLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax לייף טכנולוג'יז12633012
SB431542 מו"פ D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2Medium STEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
VimentinCell Signaling5741S
Y-27632 (מעכב סלעים) מו"פ די סיסטמס1254/1
ZO-1Invitrogen339100
חומצה אסקורבית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine. Respir Res. 23 (1), 122(2022).
  2. Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).
  3. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  4. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).
  5. Khalilgharibi, N., Mao, Y. To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease. Open Biol. 11 (2), 200360(2021).
  6. Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation. Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).
  7. Parker, D., Prince, A. Innate immunity in the respiratory epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).
  8. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  9. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).
  10. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).
  11. Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection. Front Immunol. 13, 1012048(2022).
  12. Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier. Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).
  13. Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease. J Vis Exp. (170), e62456(2021).
  14. Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).
  15. Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides. Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).
  16. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).
  17. Hao, S., et al. Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium. mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).
  18. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).
  19. Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), e71098(2013).
  20. Pouyanfard, S., et al. Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis. Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).
  21. Ardini-Poleske, M. E., et al. Lungmap: The molecular atlas of lung development program. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).
  22. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).
  23. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).
  24. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  25. Firth, A. L., et al. Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

iPSC

מאמרים קשורים