מאמר שיטה

בדיקה טוקסיקולוגית ואקוטוקסיקולוגית המבוססת על תנועתיות המוציטים של מולים (Mytilus galloprovincialis)

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67285

⸱

13 בדצמבר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

במאמר זה

סיכום

המאמר מציע שיטה חדשה במבחנה להערכה מהירה ורגישה של הרעילות והרעילות האקולוגית של מזהמים, המבוססת על התנועתיות של המוציטים Mytilus galloprovincialis . השיטה נועדה לתרום לפיתוח בדיקות חשיפה טוקסיקולוגיות ואקוטוקסיקולוגיות אתיות ורגישות יותר.

תקציר

המוציטים הם התאים בעלי היכולת החיסונית במחזור הדם ברכיכות דו-צדדיות, והם ממלאים תפקיד מפתח במספר תפקידים חשובים של מערכת החיסון המולדת בתיווך תאים. בשלבים המוקדמים של התגובה החיסונית, המוציטים נודדים באופן פעיל לאתר הזיהום. תנועתיות טבועה זו היא מאפיין בסיסי של תאים אלה. הוא מייצג פונקציה תאית מרכזית המשלבת מספר תהליכים, כגון הידבקות תאים, איתות תאים, דינמיקה של שלד תאים ושינויים בנפח התא. לכן, שינויים בתנועתיות התאים בעקבות חשיפה לתרופות או מזהמים יכולים לשמש כנקודת קצה טוקסיקולוגית שימושית. למרות התפקיד הבסיסי של תנועתיות התאים בפיזיולוגיה של התא, היא נחקרה בצורה גרועה מנקודת מבט טוקסיקולוגית. עבודה זו מציעה שיטה חדשה במבחנה להערכה מהירה ורגישה של הרעילות והרעילות האקולוגית של מזהמים, המבוססת על הערכת תנועתיות ההמוציטים של Mytilus galloprovincialis. פיתחנו בדיקת תנועתיות תאים על המוציטים הנצמדים לתחתית של מיקרו-פלטת פוליסטירן בעלת 96 בארות. בעקבות חשיפה לריכוזים הולכים וגדלים של תרופות, מסלולי התאים והמהירויות כומתו על ידי מעקב תאים במיקרוסקופ זמן-lapse, מה שמאפשר לנו למדוד את ההשפעות על תנועתיות ההמוציטים. בשל קלות איסוף ההמוציטים מבעלי החיים באופן לא פולשני יחסית, השיטה המוצעת מציעה בדיקה חלופית לסינון ההשפעות ומנגנוני הפעולה של מזהמים ותרופות. זה תואם את הקריטריונים של 3Rs (החלפה, הפחתה ועידון ), מתייחס לחששות אתיים ותורם להפחתת ניסויים בבעלי חוליות in vivo בבעלי חיים.

מבוא

שיטות מבוססות אפקט, כגון בדיקות ביולוגיות in vitro ו-in vivo, מייצגות כלים חדשניים לזיהוי ההשפעות של מזהמים כימיים סביבתיים באורגניזמים חיים ולשימוש בהם ככלים לניטור סביבתי והערכת סיכונים 1,2,3,4. הם משלימים את הגישה הכימית האנליטית הקלאסית על ידי התגברות על חלק ממגבלותיה. לדוגמה, שיטות מבוססות השפעה יכולות להעריך את הזמינות הביולוגית של מזהמים, את השפעתם על בריאות האורגניזמים ואת ההשפעות הטוקסיקולוגיות המשולבות של תערובות. ייתכן שלא ניתן לחזות את ההשפעות המשולבות הללו רק על סמך ניתוח כימי5.

בשנים האחרונות, אקוטוקסיקולוגיה של מזהמים מעוררי דאגה (מזהמים מתעוררים) מייצגת תחום שבו שיטות מבוססות השפעה יכולות להיות כלים שימושיים לאיתור חשיפה ולהערכת ההשפעה על הביוטה 1,5,6,7. מספר שיטות מבוססות אפקט משתמשות ברכיכות דו-צדדיות כאורגניזמים לבדיקה בניטור והערכה סביבתית 8,9. מאפיינים מסוימים הופכים את האורגניזמים הללו למתאימים למחקרים אקוטוקסיקולוגיים, כגון תפוצתם הרחבה, אופי ההזנה המסננת שלהם, אורח החיים היציב שלהם, יכולת הצטברות ביולוגית של מגוון רחב של מזהמים סביבתיים ולפתח תגובות ניתנות לזיהוי למזהמים, האפשרות לעבוד עם שלבי חיים שונים ולשמור בתנאי מעבדה7. הם רגישים מאוד לחשיפה לזיהום ומראים מגוון תגובות למזהמים רעילים בהתאם למין, שלב החיים ותנאי הסביבה 8,9,10. לכן, מספר הנחיות סביבתיות משתמשות במינים דו-צדדיים כמיני בדיקה סטנדרטיים10,11.

מבין הרכיכות הדו-כיווניות, Mytilus galloprovincialis הנפוץ הוא אחד המינים הנפוצים ביותר בתחום האקוטוקסיקולוגי בשל יכולתו לפתח תגובות הניתנות לזיהוי מוקדם לחשיפה לזיהום כימי, כולל השראת מטלותיונין, שינוי אנזים נוגד חמצון, חוסר יציבות הממברנה הליזוזומלית, חמצון שומנים, הצטברות ליפופוסין, תדירות מיקרו-גרעינים מוגברת, אינדוקציה פחמנית אנהידראז 12,13,14, 15. המוציטים, התאים המולימפטיים בעלי היכולת החיסונית, נמצאים בשימוש נרחב לחקר ההשפעות הטוקסיקולוגיות של מזהמים סביבתיים ברכיכות דו-צדדיות 4,13,16,17. תאים אלה חיוניים לתגובה החיסונית של האורגניזם, ומבצעים מספר פונקציות חשובות של חסינות מולדת בתיווך תאים. אלה כוללים חיסול חיידקים באמצעות פגוציטוזיס ותגובות ציטוטוקסיות שונות, כגון שחרור אנזימים ליזוזומליים, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים וייצור מטבוליטים של חמצן במהלך פרץ הנשימה 18,19,20. המוציטים הם תאים תנועתיים מהותיים 21,22,23 המסוגלים לנדוד לאתר ההדבקה בשלב המוקדם של התגובה החיסונית של האורגניזם. באופן כללי, תנועתיות היא תכונה בסיסית המאפיינת את כל תאי החיסון מכיוון שהיא מאפשרת מעקב חיסוני של תאים אלה כדי להגן על הגוף24. מחקר על מינים שונים של רכיכות מדגים כי תנועתיות ההמוציטים היא מרכיב קריטי בתגובה החיסונית שלהם, ריפוי פצעים ואינטראקציה עם פתוגנים. תנועתיות זו מווסתת על ידי מסלולים מולקולריים ספציפיים, המדגישים את המורכבות וההתמחות של תפקודי המוציטים ברכיכות 21,25,26,27.

למרות החשיבות הבסיסית של תנועתיות בפיזיולוגיה של המוציטים, מעט מאוד מחקרים חקרו את הרגישות של תנועתיות ההמוציטים למזהמים כימיים סביבתיים 23,28,29,30. לאחרונה, קבוצתנו אפיינה את התנועה הספונטנית של המוציטים Mytilus galloprovincialis במיקרו-פלטת פוליסטירן 96 בארות שטופלה בתרבית רקמות ובחנה את הרגישות של תנועתיות ההמוציטים לחשיפה חוץ גופית לאקמול23. המוציטים M. galloprovincialis הראו תנועת תאים אקראית המבוססת על lamellipodia ושינויי צורה מהירים, כפי שנמצא בעבר במין מולים אחר, Mytilus edulis 21,22,23,28, וכבר תואר בתאי חיסון אנושיים 31. תנועתיות המוציטים הוכחה לאחרונה כרגישות לגורמי לחץ כימיים23,28. בהתבסס על ממצאים קודמים אלה, עבודה זו מציעה שיטה חדשה במבחנה להערכה מהירה ורגישה של רעילות ורעילות אקולוגית של מזהמים המבוססת על הערכת התנועתיות של המוציטים M. galloprovincialis והשינויים בה, באמצעות ניתוח ולוצימטרי של תנועתיות התא (כימות מהירות ממוצעת, מרחק נדידה, מרחק אוקלידי וישירות). השיטה מציעה אפשרות לסנן במבחנה את הרעילות של מספר חומרים במבחנים קצרי טווח (הנמשכים 1-4 שעות) או במבחני חשיפה ממושכת, הנמשכים 24-48 שעות.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו על פי החקיקה האיטלקית לרווחת בעלי חיים (D.L.26/2014) שיישמה את הנחיית מועצת הוועדה האירופית (2010/63 EEC). Mytilus galloprovincialis הוא צדפה דו-צדדית הניזונה מפילטר, הידועה בכינויה צדפה ים תיכונית. מקורו בים התיכון ובחוף האטלנטי של דרום אירופה. הוא הוצג ונפוץ במערב צפון אמריקה, אסיה ודרום אפריקה. זהו מין דיג מסחרי חשוב בכמה אזורים בעולם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מי ים מלאכותיים (ASTM) או מי ים טבעיים מסוננים

  1. להכנת מי ים מלאכותיים ASW על פי ASTM D1141-98 (2021)32, ממיסים את המלחים הבאים במים מזוקקים (גרם עבור 1 ליטר): 27.65 NaCl, 0.133 NaHCO3, 3.33 MgCl2· 6H2O, 2.66 Na2SO4, 0.733 CaCl2 · 2H2O, 0.466 KCl, 0.067 KBr, 0.02 H3BO3, 0.013 SrCl2·6H2O, 0.0019 NaF. לתמיסת ASW יש pH של 7.80.
  2. להכנת מי ים טבעיים מסוננים (FSW), מסננים מי ים טבעיים 37 PSU, שנאספו מאתר שאינו מושפע מפעילויות אנתרופוגניות עם מסנני 0.2 מיקרומטר.

2. התאקלמות בעלי חיים

  1. אקלום דגימות מולים בוגרות (Mytilus galloprovincialis Lam.) למשך 24 שעות במיכלים סטטיים (ברעב) המכילים ASW או FSW מאוורר (1 ליטר לבעל חיים) בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס בחדר תרמוסטטי לפני השימוש הניסיוני.

3. הכנת ריאגנטים להערכת תנועתיות המוציטים

  1. הכן מי ים מסוננים (FSW) כאמור לעיל או מי מלח פיזיולוגיים סטנדרטיים (SPS). ממיסים HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזין-חומצה אתנסולפונית) 4.77 גרם, NaCl 25.48 גרם, MgSO4 13.06 גרם, KCl 0.75 גרם, CaCl2 1.47 גרם בכ-800 מ"ל מים מזוקקים, ואז נוצרים עד 1 ליטר על ידי תוספת של מים מזוקקים יותר. התאם את ה-pH ל-7.36 עם 1 M NaOH.
  2. הכן תמיסת מלאי אדומה ניטרלית של 20 מ"ג/מ"ל בדימתיל סולפוקסיד (DMSO).
  3. הכן תמיסת צביעה בצבע אדום ניטרלי: הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אדום ניטרלי ל-995 מיקרוליטר של FSW או SPS.
  4. הכן FSW או SPS בתוספת 2 מ"מ של L-גלוטמין, 40 IU/מ"ל פניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין כדלקמן: הוסף 100 מיקרוליטר של 2 מ"מ L-גלוטמין ו-100 מיקרוליטר של תערובת פניצילין/סטרפטומיצין ל-10 מ"ל של FSW/SPS.
  5. הכן 0.4% טריפן כחול ב-FSW או SPS.
    הערה: תמיסת מלאי אדום ניטרלי הוכנה על פי Martínez-Gómez et al.33. תמיסת המלאי האדום הנייטרלי מחזיקה מעמד כ-2-3 שבועות כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להכין תמיסת צביעה בצבע אדום ניטרלי ו-0.4% טריפן כחול ממש לפני הבדיקה.

4. דגימת המולימפה

  1. מלאו מזרק ב-0.5 מ"ל של מי ים מסוננים FSW או SPS מי מלח פיזיולוגיים סטנדרטיים (ב-15 מעלות צלזיוס).
  2. מפרקים מעט ובזהירות את השסתומים לאורך פני הגחון בעזרת אזמל. שמור על האזמל במקומו או השתמש בקצה פיפטה. אפשר למחט של מזרק היפודרמי להיכנס לחלל שבין השסתומים.
  3. אסוף בעדינות 0.5 מ"ל של המולימפה משריר המקרב האחורי עם המזרק הממולא מראש על פי UNEP/RAMOGE34.
  4. הסר את המחט מהמזרק והעביר את תכולת המזרק למיקרו-צינור.
  5. אוספים את המולימפה מ-3-4 מולים ואוספים יחד את דגימות המולימפה בצינור ב-15 מעלות צלזיוס תוך שימוש באותו יחס בין פרטים.
    הערה: המילוי המוקדם של המזרק משמש לדילול מיידי של המולימפה 1:1 במהלך הדגימה. דילול המולימפה עם FSW או SPS ביחס של 50:50 משמש בדרך כלל למניעת צבירת המוציטים, על פי Martínez-Gómez et al.33.

5. ציפוי ותרבות המוציטים

  1. ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר.
  2. לדלל את המולימפה בריכוז של 1 ×10 6 תאים/מ"ל עם FSW או SPS.
  3. הערך את הכדאיות של המוציטים בתרחיף על ידי צביעה כחולה של טריפאן: הוסף 100 מיקרוליטר של 0.4% טריפן כחול מומס ב-FSW או SPS ל-100 מיקרוליטר של תרחיף המוציטים. יש לדגור במשך 5 דקות בחום של 15 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר מכן, הוסף טיפת תרחיף בהמוציטומטר וספור את התאים הלא מוכתמים (ברי קיימא) והצבועים (שאינם ברי קיימא) תחת תצפית מיקרוסקופית.
  5. הערך את כדאיות ההמוציטים כאחוז התאים ברי קיימא המחושב על המספר הכולל של תאים שנספרו35.
  6. השתמש בנוסחה הבאה להערכת כדאיות התא35:
    תאים ברי קיימא (%) = [מספר תאים ברי קיימא/מספר תאים כולל (בר-קיימא + לא בר-קיימא)] x 100
  7. ודא שכדאיות ההמוציטים צריכה להיות גבוהה מ-95% כדי להמשיך הלאה בפרוטוקול.
  8. הוסף 50 מיקרוליטר של המולימפה מדולל לכל באר של תרבית תאים עם 96 בארות פוליסטירן שטוח TC. מכסים את הצלחת במכסה.
  9. אפשר להמוציטים להיצמד לתחתית הבארות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס ליצירת שכבה חד-שכבתית.
  10. הסר את עודפי המולימפה על ידי שאיבה עדינה בעזרת מיקרופיפטה.

6. בדיקה לטווח קצר

  1. לבדיקות לטווח קצר (תוך 1-4 שעות), דגרו מיד את התאים הנצמדים לתחתית הבארות עם 100 מיקרוליטר של החומר המעניין שנפתר ב-FSW או SPS בריכוזים שונים ב-15 מעלות צלזיוס. השתמש בשלוש בארות לפחות לשלוש קביעות שכפול של כל תנאי ניסוי.
  2. לאחר הדגירה, העריכו את תנועתיות התאים לאחר שלב 8.

7. בדיקת חשיפה ממושכת

  1. לחשיפות ממושכות, כלומר מבחני חשיפה של 24-48 שעות, דגרו על התאים הדבקים המתורבתים עם ריכוזים הולכים וגדלים של חומר הבדיקה המומס במדיום התרבית (FSW או ASW) בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין 40 IU/mL פניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) ב-15 מעלות צלזיוס. השתמש בשלוש בארות לפחות לשלוש קביעות שכפול של כל תנאי ניסוי.
  2. לאחר הדגירה, העריכו את תנועתיות התאים לאחר שלב 8.

8. הערכת תנועתיות תאים על ידי מיקרוסקופ זמן-lapse

  1. הכנס את לוחית הרב-באר המכילה את ההמוציטים החיים הדבקים לקורא רב-מצבי.
  2. הערך את התנועתיות של התאים החיים הדבקים על ידי הדמיה בזמן אמת על הצלחת באמצעות מיקרוסקופ זמן-lapse: צלם תמונות של אותו אזור עניין (ROI) (ממד ההחזר על ההשקעה בשימוש: 720 מיקרומטר x 720 מיקרומטר) בכל באר בקצב של תמונה אחת כל דקה למשך 10 דקות באמצעות קורא הרב-מצבים בהגדלה של פי 20 והדמיית שדה בהיר צבעוני.
  3. להדמיה טובה יותר של ההמוציטים, צבעו את התאים בצבע החיוני אדום ניטרלי ממש לפני מיקרוסקופ זמן-lapse כדלקמן:
    1. הסר את מדיום הדגירה מכל באר.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה של אדום ניטרלי מומס במי מלח פיזיולוגיים סטנדרטיים המכיל את החומר המעניין לבארות הצלחת המכילה את התאים הדביקים.
    3. דגרו על התאים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. שוטפים את עודפי הצבע.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר מהחומר המעניין שנפתר ב- FSW או SPS. דמיין את התאים להערכת תנועתיות.
      הערה: השימוש בקורא רב-מצבי מאפשר רכישה בו זמנית של תמונות ממספר רב של בארות, ומאפשר זיהוי תנועתיות בו זמנית של כל תנאי הניסוי והשכפולים הכלולים בבאר. הצבע האדום הנייטרלי נשמר בתוך הליזוזומים, המופיעים ככתמים כתומים קטנים בציטופלזמה, בעוד שהגרעין מופיע כחור שקוף מכיוון שהצבע החיוני של האצידופילוס אינו מכתים אותו. רכישת התמונה נעשתה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר של 20 מעלות צלזיוס.

9. מעקב אחר תאים וחישוב פרמטרים וולוצימטריים

  1. נתח את המסגרות של אותו אזור עניין שנרכש במיקרוסקופ זמן-lapse על ידי תמונה J עבור כל באר.
  2. שמור את התמונות בתיקייה ללא רווחים בשם. התמונות יכולות להיות בפורמט JPEG או PNG.
  3. פתח את ImageJ. לחץ על קובץ > ייבא > רצף תמונות.
  4. בצע מעקב אחר תאים על תאים בודדים באמצעות תוסף המעקב הידני של ImageJ. מיקומם של תאים בודדים מסומן בתמונות עוקבות, מה שמאפשר מעקב אחר שינויי מיקום לאורך זמן.
  5. נתח לפחות 40 תאים לבאר, לא כולל תאים שבורחים מהשדה המוקלט מהניתוח.
  6. ייבא ערכות נתונים מהתוסף ImageJ, "מעקב ידני", לתוכנת Chemotaxis ו-Migration Tool הזמינה בחינם.
  7. כימות פרמטרים מהירים כגון מהירות ממוצעת, מרחק אוקלידי, מרחק מועבר וישירות באמצעות תוכנת Chemotaxis and Migration Tool בהתאם להוראות המפורטות המדווחות במדריך למשתמש הזמין בחינם של התוכנה36או השלבים המפורטים להלן:
    1. ייבא מערכי נתונים מהתוסף ImageJ "מעקב ידני" לתוכנת Chemotaxis ו-Migration Tool.
    2. בחר את מספר הפרוסות הרצוי (למשל, מספר התמונות המשמשות למעקב).
    3. כייל את התוכנה על-ידי הגדרת גודל פיקסל x/y ומרווח הזמן. כיול x/y מציין את אורך הקצה של פיקסל במיקרומטר, בעוד שמרווח הזמן מייצג את משך הזמן בין כל פרוסה.
    4. לאחר התאמת הערכים והפרמטרים, לחץ על החל הגדרות.
    5. התוויית מסלולים וייצוא כתמונה. לחץ על כפתור הערכים הנמדדים כדי לראות את הערכים הנמדדים. שמור אותו.
    6. לחץ על כפתור הסטטיסטיקה ושמור את המהירות והישירות של סדרת הרצועות.
  8. השווה את הפרמטרים הוולוצימטריים המחושבים עבור תאי בקרה לאלו של המוציטים שנחשפו לחומר הבדיקה בריכוזים שונים.
    הערה: מרחק הנדידה (נמדד במיקרומטר) מתייחס לאורך נתיב הנדידה במהלך תקופת התצפית (10 דקות). מרחק אוקלידי (נמדד גם במיקרומטר) מייצג את מרחק הקו הישר בין נקודת ההתחלה לנקודת הקצה של התא. המהירות הממוצעת (מבוטא במיקרומטר דקה-1) מחושבת כיחס בין המרחק המועבר למשך המעקב אחר התאים עבור כל תא. ישירות מוגדרת כיחס בין המרחק האוקלידי למרחק המצטבר עבור כל מסלול.

תוצאות

המחקר מציג שיטה חדשה במבחנה להערכה מהירה ורגישה של הרעילות והרעילות האקולוגית של מזהמים, תוך שימוש בתנועתיות של המוציטים Mytilus galloprovincialis. איור 1A-C מציג הדמיה מייצגת של זמן-lapse של המוציטים לאחר חיבור של 30 דקות לתחתית הבאר. התאים באיור נצבעו באדום ניטרלי ממש לפני הערכת התנועתיות. תנועות התאים נוטרו באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בקצב של תמונה אחת בכל דקה למשך 10 דקות, בהגדלה של פי 20, עם קורא רב-מצבי. איור 1A-C מציג שלוש מתוך 11 הפריימים שנלכדו מאותו אזור עניין (ROI) ב-0 דקות, 5 דקות ו-10 דקות. אותם תאים ממוספרים בכל שלושת האיורים כדי להדגיש את תנועתם, והמספור נשאר עקבי בכל האיורים כדי להמחיש בבירור את מסלולם

התאים מראים תנועות של תא בודד המבוססות על פעילות lamellipodia ושינויי צורה מהירים. התאים סומנו בצבע החיוני אדום ניטרלי כדי לשפר את ההדמיה שלהם במהלך המעקב. אדום ניטרלי הוא צבע קטיוני אמפיפילי וחלש שיכול לחלחל בקלות לקרום התא. ברגע שנכנס לתאים, הצבע נלכד בליזוזומים עקב פרוטונציה. המוציטים של מולים, במיוחד גרנולוציטים, מראים מערכת ליזוזומלית מפותחת היטב; לכן, הם נראים היטב על ידי צביעה אדומה ניטרלית, כאשר הציטופלזמה עשירה בכמה ליזוזומים מסומנים באדום והגרעין (שאינו מסומן על ידי הצבע) מופיע כחור שקוף.

באמצעות יישום הפרוטוקול, ניתן להבחין בשני מורפוטיפים עיקריים של המוציטים על פי Udayan et al.23: (1) תאים מפוזרים עם צורת שעועית דו קוטבית ולפעמים מתאר אמבואידי, ותאים קטנים יותר בצורת כוכב עגול (תאים n = 3 ו-10). בשני סוגי התאים, התנועה התאפיינה בשינויי צורה מתמשכים, עם התרחבות ונסיגה מתמשכת של פסאודופודיה ופילופודיה.

יישום הפרוטוקול מאפשר הערכה מוצלחת של תנועתיות ההמוציטים על ידי בניית עלילות מסלול, כפי שדווח באיור 2, וחישוב הפרמטרים הוולוצימטריים העיקריים כגון מהירות ממוצעת וישירות. אלה התאימו בהתאמה ל-6.46 ±-0.2 מיקרומטר/דקה ו-0.56 ±-0.02 (ממוצע ±-SEM) עבור תאים מפוזרים ו-5.18 ±-0.34 מיקרומטר/דקה ו-0.37 ±-0.03 עבור תאים קטנים, בהתאמה בתנאים פיזיולוגיים בסיסיים לאחר הצמדה של 30 דקות לתחתית הבאר. לכן, הפרוטוקול מאפשר סיווג של אוכלוסיות המוציטים שונות על סמך פרמטרים וולוצימטריים.

באמצעות יישום הפרוטוקול ניתן לזהות שינויים בפרמטר הוולוצימטרי של תנועתיות ההמוציטים בעקבות חשיפה לתרופות או מזהמים. איור 3A-D מציג תוצאות מייצגות של חשיפה חוץ גופית של המוציטים מולים לאקמול, שהיא אחת התרופות המשתחררות לסביבה (PiE) עם הריכוז הגבוה ביותר ותדירות הגילוי הגבוהה ביותר בנהרות בכל רחבי העולם31.

על פי Udayan et al.23, בתאי ביקורת, נצפתה עלייה משמעותית במהירות עם הזמן בשני המורפוטיפים של התאים, מה שמרמז על הפעלת המוציטים במהלך תרבית 24 שעות, ככל הנראה מעוררת את התגובה הדלקתית הנגרמת בניסוי על ידי נסיגה וציפוי בסביבת התרבית. כאשר התאים נחשפו לתרופה, הפעלת התנועתיות של ההמוציטים הופחתה באופן משמעותי בתאים מפוזרים (איור 3A) לאחר 24 שעות, אך לא בתאים עגולים קטנים (איור 3C), המאופיינים במהירות בסיסית ממוצעת נמוכה יותר (כפי שהוערך בזמן 0). בנוסף, הפרוטוקול איפשר זיהוי של שינויים במסלול התא בעקבות חשיפה לתרופות, כפי שעולה מהעלייה המשמעותית בישירות של תאים קטנים לאחר 24 שעות והירידה בישירות לאחר חשיפה של שעה אחת בתאים מפוזרים (איור 3C,D).

figure-results-1
איור 1: הדמיית זמן-lapse מייצגת של המוציטים ניטרליים מוכתמים באדום לאחר 30 דקות של חיבור לתחתית הבאר. התאים נצבעו בצבע החיוני אדום ניטרלי ממש לפני הערכת התנועתיות. תנועות התאים נוטרו באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בקצב של תמונה אחת בכל דקה למשך 10 דקות בהגדלה של פי 20. לקיצור, לוחות A, B ו-C מציגים שלוש מתוך 11 הפריימים שצולמו מאותו אזור עניין (ROI) ב-0 דקות, 5 דקות ו-10 דקות. אותם תאים ממוספרים בכל שלושת האיורים כדי להמחיש את תנועתם, וחצים מציינים את מרווחי הזמן. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: עלילת מסלול מייצגת של המוציטים M. galloprovincialis . המסלולים המוצגים מגיעים מבאר אחת. המסלולים של 25 תאים מוצגים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: השפעת חשיפה לאקמול (24 שעות) על המהירות והישירות של תאים מפוזרים (A,B) ותאים קטנים עגולים בצורת כוכב (C,D). הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. המובהקות הסטטיסטית של הנתונים הוערכה על ידי ANOVA חד כיווני ומבחן הפוסט של Tukey. *P < 0.05 לעומת בקרה (P < 0.05). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר בעבודה זו מייצג שיטה חדשה במבחנה המתאימה להערכה מהירה ורגישה של רעילות תרופות ומזהמים המבוססת על הערכת התנועתיות של המוציטים M. galloprovincialis והשינויים בה. תנועתיות היא היבט ייחודי של התפקוד החיסוני של תאים אלה 21,22,23,37,38, ולכן כל שינוי בתנועתיות התאים עשוי לבשר על שינויים בתפקוד החיסוני של תאים אלה. תנועתיות היא פונקציה תאית חיונית המשלבת מספר תהליכים תאיים, כגון הידבקות תאים, איתות תאים, פעילות שלד תאים, איתות תוך תאי וויסות נפח התא, ודורשת אינטגרציה ותיאום של אותות ביוכימיים וביומכניים מורכבים 39,40,41. כל אחד מהתהליכים הללו או המרכיבים של כל תהליך יכולים להיות מטרות פוטנציאליות לפעולה רעילה של תרופות ומזהמים. לכן, שינויים בתנועתיות במהירות התא ו/או במסלול מייצגים נקודות קצה רגישות המשלבות את ההשפעות על מטרות תאיות מרובות.

הפרוטוקול מתאים להערכה חוץ גופית של השפעות חומרי הבדיקה במבחנים לטווח קצר (הנמשכים 1-4 שעות) או במבחני חשיפה ממושכת, הנמשכים 24-48 שעות, ומאפשרים סינון מהיר של מזהמים ותרופות להשפעות רעילות פוטנציאליות. על ידי שימוש בצלחת של 96 בארות, השיטה מאפשרת בדיקה בו זמנית של מספר חומרים או ריכוזים משתנים של חומר בודד, ובכך חוסכת זמן וריאגנטים. בנוסף, ניתן להתאים את הפרוטוקול לשימוש גם עם ציוד אחר, כגון מיקרוסקופ ניגוד פאזה או מיקרוסקופ פלורסנט. במקרה זה, ניתן היה לדמות תאים ללא כל כתם או באמצעות צבעים חיוניים פלואורסצנטיים.

בעוד שהשיטה מציעה חלופות חדשות ורגישות לבדיקה טוקסיקולוגית, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות של השיטה ליישומים רחבים יותר. ראשית, היבט קריטי של יישום הפרוטוקול הוא הטמפרטורה. ידוע כי המוציטים של מולים רגישים לשינויי טמפרטורה. השפעות הטמפרטורה על ההמוציטים הן מורכבות, כאשר טמפרטורות גבוהות ונמוכות משפיעות לרעה על תפקודי מערכת החיסון שלהם 42,43,44. כפי שנצפה במהלך הגדרת השיטה, השלב הקריטי הנוגע להשפעת הטמפרטורה על תנועתיות התאים הוא השלב המקדים של קצירת תאים, הידבקות וטיפוח על המצע, שצריך לעקוב אחר טמפרטורת ההתאקלמות של האורגניזמים. עליות טמפרטורה של כמה מעלות במהלך שלב ראשון זה מעל טמפרטורת ההתאקלמות יכולות להיות קריטיות לרכישת צורת התא המתפשט והתנועתיות. לכן, טמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס מומלצת לתרבית המוציטים. רכישת התמונה בהילוך מהיר להערכת תנועתיות נעשתה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר של 20 מעלות צלזיוס. בהתבסס על תצפית ראשונית במהלך הגדרת השיטה, החשיפה של תאים מתורבתים למרווח זמן זה ב-20 מעלות צלזיוס אינה משנה באופן משמעותי את תנועתיות ההמוציטים. מגבלה נוספת של השיטה כרוכה במעקב ידני אחר המוציטים, מה שעשוי להציג שונות תלוית משתמש ולדרוש זמן ותשומת לב משמעותיים לפרטים. עם זאת, השימוש בצבע האדום הנייטרלי החיוני משפר את ההדמיה של התאים, ובתורו, מעקב אחר תאים באמצעות הדמיה של המערכת הליזוזומלית המפותחת. הגרעין אינו מוכתם על ידי הצבע, והוא מופיע כחור ריק שניתן לזהות בקלות ולהצביע בקלות במהלך מעקב ידני של התא. מגבלה נוספת של השיטה קשורה לאופי המבחנה שלה. בעוד שמצב המבחנה מספק סביבה מבוקרת להערכת תנועתיות, ייתכן שהוא לא ישחזר באופן מלא את האינטראקציות והתגובות המורכבות המתרחשות in vivo, במיוחד בתוך תגובות חיסוניות של אורגניזם שלם.

בשנים האחרונות נכנסו לשימוש נפוץ במדעי החיים גישות ומתודולוגיות חדשות, שמטרתן לשפר את התוצאות ולהפחית את ההסתמכותעל ניסויים בבעלי חיים. הפרוטוקול מציע בדיקה רגישה חלופית לבדיקה חוץ גופית של ההשפעות ומנגנוני הפעולה של מזהמים ותרופות כדי לסנן במהירות את ההשפעות הטוקסיקולוגיות של מזהמים כימיים הקיימים, בנפרד או בתערובות, במטריצות סביבתיות. הוא מתמקד בנקודת קצה חדשה, התנועתיות של תאי מערכת החיסון, שיכולה לספק תגובה משולבת להשפעות הטוקסיקולוגיות המופעלות על ידי תרופות ומזהמים על מטרות תאיות שונות. במובן זה, הוא מרחיב את מגוון בדיקות המבחנה הקיימות בספרות, גם מנקודת מבט של גישה משולבת רב-מבחנית ליישום בניטור ביולוגי סביבתי. חלק מהמאפיינים של הפרוטוקול מיישרים קו עם הקריטריונים של 3R (החלפה, הפחתה ועידון ), ותורמים להפחתת ניסויים בבעלי חוליות in vivo ולפיתוח מבחן רעילות חשיפה טוקסיקולוגית ואקוטוקסיקולוגית אתית ויעילה יותר. מאפיינים אלה כוללים את איסוף המולימפה הקל ממולים בצורה פולשנית נמוכה, הכמות הקטנה של המולימפה הנדרשת לבדיקה, ושימוש בצלחת מרובת בארות, המאפשרת חשיפה בו זמנית של ריכוזי רעלים מרובים ומשכפלים המציעים חיסכון משמעותי בזמן ובריאגנטים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי הפרויקט "Dipartimento di Eccellenza" שהוענק ל-DiSTeBA על ידי משרד האוניברסיטאות והמחקר האיטלקי, CUP: F85D18000130001, ועל ידי NBFC (המרכז הלאומי לעתיד המגוון הביולוגי) במימון האיחוד האירופי NextGenerationEU, PNRR, פרויקט מס' CN00000033. אנו מודים גם לתשתית BIOforIU במחלקה למדעי הביולוגיה והסביבה והטכנולוגיות של אוניברסיטת סלנטו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 ומיקרו; מסנן m (קוטר 25 מ"מ)ABLUO מעבדה
2.5 מ"ל מחט מזרק היפודרמי 22GRays2522CM32Labware
96 בארות פוליסטירן שטוח תחתון TC מטופלמיקרופלייט Corning3916Labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KG
תוכנת כלי כימוטקסיס כימי והגירה (Ibidi GmbH)תוכנה
Cytation 5 ציוד Agilent BioTeckCytation 5: קורא מולטי-מוד להדמיית תאים
דימתיל סולפוקסיד (DMSO) מרק (סיגמא - אולדריץ') 472301
פלקון ממס 15 מ"ל צינור קורנינג תחתון חרוטי352196כלי מעבדה
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394
המוציטומטר כימי קריאה מהירה 102BiosigmaBVS100מעבדה
HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזין-חומצה אתנסולפונית)מרק(סיגמא - אולדריץ') H3375-500G
Chemical ImageJ תוכנהNIHתוכנת
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881כימיקל
KClMerk 104936
כימיקל L-גלוטמיןמרק (Sigma - Aldrich) G7513חומצת אמינו חיונית לתרבית תאים בינונית
MgCl2· 6<תת>2Oמרק (סיגמא - אולדריץ') M2670כימיקל
MgSO4merk (Sigma - Aldrich) מיקרוסקופ כימי M7506
ניקון Eclipse E600ניקוןציוד: הדמיית תאים 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-Rכימי
NaFFluka71519 500 גרםכימי
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KG
אדום ניטרלי(Sigma - Aldrich) N4638-1Gצבע תאים חיוניים
פניצילין/סטרפטומיציןמרק (Sigma - Aldrich) P0781-100MLאנטיביוטיקה לתרבית תאים
SrCl2· 6<תת>2Oמרק (סיגמא - אולדריץ') 255521טריפן כימי
כחול מרק (סיגמא - אולדריץ') T8154צבע תאים
מרק כימי

מקורות

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Time Lapse
בדיקה טוקסיקולוגית ואקוטוקסיקולוגית המבוססת על תנועתיות המוציטים של מולים (Mytilus galloprovincialis)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.