הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67261

⸱

4 באוקטובר 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את היישום של תחום מתג אלוסטרי מהונדס המופעל על ידי אור כחול (LightR) עבור בקרה מרחבית-טמפורלית הפיכה של פעילות החלבון. תוך שימוש ב-Src טירוזין קינאז כמודל, מחקר זה מציע פרוטוקול מפורט לפיתוח ואפיון Src מווסת אור (LightR-Src). הוא מדגים את הרבגוניות של גישה זו בכל סוגי האנזימים.

תקציר

אופטוגנטיקה מציעה פוטנציאל לחיקוי בקרה מרחבית-זמנית מורכבת של פעילות האנזים עד לרזולוציה תת-תאית. עם זאת, רוב הגישות האופטוגנטיות מתמודדות לעתים קרובות עם אתגרים משמעותיים בשילוב יכולות מרובות בכלי יחיד החלים על מגוון רחב של חלבוני מטרה. השגת שליטה מדויקת בקינטיקה של הפעלה/כיבוי, הבטחת מינימום דליפה בחושך והפגנת ביצועים יעילים בתאי יונקים עם דיוק תת-תאי הם חלק מהאתגרים הנפוצים ביותר העומדים בפני תחום זה. פתרון מבטיח טמון ביישום של תחומים רגישים לאור שתוכננו באופן רציונלי כדי לשלוט באופן אלוסטרי בפעילות החלבון. באמצעות אסטרטגיה זו, יצרנו שיטה אופטוגנטית המשלבת את כל התכונות הרצויות. הגישה כוללת שילוב של מודול מתג אלוסטרי מווסת אור (LightR) בחלבון המטרה כדי לווסת את פעילות האנזים באמצעות אור כחול (465 ננומטר). תחום LightR נוצר על ידי קישור שני תחומי קולטי אור חיים (VVD), ויוצר מהדק רגיש לאור שניתן לשלב בלולאה גמישה קטנה בתוך התחום הקטליטי של אנזים. במצבו החשוך, מהדק LightR פתוח, ובכך מעוות את התחום הקטליטי של האנזים ומנטרל אותו. עם חשיפה לאור כחול, תחום LightR נסגר ומשחזר את מבנה התחום הקטליטי ואת פעילות האנזים. בכתב יד זה, אנו דנים באסטרטגיות תכנון ליצירת חלבון קינאז מווסת אור ומדגימים את שליטתו על ידי אור כחול, הפיכות, קינטיקה וויסות מדויק ברמה התת-תאית, המאפשרים דיוק מרחבי-זמני הדוק. תוך שימוש ב-Src טירוזין קינאז כמודל, אנו מציגים פרוטוקול לוויסות יעיל של פעילות LightR-Src kinase. אנו גם מדגימים את ישימות LightR על פני קבוצות אנזימים שונות, ומרחיבים את התועלת של מערכת הכלים במענה לשאלות מכניסטיות של מסלולי איתות במחלות שונות.

מבוא

יכולתו של התא לפרש אותות חיצוניים ולהמיר אותם לתגובות ספציפיות בהקשרים פיזיולוגיים או פתולוגיים מכוונת על ידי קבוצות ייעודיות של חלבונים. תרומתו של כל חלבון לתגובות מורכבות כאלה מוגדרת לעתים קרובות על ידי מיקומו התת-תאי, רמת הביטוי שלו ועיתוי ההפעלה החולפת, המתמשכת או המתנדנדת. ניתוח תפקידם של פרמטרים בודדים אלה בוויסות האיתות דורש שיטות המסוגלות לשכפל בקרה מרחבית-זמנית מורכבת של פעילות החלבונים ברמה התת-תאית. טכניקות מסורתיות כגון מניפולציה גנטית ומעכבי מולקולות קטנות נופלים בהקשר זה. לעומת זאת, טכניקות אופטוגנטיות מבטיחות את הפוטנציאל לנתיחה של תהליכים ביולוגיים על ידי מניפולציה או חיקוי של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. עם זאת, הכלים הנוכחיים חסרים לעתים קרובות ישימות רחבה או שליטה תת-תאית. מספר אסטרטגיות קיימות משיגות רגולציה הדוקה של לוקליזציה של חלבונים ואינטראקציות; אך חסר שליטה ישירה על הפעילות האנזימטית 1,2,3,4. אחרים מאפשרים ויסות של פעילות אנזימטית אך עשויים להיות חסרי שליטה תת-תאית או ישימות מוגבלת על פני קבוצות אנזימים שונות 5,6,7,8,9. במאמר פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה חדשנית להנדסת חלבונים המשלבת את יתרונות האופטוגנטיקה לכלי אחד: ויסות זמני הדוק, קינטיקה כווצת, בקרה תת-תאית ותחולת אנזימים רחבה10. הנדסנו תחום מווסת אור (LightR) שמתפקד כמתג אלוסטרי כאשר הוא מוכנס לחלבון המטרה המעניין. אסטרטגיה זו מאפשרת בקרה מרחבית-זמנית הדוקה על ההפעלה וההשבתה של חלבון בעל עניין בתאים חיים.

כאן נדונה אסטרטגיית התכנון והיישום של הכלי האופטוגנטי LightR במספר סוגי אנזימים. מחקר זה מציע פרוטוקול שלב אחר שלב לפיתוח, אפיון ויישום של טירוזין קינאז Src מווסת אור (LightR-Src). המחקר מדגים עוד יותר את יכולת הכוונון של קינטיקה של השבתת מתג LightR. מתג LightR המנטרל לאט יכול לשמור על פעילות אנזימים עם תדירות תאורה מופחתת, בעוד שגרסת מחזור מהיר, FastLightR, דורשת תאורה תכופה יותר להפעלה, אך מציגה השבתה מהירה כאשר התאורה כבויה. הפעלה/השבתה של FastLightR-Src בתאים חיים גורמת למחזורים של התפשטות תאים ונסיגה. התפשטות תאים הנגרמת על ידי FastLightR-Src מסכימה עם התפקיד הפיזיולוגי של קינאז Src11,12. בשל קינטיקה של אי-הפעלה מהירה, FastLightR-Src יכול להיות מווסת גם ברמה תת-תאית, וכתוצאה מכך לעורר בליטות מקומיות וקיטוב תאים. כדי להדגים את הישימות של כלי LightR לסוגים אחרים של אנזימים, אנו מדריכים את הקוראים בקצרה בהצלחה דומה עם קינאז bRaf מהונדס מווסת אור (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) ורקומבינאז DNA ספציפי לאתר Cre (LightR-Cre). בסך הכל, לגישה זו יש פוטנציאל לקדם את הבנתנו של מסלולי איתות מורכבים המעצבים את הפתופיזיולוגיה של מחלות מגוונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכנון ופיתוח LightR (איור 1)

  1. תכנון אסטרטגי
    הערה: תחום LightR מורכב משני תחומי קולטי אור חיים (VVD) המחוברים זה לזה יחד מ- Neurospora crassa13,14,15,16. VVDs הומודימריזציה בנוכחות אור, ודימריזציה כזו כרוכה בשינוי קונפורמטיבי המביא את N-terminus של מונומר VVD אחד ליד C-terminus של מונומר VVD אחר (איור 1A). חיבור שני דומיינים VVD עם מקשר גמיש יוצר תחום דמוי מהדק שיהיה פתוח בחושך וסגור עם הארה באור כחול. שילוב מהדק זה בתחום הקטליטי של האנזים מאפשר ויסות פעילות בתיווך אור. בחושך, המהדק הפתוח מעוות את התחום, משבית את האנזים; הארה עם האור הכחול גורמת למהדק להיסגר, ומשקמת את פעילות האנזים (איור 1B). תפיסה זו יכולה להיות מיושמת על אנזימים ממשפחות שונות, כולל חלבון קינאזות ורקומבינאזות DNA10 (איור 1C).
    1. עיצוב LightR
      1. כדי לחבר שתי מולקולות VVD, השתמש במקשר גמיש של 22 חומצות אמינו (GGS)4G(GGS)3 בין כל מונומר.
        הערה: המקשר מספק גמישות ואורך מספיקים כדי להכיל את השיוך והדיסוציאציה של מונומרים VVD.
      2. הוסף קישורי GPGGSGG ו- GSGGPG למסוף N ו- C של תחום LightR, בהתאמה.
        הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את אורך והרכב המקשרים לחלבון ספציפי. מקשרים קצרים יותר מסוג GSG ו-Single Gly נמצאים בשימוש שגרתי כאשר יש צורך ברגולציה הדוקה יותר. גודל לולאת ההחדרה וקרבתה לשאריות קטליטיות, ישפיעו גם הם על הטווח הדינמי של הוויסות. לולאות קצרות יותר נוטות יותר לספק ויסות הדוק יותר של הפעילות הקטליטית אך עלולות לגרום לפעילות נמוכה יותר לאחר התאורה. הרצף של תחום LightR מסופק בטבלה משלימה 1.
    2. הכנסת LightR
      הערה: אתר החדרת LightR מתאים יאפשר רגולציה הדוקה של פונקציית התחום הממוקד מבלי לחסום באופן סטרילי את האינטראקציות שלו או לגרום לשינויים מבניים בלתי הפיכים שישפיעו על תפקידו הביולוגי. מבנה גבישי של חלבון המטרה הוא מדריך אידיאלי בזיהוי אזורי לולאה גמישים כאלה להחדרת LightR. במידת הצורך, המבנה הגבישי של הומולוג קרוב יכול להספיק. להלן כמה קריטריונים כלליים שיש לקחת בחשבון.
      1. ודא שלולאת ההחדרה מצומדת מבנית לאלמנטים הקטליטיים הקריטיים של האנזים. ודא שלולאת ההחדרה שנבחרה אינה אתר קישור קיים לחלבון ושהחדרת LightR אינה עלולה לשבש אינטראקציות תפקודיות כלשהן עקב השפעות סטריות.
      2. כאסטרטגיה ראשונית, החלף חומצת אמינו אחת בלולאת ההחדרה בעת הכנסת LightR. יש לכוון למרכז לולאת ההחדרה המכילה חומצת אמינו קוטבית או קטנה (למשל, Glu, Arg, Lys, Gly) החשופה לממס ואינה מעורבת באינטראקציות תוך-מולקולריות.
        הערה: כאשר תחליף חומצת אמינו אחת אינו יוצר חלבון פונקציונלי, אופטימיזציה של מבנה LightR תדרוש החלפה של חומצות אמינו מרובות או את לולאת ההחדרה כולה. הערך את הפונקציונליות של אתרי הכנסה מרובים עבור LightR בתוך הלולאה המוגדרת.
      3. ודא שאנזים המטרה פועל ללא תלות בוויסות אנדוגני. השג זאת על ידי שימוש בגרסה מוטנטית פעילה של האנזים עבור תבנית ההחדרה.
        הערה: אנזימים מסוג Wild יכולים לשמש גם ליצירת מבנים LightR, אך הדבר עשוי לגרום למערכת מגודרת AND שתהיה מווסתת על ידי מנגנונים אנדוגניים ואור.
      4. בקרות חיוביות ושליליות חיוניות לניתוח פעילות אנזים LightR. השתמש במוטציות פעילות מכוננות של חלבונים אנדוגניים כבקרות חיוביות ובגרסאות מוטנטיות לא פעילות קטליטית של אנזים LightR הממוקד כבקרות שליליות.
        הערה: בעת בחירת מוטציות מנטרלות, חיוני לוודא שהמוטציה מרווחת מספיק מאתר החדרת LightR כדי למנוע הפרעה לבלתי הפיכות של קיפול אנזים LightR. בהתבסס על הקריטריונים לעיל, אתר החדרת LightR בקינאז Src נבחר באזור לולאה גמיש המצומד מבנית למוטיב GXGXXG השמור מאוד באזור לולאה G-loop/גליצין עשיר ב- ATP באמצעות גדיל בטא. חשוב לציין, הוא ממוקם הרחק מכיס קשירת ה-ATP ומאזור קשירת המצע10,17 (איור 1C (i)).
        הערה: עקב הומולוגיה מבנית בין קינאזות, אתר ההחדרה LightR ב-bRaf נבחר באותה לולאה מבנית כמו אתר ההחדרה ב-Src (איור 1C (ii)).
        הערה: בהתבסס על העקרונות המפורטים בסעיף 1.1.2., אתר החדרת LightR ב- Cre recombinase, שאינו קינאז, נבחר באחת הלולאות הגמישות המרוחקות מהליבה הקטליטית, כלומר אתר קשירת ה- DNA. עם זאת, לולאת ההחדרה עדיין מצומדת מבנית לשאריות קטליטיות, קריטיות בתחום קשירת הדנ"א, דרך סליל α כדי להבטיח את הצלחת פונקציונליות LightR-Cre (איור 1C (iii)). כל אתרי ההחדרה עם בקרות חיוביות ושליליות עבור אנזימים שונים המתוארים בפרוטוקול הנוכחי מפורטים בטבלה משלימה 2.
    3. פיתוח FastLightR.
      הערה: הכנסת מוטציית I85V לשני ה-VVD ב-LightR מאפשרת דינמיקת הפעלה-השבתה מהירה יותר, המיוחסת להמרה מהירה של המוטציה למצב אפל18,19. הדור של FastLightR-Src ו- FastLightR-bRaf עם קינטיקה של אינאקטיבציה מהירה מאפשר שליטה זמנית הדוקה בהפעלה ובהשבתה. הוא מאפשר השגת ויסות תת-תאי של LightR-Src בתאים חיים.
      הערה: פעילות Cre recombinase גורמת לרקומבינציה בלתי הפיכה של DNA; לפיכך, תכונות ההפיכות של LightR אינן ישימות.
      הערה: כדי לפשט את זיהוי מבנה LightR, ניתן להצמיד חלבון פלואורסצנטי או כל תג מתאים אחר למסוף N או C של חלבון המטרה. מחקר זה השתמש ב- mCherry-myc עבור LightR-Src, ונוס עבור LightR-bRaf, ו- miRFP670 עבור רקומבינאז LightR-Cre.
  2. אסטרטגיית שיבוט
    הערה: גישת השיבוט, בניגוד לגישות מסורתיות, מבוססת על מוטגנזה מכוונת אתר שאינה מסתמכת על אתרי הגבלה ספציפיים10,20.
    1. דור של "Megaprimer"
      1. קודון-אופטימיזציה של הגנים LightR כדי להבטיח ביטוי יציב של שני רצפי DNA VVD טנדם ממקור פטרייתי בתאי יונקים ולהפוך את הרצפים שונים ככל האפשר לשיבוט ללא שגיאות באמצעות PCR. כדי לבצע מיטוב קודון, בצע את השלבים 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. יישר את רצף חומצות האמינו של VVDs ואת המקשרים שנבחרו זה לצד זה כדי ליצור את מפת הרצף התיאורטית של LightR.
      3. הדבק את הרצף בכל פלטפורמת אופטימיזציה מקוונת של קודון המשתמשת באלגוריתם מתקדם לאופטימיזציה של קודון כדי לקבוע את אפשרות הרצף הטובה ביותר עם מורכבות מינימלית. ודא שאורגניזם היעד נבחר, מסגרת הקריאה נשמרת ורצפי VVD נבחרים למיטוב.
      4. השג DNA של LightR כמקטע מסונתז מותאם אישית (ראה טבלה משלימה 1) או ממבנה LightR10 שפורסם בעבר.
      5. הגבירו את הגן LightR כדי ליצור "Megaprimer" באמצעות אסטרטגיית20 שתוארה קודם לכן המתוארת באיור 1D. סנתז את LightR "Megaprimer" באמצעות PCR בעקבות המלצות היצרן עבור DNA פולימראז ספציפי באמצעות תערובת תגובת PCR הבאה:
        מאגר תואם 5x DNA פולימראז: 10 μL
        100 מיקרומטר מגה-פריימר קדמי: 0.5 μL
        100 מיקרומטר מגה-פריימר הפוך: 0.5 μL
        תערובת dNTP של 10 ננומטר: 2 מיקרוליטר
        DNA פולימראז (2000 יחידות/מ"ל): 1 μl (0.02 U/μL)
        50 ng DNA תבנית: 1 μL
        מים בדרגת PCR: 35 מיקרוליטר
        הערה: כאן, נאמנות גבוהה, התחלה חמה DNA פולימראז עם טמפרטורות חישול פריימר אוניברסלי משמשים.
      6. להפריד את megaprimer וכתוצאה מכך על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. אורכו של המוצר יהיה כ-1000 נוקלאוטידים. הבלו את המגפריימר מג'ל האגרוז וטיהרו באמצעות ערכת מיצוי ג'ל, בהתאם להמלצות היצרן או בטכניקה מקבילה.
    2. החדרת גן LightR באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר: החדרת LightR, החלפת חומצת אמינו רצויה או אורך של חומצות אמינו. פלסמיד התבנית יהיה זה שבו מוכנס תחום LightR. בצע תגובת PCR כמתואר20 קודם לכן באמצעות התערובת הבאה.
      מאגר תואם 5x DNA פולימראז: 5 μL
      תערובת dNTP של 10 ננומטר: 1 מיקרוליטר
      DNA פולימראז (2000 יחידות/מ"ל): 1 μL (0.02 U/μL)
      50 ng תבנית יעד DNA: 1 μL
      Megaprimer מופק (משקל מחושב): 10 μL
      DMSO: 2.5 μL
      מים בדרגת PCR: 2.5 μL
      הערה: מסת מגה-פריימר (ng) = יחס מוסף/וקטור מולארי רצוי x מסה של יחס וקטור x של הוספה לאורכים וקטוריים. היחס המולרי הרצוי בין הוספה לווקטור הוא 3/1.
    3. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, יש להוסיף 1 μL של אנזים DpnI (2000 יחידות/מ"ל) כדי לעכל באופן סלקטיבי רק את הדנ"א העודף והמתילציה ולדגור על התערובת ב-37°C למשך 1-1.5 שעות. זה יגדיל באופן משמעותי את התשואה של המבנה שונה.
    4. המר 1-2 μL של תגובת PCR לתאים מוסמכים DH5α בהתאם לפרוטוקולי היצרן.
    5. צלחת חיידקים מותמרים על צלחת מרק לוריא (LB)-אגר עם אנטיביוטיקה מתאימה לבחירה. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה או בטמפרטורת החדר (RT; 25-30°C) למשך 72 שעות.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות LB עם מושבות הגדלות עליהן ב- 4 ° C למשך עד חודש אחד, וניתן להשהות את הפרוטוקול.
    6. PCR מסך מושבה
      1. עבור סינון מושבה מבוסס PCR, תכננו פריימרים שמכניסים את LightR ומכוונים לדנ"א כדי לייצר כ-400-700 מקטעים bp.
      2. הוסף כמות קטנה של מושבה מצלחת LB לתערובת ה- PCR המסופקת להלן והמשך ל- thermocycling בהתאם להמלצות היצרן עבור ה- DNA פולימראז הספציפי.
        2x Taq RED מאסטר מיקס: 5 μL
        מים בדרגת PCR : 5 μL
        100 מיקרומטר פריימר קדמי : 0.5 μL
        100 מיקרומטר פריימר הפוך: 0.5 מיקרומטר
      3. בדוק מושבות חיוביות על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose.
      4. בחרו את המושבות שיצרו את גודל מוצר ה-PCR הרצוי וחסנו אותן בנפרד ל-3 מ"ל של מרק LB עם האנטיביוטיקה, בהתאם לעמידות האנטיביוטית בעמוד השדרה של הפלסמיד. לאחר מכן, לדגור ולנער ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.
      5. יש לחלץ DNA פלסמיד מתרבית נוזלית בהתאם להוראות היצרן של ערכת טיהור הפלסמיד למיצוי DNA פלסמיד ולוודא את נוכחות העלון על ידי ריצוף.
        הערה: פריימרים לשיבוט מסוכמים בטבלה משלימה 3.

2. ציפוי תאים וניתוח ביוכימי של פעילות האנזים LightR (איור 2A)

  1. לניתוח ביוכימי של LightR-kinases (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), צלחת 1 x 106 תאי LinXE לכל צלחת תרבית תאים בגודל 3.5 ס"מ עבור כל קבוצת ניסוי. ראו טבלה משלימה 4.
  2. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 16-18 שעות.
  3. למחרת, הדבק את התאים עם מבנה הדנ"א שנבחר, באמצעות מגיב טרנספקציה מתאים בהתאם להמלצות היצרן (טבלה משלימה 4).
    הערה: מגיב הטרנספקציה האופטימלי יהיה תלוי במבנה, בווקטור ובסוג התאים המשמשים. במחקר זה נעשה שימוש ב-2 מק"ג דנ"א בצלחת בגודל 3.5 ס"מ באמצעות מגיב טרנספקציה. יש לבצע בדיקות אמפיריות כדי לקבוע את מגיב הטרנספקציה האופטימלי. מכיוון שמבנים נגועים יבטאו חלבונים המווסתים על ידי אור כחול, כל השלבים הבאים בטיפול בתאים נגועים חייבים להתבצע תחת אור אדום. עטפו את הצלחות בתאים נגועים ברדיד אלומיניום לפני הצבתם באינקובטור כדי למנוע תאורה מקרית.
  4. לאחר 16-18 שעות של טרנספקציה לחשוף את התאים לאור כחול10. כדי לבצע זאת, מקם מערכת מנורות פאנל דיודה פולטת אור (LED) 465 ננומטר באינקובטור תרבית הרקמות. הניחו לוח פרספקס מחורר 10 ס"מ מעל המנורה לקבלת ההארה הרצויה של 3 mW/cm2 (קובץ משלים 1). יש צורך בלוח מחורר כדי לשמור על זרימת אוויר רציפה באינקובטור. להאיר תאים לתקופה הרצויה.
  5. להפעלה של LightR-Src ו- LightR-bRaf, השתמש בתאורה רציפה. לתאורה רציפה, הפעל וכבה את לוח ה-LED באופן ידני.
  6. לשמירה על מחזור ההפעלה/אי-ההפעלה של FastLightR Src, השתמש במחזורי הפעלה/כיבוי הנשלטים באופן ידני או על-ידי מיקרו-בקר.
    הערה: ניתן להשתמש במספר ערכות כלי תוכנה המספקות סביבת פיתוח משולבת (IDE) לכתיבה והעלאה של הקוד הנדרש. ערכות כלים אלה תומכות בתכנות C/C++ ומציעות גישה כללית לקלט/פלט (GPIO), החיונית לשליטה בתאורה הפועמת. תיאור מפורט של הפרוטוקולים והקוד המשמשים למטרות אלה מתואר בקובץ משלים 1.
  7. בסוף נקודות הזמן המתאימות של הניסוי (טבלה משלימה 4), קצרו את התאים תחת אורות אדומים בטוחים. שאפו את התקשורת ושטפו את התאים עם PBS קר.
  8. כדי לבודד חלבון, תאי ליז עם 500 μL של חיץ דגימה 2x Laemmli בתוספת 5% v/v 2-Mercaptoethanol. לדגור על הליזט ב 100 ° C במשך 5 דקות. לנתח lysates התא על ידי אלקטרופורזה ג'ל חלבון ו blotting המערבי21.
    הערה: הרכב של 2x Laemmli חיץ הוא כדלקמן: עבור 500 מ"ל: 5.18 גרם של Tris-HCL, 131.5 מ"ל של גליצרול, 52.5 מ"ל של 20% SDS, 0.5 גרם של ברומופנול כחול, pH סופי 6.8.
  9. הערך את פעילות LightR-Src על-ידי הערכת רמת הזרחן של p130cas אנדוגני ב-Tyr249 ופקסילין ב-TyrY11822,23 (איור 2). הערך את פעילות LightR-bRaf על ידי הערכת רמת הזרחן של MEK1 ב- Ser217/221 ו- ERK1/2 ב- TyrY202/20424,25.

3. ניתוח פונקציונלי של פעילות LightR-Cre

  1. לניתוח פונקציונלי של פעילות LightR-Cre, צלחת 1 x 106 תאי LinXE לכל צלחת תרבית תאים 3.5 ס"מ. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 16-18 שעות.
  2. הדבק את התאים בהתאם לפרוטוקול המתואר בסעיף 2, איור 2A וטבלה משלימה 5. Co-transfect סך של 2 מיקרוגרם DNA, עם יחס של 1:9 של LightR-Cre-iRFP670 ופלסמיד Reporter Floxed-STOP-mCherry2.
  3. לאחר 16-18 שעות לאחר הטרנספקציה, להאיר תאים. הפעלה יעילה של LightR-Cre דורשת תאורה ממושכת. לכן, כדי למנוע פוטוטוקסיות, השתמש בהארה פועמת למשך 8 שעות עם מחזורי 2 שניות ON ו- 20 s OFF באמצעות מערכת מנורות פאנל LED 465 ננומטר הנשלטת על ידי מיקרו-בקר כמפורט בסעיף 2 ובקובץ משלים 1.
  4. בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מטרת אוויר פי 20. לתצוגה חזותית של LightR-Cre-iRFP670, השתמש בערכת מסננים Cy5, ולהדמיה של mCherry מביטוי Floxed-mCherry, השתמש בערכת מסננים RFP.
    הערה: עבור הדמיה, נעשה שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בקוביות אור Cy5/RFP.

4. הכנת דגימות להדמיית תאים חיים

  1. צלחת 2 x 105 תאי HeLa לכל צלחת תרבית רקמה 35 מ"מ במדיה תרבית תאים לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
  2. ברגע שהתאים התחברו והמפגש הוא בערך 60%-70%, הדבק את תאי HeLa עם אחת מהתערובות הבאות: (i) 0.85 מיקרוגרם של FastLightR-Src-mCherry-myc/0.15 מיקרוגרם של Stargazin-iRFP, או (ii) 0.75 מיקרוגרם של FastLightR-bRaf-Venus/0.25 מיקרוגרם של mCherry-ERK2
    הערה: בניסויי FastLightR-Src, Stargazin-iRFP משמש לסימון קרום פלזמה לניתוח התפשטות תאים. אם רצוי ביטוי FastLightR-Src גבוה יותר, ניתן להשמיט את stargazin-iRFP ובמקום זאת להשתמש במיקרוגרם אחד של FastLightR-Src. במקרים אלה, צבע קרום צריך לשמש כדי לדמיין את התאים. כתמי קרום פלזמה משמשים באופן שגרתי לתיוג קרום התא.
  3. מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי למנוע הארה מקרית של התאים ודגרים במשך 16-18 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
  4. בצע את כל השלבים הבאים תחת תאורת אור אדום כדי למנוע הפעלה לא מכוונת של המבנים. חשיפה לאור לבן תגרום להפעלת קינאזות LightR ועלולה להשפיע על התוצאות הבאות.
  5. באותו יום, יש לצפות 3 כיסויי זכוכית עגולים (קוטר 25 מ"מ, עובי 0.17 מ"מ) למשך הלילה בפיברונקטין 5 מ"ג/ליטר ב-PBS בטמפרטורה של 37°C.
  6. יש לשטוף את החלקות עם PBS 16-18 שעות לאחר הטרנספקציה והצלחת ~ 1 x 105 תאי HeLa נגועים על כל כיסוי. יש לדגור בתרבית תאים במשך שעתיים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
    הערה: צפיפות הזריעה הנמוכה נחוצה כדי להבטיח שתאים בשדה הראייה לא נוגעים זה בזה.
  7. הכינו את אמצעי ההדמיה על ידי הוספת FBS למדיית ההדמיה L-15 של לבוביץ לריכוז סופי של 5%. סנן את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר וחמם אותה ל 37 ° C.
  8. שמן מינרלי מחמם מראש ל 37 °C.
  9. שטפו את הכיסויים המכילים את התאים עם PBS פעמיים. אם אתם משתמשים בצבע ממברנה, יש להכתים את התאים בהתאם להוראות היצרן לפני שטיפת הכיסויים.
  10. הניחו בזהירות את הכיסוי בתא הדמיה של תאים חיים. הוסף 1 מ"ל של מדיית הדמיה L-15 לתא.
  11. הוסף 1 מ"ל של שמן מינרלי על גבי המדיה כדי למנוע אידוי במהלך תהליך ההדמיה.
  12. שמור על החדר מוגן מפני אור בטמפרטורה של 37°C עד שהוא מוכן לתמונה.

5. הפעלה והדמיה גלובליות של FastLightR-Src (איור 3)

  1. חברו טבעת טבעת מיקרוסקופ LED כחולה למעבה המיקרוסקופ, והציבו אותה כ-1.5 ס"מ מעל מחזיק הדגימה. חבר את ממסר הבקרה AC/DC עבור טבעת האור למחשב המיקרוסקופ.
    הערה: עבור הניסויים במחקר זה, התאורה נשלטה באמצעות ממשק Transistor-Transistor Logic (TTL) באמצעות תוכנת ההדמיה. תאורה אפיפלואורסצנטית עשויה לשמש גם להפעלה גלובלית של מבני LightR אם מקור תאורה חיצוני אינו זמין. אורכי גל עירור GFP, כגון מסנן עירור 490/20 ננומטר, יעילים בהפעלת LightR.
  2. הניחו את התא על במת מיקרוסקופ שחומם מראש ל-37°C ובחרו תאים המבטאים FastLightR-Src-mCherry ו-Stargazin-iRFP (איור 3B) או FastLightR-bRaf-Venus ו-mCherry ERK-2 (איור 5B).
  3. לחקר ניסויי תאורה והדמיה גלובליים, השתמש ביעדים תואמי מיקרוסקופ ובעלי ביצועים גבוהים (40x) עם תיקון אפוכרומטי, תיקון שדה שטוח וצמצם מספרי גבוה.
    1. למחקרים גלובליים מבוססי תאורה של Src kinase, השתמש בעירור 561/10 ננומטר ובמסנני פליטה של 595/40 ננומטר כדי להמחיש FastLightR-Src-mCherry והשתמש בעירור 640/20 ננומטר ובמסנן פליטה 655LP כדי להמחיש stargazin-iRFP.
    2. למחקרים גלובליים מבוססי תאורה של bRaf kinase, השתמש בעירור 514/10 ננומטר ובמסנני פליטה של 540/21 ננומטר כדי להמחיש FastLightR-bRaf-Venus והשתמש בעירור 561/10 ננומטר ובמסנני פליטה של 595/40 ננומטר כדי להמחיש mCherry-ERK-2.
    3. השתמש במראה פוליכרואית מרובת פסים בכל ערוצי ההדמיה הפלואורסצנטיים.
  4. בהתאם לתנאי הניסוי, שקול את ההמלצות הבאות.
    1. דמיינו את התאים לפחות 10 דקות לפני ההארה כדי לבסס פעילות בסיסית של התאים.
      הערה: תוכנית בסיסית זו נדרשת כדי לקבוע אם הפעלה של FastLightR קינאז על-ידי תאורה גורמת לשינויים כלשהם בהתנהגות התא או בלוקליזציה של חלבונים. ניתן גם לבצע תקופות ארוכות יותר של הדמיה בסיסית כדי לספק מובהקות סטטיסטית גדולה יותר.
    2. בשל ההשבתה המהירה של קינטיקה של FastLightRs, כולל תאים רבים להדמיה עלולה לגרום להשבתה של Src/bRaf בין עמדות הבמה ויכולה להחליש את תגובתו. כדי להימנע משגיאה כזו, תמונה 4 תאים/דקה בעת ניתוח פעילות FastLightR-Kinase בפרוטוקול המתואר ותמונה כל תא שנבחר בכל דקה למשך 110 דקות בסך הכל (קובץ משלים 2).
    3. השתמש בהארה פועמת על גבי תאורה רציפה כדי להפחית את ההשפעות הפוטוטוקסיות הפוטנציאליות של אור כחול. הארה של 12 שניות עבור כל אחד מארבעת התאים לדקה יעילה (קובץ משלים 2, איור 3A).
      הערה: מחזורי ההארה צריכים להיקבע אמפירית עבור מבנים שונים וסוגי מקורות תאורה.
    4. כבו את התאורה במהלך הדמיה תאית כדי למנוע דימום בתעלות הפלואורסצנטיות.
      הערה: הדמיה של תאים רבים מדי בבת אחת תפחית את זמן ההארה הכולל הזמין עבור הדגימה, ותוביל לתגובה מוחלשת כתוצאה מהפעלה לא מספקת.
  5. לאחר ההדמיה, שמור את הסרטים כ- . פורמט קובץ מחסנית TIF לניתוח.
    הערה: בשל התאורה הפחות אחידה עם אפיפלואורסצנטיות GFP בהשוואה לאור טבעתי, ניסויים המשתמשים באפיפלואורסנציה של GFP ידרשו תאורה תכופה יותר. התוצאה היא שפחות תאים מצולמים בכל ניסוי.

6. הפעלה תת-תאית והדמיה של FastLightR-Src (איור 4)

  1. הניחו את התא על במת מיקרוסקופ שחומם מראש ל-37°C ובחרו תא בודד המבטא הן את FastLightR-Src-mCherry והן את Stargazin-iRFP.
  2. בחר את האזורים הספציפיים (ROI) בתוך התא שברצונך להאיר. מחקר זה בוחר שטח קטן בשולי התא הנבחר.
    הערה: להארה מקומית, נעשה שימוש בלייזר 445 ננומטר הממוקד על ידי מודול TIRF במצב FRAP או התקן מיקרו-מראה הנשלט באמצעות ממשק TTL באמצעות תוכנת ההדמיה. כל מערכת תאורה מעוצבת תעבוד עבור ניסויים אלה. אם נעשה שימוש במערכת מבוססת סריקה, קבע את עוצמת הלייזר וההומוגניות להפעלה מספקת ללא נזק לתא.
  3. דמיינו את התא שנבחר כל דקה במשך 20 דקות במצב הבסיסי לפני ההארה, 50 דקות בזמן תאורה מקומית, ואז 20 דקות לאחר ההפעלה למשך 90 דקות בסך הכל (קובץ משלים 2).
  4. עבור הפעלה והשבתה, ספק פרק זמן מתאים המתאים לחלבון המטרה כדי לאפשר נטרולציה מלאה של חלבון LightR. עבור FastLightR-Src, אפשר לפחות 10 דקות של השבתה עבור פעילות שיורית כדי לבצע ablate ואפשר השבתה של 20 דקות בהתקנה הניסיונית שהודגמה עבור תאורה מקומית.
  5. לאחר ההדמיה, שמור את הסרטים בשם . פורמט קובץ מחסנית TIF לניתוח.

7. ניתוח התפשטות תאים

  1. הכן תמונות לעיבוד וניתוח נתונים. ודא שהתמונות נמצאות ב- . תבנית מחסנית TIF. שמור אותם ישירות מתוכנת ההדמיה או המר אותם באמצעות תוכנית קוד פתוח.
  2. הורד את חבילת הסקריפט של CellGeo מהקבצים המכווצים של הנתונים המשלימים26.
    הערה: חבילת CellGeo מכילה מספר קבצי Script שונים. בחר את החבילה הרצויה מהרשימה בהתבסס על סוג הניתוח כפי שמתואר בפרוטוקול סעיפים 7-9.
  3. פתח והפעל את קובץ ה- Script שכותרתו MovThresh כדי ליצור מסיכה של התא.
    1. בחר File > Import (.tif) ובחר את תמונות Stargazin-iRFP של התאים.
    2. סרוק בין המסגרות באמצעות פס הגלילה בפינה השמאלית התחתונה. אם הסף המוצע מתאים, עבור לשלב 7.4.
    3. אם הסף המוצע אינו תואם להתנהגות התא, בחרו 'עקומות חלקות' או 'מותאמות אישית' מתחת ל'בחירת עקומה'. צור את העקומה המותאמת אישית על-ידי גלילה בין המסגרות ולאחר מכן התאמת הסף בצד ימין של החלון.
    4. לחץ על Re-Threshold.
    5. לחץ על קובץ > שמירה כמסיכות, שנה את שם הקובץ ושמור אותו באמצעות האפשרות שמור בשם .
  4. פתח את קובץ המחסנית החדש שנוצר בתוכנית ניתוח תמונות בקוד פתוח.
  5. בחר תמונה > התאם > סף > החל.
  6. בחר נתח > נתח חלקיקים > בדוק את תוצאות התצוגה > אישור.
  7. חישוב השינוי בשטח עבור כל תא על ידי חלוקת השטח בכל זמן נתון בשטח הממוצע של אותו תא לפני הקרנת האור הכחול.
  8. התווה את שינוי האזור כתרשים קו או עמודות.
  9. חשב את הערך הממוצע ורווחי סמך של 90% עבור כל נקודת זמן של כל התאים שטופלו באותם תנאים.

8. ניתוח דינמיקה של קצה התא

  1. הכן את קבצי האוסף באמצעות השלבים המתוארים בסעיף 7 של הפרוטוקול.
  2. פתח והפעל את קובץ ה-script שכותרתו ProActive.
    1. בחר File > Import > Masks (.tif) ובחר במסיכה שנוצרה באמצעות הסקריפט MovThresh .
    2. בחר את הפעילות המעניינת בניתוח בפינה השמאלית התחתונה (בולטת, מושכת או סה"כ).
    3. בחר את סוג הנורמליזציה. בדרך כלל, נורמליזציה של שטח משמשת לניתוחים אלה.
    4. בחר במסגרת ההתייחסות ההתחלתית בעזרת המחוון משמאל. מחוון ההשהיה מימין יקבע את השהיית הזמן בין שתי נקודות זמן המשמשות למדידת השטח שנצבר ואבד על-ידי התא.
    5. אם מספר המסגרת ומספר ההשהיה שנבחרו גדולים באופן נוסף ממספר המסגרות בסרט, תמונת התצוגה המקדימה לא תוצג. אפס ערכים אלה כך שיהיו שווים פחות ממספר המסגרות הכולל.
  3. שנה את הסף לבליטה או לנסיגה על-ידי סימון התיבה עבור עקומה חלקה תחת המקטע תוצאות . פעולה זו ממוצעת את ערכי הסף על פני חלון ספציפי, דבר שיכול לפתור בעיות שבהן תנודות קלות מזוהות כפעילות.
  4. בחר Run the Range כדי לחשב את הפעילות לאורך הזמן שצוין על-ידי מחווני המסגרת וההשהיה.
  5. שמור את הנתונים המספריים על-ידי בחירה באפשרות File > Save As > Results(. mat) והשתמש בהם כדי לקבוע ממוצע של פעילות בולטת או פעילות נסוגה.
  6. קבע את מרווחי בר-סמך של 90% עבור כל נקודת זמן.
    הערה: פעולה זו תשמור מערך של מספר ערכים שונים. קובץ הטקסט "כיצד להשתמש ב-ProActive" הכלול בסקריפט מספק תיאור מפורט של מה מייצג כל ערך וכיצד הם נקבעו26.
  7. שמור את הייצוג החזותי של הפעילות על-ידי בחירה באפשרות File > Save As > Images (.tif).

9. ניתוח משמרות Centroid

  1. עבור ניתוח הסטת צנטרויד, השתמש בכל תוכנה שיכולה לקבוע קואורדינטות צנטרוידיות.
  2. בתוכנת הניתוח, פתח את ערימת התמונות המוסווית של התא המעניין כמתואר בסעיף 7 של הפרוטוקול.
  3. בחר Measure > Integrated Morphometry Analysis ולאחר מכן לחץ על Preferences > Draw Centroid Mark > Check ולאחר מכן בחר Measure.
    1. רשום קואורדינטות צנטרוידיות לפני תנועה (A).
    2. רשום קואורדינטות צנטרוידיות בסוף הניסוי (B).
    3. רשום את הקואורדינטות עבור מרכז תבנית ההארה (C).
  4. כעת, לאחר שנאספו שלוש הנקודות, קבעו את הזווית figure-protocol-1BAC8. θ1 מתאים לזווית ABC ו-θ2 מתאים לזווית figure-protocol-2figure-protocol-3CBA (איור 4Cii). בצע פעולה זו באמצעות המשוואה הבאה:
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    הערה: ניתן להשתמש במחשבון כדי לקבוע את הזוויות והמרחקים ישירות מהקואורדינטות כדי להקל על השימוש.
  5. קבע את התזוזה הצנטרואידית על-ידי הכפלת המרחק שצנטרויד התא עבר בפיקסלים במקדם ההמרה כאשר פיקסל אחד שווה ל- 0.4 מיקרומטר. ההמרה הספציפית של פיקסלים למרחק תהיה תלויה בהגדלה ובהגדרת המצלמה במערכת.
  6. לאחר קביעת זווית ההיסט הצנטרואידים והמרחק, פתחו תוכנת גרפים המסוגלת להפיק תמונות של קואורדינטות קוטביות.
  7. הכנס את זווית ההזזה הצנטרואידית כמדידת θ ואת המרחק שעבר כרדיוס. השתמש ב- ANOVA כדי לבדוק רווחי סמך של 95%.
  8. התווה את התוצאות ושמור את התמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

LightR-Src מתוכנן ונוצר בהתאם לאסטרטגיה המתוארת באיור 1A,B. ניתוח ביוכימי של LightR-Src ניגש לזרחון של מצעי Src אנדוגניים ידועים, p130Cas (Y249)22 ופקסלין (Y118)23 בתגובה לאור כחול ב-60 דקות של הארה רציפה (איור 2B). יש לציין כי לא נצפתה הפעלת רקע של Src קינאז כאשר LightR-Src מתבטא רק בחושך במשך 16-18 שעות לאחר הטרנספקציה. יתר על כן, המוטציה הלא פעילה קטליטית של LightR-Src עם מוטציית D388R אינה גורמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר שלנו מציג גישה אופטוגנטית לחקר מסלולי איתות מגוונים ומדגים את ישימות רחבה שלה בהתמודדות עם שאלות ביולוגיות שונות. מערכת הכלים LightR מספקת מספר יתרונות חיוניים: (1) ויסות אלוסטרי של פעילות החלבון, (2) בקרה זמנית הדוקה של הפעילות שניתן לכוונן כדי להשיג קינטיקה שונה של הפעלה ואינאקטיבציה, (3) רזולוציה מרחבית של פעילות ברמה התת-תאית, (4) ספציפיות של אפנון איתות ופעילות ביולוגית ו-(5) טווח רחב של ישימות לחלבוני מטרה שונים. יש לציין כי LightR משלבת באופן ייחודי את כל היתרונות הללו בכלי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לד"ר מארק שעיה על תרומתו לפיתוח אנזימי LightR והפרוטוקולים הקשורים אליהם. pCAG-iCre היה מתנה מווילסון וונג (פלסמיד Addgene #89573), pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry היה מתנה ממוסיטושי סאטו (פלסמיד Addgene #122963), מבנה bRaf-Venus הנושא מוטציה V600E היה מתנה מד"ר ג'ון או'בריאן (MUSC); גן ERK2 מ-pCEFL-ERK2 (מתנה ממעבדתו של ד"ר צ'נינג דר, UNC) שובט לתוך עמוד השדרה mCherry-C1 כדי לקבל פלסמיד mCherry-ERK2; ו pmiRFP670-N1 היה מתנה מ ולדיסלב Verkhusha (פלסמיד Addgene # 79987). העבודה נתמכה על ידי מענקי NIH R33CA258012, R35GM145318 ו-P01HL151327 ל-AK. עבודה זו נתמכה גם על ידי מלגת ההכשרה T32 VBST T32HL144459 ל- NL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#1.5 כיסויי זכוכית 25 מ"מ עגוליםוורנר אינסטרומנטס 64-0715 
1.5 מ"ל צינורות ארה"ב מדעית cc7682-3394
2x מאגרעבור 500 מ"ל: 5.18 גרם של  Tris-HCL, 131.5 מ"ל גליצרול, 52.5 מ"ל של 20% SDS, 0.5 גרם ברומופנול כחול, pH סופי 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומיBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer תרמו סיינטיפיק F538L
60 LED מיקרוסקופ טבעת אורבולי אופטיקהML46241324כחול LED, קוטר 60 מ"מ, 5 W
אגרוז GoldBiotechA-201
Anti-ERK 1/2 איתותתאי9102
נוגדן Anti-GAPDHinvitrogenAM4300
Anti-GFPClontech632380
Anti-mCherry Anti-Cherry AntibodyinvitrogenM11217
Anti-MEKאיתות תאים9122
Anti-p130CasBD Biosciences610271
איתות תאים אנטי-פקסילין2542
אנטי-פוספו-ERK 1/2 T202/Y204איתות תאי9101
אנטי-פוספו-pY249 p130Casאיתות תאים4014
אנטי-פוספו-Y118איתות תאי2541
תא אנטו-פוספו-S217/221 MEK איתות9121
Arduino תואם ספק כוחמחשב ארגוניLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark סרום בקר עוברי (FBS) Gemini Bio-products100-106משולש 0.1 ומיקרו מומת בחום; M מסנן סטרילי 
bRaf-V600E-Venusמתנה מד"ר ג'ון אובריאן, MUSC
BSA גולד ביוטקA-420 
קרבניצילין (דיסודיום)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask צבע ממברנת פלזמה אדום עמוקinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
DH5a תאים מוכשרים נב C2987H
DMEM קורנינג 15-013-CV
סולם DNA גולד ביו D010-500
dNTPs NEBN04475
Dpn1 אנזים NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, ריאגנטים של קלילנד 
EGTAאקרוס 
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
פיברונקטין מפלזמת בקר סיגמא F1141
FuGENE(R) 6 מגיב טרנספקציה PromegaE2692מגיב טרנספקציה
ג'ל צבע חומצת גרעין ירוקה GoldBioG-740-500
צבע סגול לטעינת ג'ל 6x NEBB7024A
GeneJET תרמו סיינטיפיק ערכת מיצוי ג'לK0692
ערכת GeneJET פלסמיד מיני-פרפתרמו מדעי K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (פי 100) 100 מ"ל 
תאי HEK 293T ATCC CRL-11268
תאי HeLa ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot ממסרלוגרים דיגיטלייםDLI 705020645490ממסר בקרת AC/DC לתאורה:
Kanamycin MonosulfateGold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xקורנינג 10-045-CV 
ל.ב. אגר פישרBP1425-2
מערכת תאורת גידול LEDHQRP884667106091218מערכת מנורות פאנל LED 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aתוכנה להפעלת CellGEO Scripts
MetamorphMolecular DevicesImaging Analysis Software MgCl
2 פישר כימיקלM33-500
שמן מינרליסיגמא M5310
MiniPrep בחירת גנים 96-308
Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים 12 בארותBio-Rad4561085
ביולוגיה מולקולרית בדרגת מים קורנינג 46-000-CV 
מראה פוליכרואית רב-פס89903BSChroma
NaCl פישר כימיקליםS271-3 
PBS עם Ca ו-Mg קורנינג 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2מתנה מהמעבדה של ד"ר צ'אנינג דר,
צינורות UNC PCR labForce1149Z650.2 מ"ל צינורות וכובעים עם 8 רצועות, רצועה קשיחה מחוברת בנפרד מכסי כיפה 
Phusion Plus DNA פולימראזתרמו מדעי F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Polygon 400 Pattern IlluminatorMightexDSI-G-00C
פריימרים IDT
PVDF ממברנותBioRad1620219Immun-Blot PVDF/כריכי נייר פילטר 
T0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ, eDTA, 1x [-] נתרןקורנינג 25-053-CI
Tris-אצטט-EDTA (TAE) 50x פישר BP1332-1 לאלקטרופורזה 
UPlanSApo 40x מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוס1-U2B828
USB TTL תיבתמכשירים לאומיים6501לממשק TTL
&בטא;-מרקפטואתנולפישר כימיקלים O3446I-100
Laemmli נוגדן נוגדנים פקסילין A000066409910250ערכת מיצוי ג'ל  ערכת

מקורות

  1. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
  2. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat Chem Biol. 12 (12), 1059-1064 (2016).
  3. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  4. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  5. Diaz, J. E., et al. A split-Abl kinase for direct activation in cells. Cell Chem Biol. 24 (10), 1250-1258.e4 (2017).
  6. Hongdusit, A., Zwart, P. H., Sankaran, B., Fox, J. M. Minimally disruptive optical control of protein tyrosine phosphatase 1B. Nat Commun. 11 (1), 788(2020).
  7. Wang, J., et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature. 569 (7757), 509-513 (2019).
  8. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  9. Zhou, X. X., Fan, L. Z., Li, P., Shen, K., Lin, M. Z. Optical control of cell signaling by single-chain photoswitchable kinases. Science. 355 (6327), 836-842 (2017).
  10. Shaaya, M., et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity. Elife. 9, e60647(2020).
  11. Chu, P. H., et al. Engineered kinase activation reveals unique morphodynamic phenotypes and associated trafficking for Src family isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12420-12425 (2014).
  12. Kaplan, K. B., Swedlow, J. R., Morgan, D. O., Varmus, H. E. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes Dev. 9 (12), 1505-1517 (1995).
  13. Nihongaki, Y., Suzuki, H., Kawano, F., Sato, M. Genetically engineered photoinducible homodimerization system with improved dimer-forming efficiency. ACS Chem Biol. 9 (3), 617-621 (2014).
  14. Vaidya, A. T., Chen, C. H., Dunlap, J. C., Loros, J. J., Crane, B. R. Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci Signal. 4 (184), ra50(2011).
  15. Zoltowski, B. D., Crane, B. R. Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry. 47 (27), 7012-7019 (2008).
  16. Zoltowski, B. D., et al. Conformational switching in the fungal light sensor vivid. Science. 316 (5827), 1054-1057 (2007).
  17. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  18. Zoltowski, B. D., Vaccaro, B., Crane, B. R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor. Nat Chem Biol. 5 (11), 827-834 (2009).
  19. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: Design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. 53 (1), 14.13.1-14.13.16 (2011).
  20. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6 (1), 6256(2015).
  21. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Cunningham-Edmondson, A. C., Hanks, S. K. p130Cas substrate domain signaling promotes migration, invasion, and survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 1, 39-52 (2009).
  23. Sachdev, S., Bu, Y., Gelman, I. H. Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer. 9, 12(2009).
  24. Cope, N., et al. Mechanism of BRAF activation through biochemical characterization of the recombinant full-length protein. ChemBioChem. 19 (18), 1988-1997 (2018).
  25. Singhal, A., Li, B. T., O'Reilly, E. M. Targeting KRAS in cancer. Nat Med. 30 (4), 969-983 (2024).
  26. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  27. Kaimachnikov, N. P., Kholodenko, B. N. Toggle switches, pulses and oscillations are intrinsic properties of the Src activation/deactivation cycle. FEBS J. 276 (15), 4102-4118 (2009).
  28. Burack, W. R., Shaw, A. S. Live cell imaging of ERK and MEK. J Biol Chem. 280 (5), 3832-3837 (2005).
  29. Baaske, J., et al. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci Rep. 8 (1), 15024(2018).
  30. Dagliyan, O., et al. Computational design of chemogenetic and optogenetic split proteins. Nat Commun. 9 (1), 4042(2018).
  31. Harmer, Z. P., et al. Dynamic multiplexed control and modeling of optogenetic systems using the high-throughput optogenetic platform, Lustro. ACS Synth Biol. 13 (5), 1424-1433 (2024).
  32. Liu, Q., Tucker, C. L. Engineering genetically-encoded tools for optogenetic control of protein activity. Curr Opin Chem Biol. 40, 17-23 (2017).
  33. Morikawa, K., et al. Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nat Commun. 11 (1), 2141(2020).
  34. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr Opin Chem Biol. 15 (6), 789-797 (2011).
  35. Wu, J., et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 11 (1), 3708(2020).
  36. Conlon, P., Gelin-Licht, R., Ganesan, A., Zhang, J., Levchenko, A. Single-cell dynamics and variability of MAPK activity in a yeast differentiation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), E5896-E5905 (2016).
  37. Jacquel, A., et al. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in phosphatidylinositol-3 kinase/AKT are required for caspase activation in monocytes undergoing differentiation into macrophages. Blood. 114 (17), 3633-3641 (2009).
  38. Kholodenko, B. N. Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillations in the mitogen-activated protein kinase cascades. Eur J Biochem. 267 (6), 1583-1588 (2000).
  39. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 165-176 (2006).
  40. Li, Y., Roberts, J., Aghdam, Z. A., Hao, N. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) dynamics determine cell fate in the yeast mating response. J Biol Chem. 292 (50), 20354(2017).
  41. Maeda, M., et al. Periodic signaling controlled by an oscillatory circuit that includes protein kinases ERK2 and PKA. Science. 304 (5672), 875-878 (2004).
  42. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  43. Roche, S., Fumagalli, S., Courtneidge, S. A. Requirement for Src family protein tyrosine kinases in G2 for fibroblast cell division. Science. 269 (5230), 1567-1569 (1995).
  44. Klomp, J. E., et al. Mimicking transient activation of protein kinases in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 14976-14981 (2016).
  45. Karginov, A. V., et al. Dissecting motility signaling through activation of specific Src-effector complexes. Nat Chem Biol. 10 (4), 286-290 (2014).
  46. Cary, L. A., Klinghoffer, R. A., Sachsenmaier, C., Cooper, J. A. Src catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol. 22 (8), 2427-2440 (2002).
  47. Fu, P., et al. Sphingolipids signaling in lamellipodia formation and enhancement of endothelial barrier function. Curr Top Membr. 82, 1-31 (2018).
  48. Tian, X., Zhou, B. Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem. 296, 100509(2021).
  49. Abremski, K., Hoess, R., Sternberg, N. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: Evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32 (4), 1301-1311 (1983).
  50. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259 (3), 1509-1514 (1984).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בקרה אופטוגנטיתדומיין LightRהפעלה באמצעות אור כחולבקרת פרוטאין קינאזדיוק תת-תאינדידת תאיםהיצמדות מוקדית
בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.