אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב להערכת עמידות צפצפה לפתוגנים של אפטות גזע באמצעות שיטת חיסון עלי in vivo . שיטה זו מתאימה במיוחד להערכה בקנה מידה גדול של עמידות למחלת Cytospora chrysosperma ו- Botryosphaeria dothidea canker בצאצאי גידול צפצפה בסין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חיסון עלי Vivo: שיטה חלופית להערכת עמידות המחלה של שיבוטים היברידיים בגידול צפצפה של מחלת אפטות גזע
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות אפטות גזע הנגרמות על ידי הפתוגן Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) ו - Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. ודה נוט הן שתי מחלות היער העיקריות במטעי הצפצפה בסין, שלעיתים יכולות להרוס את כל שתילי הצפצפה או לפגוע קשות ביערות צפצפה בוגרים. השבחה היברידית היא השיטה הישירה והיעילה ביותר לשליטה וניהול מחלות עצים. עם זאת, הערכת עמידות למחלות או בחירת שיבוטים עמידים למחלות המבוססים על חיסון גזע חוץ גופי אינה יעילה, גוזלת זמן ויקרה, ומגבילה את התפתחות הרבייה ההיברידית של מחלת אפטות גזע הצפצפה. במחקר זה, הצענו שיטה חלופית להערכת עמידות המחלה לפתוגנים של אפטות גזע באמצעות חיסון עלי in vivo . חומרי הבדיקה המשמשים בשיטה זו יכולים להיות על שתילי צפצפה בני שנה או על ענפים שנתיים של צפצפה רב שנתית בחממה או בשדה. השלב הקריטי בשיטה חלופית זו הוא בחירת העלים המחוסנים: 5-7 העליםהחדשים שהבשילו עשויים להיות המתאימים ביותר. השלב הקריטי השני של שיטת חיסון העלים הוא יצירת פצעים על עלי הצמח דרך פירסי מחט, מתן נגעים מספיקים כדי למדוד את חומרת המחלה. עבור המספר המספיק של עלים המיוצרים בשלב המוקדם של גידול הצפצפה, חיסון זה של עלי in vivo תורם לסריקה מהירה, מדויקת ובקנה מידה גדול של שיבוטי צפצפה עמידים למחלות כדי לעצור פתוגנים של אפטות אפטות. יתר על כן, שיטת חיסון עלים זו תשמש גם כשיטה יעילה לסינון פתוטיפים של מחלת אפטות גזע C. chrysosperma, B.dothidea, או פתוגנים אחרים של אפטות גזע צפצפה.
מבוא
מחלות אפטות גזע צפצפה, הנגרמות בעיקר על ידי שני פתוגנים נקרוטרופיים, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. ו- Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. &דה נוט., מאיימים קשות על התפתחותם והישרדותם של מטעי צפצפה בצפון-מזרח, צפון וצפון-מערב (שלושה צפון) של סין. גידול היברידי הוא השיטה הישירה והיעילה ביותר לשליטה וניהול מחלות עצים; עם זאת, בהשוואה להתקדמות ברבייה של שיבוטים היברידיים צפצפה בעלי תפוקה גבוהה, גידול מהיר או שיבוטים היברידיים אחרים של צפצפה, המחקר על גידול עמידות למחלת אפטות צפצפה הוא נדיר. רק מחקרים מוגבלים על רבייה היברידית עמידה למחלות דווחו 1,2,3, ואף שיבוט היברידי עמיד לאפטות לא טופח בייעור צפצפה.
השלב המכריע של רבייה היברידית רגילה הוא בחירת השיבוט המבוססת על רכישת פנוטיפ של צאצאים היברידיים. עם זאת, רכישת פנוטיפים פתולוגיים (פתוטיפים) היא תהליך גוזל זמן, מייגע, מעייף, יקר ותלוי מומחים. עבור צמחים עציים, זה מאתגר יותר בשל הטבע הגוזל זמן, עבודה וכלכלה שנגרם על ידי מחזור החיים הארוך שלהם, צמיחה איטית, וגוף מסיבי. לדוגמה, בצפצפה, בדיקת העמידות לאפטות של צאצאים היברידיים נערכה 5-7 שנים לאחר הכלאה באמצעות שיטות חיסון גזע חוץ גופיות קונבנציונליות 1,2,3. יתר על כן, כשהם מוגבלים על ידי שיטת סינון זו העמידה למחלות ביעילות נמוכה ובצריכה גבוהה, החוקרים בחרו מחדש את השיבוטים העמידים לאפטות מתת-קבוצה קטנה (לדוגמה, שיבוטי הצפצפה שנבחרו בעלי תפוקה גבוהה או גידול מהיר), ולא מכל צאצאי הכלאיים. לכן, באמצעות שיטות החיסון הרגילות, הוא אינו בטוח לזהות את השיבוטים העמידים האותנטיים ואינו יכול לחשוף את המגוון העמיד למחלות של צאצאי הרבייה, ובכך להגביל את חקר הגנים או מודולי הגנים הקשורים לעמידות למחלות. בהשוואה להתפתחות המהירה של גידול מהיר של צפצפה / יבול גבוה, תוכניות רבייה אלה יכולות להשיג הכלאות באמצעות ברירה פנוטיפית או אפילו ברירה גנומית בשנתיים הראשונות של הרבייה4, הרבייה העמידה לאפטות צפצפה התפתחה לאט. הסינון (או האיתור) העמיד למחלות של צאצאים היברידיים, או שיטת החיסון נגד פתוגנים, הפך לשלב הגבלת המהירות המכריע ברבייה של אפטות צפצפה עמידות למחלות.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטת חיסון חדשנית לפתוגנים של אפטות גזע צפצפה, בשיטת חיסון עלי vivo . באמצעות שיטה זו אנו יכולים לבדוק במהירות וביעילות את עמידותם של עשרות מיני צפצפה (זנים או שיבוטים) תוך 5-7 ימים. בדיקת התיקוף המחישה כי חיסון עלי in vivo עולה בקנה אחד עם החיסון המסורתי בגזע חוץ גופי על זיהוי עמידות של מחלת אפטות גזע, דבר המצביע על כך ששיטת חיסון העלים מתאימה לבדיקת עמידות בקנה מידה גדול של מחלות אפטות צפצפה, כגון בחירת גנוטיפ שלם של צאצאי עמידות ברבייה של מחלת אפטות גזע. שיטה זו פותרת את הבעיה הפתולוגית של בחירת צאצאים עמידים ברבייה היברידית של מחלות אפטות צפצפה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות פטרייתית לפתוגן אפטות
- מכינים את אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA; מיצוי תפוחי אדמה 6.0 גרם, דקסטרוז 20.0 גרם, אגר 20.0 גרם) מדיום תרבית לזנים פטרייתיים; ממיסים את החומרים הנ"ל במים עד 1000 מ"ל, ממיסים לחלוטין את המדיום ב 100 ° C למשך 10 דקות.
- יוצקים מדיום PDA לתוך צינורות 25 מ"ל (כל אחד מכיל 15.0 מ"ל); יש לעקר את כל הצינורות בטמפרטורה של 121.1°C למשך 30 דקות. יוצקים את המדיום לצלחות תרבית (בקוטר 9.0 ס"מ) ומקררים את הצלחות בטמפרטורת החדר (RT).
- חותכים את התפטיר של הפתוגן הפטרייתי, אשר תרבית בינוני PDA ב 28 ° C במשך 7 ימים, לתוך ~ 0.5 ס"מ קוביות מרובעות; לחסן את קוביות הפטרייה במרכז לוחות PDA (דפנות התפטיר פונות למדיום).
- תרבית את הפתוגנים הפטרייתיים באינקובטור תרמוסטטי (28 מעלות צלזיוס, בחושך) במשך 7-10 ימים.
- חותכים את מדיום כף היד עם תפטיר פטרייתי לקוביות מרובעות (אורך צד 1.0-1.2 ס"מ).
2. הכנת חומרי צפצפה
- עבור שיבוטים של צפצפה בת שנה (מעובדים > 3 חודשים), בחרו את העלים החדשים שהובגרו והמורחבים במלואם (תמיד 5-7עלים , מראש השתיל/ענפים) של הענפים העיקריים כחומרים מחוסנים, וודאו שהם נקיים ממזיקים, מחלות ונזקים מכניים.
- עבור ענפים בני שנה של שיבוטים היברידיים רב-שנתיים של צפצפה (מעובדים > חודשיים), בחר את 5-7העלים העליונים של הענפים שנבחרו כחומרים מחוסנים. ודא שהעלים בריאים ובעלי אותו מצב אור (צל או אור) בין כל שיבוטי הצפצפה שנבדקו.
3. טיפול מקדים בעלי חיסון
- רססו את עלי הצפצפה במים נקיים, ולאחר הייבוש, נגבו את העלים שנבחרו עם 75% אלכוהול שעה או יום אחד לפני מניפולציות החיסון.
4. חיסון עלי In vivo
- לעלים קטנים (רוחב העלה < 8.0 ס"מ), יש לחסן שתי קוביות תפטיר פטרייתי מרובעות וקוביות PDA (או אגר מים, WA) (באורך צד 1.0-1.2 ס"מ) על פני השטח העליונים של 5-7 העלים העליונים של שיבוט צפצפה; התפטיר פונה לעלים. יש לוודא כי אתרי החיסון ממוקמים במרכז חצאי העלים, ~1-2 ס"מ מהמרחק בין הוורידים המרכזיים, תוך הימנעות מטשטוש הוורידים המשניים. כל שיבוט מחסן 12 אתרים על 6 עלים (10 אתרים לתפטיר ו-2 אתרים לחיסון PDA).
- לעלים גדולים (רוחב העלה ≥ 8.0 ס"מ), חסנו ארבע קוביות תפטיר פטרייתי מרובעות וקוביות PDA (או WA) על 5-7 עלי הצפצפה העליונים. כל שיבוט מחסן 12 אתרים ב-3 עלים (10 אתרים לתפטיר ו-2 אתרים לחיסון מחשב כף יד.
- עטפו את העלים המחוסנים בסרט הדבקה שקוף (ברוחב 6.0 ס"מ) ולחצו עליהם בעדינות כדי להפוך אותם להדביקים לעלים, ובכך מנעו תזוזה ואיבוד מים של קוביות התפטיר (או מחשב כף היד) במהלך הניסוי.
- מנקבים את העלים ואת קוביות התפטיר (או מחשב כף יד) בחמישה אתרים עד שהמחטים חודרות את הקוביות מהמשטח העליון לתחתון של עלי הצפצפה. אתר אחד נמצא במרכז, וארבעת האחרים נמצאים 1-2 מ"מ ליד ארבעת קודקודי הקוביות.
הערה: שיתוף פעולה צוות של 3 אנשים מומלץ למניפולציה של חיסון פטרייתי. מניפולציית החיסון של אוכלוסיית כלאיים צפצפה (>100 גנוטיפים) יכולה להתבצע תוך 4 שעות באמצעות עבודת צוות. מניפולציות הפירסינג בוצעו לאחר שכל העלים שנבדקו חוסנו ונעטפו כדי להקל על ההשפעה של זמני פירסינג שונים על חומרת המחלה. - בדוק את שינוי המיקום ואת אובדן המים של חיסוני התפטיר, וצפה בהופעת נגעים נמקיים סביב אתרי פצע פירס מפני השטח התחתונים של העליםעד היום השלישי לחיסון.
- תוך 3 ימים מהחיסון, שימו לב לשינוי המיקום ולאובדן המים של קוביות התפטיר. הגדירו וסמנו את קוביות התפטיר המועברות והמיובשות כחיסונים לא יעילים והשליכו אותן מהזיהוי הסופי של הפתוטיפים תוך הגדרת הקוביות האחרות כחיסונים יעילים.
הערה: פרוטוקול זה מגדיר את שיבוטי הצפצפה שנבדקו עם יותר מחמש קוביות חיסון יעילות כשיבוטים מחוסנים לא חוקיים; לכן, כל שיבוט צפצפה סיפק לפחות 30 אתרי חיסון יעילים, שיתפתחו ל-30 נקודות נמק עצמאיות.
- תוך 3 ימים מהחיסון, שימו לב לשינוי המיקום ולאובדן המים של קוביות התפטיר. הגדירו וסמנו את קוביות התפטיר המועברות והמיובשות כחיסונים לא יעילים והשליכו אותן מהזיהוי הסופי של הפתוטיפים תוך הגדרת הקוביות האחרות כחיסונים יעילים.
- קטפו את כל העלים המחוסנים בסוף הניסוי (~5-7 ימים לאחר החיסון), החזירו אותם למעבדה בשקיות דגימת פלסטיק, ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. רכישת פתוטיפ עלים והערכת עמידות צפצפה למחלות אפטות גזע במעבדה
- הסירו בזהירות את סרטי ההדבקה השקופים ואת התפטיר (או מחשבי כף היד) מהעלים.
- התבוננו וזהו את פתוטיפ העלים של כל שיבוט צפצפה, כולל הצורה והצבע של כתמים נמקיים, ועשויים לכלול את המבנה דמוי קור הפטרייה, פיקנידיה וקונידיה שנוצרו על פני השטח של העלים סביב אתרי הפירס.
- צלם את העלים (עם סרגל נוסף) באמצעות מצלמה, או סרוק את העלים (עם סרגל נוסף) באמצעות סורק לקבלת תמונות ברזולוציה של מעל 300 dpi, ולאחר מכן שמור את התמונות בתבנית JPEG , TIFF או PNG.
6. זיהוי וניתוח סטטיסטי של התרחשות המחלה
- פתח את התמונות של עלים חולים בתוכנה ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
- קבעו את קנה המידה בהתאם לסרגל בתמונות העלים.
- זהה ומדוד את הנגעים בעזרת כלי השרביט (עקיבה).
- רשום וייצא את ערכי האזור כגיליון אלקטרוני לאחר מדידת האזורים של כל הכתמים הנמקיים.
- קבעו את הקריטריונים לקביעת המחלה:
- אם שטח הנגע סביב קוביות התפטיר המכוסות באתרי פירס גדול משמעותית מזה המכוסה בקוביות PDA, אז הגדירו אתרים אלה כאתרי מחלה.
- אם המאפיינים המורפולוגיים של קוביות התפטיר שכסו אתרי פירס השתנו באופן משמעותי בהשוואה לאתרים המכוסים במחשבי כף יד, כולל צבעי הנגע, המייצרים מבנה דמוי קורים, פיקנידיה וקונידיה, הגדירו את האתר גם כאתר מחלה.
- חשב את האזורים הממוצעים של כתמי הנגע היעילים של כל שיבוט צפצפה היברידי. על פי האזורים הממוצעים, חלקו את כל כתמי התפטיר של שיבוט צפצפה אחד לשתי קטגוריות: התחלה ואי הופעה. לאחר מכן, חשב את שיעור היארעות המחלה של שיבוט הצפצפה הנבדק (פורמולה 1: שיעור היארעות המחלה (%) = מספר אתרי הדקירה החולה/המספר הכולל של אתרי דקירה יעילים × 100).
- חשב את השטח הממוצע של כתמים חולים בעלים (n = 50). על פי ערכי האזורים הממוצעים של כתמי עלים חולים בכל שיבוטי הצפצפה שנבדקו, קבעו סטנדרט לדירוג מחלה בן 5 רמות.
- חשב את מדד המחלה של כל שיבוט צפצפה (פורמולה 2) בהתבסס על תקן דירוג המחלה לעיל (פורמולה 2: מדד המחלה = ∑(מספר אתרי הדקירה לפי רמה × ערכי חומרה בכל הרמות)/(ערך רמת החומרה הגבוהה ביותר × המספר הכולל של אתרי דקירה יעילים) × 100).
- אמת את ההתפלגות הנורמלית של מספר שיבוטי הצפצפה על פני רמות התנגדות שונות באמצעות מבחן שפירא-וילק באמצעות כל תוכנת ניתוח נתונים מתאימה.
- על פי מדד המחלה, זהה את כל שיבוטי הצפצפה שנבדקו כחמש (או שבע) קבוצות: התנגדות גבוהה מאוד (VHR), התנגדות גבוהה (HR), התנגדות (R), ללא התנגדות וללא רגישות (NRNS), רגישות (S), רגישות גבוהה (HS) ורגישות גבוהה מאוד (VHS)קבוצה 5.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול הזה, תהליך העבודה הסכמטי נערך ב-48 שיבוטים היברידיים של צפצפה שנדבקו על-ידי פתוגן האפטות C . chrysosperma (איור 1). שיבוטי הכלאיים של הצפצפה הם חלק מצאצאי הכלאה של P. deltoides, המעובדים במשתלה באקדמיה הסינית ליערנות (CAF), בייג'ינג.
פתוגן אפטות הגזע C. chrysosperma isolate CZC הוא זן פטרייתי טיפוסי (עם פתוגניות אמצעית) המשמש למחקר פיזיולוגי של מחלת אפטות צפצפה 6,7,8,9 ומופקד במעבדה שלנו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מספק שיטת חיסון מהירה ויעילה לפתוגנים של עמידות לאפטות צפצפה, המתאימה לתחומי המחקר הדורשים בדיקות סקר עמידות למחלות בקנה מידה גדול, כגון רבייה היברידית של עמידות לאפטות צפצפה ובדיקת פתוגניות של פתוגנים של אפטות גזע.
נקודת המפתח הראשונה של השיטה היא להעריך עמידות למחלות על ידי חיסון עלים שזה עתה הבשילו במקום גבעולים / ענפים בשלים. כתוצאה מכך, בחירת שיבוטים של אפטות גזע עמידות למחלות יכולה להתבצע תוך 1-2 שנים של הכלאה צפצפה בעת שימוש בשיטת חיסון העל...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן במשותף על ידי המוסד המדעי המרכזי לאינטרס ציבורי, קרן המחקר בזאלית של מעבדת המפתח הממלכתית לגנטיקה והשבחה של עצים (מענק מספר CAFYBB2020ZY001-2) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מספר 32171776) לג'יאפינג ג'או.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| רדיד אלומיניום | Biosharp | BS-QT-027B | |
| C. chrysosperma isolate | מרכז איסוף תרבות היערנות של סין | CFCC86775 | הפרדה ושימור על ידי המעבדה שלנו |
| Cytospora chrysosperma | מעבדה לפיזיולוגיה של צמחים, המכון לטכנולוגיה חדשה של יערנות, האקדמיה הסינית ליערנות | מספר כניסה ל-NCBI: MK994101 עבור rRNA-ITS ו-MN025273 עבור EF1α ג'ן מספר CGMCC:40575 | הפרדה ושימור על-ידי המעבדה שלנו |
| Epson Perfection V370 Photo | Epson | V370 | ; סרוק את העלים לתמונה |
| PDA (אגר תפוחי אדמה דקסטרוז) | Solarbio | P8931 | לספק תזונה לגידול פטרייתי |
| סרט | כדי לתקן פטריות על העלים | ||
| Populus alba var. Pyramidalis | מעבדה לפיזיולוגיה של צמחים, המכון לטכנולוגיה חדשה ליערנות, האקדמיה הסינית ליערנות | מעובד על ידי המעבדה שלנו | |
| ניתוח נתונים | SPSS | IBM | |
| חממה תרמוסטטית | שנחאי Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd | KTD-6000 | לספק סביבה לצמיחת פטריות |
| מצלמת TG-6 קשוחה | OLYMPUS | לצילום עלים חולים |
מקורות
- Du, K., et al. Genetic analysis and seedling selection of the poplar progenies of Aigeiros section. Journal of Huazhong Agricultural University. 28 (5), 624-630 (2009).
- Shi, Y. Identification of canker resistance to selection poplar clones [Master's thesis]. , Northwest Agriculture and Forestry University. (2014).
- Zhang, L., Zhang, H., Ou, D., Fan, J. Investigation on the resistance to canker of some new leuce hybrids inoculated with Botryosphaeria dothidea. Journal of Northwest Forestry University. 32 (6), 210-213 (2017).
- Du, C., et al. Genomic selection of seedling growth traits in a poplar hybrid population. For Res. 36 (6), 11-19 (2023).
- Li, Z., et al. A rapid and efficient in vivo inoculation method for introducing tree stem canker pathogens onto leaves: Suitable for large-scale assessment of resistance in poplar breeding progeny. BioRxiv. , (2024).
- Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9 (1), 10111(2019).
- Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 112, 101523(2020).
- Xing, J., et al. Comparisons of photosynthetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis Infected by the stem canker pathogen Valsa sodida and Botryosphaeria dothidea at early stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
- Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
- Balendres, M. A., De Torres, R., Dela Cueva, F. Culture storage age and fungal re-isolation from host-tissue influence Colletotrichum spp. virulence to pepper fruits. J Phytopathol. 167 (9), 510-515 (2019).
- Ward, K. T., Ostry, M. E. Variation in Septoria musiva and implications for disease resistance screening of poplars. Plant Dis. 89 (10), 1077-1082 (2005).
- Asalf, B., et al. Ontogenic resistance of leaves and fruit, and how leaf folding influences the distribution of powdery mildew on strawberry plants colonized by Podosphaera aphanis. Phytopathology. 104 (9), 954-963 (2014).
- Dunnell, K. L., Le Boldus, J. M. The correlation between Septoria leaf spot and stem canker resistance in hybrid poplar. Plant Dis. 101 (3), 464-469 (2017).
- Wei, J., Huang, L., Gao, Z., Ke, X., Kang, Z. Laboratory evaluation methods of apple Valsa canker disease caused by Valsa ceratosperma sensu Kobayashi. Acta Phytopathol Sinica. 40 (1), 14-20 (2010).
- Shen, W., et al. Comparative study on the effectiveness of three inoculation methods for Valsa sordida in Populus alba var. pyramidalis. Biology. 13 (4), 251(2024).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
