בקרה מרחבית-זמנית של פעילות החלבונים באמצעות ויסות אלוסטרי אופטוגנטי

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את היישום של תחום מתג אלוסטרי מהונדס המופעל על ידי אור כחול (LightR) עבור בקרה מרחבית-טמפורלית הפיכה של פעילות החלבון. תוך שימוש ב-Src טירוזין קינאז כמודל, מחקר זה מציע פרוטוקול מפורט לפיתוח ואפיון Src מווסת אור (LightR-Src). הוא מדגים את הרבגוניות של גישה זו בכל סוגי האנזימים.

תקציר

אופטוגנטיקה מציעה פוטנציאל לחיקוי בקרה מרחבית-זמנית מורכבת של פעילות האנזים עד לרזולוציה תת-תאית. עם זאת, רוב הגישות האופטוגנטיות מתמודדות לעתים קרובות עם אתגרים משמעותיים בשילוב יכולות מרובות בכלי יחיד החלים על מגוון רחב של חלבוני מטרה. השגת שליטה מדויקת בקינטיקה של הפעלה/כיבוי, הבטחת מינימום דליפה בחושך והפגנת ביצועים יעילים בתאי יונקים עם דיוק תת-תאי הם חלק מהאתגרים הנפוצים ביותר העומדים בפני תחום זה. פתרון מבטיח טמון ביישום של תחומים רגישים לאור שתוכננו באופן רציונלי כדי לשלוט באופן אלוסטרי בפעילות החלבון. באמצעות אסטרטגיה זו, יצרנו שיטה אופטוגנטית המשלבת את כל התכונות הרצויות. הגישה כוללת שילוב של מודול מתג אלוסטרי מווסת אור (LightR) בחלבון המטרה כדי לווסת את פעילות האנזים באמצעות אור כחול (465 ננומטר). תחום LightR נוצר על ידי קישור שני תחומי קולטי אור חיים (VVD), ויוצר מהדק רגיש לאור שניתן לשלב בלולאה גמישה קטנה בתוך התחום הקטליטי של אנזים. במצבו החשוך, מהדק LightR פתוח, ובכך מעוות את התחום הקטליטי של האנזים ומנטרל אותו. עם חשיפה לאור כחול, תחום LightR נסגר ומשחזר את מבנה התחום הקטליטי ואת פעילות האנזים. בכתב יד זה, אנו דנים באסטרטגיות תכנון ליצירת חלבון קינאז מווסת אור ומדגימים את שליטתו על ידי אור כחול, הפיכות, קינטיקה וויסות מדויק ברמה התת-תאית, המאפשרים דיוק מרחבי-זמני הדוק. תוך שימוש ב-Src טירוזין קינאז כמודל, אנו מציגים פרוטוקול לוויסות יעיל של פעילות LightR-Src kinase. אנו גם מדגימים את ישימות LightR על פני קבוצות אנזימים שונות, ומרחיבים את התועלת של מערכת הכלים במענה לשאלות מכניסטיות של מסלולי איתות במחלות שונות.

מבוא

יכולתו של התא לפרש אותות חיצוניים ולהמיר אותם לתגובות ספציפיות בהקשרים פיזיולוגיים או פתולוגיים מכוונת על ידי קבוצות ייעודיות של חלבונים. תרומתו של כל חלבון לתגובות מורכבות כאלה מוגדרת לעתים קרובות על ידי מיקומו התת-תאי, רמת הביטוי שלו ועיתוי ההפעלה החולפת, המתמשכת או המתנדנדת. ניתוח תפקידם של פרמטרים בודדים אלה בוויסות האיתות דורש שיטות המסוגלות לשכפל בקרה מרחבית-זמנית מורכבת של פעילות החלבונים ברמה התת-תאית. טכניקות מסורתיות כגון מניפולציה גנטית ומעכבי מולקולות קטנות נופלים בהקשר זה. לעומת זאת, טכניקות אופטוגנטיות מבטיחות את הפוטנציאל לנתיחה של תהליכים ביולוגיים על ידי מניפולציה או חיקוי של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. עם זאת, הכלים הנוכחיים חסרים לעתים קרובות ישימות רחבה או שליטה תת-תאית. מספר אסטרטגיות קיימות משיגות רגולציה הדוקה של לוקליזציה של חלבונים ואינטראקציות; אך חסר שליטה ישירה על הפעילות האנזימטית 1,2,3,4. אחרים מאפשרים ויסות של פעילות אנזימטית אך עשויים להיות חסרי שליטה תת-תאית או ישימות מוגבלת על פני קבוצות אנזימים שונות 5,6,7,8,9. במאמר פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה חדשנית להנדסת חלבונים המשלבת את יתרונות האופטוגנטיקה לכלי אחד: ויסות זמני הדוק, קינטיקה כווצת, בקרה תת-תאית ותחולת אנזימים רחבה¹⁰. הנדסנו תחום מווסת אור (LightR) שמתפקד כמתג אלוסטרי כאשר הוא מוכנס לחלבון המטרה המעניין. אסטרטגיה זו מאפשרת בקרה מרחבית-זמנית הדוקה על ההפעלה וההשבתה של חלבון בעל עניין בתאים חיים.

כאן נדונה אסטרטגיית התכנון והיישום של הכלי האופטוגנטי LightR במספר סוגי אנזימים. מחקר זה מציע פרוטוקול שלב אחר שלב לפיתוח, אפיון ויישום של טירוזין קינאז Src מווסת אור (LightR-Src). המחקר מדגים עוד יותר את יכולת הכוונון של קינטיקה של השבתת מתג LightR. מתג LightR המנטרל לאט יכול לשמור על פעילות אנזימים עם תדירות תאורה מופחתת, בעוד שגרסת מחזור מהיר, FastLightR, דורשת תאורה תכופה יותר להפעלה, אך מציגה השבתה מהירה כאשר התאורה כבויה. הפעלה/השבתה של FastLightR-Src בתאים חיים גורמת למחזורים של התפשטות תאים ונסיגה. התפשטות תאים הנגרמת על ידי FastLightR-Src מסכימה עם התפקיד הפיזיולוגי של קינאז Src^11,12. בשל קינטיקה של אי-הפעלה מהירה, FastLightR-Src יכול להיות מווסת גם ברמה תת-תאית, וכתוצאה מכך לעורר בליטות מקומיות וקיטוב תאים. כדי להדגים את הישימות של כלי LightR לסוגים אחרים של אנזימים, אנו מדריכים את הקוראים בקצרה בהצלחה דומה עם קינאז bRaf מהונדס מווסת אור (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) ורקומבינאז DNA ספציפי לאתר Cre (LightR-Cre). בסך הכל, לגישה זו יש פוטנציאל לקדם את הבנתנו של מסלולי איתות מורכבים המעצבים את הפתופיזיולוגיה של מחלות מגוונות.

פרוטוקול

1. תכנון ופיתוח LightR (איור 1)

1. תכנון אסטרטגי
   הערה: תחום LightR מורכב משני תחומי קולטי אור חיים (VVD) המחוברים זה לזה יחד מ- Neurospora crassa^13,14,15,16. VVDs הומודימריזציה בנוכחות אור, ודימריזציה כזו כרוכה בשינוי קונפורמטיבי המביא את N-terminus של מונומר VVD אחד ליד C-terminus של מונומר VVD אחר (איור 1A). חיבור שני דומיינים VVD עם מקשר גמיש יוצר תחום דמוי מהדק שיהיה פתוח בחושך וסגור עם הארה באור כחול. שילוב מהדק זה בתחום הקטליטי של האנזים מאפשר ויסות פעילות בתיווך אור. בחושך, המהדק הפתוח מעוות את התחום, משבית את האנזים; הארה עם האור הכחול גורמת למהדק להיסגר, ומשקמת את פעילות האנזים (איור 1B). תפיסה זו יכולה להיות מיושמת על אנזימים ממשפחות שונות, כולל חלבון קינאזות ורקומבינאזות DNA¹⁰ (איור 1C).
   1. עיצוב LightR
      1. כדי לחבר שתי מולקולות VVD, השתמש במקשר גמיש של 22 חומצות אמינו (GGS)4G(GGS)3 בין כל מונומר.
         הערה: המקשר מספק גמישות ואורך מספיקים כדי להכיל את השיוך והדיסוציאציה של מונומרים VVD.
      2. הוסף קישורי GPGGSGG ו- GSGGPG למסוף N ו- C של תחום LightR, בהתאמה.
         הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את אורך והרכב המקשרים לחלבון ספציפי. מקשרים קצרים יותר מסוג GSG ו-Single Gly נמצאים בשימוש שגרתי כאשר יש צורך ברגולציה הדוקה יותר. גודל לולאת ההחדרה וקרבתה לשאריות קטליטיות, ישפיעו גם הם על הטווח הדינמי של הוויסות. לולאות קצרות יותר נוטות יותר לספק ויסות הדוק יותר של הפעילות הקטליטית אך עלולות לגרום לפעילות נמוכה יותר לאחר התאורה. הרצף של תחום LightR מסופק בטבלה משלימה 1.
   2. הכנסת LightR
      הערה: אתר החדרת LightR מתאים יאפשר רגולציה הדוקה של פונקציית התחום הממוקד מבלי לחסום באופן סטרילי את האינטראקציות שלו או לגרום לשינויים מבניים בלתי הפיכים שישפיעו על תפקידו הביולוגי. מבנה גבישי של חלבון המטרה הוא מדריך אידיאלי בזיהוי אזורי לולאה גמישים כאלה להחדרת LightR. במידת הצורך, המבנה הגבישי של הומולוג קרוב יכול להספיק. להלן כמה קריטריונים כלליים שיש לקחת בחשבון.
      1. ודא שלולאת ההחדרה מצומדת מבנית לאלמנטים הקטליטיים הקריטיים של האנזים. ודא שלולאת ההחדרה שנבחרה אינה אתר קישור קיים לחלבון ושהחדרת LightR אינה עלולה לשבש אינטראקציות תפקודיות כלשהן עקב השפעות סטריות.
      2. כאסטרטגיה ראשונית, החלף חומצת אמינו אחת בלולאת ההחדרה בעת הכנסת LightR. יש לכוון למרכז לולאת ההחדרה המכילה חומצת אמינו קוטבית או קטנה (למשל, Glu, Arg, Lys, Gly) החשופה לממס ואינה מעורבת באינטראקציות תוך-מולקולריות.
         הערה: כאשר תחליף חומצת אמינו אחת אינו יוצר חלבון פונקציונלי, אופטימיזציה של מבנה LightR תדרוש החלפה של חומצות אמינו מרובות או את לולאת ההחדרה כולה. הערך את הפונקציונליות של אתרי הכנסה מרובים עבור LightR בתוך הלולאה המוגדרת.
      3. ודא שאנזים המטרה פועל ללא תלות בוויסות אנדוגני. השג זאת על ידי שימוש בגרסה מוטנטית פעילה של האנזים עבור תבנית ההחדרה.
         הערה: אנזימים מסוג Wild יכולים לשמש גם ליצירת מבנים LightR, אך הדבר עשוי לגרום למערכת מגודרת AND שתהיה מווסתת על ידי מנגנונים אנדוגניים ואור.
      4. בקרות חיוביות ושליליות חיוניות לניתוח פעילות אנזים LightR. השתמש במוטציות פעילות מכוננות של חלבונים אנדוגניים כבקרות חיוביות ובגרסאות מוטנטיות לא פעילות קטליטית של אנזים LightR הממוקד כבקרות שליליות.
         הערה: בעת בחירת מוטציות מנטרלות, חיוני לוודא שהמוטציה מרווחת מספיק מאתר החדרת LightR כדי למנוע הפרעה לבלתי הפיכות של קיפול אנזים LightR. בהתבסס על הקריטריונים לעיל, אתר החדרת LightR בקינאז Src נבחר באזור לולאה גמיש המצומד מבנית למוטיב GXGXXG השמור מאוד באזור לולאה G-loop/גליצין עשיר ב- ATP באמצעות גדיל בטא. חשוב לציין, הוא ממוקם הרחק מכיס קשירת ה-ATP ומאזור קשירת המצע^10,17 (איור 1C (i)).
         הערה: עקב הומולוגיה מבנית בין קינאזות, אתר ההחדרה LightR ב-bRaf נבחר באותה לולאה מבנית כמו אתר ההחדרה ב-Src (איור 1C (ii)).
         הערה: בהתבסס על העקרונות המפורטים בסעיף 1.1.2., אתר החדרת LightR ב- Cre recombinase, שאינו קינאז, נבחר באחת הלולאות הגמישות המרוחקות מהליבה הקטליטית, כלומר אתר קשירת ה- DNA. עם זאת, לולאת ההחדרה עדיין מצומדת מבנית לשאריות קטליטיות, קריטיות בתחום קשירת הדנ"א, דרך סליל α כדי להבטיח את הצלחת פונקציונליות LightR-Cre (איור 1C (iii)). כל אתרי ההחדרה עם בקרות חיוביות ושליליות עבור אנזימים שונים המתוארים בפרוטוקול הנוכחי מפורטים בטבלה משלימה 2.
   3. פיתוח FastLightR.
      הערה: הכנסת מוטציית I85V לשני ה-VVD ב-LightR מאפשרת דינמיקת הפעלה-השבתה מהירה יותר, המיוחסת להמרה מהירה של המוטציה למצב אפל^18,19. הדור של FastLightR-Src ו- FastLightR-bRaf עם קינטיקה של אינאקטיבציה מהירה מאפשר שליטה זמנית הדוקה בהפעלה ובהשבתה. הוא מאפשר השגת ויסות תת-תאי של LightR-Src בתאים חיים.
      הערה: פעילות Cre recombinase גורמת לרקומבינציה בלתי הפיכה של DNA; לפיכך, תכונות ההפיכות של LightR אינן ישימות.
      הערה: כדי לפשט את זיהוי מבנה LightR, ניתן להצמיד חלבון פלואורסצנטי או כל תג מתאים אחר למסוף N או C של חלבון המטרה. מחקר זה השתמש ב- mCherry-myc עבור LightR-Src, ונוס עבור LightR-bRaf, ו- miRFP670 עבור רקומבינאז LightR-Cre.
2. אסטרטגיית שיבוט
   הערה: גישת השיבוט, בניגוד לגישות מסורתיות, מבוססת על מוטגנזה מכוונת אתר שאינה מסתמכת על אתרי הגבלה ספציפיים^10,20.
   1. דור של "Megaprimer"
      1. קודון-אופטימיזציה של הגנים LightR כדי להבטיח ביטוי יציב של שני רצפי DNA VVD טנדם ממקור פטרייתי בתאי יונקים ולהפוך את הרצפים שונים ככל האפשר לשיבוט ללא שגיאות באמצעות PCR. כדי לבצע מיטוב קודון, בצע את השלבים 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. יישר את רצף חומצות האמינו של VVDs ואת המקשרים שנבחרו זה לצד זה כדי ליצור את מפת הרצף התיאורטית של LightR.
      3. הדבק את הרצף בכל פלטפורמת אופטימיזציה מקוונת של קודון המשתמשת באלגוריתם מתקדם לאופטימיזציה של קודון כדי לקבוע את אפשרות הרצף הטובה ביותר עם מורכבות מינימלית. ודא שאורגניזם היעד נבחר, מסגרת הקריאה נשמרת ורצפי VVD נבחרים למיטוב.
      4. השג DNA של LightR כמקטע מסונתז מותאם אישית (ראה טבלה משלימה 1) או ממבנה LightR¹⁰ שפורסם בעבר.
      5. הגבירו את הגן LightR כדי ליצור "Megaprimer" באמצעות אסטרטגיית²⁰ שתוארה קודם לכן המתוארת באיור 1D. סנתז את LightR "Megaprimer" באמצעות PCR בעקבות המלצות היצרן עבור DNA פולימראז ספציפי באמצעות תערובת תגובת PCR הבאה:
         מאגר תואם 5x DNA פולימראז: 10 μL
         100 מיקרומטר מגה-פריימר קדמי: 0.5 μL
         100 מיקרומטר מגה-פריימר הפוך: 0.5 μL
         תערובת dNTP של 10 ננומטר: 2 מיקרוליטר
         DNA פולימראז (2000 יחידות/מ"ל): 1 μl (0.02 U/μL)
         50 ng DNA תבנית: 1 μL
         מים בדרגת PCR: 35 מיקרוליטר
         הערה: כאן, נאמנות גבוהה, התחלה חמה DNA פולימראז עם טמפרטורות חישול פריימר אוניברסלי משמשים.
      6. להפריד את megaprimer וכתוצאה מכך על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. אורכו של המוצר יהיה כ-1000 נוקלאוטידים. הבלו את המגפריימר מג'ל האגרוז וטיהרו באמצעות ערכת מיצוי ג'ל, בהתאם להמלצות היצרן או בטכניקה מקבילה.
   2. החדרת גן LightR באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר: החדרת LightR, החלפת חומצת אמינו רצויה או אורך של חומצות אמינו. פלסמיד התבנית יהיה זה שבו מוכנס תחום LightR. בצע תגובת PCR כמתואר²⁰ קודם לכן באמצעות התערובת הבאה.
      מאגר תואם 5x DNA פולימראז: 5 μL
      תערובת dNTP של 10 ננומטר: 1 מיקרוליטר
      DNA פולימראז (2000 יחידות/מ"ל): 1 μL (0.02 U/μL)
      50 ng תבנית יעד DNA: 1 μL
      Megaprimer מופק (משקל מחושב): 10 μL
      DMSO: 2.5 μL
      מים בדרגת PCR: 2.5 μL
      הערה: מסת מגה-פריימר (ng) = יחס מוסף/וקטור מולארי רצוי x מסה של יחס וקטור x של הוספה לאורכים וקטוריים. היחס המולרי הרצוי בין הוספה לווקטור הוא 3/1.
   3. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, יש להוסיף 1 μL של אנזים DpnI (2000 יחידות/מ"ל) כדי לעכל באופן סלקטיבי רק את הדנ"א העודף והמתילציה ולדגור על התערובת ב-37°C למשך 1-1.5 שעות. זה יגדיל באופן משמעותי את התשואה של המבנה שונה.
   4. המר 1-2 μL של תגובת PCR לתאים מוסמכים DH5α בהתאם לפרוטוקולי היצרן.
   5. צלחת חיידקים מותמרים על צלחת מרק לוריא (LB)-אגר עם אנטיביוטיקה מתאימה לבחירה. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה או בטמפרטורת החדר (RT; 25-30°C) למשך 72 שעות.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות LB עם מושבות הגדלות עליהן ב- 4 ° C למשך עד חודש אחד, וניתן להשהות את הפרוטוקול.
   6. PCR מסך מושבה
      1. עבור סינון מושבה מבוסס PCR, תכננו פריימרים שמכניסים את LightR ומכוונים לדנ"א כדי לייצר כ-400-700 מקטעים bp.
      2. הוסף כמות קטנה של מושבה מצלחת LB לתערובת ה- PCR המסופקת להלן והמשך ל- thermocycling בהתאם להמלצות היצרן עבור ה- DNA פולימראז הספציפי.
         2x Taq RED מאסטר מיקס: 5 μL
         מים בדרגת PCR : 5 μL
         100 מיקרומטר פריימר קדמי : 0.5 μL
         100 מיקרומטר פריימר הפוך: 0.5 מיקרומטר
      3. בדוק מושבות חיוביות על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose.
      4. בחרו את המושבות שיצרו את גודל מוצר ה-PCR הרצוי וחסנו אותן בנפרד ל-3 מ"ל של מרק LB עם האנטיביוטיקה, בהתאם לעמידות האנטיביוטית בעמוד השדרה של הפלסמיד. לאחר מכן, לדגור ולנער ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.
      5. יש לחלץ DNA פלסמיד מתרבית נוזלית בהתאם להוראות היצרן של ערכת טיהור הפלסמיד למיצוי DNA פלסמיד ולוודא את נוכחות העלון על ידי ריצוף.
         הערה: פריימרים לשיבוט מסוכמים בטבלה משלימה 3.

2. ציפוי תאים וניתוח ביוכימי של פעילות האנזים LightR (איור 2A)

1. לניתוח ביוכימי של LightR-kinases (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), צלחת 1 x 10⁶ תאי LinXE לכל צלחת תרבית תאים בגודל 3.5 ס"מ עבור כל קבוצת ניסוי. ראו טבלה משלימה 4.
2. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 16-18 שעות.
3. למחרת, הדבק את התאים עם מבנה הדנ"א שנבחר, באמצעות מגיב טרנספקציה מתאים בהתאם להמלצות היצרן (טבלה משלימה 4).
   הערה: מגיב הטרנספקציה האופטימלי יהיה תלוי במבנה, בווקטור ובסוג התאים המשמשים. במחקר זה נעשה שימוש ב-2 מק"ג דנ"א בצלחת בגודל 3.5 ס"מ באמצעות מגיב טרנספקציה. יש לבצע בדיקות אמפיריות כדי לקבוע את מגיב הטרנספקציה האופטימלי. מכיוון שמבנים נגועים יבטאו חלבונים המווסתים על ידי אור כחול, כל השלבים הבאים בטיפול בתאים נגועים חייבים להתבצע תחת אור אדום. עטפו את הצלחות בתאים נגועים ברדיד אלומיניום לפני הצבתם באינקובטור כדי למנוע תאורה מקרית.
4. לאחר 16-18 שעות של טרנספקציה לחשוף את התאים לאור כחול¹⁰. כדי לבצע זאת, מקם מערכת מנורות פאנל דיודה פולטת אור (LED) 465 ננומטר באינקובטור תרבית הרקמות. הניחו לוח פרספקס מחורר 10 ס"מ מעל המנורה לקבלת ההארה הרצויה של 3 mW/cm² (קובץ משלים 1). יש צורך בלוח מחורר כדי לשמור על זרימת אוויר רציפה באינקובטור. להאיר תאים לתקופה הרצויה.
5. להפעלה של LightR-Src ו- LightR-bRaf, השתמש בתאורה רציפה. לתאורה רציפה, הפעל וכבה את לוח ה-LED באופן ידני.
6. לשמירה על מחזור ההפעלה/אי-ההפעלה של FastLightR Src, השתמש במחזורי הפעלה/כיבוי הנשלטים באופן ידני או על-ידי מיקרו-בקר.
   הערה: ניתן להשתמש במספר ערכות כלי תוכנה המספקות סביבת פיתוח משולבת (IDE) לכתיבה והעלאה של הקוד הנדרש. ערכות כלים אלה תומכות בתכנות C/C++ ומציעות גישה כללית לקלט/פלט (GPIO), החיונית לשליטה בתאורה הפועמת. תיאור מפורט של הפרוטוקולים והקוד המשמשים למטרות אלה מתואר בקובץ משלים 1.
7. בסוף נקודות הזמן המתאימות של הניסוי (טבלה משלימה 4), קצרו את התאים תחת אורות אדומים בטוחים. שאפו את התקשורת ושטפו את התאים עם PBS קר.
8. כדי לבודד חלבון, תאי ליז עם 500 μL של חיץ דגימה 2x Laemmli בתוספת 5% v/v 2-Mercaptoethanol. לדגור על הליזט ב 100 ° C במשך 5 דקות. לנתח lysates התא על ידי אלקטרופורזה ג'ל חלבון ו blotting המערבי²¹.
   הערה: הרכב של 2x Laemmli חיץ הוא כדלקמן: עבור 500 מ"ל: 5.18 גרם של Tris-HCL, 131.5 מ"ל של גליצרול, 52.5 מ"ל של 20% SDS, 0.5 גרם של ברומופנול כחול, pH סופי 6.8.
9. הערך את פעילות LightR-Src על-ידי הערכת רמת הזרחן של p130cas אנדוגני ב-Tyr249 ופקסילין ב-TyrY118^22,23 (איור 2). הערך את פעילות LightR-bRaf על ידי הערכת רמת הזרחן של MEK1 ב- Ser217/221 ו- ERK1/2 ב- TyrY202/204^24,25.

3. ניתוח פונקציונלי של פעילות LightR-Cre

1. לניתוח פונקציונלי של פעילות LightR-Cre, צלחת 1 x 10⁶ תאי LinXE לכל צלחת תרבית תאים 3.5 ס"מ. לדגור על תאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 16-18 שעות.
2. הדבק את התאים בהתאם לפרוטוקול המתואר בסעיף 2, איור 2A וטבלה משלימה 5. Co-transfect סך של 2 מיקרוגרם DNA, עם יחס של 1:9 של LightR-Cre-iRFP670 ופלסמיד Reporter Floxed-STOP-mCherry².
3. לאחר 16-18 שעות לאחר הטרנספקציה, להאיר תאים. הפעלה יעילה של LightR-Cre דורשת תאורה ממושכת. לכן, כדי למנוע פוטוטוקסיות, השתמש בהארה פועמת למשך 8 שעות עם מחזורי 2 שניות ON ו- 20 s OFF באמצעות מערכת מנורות פאנל LED 465 ננומטר הנשלטת על ידי מיקרו-בקר כמפורט בסעיף 2 ובקובץ משלים 1.
4. בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מטרת אוויר פי 20. לתצוגה חזותית של LightR-Cre-iRFP670, השתמש בערכת מסננים Cy5, ולהדמיה של mCherry מביטוי Floxed-mCherry, השתמש בערכת מסננים RFP.
   הערה: עבור הדמיה, נעשה שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בקוביות אור Cy5/RFP.

4. הכנת דגימות להדמיית תאים חיים

1. צלחת 2 x 10⁵ תאי HeLa לכל צלחת תרבית רקמה 35 מ"מ במדיה תרבית תאים לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
2. ברגע שהתאים התחברו והמפגש הוא בערך 60%-70%, הדבק את תאי HeLa עם אחת מהתערובות הבאות: (i) 0.85 מיקרוגרם של FastLightR-Src-mCherry-myc/0.15 מיקרוגרם של Stargazin-iRFP, או (ii) 0.75 מיקרוגרם של FastLightR-bRaf-Venus/0.25 מיקרוגרם של mCherry-ERK2
   הערה: בניסויי FastLightR-Src, Stargazin-iRFP משמש לסימון קרום פלזמה לניתוח התפשטות תאים. אם רצוי ביטוי FastLightR-Src גבוה יותר, ניתן להשמיט את stargazin-iRFP ובמקום זאת להשתמש במיקרוגרם אחד של FastLightR-Src. במקרים אלה, צבע קרום צריך לשמש כדי לדמיין את התאים. כתמי קרום פלזמה משמשים באופן שגרתי לתיוג קרום התא.
3. מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי למנוע הארה מקרית של התאים ודגרים במשך 16-18 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂.
4. בצע את כל השלבים הבאים תחת תאורת אור אדום כדי למנוע הפעלה לא מכוונת של המבנים. חשיפה לאור לבן תגרום להפעלת קינאזות LightR ועלולה להשפיע על התוצאות הבאות.
5. באותו יום, יש לצפות 3 כיסויי זכוכית עגולים (קוטר 25 מ"מ, עובי 0.17 מ"מ) למשך הלילה בפיברונקטין 5 מ"ג/ליטר ב-PBS בטמפרטורה של 37°C.
6. יש לשטוף את החלקות עם PBS 16-18 שעות לאחר הטרנספקציה והצלחת ~ 1 x 10⁵ תאי HeLa נגועים על כל כיסוי. יש לדגור בתרבית תאים במשך שעתיים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
   הערה: צפיפות הזריעה הנמוכה נחוצה כדי להבטיח שתאים בשדה הראייה לא נוגעים זה בזה.
7. הכינו את אמצעי ההדמיה על ידי הוספת FBS למדיית ההדמיה L-15 של לבוביץ לריכוז סופי של 5%. סנן את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר וחמם אותה ל 37 ° C.
8. שמן מינרלי מחמם מראש ל 37 °C.
9. שטפו את הכיסויים המכילים את התאים עם PBS פעמיים. אם אתם משתמשים בצבע ממברנה, יש להכתים את התאים בהתאם להוראות היצרן לפני שטיפת הכיסויים.
10. הניחו בזהירות את הכיסוי בתא הדמיה של תאים חיים. הוסף 1 מ"ל של מדיית הדמיה L-15 לתא.
11. הוסף 1 מ"ל של שמן מינרלי על גבי המדיה כדי למנוע אידוי במהלך תהליך ההדמיה.
12. שמור על החדר מוגן מפני אור בטמפרטורה של 37°C עד שהוא מוכן לתמונה.

5. הפעלה והדמיה גלובליות של FastLightR-Src (איור 3)

1. חברו טבעת טבעת מיקרוסקופ LED כחולה למעבה המיקרוסקופ, והציבו אותה כ-1.5 ס"מ מעל מחזיק הדגימה. חבר את ממסר הבקרה AC/DC עבור טבעת האור למחשב המיקרוסקופ.
   הערה: עבור הניסויים במחקר זה, התאורה נשלטה באמצעות ממשק Transistor-Transistor Logic (TTL) באמצעות תוכנת ההדמיה. תאורה אפיפלואורסצנטית עשויה לשמש גם להפעלה גלובלית של מבני LightR אם מקור תאורה חיצוני אינו זמין. אורכי גל עירור GFP, כגון מסנן עירור 490/20 ננומטר, יעילים בהפעלת LightR.
2. הניחו את התא על במת מיקרוסקופ שחומם מראש ל-37°C ובחרו תאים המבטאים FastLightR-Src-mCherry ו-Stargazin-iRFP (איור 3B) או FastLightR-bRaf-Venus ו-mCherry ERK-2 (איור 5B).
3. לחקר ניסויי תאורה והדמיה גלובליים, השתמש ביעדים תואמי מיקרוסקופ ובעלי ביצועים גבוהים (40x) עם תיקון אפוכרומטי, תיקון שדה שטוח וצמצם מספרי גבוה.
   1. למחקרים גלובליים מבוססי תאורה של Src kinase, השתמש בעירור 561/10 ננומטר ובמסנני פליטה של 595/40 ננומטר כדי להמחיש FastLightR-Src-mCherry והשתמש בעירור 640/20 ננומטר ובמסנן פליטה 655LP כדי להמחיש stargazin-iRFP.
   2. למחקרים גלובליים מבוססי תאורה של bRaf kinase, השתמש בעירור 514/10 ננומטר ובמסנני פליטה של 540/21 ננומטר כדי להמחיש FastLightR-bRaf-Venus והשתמש בעירור 561/10 ננומטר ובמסנני פליטה של 595/40 ננומטר כדי להמחיש mCherry-ERK-2.
   3. השתמש במראה פוליכרואית מרובת פסים בכל ערוצי ההדמיה הפלואורסצנטיים.
4. בהתאם לתנאי הניסוי, שקול את ההמלצות הבאות.
   1. דמיינו את התאים לפחות 10 דקות לפני ההארה כדי לבסס פעילות בסיסית של התאים.
      הערה: תוכנית בסיסית זו נדרשת כדי לקבוע אם הפעלה של FastLightR קינאז על-ידי תאורה גורמת לשינויים כלשהם בהתנהגות התא או בלוקליזציה של חלבונים. ניתן גם לבצע תקופות ארוכות יותר של הדמיה בסיסית כדי לספק מובהקות סטטיסטית גדולה יותר.
   2. בשל ההשבתה המהירה של קינטיקה של FastLightRs, כולל תאים רבים להדמיה עלולה לגרום להשבתה של Src/bRaf בין עמדות הבמה ויכולה להחליש את תגובתו. כדי להימנע משגיאה כזו, תמונה 4 תאים/דקה בעת ניתוח פעילות FastLightR-Kinase בפרוטוקול המתואר ותמונה כל תא שנבחר בכל דקה למשך 110 דקות בסך הכל (קובץ משלים 2).
   3. השתמש בהארה פועמת על גבי תאורה רציפה כדי להפחית את ההשפעות הפוטוטוקסיות הפוטנציאליות של אור כחול. הארה של 12 שניות עבור כל אחד מארבעת התאים לדקה יעילה (קובץ משלים 2, איור 3A).
      הערה: מחזורי ההארה צריכים להיקבע אמפירית עבור מבנים שונים וסוגי מקורות תאורה.
   4. כבו את התאורה במהלך הדמיה תאית כדי למנוע דימום בתעלות הפלואורסצנטיות.
      הערה: הדמיה של תאים רבים מדי בבת אחת תפחית את זמן ההארה הכולל הזמין עבור הדגימה, ותוביל לתגובה מוחלשת כתוצאה מהפעלה לא מספקת.
5. לאחר ההדמיה, שמור את הסרטים כ- . פורמט קובץ מחסנית TIF לניתוח.
   הערה: בשל התאורה הפחות אחידה עם אפיפלואורסצנטיות GFP בהשוואה לאור טבעתי, ניסויים המשתמשים באפיפלואורסנציה של GFP ידרשו תאורה תכופה יותר. התוצאה היא שפחות תאים מצולמים בכל ניסוי.

6. הפעלה תת-תאית והדמיה של FastLightR-Src (איור 4)

1. הניחו את התא על במת מיקרוסקופ שחומם מראש ל-37°C ובחרו תא בודד המבטא הן את FastLightR-Src-mCherry והן את Stargazin-iRFP.
2. בחר את האזורים הספציפיים (ROI) בתוך התא שברצונך להאיר. מחקר זה בוחר שטח קטן בשולי התא הנבחר.
   הערה: להארה מקומית, נעשה שימוש בלייזר 445 ננומטר הממוקד על ידי מודול TIRF במצב FRAP או התקן מיקרו-מראה הנשלט באמצעות ממשק TTL באמצעות תוכנת ההדמיה. כל מערכת תאורה מעוצבת תעבוד עבור ניסויים אלה. אם נעשה שימוש במערכת מבוססת סריקה, קבע את עוצמת הלייזר וההומוגניות להפעלה מספקת ללא נזק לתא.
3. דמיינו את התא שנבחר כל דקה במשך 20 דקות במצב הבסיסי לפני ההארה, 50 דקות בזמן תאורה מקומית, ואז 20 דקות לאחר ההפעלה למשך 90 דקות בסך הכל (קובץ משלים 2).
4. עבור הפעלה והשבתה, ספק פרק זמן מתאים המתאים לחלבון המטרה כדי לאפשר נטרולציה מלאה של חלבון LightR. עבור FastLightR-Src, אפשר לפחות 10 דקות של השבתה עבור פעילות שיורית כדי לבצע ablate ואפשר השבתה של 20 דקות בהתקנה הניסיונית שהודגמה עבור תאורה מקומית.
5. לאחר ההדמיה, שמור את הסרטים בשם . פורמט קובץ מחסנית TIF לניתוח.

7. ניתוח התפשטות תאים

1. הכן תמונות לעיבוד וניתוח נתונים. ודא שהתמונות נמצאות ב- . תבנית מחסנית TIF. שמור אותם ישירות מתוכנת ההדמיה או המר אותם באמצעות תוכנית קוד פתוח.
2. הורד את חבילת הסקריפט של CellGeo מהקבצים המכווצים של הנתונים המשלימים²⁶.
   הערה: חבילת CellGeo מכילה מספר קבצי Script שונים. בחר את החבילה הרצויה מהרשימה בהתבסס על סוג הניתוח כפי שמתואר בפרוטוקול סעיפים 7-9.
3. פתח והפעל את קובץ ה- Script שכותרתו MovThresh כדי ליצור מסיכה של התא.
   1. בחר File > Import (.tif) ובחר את תמונות Stargazin-iRFP של התאים.
   2. סרוק בין המסגרות באמצעות פס הגלילה בפינה השמאלית התחתונה. אם הסף המוצע מתאים, עבור לשלב 7.4.
   3. אם הסף המוצע אינו תואם להתנהגות התא, בחרו 'עקומות חלקות' או 'מותאמות אישית' מתחת ל'בחירת עקומה'. צור את העקומה המותאמת אישית על-ידי גלילה בין המסגרות ולאחר מכן התאמת הסף בצד ימין של החלון.
   4. לחץ על Re-Threshold.
   5. לחץ על קובץ > שמירה כמסיכות, שנה את שם הקובץ ושמור אותו באמצעות האפשרות שמור בשם .
4. פתח את קובץ המחסנית החדש שנוצר בתוכנית ניתוח תמונות בקוד פתוח.
5. בחר תמונה > התאם > סף > החל.
6. בחר נתח > נתח חלקיקים > בדוק את תוצאות התצוגה > אישור.
7. חישוב השינוי בשטח עבור כל תא על ידי חלוקת השטח בכל זמן נתון בשטח הממוצע של אותו תא לפני הקרנת האור הכחול.
8. התווה את שינוי האזור כתרשים קו או עמודות.
9. חשב את הערך הממוצע ורווחי סמך של 90% עבור כל נקודת זמן של כל התאים שטופלו באותם תנאים.

8. ניתוח דינמיקה של קצה התא

1. הכן את קבצי האוסף באמצעות השלבים המתוארים בסעיף 7 של הפרוטוקול.
2. פתח והפעל את קובץ ה-script שכותרתו ProActive.
   1. בחר File > Import > Masks (.tif) ובחר במסיכה שנוצרה באמצעות הסקריפט MovThresh .
   2. בחר את הפעילות המעניינת בניתוח בפינה השמאלית התחתונה (בולטת, מושכת או סה"כ).
   3. בחר את סוג הנורמליזציה. בדרך כלל, נורמליזציה של שטח משמשת לניתוחים אלה.
   4. בחר במסגרת ההתייחסות ההתחלתית בעזרת המחוון משמאל. מחוון ההשהיה מימין יקבע את השהיית הזמן בין שתי נקודות זמן המשמשות למדידת השטח שנצבר ואבד על-ידי התא.
   5. אם מספר המסגרת ומספר ההשהיה שנבחרו גדולים באופן נוסף ממספר המסגרות בסרט, תמונת התצוגה המקדימה לא תוצג. אפס ערכים אלה כך שיהיו שווים פחות ממספר המסגרות הכולל.
3. שנה את הסף לבליטה או לנסיגה על-ידי סימון התיבה עבור עקומה חלקה תחת המקטע תוצאות . פעולה זו ממוצעת את ערכי הסף על פני חלון ספציפי, דבר שיכול לפתור בעיות שבהן תנודות קלות מזוהות כפעילות.
4. בחר Run the Range כדי לחשב את הפעילות לאורך הזמן שצוין על-ידי מחווני המסגרת וההשהיה.
5. שמור את הנתונים המספריים על-ידי בחירה באפשרות File > Save As > Results(. mat) והשתמש בהם כדי לקבוע ממוצע של פעילות בולטת או פעילות נסוגה.
6. קבע את מרווחי בר-סמך של 90% עבור כל נקודת זמן.
   הערה: פעולה זו תשמור מערך של מספר ערכים שונים. קובץ הטקסט "כיצד להשתמש ב-ProActive" הכלול בסקריפט מספק תיאור מפורט של מה מייצג כל ערך וכיצד הם נקבעו²⁶.
7. שמור את הייצוג החזותי של הפעילות על-ידי בחירה באפשרות File > Save As > Images (.tif).

9. ניתוח משמרות Centroid

1. עבור ניתוח הסטת צנטרויד, השתמש בכל תוכנה שיכולה לקבוע קואורדינטות צנטרוידיות.
2. בתוכנת הניתוח, פתח את ערימת התמונות המוסווית של התא המעניין כמתואר בסעיף 7 של הפרוטוקול.
3. בחר Measure > Integrated Morphometry Analysis ולאחר מכן לחץ על Preferences > Draw Centroid Mark > Check ולאחר מכן בחר Measure.
   1. רשום קואורדינטות צנטרוידיות לפני תנועה (A).
   2. רשום קואורדינטות צנטרוידיות בסוף הניסוי (B).
   3. רשום את הקואורדינטות עבור מרכז תבנית ההארה (C).
4. כעת, לאחר שנאספו שלוש הנקודות, קבעו את הזווית BAC⁸. θ₁ מתאים לזווית ABC ו-θ₂ מתאים לזווית CBA (איור 4Cii). בצע פעולה זו באמצעות המשוואה הבאה:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   הערה: ניתן להשתמש במחשבון כדי לקבוע את הזוויות והמרחקים ישירות מהקואורדינטות כדי להקל על השימוש.
5. קבע את התזוזה הצנטרואידית על-ידי הכפלת המרחק שצנטרויד התא עבר בפיקסלים במקדם ההמרה כאשר פיקסל אחד שווה ל- 0.4 מיקרומטר. ההמרה הספציפית של פיקסלים למרחק תהיה תלויה בהגדלה ובהגדרת המצלמה במערכת.
6. לאחר קביעת זווית ההיסט הצנטרואידים והמרחק, פתחו תוכנת גרפים המסוגלת להפיק תמונות של קואורדינטות קוטביות.
7. הכנס את זווית ההזזה הצנטרואידית כמדידת θ ואת המרחק שעבר כרדיוס. השתמש ב- ANOVA כדי לבדוק רווחי סמך של 95%.
8. התווה את התוצאות ושמור את התמונה.

תוצאות

LightR-Src מתוכנן ונוצר בהתאם לאסטרטגיה המתוארת באיור 1A,B. ניתוח ביוכימי של LightR-Src ניגש לזרחון של מצעי Src אנדוגניים ידועים, p130Cas (Y249)²² ופקסלין (Y118)²³ בתגובה לאור כחול ב-60 דקות של הארה רציפה (איור 2B). יש לציין כי לא נצפתה הפעלת רקע של Src קינאז כאשר LightR-Src מתבטא רק בחושך במשך 16-18 שעות לאחר הטרנספקציה. יתר על כן, המוטציה הלא פעילה קטליטית של LightR-Src עם מוטציית D388R אינה גורמת לזרחון של מצע Src, מה שמדגים שהזרחן מתבצע על-ידי LightR-Src פעיל ולא נגרם על-ידי השפעה לא ספציפית של תאורת אור כחול (איור 2B). בהסתמך על דיווחים על פעילות תנודתית של קינאז Src²⁷ בתאים חיים, חקרנו אם ניתן לכוונן את LightR-Src כך שיפגין הפעלה מחזורית. LightR-Src המקורי הציג קינטיקה של השבתה איטית (איור 2C), מה שגרם ליצירת גרסה חדשה, Fast-LightR-Src, המכילה את מוטציית I85V בשני ה-VVD. איור 2D ממחיש ש-Fast-LightR-Src מראה קינטיקה של השבתה מהירה יותר באופן משמעותי, ומשבית לחלוטין תוך 10 דקות מרגע כיבוי האור, בהשוואה ליותר משעה עבור LightR-Src. באמצעות FastLightR-Src הצלחנו גם להשיג מחזורים חוזרים ונשנים של הפעלה/אי-הפעלה (איור 2E). תוצאות אלה מדגימות באופן קולקטיבי את יכולתו של כלי LightR להשיג ויסות ספציפי ומבוקר היטב של פעילות Src בתאים חיים.

היישום של FastLightR-Src מאפשר גם להעריך את ההשפעות של הפעלת Src חולפת על מורפודינמיקה של תאים. הפעלה של FastLightR-Src בתאי HeLa גורמת להתפשטות תאים, ותהליך זה נעצר ברגע ש- FastLightR-Src מושבת. עם ההפעלה, צפינו בטרנסלוקציה של FastLightR-Src מהתא הפרי-גרעיני להידבקויות מוקדיות וקרום פלזמה, התנהגות שהוצגה על-ידי קינאז Src^11,12 מסוג פראי. תאים מאירים המבטאים את המוטציה הלא פעילה קטליטית D388RLightR-Src אינם מראים השפעות התפשטות כאלה (איור 3B,C). זה עוד מאשר כי FastLightR-Src מתפקד באופן דומה למקבילו מסוג פראי. הארה מקומית של אזור התא גורמת להפעלה מקומית של FastLightR-Src המסומנת על ידי הצטברות מקומית LightR Src בהידבקות מוקדית ומלווה בהיווצרות בליטות קרום מקומיות (איור 4B (i), (ii)) והיסט צנטרויד התא (איור 4C (i), (ii)) וכתוצאה מכך תנועת התא לכיוון האור. לאחר שביססנו את היישום של כלי LightR לרגולציה של קינאז Src, אנו מציגים את השירות הרחב של LightR המורחב לרגולציה של bRaf kinase ו- DNA recombinase Cre. ניתוח של LightR-bRaf מראה זרחן המושרה על ידי אור של המצע האנדוגני של bRaf, MEK1, וזרחן במורד הזרם של קינאזות ERK1/2^24,25 ברמות דומות לאלה של מוטנט bRaf פעיל באופן מכונן (V600E) (איור 5A). לעומת זאת, D575RLightR-bRaf שאינו פעיל קטליטית אינו מדגים זרחן MEK1 ו-ERK1/2, בדומה לדגימות LightR-bRaf שאינן מוארות, ובכך מאשר את הספציפיות של ויסות LightR-bRaf. הדמיית תאים חיים הראתה כי מחזורים חוזרים ונשנים של הפעלה/אי-הפעלה של FastLightR-bRaf גורמים לטרנסלוקציה חוזרת ונשנית של ERK2 בתוך הגרעין ומחוצה לו, מה שמאשש את התוצאות הידועות של הפעלת bRaf²⁸ (איור 5B). ההפעלה של LightR-Cre גורמת לרקומבינציה מוצלחת של גן mCherry reporter, ומדגימה את הישימות של LightR על סוגים שונים של אנזימים (איור 5C).

איור 1: אסטרטגיית פיתוח של גישת LightR. (A) מבנים גבישיים של שני מונומרים חיים במצב כהה (PDB: 2PD7) ודימר במצב מואר (PDB: 3RH8). (B) ייצוג קריקטורה של עיצוב LightR. שני פוטורצפטורים VVD מחוברים זה לזה המוחדרים לתחום הקטליטי משבשים את הפעילות הקטליטית של החלבון בחושך. דימריזציה של VVD בתגובה לאור כחול משחזרת את פעילות החלבון. (C) מבנים גבישיים של (i) Src (PDB 1Y57), ו-(ii) bRaf (PDB 4MNF) תחומים קטליטיים. (ii) מבנה של Cre recombinase (PDB 1MA7). חיצים צהובים מציינים את אתר החדרת LightR ומציינים חומצת אמינו חלופית. (D) דיאגרמה סכמטית של אסטרטגיית שיבוט להחדרת תחום LightR לרצף אנזימי מטרה¹⁹. בשלב 1, פריימרים שתוכננו במיוחד משמשים לסינתזה PCR של מקטע LightR שמשני צדדיו אתרים המחושלים בגן המטרה לפני ואחרי אתר ההחדרה. בשלב 2, מקטע LightR שנוצר כך מוצג כמשמש כ"מגה-פריימר" להחדרת LightR לגן אנזים המטרה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר לשינוי מהיר. לוחות A-C הותאמו ושונו באישור Shaaya et ^al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אפיון ביוכימי של חלבוני LightR מהונדסים. (A) ייצוג סכמטי של פרוטוקול ניסויי לאפיון ביוכימי של LightR Src. (B) תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את מבנה LightR Src הנושא mCherry ותג myc במסוף C הוארו ברציפות באור כחול במשך 60 דקות, באמצעות מערך LED של 465 ננומטר. ליזטים של תאים נבדקו עבור זרחן של מצעי Src, פקסילין ו-p130Cas. תוצאות Western Blot מראות זרחן של פקסילין אנדוגני ו-p130Cas בתגובה להפעלת LightR-Src בתאים חיים. (ג,ד) תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את מבני LightR-Src שצוינו הנושאים תג mCherry-myc טנדם במסוף C נחשפו ברציפות לאור כחול לזמנים מוגדרים (0 דקות ו -30 דקות) ולאחר מכן הונחו בחושך לפרקי זמן שצוינו. ליזטים של תאים נבדקו עבור זרחון של מצעי Src, והראו את ההשוואה של קינטיקה הפעלה ונטרול בין (C) LightR-Src ו (D) FastLightR-Src. (E) תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את מבני LightR-Src שצוינו הנושאים תג mCherry-myc טנדם במסוף C נחשפו ברציפות לאור כחול במשך 20 דקות ולאחר מכן דגירה חוזרת ונשנית בחושך במשך 10 דקות ובאור במשך 20 דקות. ליזטים של תאים נאספו ונבדקו עבור זרחן של מצעי Src, והראו את היעילות של מחזור קינאז Src בין מצבי הפעלה ואינאקטיבציה. כל הניסויים חזרו על עצמם לפחות שלוש פעמים עם תוצאות דומות. המספרים המוצגים לצד כל לוח כתם מערבי B-E מייצגים את המשקלים המולקולריים של החלבונים, הנמדדים בקילודלטונים (kDa). לוחות B-E הותאמו ושונו באישור Shaaya et ^al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: בקרת תאורה גלובלית וזמנית והשפעה על פעילות FastLightR-Src. (A) ייצוג קריקטורה של סכמת הניסוי של תאורה מחזורית גלובלית וזמנית וניתוחי הנתונים הבאים. (ב,ג) ויסות המורפולוגיה של התא ולוקליזציה של FastLightR-Src על ידי אור כחול מתואר בתמונות מייצגות של תאי HeLa המתקבלות מסדרת קיטועי זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. תאים אלה ביטאו באופן זמני את FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 תאים) או D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 תאים) יחד עם Stargazin-iRFP670 (סמן קרום פלזמה). הדמיה של תאים חיים בוצעה כל דקה בזמן שהתאים היו מוארים באור כחול (קווי מתאר כחולים). (B) חיצים צהובים מדגישים לוקליזציה של FastLightR-Src במבנים הדומים להידבקויות מוקד. התמונות התקבלו מסדרה של תאי HeLa בהילוך מהיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. (C) כימות השינויים בשטח התא הנגרמים על-ידי הפעלה של FastLightR-Src לעומת D388RLightR-Src מוצג בכל לוח. חלון התאורה מסומן כמלבנים כחולים. גרפים מייצגים רווח בר-סמך ממוצע ± 90%. לוחות B ו-C הותאמו ושונו באישור Shaaya et ^al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: בקרת תאורה תת-תאית מקומית והשפעה על פעילות FastLightR-Src. (A) ייצוג מצויר של סכמה ניסיונית של בקרת תאורה תת-תאית מקומית. (B) (i) רצף קיטועי זמן הממחיש תא HeLa המבטא FastLightR-Src-mCherry, מואר מקומית באור כחול (מתואר על ידי עיגול כחול). התמונות צולמו בכל דקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (60x אובייקטיבי). התמונות מוצגות כתמונות ניגודיות הפוכות המתקבלות בפרקי זמן מוגדרים. (ii) תמונות הקרנה של תאים המציגות בליטות שנוצרו בפרקי זמן מוגדרים. סף ומיסוך המורפולוגיה של התא על ציר הזמן הניסויי מייצג את הפלטפורמה לניתוח התפשטות התא והדינמיקה של קצה התא. האזור המואר שצוין בתא מסומן בעיגול כחול. (C) (i) תרשים קוטבי לתאים המייצגים את מרחק הנדידה של הצנטרויד (d) ואת זווית הסטייה (θ) ביחס לתאורת האור הכחול המקומית. נקודות שחורות מייצגות תאי HeLa בודדים המבטאים D388RLightR-Src (N = 6 תאים) או FastLightR-Src (N = 10 תאים). (ii) ייצוג סכמטי המדגים את מרחק ההסטה הצנטרואידי (d) שעבר הצנטרואיד של התא מההתחלה (1) ועד לסיום (2) של גירוי מקומי של אור כחול. זווית הסטייה (θ) מציינת את מידת הסטייה של התנועה הצנטרואידית של התא ממיקום האור הכחול. ההצללה האפורה בהירה מציינת את האזור הבולט על-ידי התא בתגובה לגירוי FastLightR-Src מקומי. האזור המואר שצוין של התא מסומן על ידי עיגול כחול מלא. לוחות B ו-C הותאמו ושונו מ-Shaaya et ^al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ישימות רחבה של גישת LightR. (א) רגולציה של LightR-bRaf. תאי LinXE המבטאים באופן ארעי את LightR-bRaf-Venus, D575R LightR-bRaf Venus שאינו פעיל באופן קטליטי, או bRaf פעיל באופן מכונן (V600E)-Venus נחשפו לאור כחול רציף למשך פרק הזמן שצוין. תאים lysates נבדקו עבור phosphorylation של חלבונים מסומנים. (B) תמונות מייצגות שהתקבלו מסדרה בהילוך מהיר של דימות תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה ממחישות את ויסות תגובת האור הכחול הגלובלית בתאי LinXE המבטאים באופן ארעי את FastLightR-bRaf-Venus ו-mCherry-ERK2. תאים אלה הוארו ברחבי העולם באור כחול (50 מילישניות פולסים בכל שנייה, 50 פעימות לדקה) לפרקי זמן מוגדרים המתוארים בכחול. הדמיה של תאים חיים של mCherry-ERK2 בוצעה בכל דקה. חיצים צהובים מדגישים שלבים של לוקליזציה גרעינית של ERK2 הנגרמת על ידי הפעלת אור כחול של bRaf מהונדס. (C) תאי LinXE הודבקו באופן ארעי יחד עם כתב Floxed-stop-mCherry ו-LightR-Cre-iRFP670. התאים היו נתונים לתנאים חשוכים או לאור כחול פועם (2 שניות דולקות, 10 שניות כבויות) למשך עד 8 שעות. תמונות עבור כל נקודות הזמן של כל ערוץ נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה (10x אובייקטיבי) בהגדרות זהות והותאמו לרמות בהירות וניגודיות עקביות כדי להקל על השוואה של רמות ביטוי חלבונים בין דגימות. הניסוי חזר על עצמו לפחות שלוש פעמים, והניב תוצאות דומות. הדמות הותאמה ושונתה מ-Shaaya et ^al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: רצף LightR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: תיאור אתרי החדרת LightR ורשימת תיוג לתכנון LightR-Protein. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 3: פריימרים לשיבוט LightR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 4: תנאי טרנספקציה לאנליזה ביוכימית של פעילות חלבון LightR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 5: תנאי טרנספקציה לניתוח מבוסס הדמיה של פעילות חלבון LightR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: תאורה פועמת באמצעות סביבת פיתוח משולבת (IDE). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: הגדרות הארה במיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

המחקר שלנו מציג גישה אופטוגנטית לחקר מסלולי איתות מגוונים ומדגים את ישימות רחבה שלה בהתמודדות עם שאלות ביולוגיות שונות. מערכת הכלים LightR מספקת מספר יתרונות חיוניים: (1) ויסות אלוסטרי של פעילות החלבון, (2) בקרה זמנית הדוקה של הפעילות שניתן לכוונן כדי להשיג קינטיקה שונה של הפעלה ואינאקטיבציה, (3) רזולוציה מרחבית של פעילות ברמה התת-תאית, (4) ספציפיות של אפנון איתות ופעילות ביולוגית ו-(5) טווח רחב של ישימות לחלבוני מטרה שונים. יש לציין כי LightR משלבת באופן ייחודי את כל היתרונות הללו בכלי אחד, ובכך מספקת צעד משמעותי קדימה.

העיצוב של LightR כמתג אלוסטרי מציע מספר יתרונות. היכולת של LightR לשלוט בפעילות החלבונים כאשר הוא מוכנס לתוך לולאה גמישה קטנה מספקת רב-תכליתיות ניכרת ליישום על פני חלבונים שונים עם מבנים ופונקציות מגוונים. בהיותו מתג אלוסטרי, LightR מווסת רק את תחום המטרה של החלבון המעניין ואינו משפיע על תחומים אחרים של החלבון. לפיכך, שיטה זו מאפשרת ויסות ספציפי של הפעילות מבלי לפגוע בתפקודים חיוניים של החלבון, כגון אינטראקציות עם שותפיו הקושרים או לוקליזציה טבעית בתוך התאים. מערכות אופטוגנטיות דו-רכיביות יושמו בהצלחה לוויסות לוקליזציה של חלבונים, אינטראקציות או פונקציות חיוניות אחרות באמצעות בקרה בתיווך אור של הומו או הטרודימריזציה 29,30,31,32,33,34,35. עם זאת, מערכות אלה דורשות לעתים קרובות ביטוי שווה משקל אופטימלי של שני חלבונים, מה שהופך את היישום שלהם למאתגר יותר. ויסות אלוסטרי באמצעות מערכת LightR מושג בתוך חלבון בודד ובכך מספק גישה הרבה יותר תכליתית לחקירת איתות תאי.

הטווח הרחב של הישימות של מתג LightR למחלקות חלבון שונות מושג, בחלקו, באמצעות אופטימיזציה של מודולים שונים בתחום LightR. המקשרים המחברים את LightR לחלבון המעניין והמקשר המחבר בין שני תחומי VVD בתוך LightR (מקשר בין-VVD) יכולים להשפיע על יעילות הרגולציה. הבחירה במקשר גמיש בין-VVD (GGS)4G(GGS)3 מספקת גמישות ואורך מספיקים כדי להבטיח שיוך ודיסוציאציה של מונומרים VVD בתחום LightR. מקשר זה הבטיח את הרגולציה המוצלחת של כל חלבוני המטרה עד כה. עם זאת, במקרים בהם תחום LightR אינו משבית מספיק את החלבון בחושך, ניתן להכניס מקשר קשיח יותר אשר ירחיק את תחומי VVD זה מזה כדי לשפר את פתיחת מהדק LightR, ובכך לשמור על האנזים לא פעיל. המקשר עדיין צריך לשמור על גמישות מספקת כדי לאפשר דימריזציה של VVDs והפעלה של חלבון המטרה. כדי לחבר את LightR לחלבון המעניין, אנו משתמשים במקשרים גמישים קצרים, GPGGSGG ו-GSGGPG, שנוספו ל-N ו-C-termini של תחום LightR. הם מספקים גמישות מספקת בחיבור, ובכך מונעים שיבוש בלתי הפיך של חלבון המטרה. עם זאת, הם קצרים מספיק כדי לאפשר עיוות של חלבון המטרה בחושך תוך הקלה על שיקום תפקוד החלבון באור. מקשרים אלה תומכים בוויסות על ידי LightR עבור יישומי חלבון רבים. עם זאת, במקרים מסוימים כאשר מקשרים אלה עשויים שלא לספק השבתה מספקת של החלבון בחושך, קיצור של המקשרים עשוי להיות מועיל. קיצור לינקר כזה יכול להפחית את הגמישות ולהגביר את העיוות שנגרם על ידי מהדק LightR פתוח בחושך, ובכך למזער כל דליפה. עם זאת, התאמה זו עלולה לפגוע בפעילות המרבית של האנזים עקב עיוותים מבניים פוטנציאליים במצב המואר. לחלופין, החלפת חומצות אמינו מרובות בלולאת ההחדרה יכולה לספק יתרונות דומים של גמישות מאוזנת במקרים בהם חוסר יציבות קונפורמטיבי אינו מהווה דאגה משמעותית.

תהליכי איתות קריטיים רבים מופעלים באופן ארעי או מווסתים באופן תנודתי 36,37,38,39,40,41,42,43. יכולת הכוונון של כלי LightR מאפשרת לנו לחקות דפוסי איתות מורכבים ובכך מספקת גישה רבת עוצמה לחקירת תהליכים ביולוגיים מבוקרים זמנית. אנו משיגים זאת על ידי אפנון הקינטיקה של LightR באמצעות הכנסת מוטציית I85V לשני תחומי VVD. מוטציה זו מפחיתה את זמן מחצית החיים של דימר VVD במצב חשוך מ-18,000 שניות ל-780 שניות¹⁹, ובכך מאפשרת השבתה מהירה יותר של האנזים FastLightR.

קינטיקה של אינאקטיבה מהירה מאפשרת גם ויסות של פעילות החלבונים ברזולוציה תת-תאית. אנזימי LightR, בעלי קינטיקה איטית, עלולים להקשות על צפייה בהשפעות של הפעלה תת-תאית עקב דיפוזיה תוך-תאית של המבנה המופעל. עם קינטיקה מהירה, כל אנזים FastLightR שמתפזר מעבר לאזור התאורה המקומית יושבת במהירות. על ידי הפעלה סלקטיבית של אזורים תת-תאיים ספציפיים, חוקרים יכולים לקבל תובנות לגבי התפקודים המקומיים של החלבונים להבנה טובה יותר של תרומתם למסלולים התאיים המורכבים ולרשתות האיתות.

בעוד FastLightRs הם יקרי ערך עבור בקרה אופטית מוגבלת מרחבית וזמנית של פעילויות חלבון בתוך תאים, ישנם עדיין יישומים שבהם קינטיקה איטית עשויה להיות רצויה. LightR עם קינטיקה איטית יכול להיות מיושם במחקרים שבהם נדרשת פעילות מתמשכת ומשופרת של אור כחול. יישומים אלה ידרשו רק פולסי הארה נדירים כדי לשמור על פעילות אופטוגנטית רציפה, ובכך גם למזער בעיות כגון פוטוטוקסיות. עבור תרחישים שונים, מגוון רחב של שינויים קינטיים^10,18 יכול להיות מיושם לבד או יחד עם השני כדי להציע פתרון מבטיח לכוונון ביצועי LightR כדי לייעל את היישום שלה עבור ניסוי ספציפי.

תחולתם של אנזימי LightR נקבעת על פי יכולתם לחקות את התפקוד הביולוגי של עמיתיהם האנדוגניים. ככאלה, זה קריטי להעריך את ספציפיות המצע שלהם, איתות במורד הזרם, לוקליזציה תת-תאית. הספציפיות של פעילות LightR-Src מאושרת באמצעות זרחון של מצעי Src, כולל פקסילין ו-p130Cas^22,23. FastLightR-Src נע בין האזור הפרי-גרעיני לבין הידבקויות מוקדיות תחת תאורה מחזורית, וכתוצאה מכך התא מתפשט. תופעה כזו דומה בהצלחה לתצפיות קודמות שנעשו עם קינאז Src מקומי ומאשרת עוד יותר את יעילותו של הכלי הנוכחי בחקר הביולוגיה של Src^{11,12,44,45,46,47}. LightR-bRaf מדגים גם ספציפיות במיקוד קומפלקסים אותות כגון MEK ו ERK kinases^24,25. בנוסף, FastLightR-bRaf מציג תנודות מחזוריות של המעבורת הגרעינית ERK בתגובה לאור כחול, שהוא תוצאה ידועה של הפעלת bRaf²⁸. היכולת של אנזימי LightR לחקות באופן הדוק את תפקודם של חלבונים אנדוגניים מספקת כלי רב ערך לחקירת תפקודם.

הדיון לעיל מתאר את היכולת של קינאזות LightR לשכפל מסלולי איתות תאיים מדויקים בתוך תאים מוגדרים. בהתאם להצלחה כזו עם קינאזות, LightR-Cre משמש כמודל להמחשה המדגים את הפונקציונליות של Cre recombinase המקורי הנגזר מהבקטריופאג' P1. ה- Cre recombinase שייך למשפחת האינטגראז של רקומבינזות ספציפיות לאתר, והוא פועל על ידי הקלה על רקומבינאז בין שני אתרי זיהוי הנקראים loxP על דנ"א המטרה. רקומבינציה כזו גורמת לסידור מחדש של הדנ"א באמצעות אירוע מוצלב. בהתבסס על הכיוון הכיווני של אתר loxP בדנ"א המטרה, אירוע ההצלבה יכול להוביל למחיקה, שכפול או טרנסלוקציה של אלמנטים כרומוזומליים⁴⁸. Cre recombinase נמצא בשימוש נרחב ליצירת מודלים in vivo של בקרת גנים מושרית^49,50. עם זאת, מערכות אחרות ספונטניות, מושרות כימית או אופטוגנטיות cre recombinase לספק שליטה מוגבלת על מתי ואיפה רקומבינציה DNA מושרה במודל החי. LightR-Cre מתגבר על מגבלות אלה בכך שהוא מאפשר בקרה זמנית ומרחבית הדוקה של רקומבינציית DNA. יתר על כן, יכולת הכוונון של LightR מאפשרת לנו לחסל פעילות דליפה לא רצויה ולהבטיח את הרגולציה של Cre בדיוק גבוה. יכולות אלה פותחות הזדמנויות חדשות למידול פתולוגיה של מחלות ופיתוח טיפולים חדשים.

הוויסות המדויק של LightR בקינאזות ורקומבינאז DNA מספק הוכחה נוספת לכך שניתן ליישם כלי זה על מספר חלבונים באותה אסטרטגיה. בנוסף להפעלת קבוצות אנזימים שונות, LightR יכול להיות מחובר באופן פוטנציאלי לסוגי חלבונים אחרים, שבהם ניתן לרתום את האפנון האלוסטארי כדי למקם חלבונים לאזורים תת-תאיים ספציפיים, לגרום לאינטראקציות חלבון-חלבון, להנדס ביו-חיישנים המושרים באור כחול ועוד. בשל היתרונות האלוסטטריים של מיקוד תחום ספציפי, ניתן לשלב LightRs גם עם גישות כימוגנטיות ואופטוגנטיות אחרות באותו חלבון כדי להשיג רמה גבוהה יותר של כוונון לחקר תהליכים ביולוגיים.

יישמנו בהצלחה את LightR על חלבונים רבים אחרים (כתבי יד בהכנה). למרות הצלחה זו, פיתוח חלבון LightR פונקציונלי עשוי להיתקל באתגרים פוטנציאליים, במיוחד בבחירת אתר החדרה מתאים ובחיקוי מדויק של הפונקציה הביולוגית של חלבון המטרה. כאשר המבנה הגבישי אינו זמין, החוקרים חייבים להסתמך על מבנים חזויים או מידע על רצף חומצות אמינו, מה שמחייב פתרון בעיות נוסף כדי להנדס חלבונים עם אתרי החדרה מרובים או תחליפי חומצות אמינו. בנוסף, פעילות החלבון המהונדס חייבת להיות מכווננת היטב כדי לשכפל את הפונקציה הביולוגית בתוך התא במדויק. ההצלחה בניסויים אלה תלויה בחיקוי הפונקציונלי המדויק של החלבון המהונדס, עם ההומולוג האנדוגני שלו, אשר לעתים קרובות דורש פתרון בעיות קפדני ויכול להשתנות בהתאם לסוג התא, סוג חלבון המטרה וסוגו, כמו גם חוזק ומשך ההפעלה של אור כחול.

לסיכום, מערכת LightR מהווה כלי רב עוצמה להשגת שליטה מרחבית-זמנית מדויקת על תפקוד החלבון. החוסן, יכולת הכוונון והרבגוניות שלו הופכים אותו לבעל ערך רב לחקר תהליכים תאיים מורכבים, לפענוח מסלולי איתות ולהבהרת מנגנוני בקרת גנים. על ידי מתן שליטה חסרת תקדים לחוקרים על פעילות החלבונים, מערכת LightR מבטיחה לקדם את הבנתנו של תהליכים ביולוגיים בסיסיים ולסלול את הדרך להתערבויות טיפוליות חדשניות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
#1.5 כיסויי זכוכית 25 מ"מ עגולים	וורנר אינסטרומנטס	64-0715
1.5 מ"ל צינורות	ארה"ב מדעית	cc7682-3394
2x מאגר			עבור 500 מ"ל: 5.18 גרם של  Tris-HCL, 131.5 מ"ל גליצרול, 52.5 מ"ל של 20% SDS, 0.5 גרם ברומופנול כחול, pH סופי 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומי	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	תרמו סיינטיפיק	F538L
60 LED מיקרוסקופ טבעת אור	בולי אופטיקה	ML46241324	כחול LED, קוטר 60 מ"מ, 5 W
אגרוז	GoldBiotech	A-201
Anti-ERK 1/2 איתות	תאי	9102
נוגדן Anti-GAPDH	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Anti-Cherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	איתות תאים	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
איתות תאים אנטי-פקסילין		2542
אנטי-פוספו-ERK 1/2 T202/Y204	איתות תאי	9101
אנטי-פוספו-pY249 p130Cas	איתות תאים	4014
אנטי-פוספו-Y118	איתות תאי	2541
תא אנטו-פוספו-S217/221 MEK	איתות	9121
Arduino תואם ספק כוח	מחשב ארגוני	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark סרום בקר עוברי (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	משולש 0.1 ומיקרו מומת בחום; M מסנן סטרילי
bRaf-V600E-Venus			מתנה מד"ר ג'ון אובריאן, MUSC
BSA	גולד ביוטק	A-420
קרבניצילין (דיסודיום)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask צבע ממברנת פלזמה אדום עמוק	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a תאים מוכשרים	נב	C2987H
DMEM	קורנינג	15-013-CV
סולם DNA	גולד ביו	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 אנזים	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, ריאגנטים של קלילנד
EGTA	אקרוס
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
פיברונקטין מפלזמת בקר	סיגמא	F1141
FuGENE(R) 6 מגיב טרנספקציה	Promega	E2692	מגיב טרנספקציה
ג'ל צבע חומצת גרעין ירוקה	GoldBio	G-740-500
צבע סגול לטעינת ג'ל 6x	NEB	B7024A
GeneJET	תרמו סיינטיפיק	ערכת מיצוי ג'ל	K0692
ערכת GeneJET פלסמיד מיני-פרפ	תרמו מדעי	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (פי 100) 100 מ"ל
תאי HEK 293T	ATCC	CRL-11268
תאי HeLa	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot ממסר	לוגרים דיגיטליים	DLI 705020645490	ממסר בקרת AC/DC לתאורה:
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	קורנינג	10-045-CV
ל.ב. אגר	פישר	BP1425-2
מערכת תאורת גידול LED	HQRP	884667106091218	מערכת מנורות פאנל LED
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	תוכנה להפעלת CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software MgCl
2	פישר כימיקל	M33-500
שמן מינרלי	סיגמא	M5310
MiniPrep	בחירת גנים	96-308
Mini-PROTEAN TGX ג'לים טרומיים 12 בארות	Bio-Rad	4561085
ביולוגיה מולקולרית בדרגת מים	קורנינג	46-000-CV
מראה פוליכרואית רב-פס	89903BS	Chroma
NaCl	פישר כימיקלים	S271-3
PBS עם Ca ו-Mg	קורנינג	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			מתנה מהמעבדה של ד"ר צ'אנינג דר,
צינורות UNC PCR	labForce	1149Z65	0.2 מ"ל צינורות וכובעים עם 8 רצועות, רצועה קשיחה מחוברת בנפרד מכסי כיפה
Phusion Plus DNA פולימראז	תרמו מדעי	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Pattern Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
פריימרים	IDT
PVDF ממברנות	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/כריכי נייר פילטר
T0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ, eDTA, 1x [-] נתרן	קורנינג	25-053-CI
Tris-אצטט-EDTA (TAE) 50x	פישר	BP1332-1	לאלקטרופורזה
UPlanSApo 40x מיקרוסקופ אובייקטיבי	אולימפוס	1-U2B828
USB TTL תיבת	מכשירים לאומיים	6501	לממשק TTL
&בטא;-מרקפטואתנול	פישר כימיקלים	O3446I-100