הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67296

⸱

1 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Columbia Stem Cell Initiative, Stem Cell Core, Columbia University Irving Medical Center, 3Department of Anatomy, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 4Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University, 5ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (PMRI-AD), United Arab Emirates University

במאמר זה

סיכום

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

תקציר

מערכת CRISPR-Cas9 לעריכת גנום חוללה מהפכה במחקרי תפקוד גנים בתאי יונקים, כולל תאי גזע. עם זאת, היישום המעשי של טכניקה זו, במיוחד בתאי גזע פלוריפוטנטים, מציב אתגרים מסוימים, כגון היותה עתירת זמן ועבודה ויעילות עריכה נמוכה. במאמר זה אנו מתארים את היצירה של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) המבטא ביציבות sgRNA עבור הגן L2HGDH, תוך שימוש במערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ויציבה ביותר. ה-sgRNA המכוון לאקסון 1 של הגן L2HGDH סונתז כימית ושוכפל לווקטור lentiCRISPR v2-puro, המשלב את הביטוי המכונן של sgRNA עם Cas9 במערכת וקטורית יחידה יעילה ביותר להשגת טיטרים לנטי-ויראליים גבוהים יותר עבור זיהום hESC ובחירה יציבה באמצעות פורומיצין. תאים שנבחרו בפורומיצין הורחבו עוד יותר, ושיבוטים חד-תאיים התקבלו בשיטת הדילול המוגבלת. השיבוטים הבודדים הורחבו, והתקבלו מספר שיבוטים הומוזיגוטיים עבור הגן L2HGDH, כפי שאושר על ידי הפחתה של 100% בביטוי L2HGDH באמצעות ניתוח כתמים מערביים. יתר על כן, באמצעות MSBSP-PCR, אתר מוטציית CRISPR מופה במעלה הזרם של רצף זיהוי PAM של Cas9 בשיבוטים הומוזיגוטיים שנבחרו. בוצע ריצוף סנגר לניתוח ההחדרות/מחיקות המדויקות, ובוצע אפיון פונקציונלי של השיבוטים. שיטה זו יצרה אחוז גבוה משמעותית של מחיקות הומוזיגוטיות בהשוואה לשיטות העברת גנים לא נגיפיות שדווחו בעבר. למרות שדו"ח זה מתמקד בגן L2HGDH, גישה חזקה וחסכונית זו יכולה לשמש ליצירת נוקאאוטים הומוזיגוטיים עבור גנים אחרים בתאי גזע פלוריפוטנטיים למחקרי תפקודי גנים.

מבוא

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הם תאי גזע בעלי פוטנציאל להתמיין לכל סוגי התאים בגוף. תאים אלה משמשים כלים רבי ערך לחקר ההתפתחות האנושית, כמו גם להבנת המנגנונים העומדים בבסיסן של מחלות שונות, ובכך מציעים הבטחה עצומה לרפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וגילוי תרופות. מחקרים כאלה כוללים חקירה כיצד גנים מסוימים תורמים להתפתחות, תפקוד וויסות של אורגניזמים 1,2.

טכניקות וגישות שונות משמשות לפענוח תפקוד גנים, כולל מניפולציה גנטית, כגון נוקאאוט גנים או ביטוי יתר, ועריכת גנום. בין אלה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 התגלתה כגישה היעילה ביותר למחקרי נוקאאוט גניםועריכת גנים 1,2,3. מערכת CRISPR-Cas9 פועלת על ידי שימוש במולקולת RNA מנחה יחידה (sgRNA) שתוכננה במיוחד לזהות ולהיקשר לרצף DNA מסוים של עניין. כמדריך מולקולרי, ה-sgRNA מכוון את האנזים Cas9 למיקום המדויק בגנום הדורש שינוי. לאחר הקשירה, Cas9 יוזם שבירה דו-גדילית בדנ"א באתר המיועד. בעקבות פיצול הדנ"א מופעלים מנגנוני התיקון הטבועים בתא. אלה כוללים שני מסלולי תיקון עיקריים: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ גורם לעתים קרובות להחדרות או מחיקות (indels) באתר ההפסקה, מה שמוביל לשיבוש או השבתה של גנים. לעומת זאת, HDR מאפשר החדרה של רצפי DNA חדשים באתר ההפסקה, מה שמקל על הכנסת שינויים גנטיים ממוקדים4.

בהתחשב בחשיבות של מחיקות גנים בתאי גזע פלוריפוטנטים, פורסמו מספר פרוטוקולים על נוקאאוטים גנטיים בתיווך CRISPR-Cas9 בתאי גזע עובריים עובריים/iPSCs. עם זאת, רבים מהפרוטוקולים הללו עומדים בפני מגבלות משמעותיות, כגון היותם גוזלים זמן רב, דורשים עבודה רבה ויעילות נמוכה עקב השימוש בשיטות העברת גנים שאינם נגיפיים5. אתגרים אלה בולטים עוד יותר בתאי גזע עובריים/iPSCs, שכן תאים אלה ידועים כבעלי יעילות עריכה נמוכה יותר בהשוואה לסוגי תאים אחרים5. ניתן לטפל בחלק ממגבלות אלה על ידי הגברת היעילות של העברת פלסמיד המכיל Cas9 ו- sgRNAs. ניתן להשיג זאת בהצלחה באמצעות מערכת וקטורית לנטיויראלית, אשר יכולה לשפר באופן משמעותי את תוצאות עריכת הגנים. פרוטוקולי האריזה של Lentivirus מבוססים היטב ופשוטים, ומאפשרים אימוץ קל במעבדות, אפילו על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל. לנטי-וירוסים מפגינים יעילות זיהום גבוהה בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע עובריים (עוברי עובר) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC). לכן, שימוש במערכת לנטי-ויראלית לביטוי Cas9-sgRNA הוא אידיאלי לניסויים שגרתיים בעריכת גנים בתאי גזע עובריים/iPSCs עבור מחקרי תפקוד גנים.

כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה ופשוטה למחיקות גנים יעילות ביותר המבוססות על CRISPR-Cas9 בתאי גזע עובריים עובריים (תאי גזע עובריים) במשך זמן קצר יחסית מאשר פרוטוקולים קונבנציונליים (איור 1). למרות שנעשה שימוש בווקטור לנטי-ויראלי עם ביטוי מכונן של Cas9 ו-sgRNA, ניתן בקלות להחליף אותו בביטוי Cas9 הניתן להשראת תרופות עבור ביטוי Cas9 הניתן לשליטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרטי רצפי הגנים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. תכנון RNA מדריך יחיד (sgRNA), שיבוט וייצור וקטורים לנטי-ויראליים

הערה: נעשה שימוש בשני רצפי sgRNA שונים המכוונים לאקסון 1 של הגן L2HGDH , שניהם מותאמים מ-Qiu et al.6עם אתרי PAM של AGG ו-TGG עבור רצפים 1 ו-2, בהתאמה. אורכם של שני ה-sgRNA היה 20 bp, והקצוות שונו כדי להוסיף רצפי קישור עבור אנזים הגבלה Bsmb1 שישוכפל בווקטור המטרה (LentiCRISPRv2) כפי שתואר בדו"ח הקודם6. רצפי לינקר נוספו במהלך תכנון sgRNA למטרות שיבוט.

  1. אנלי מסנתז כימית sgRNAs6 ומשובט לתוך Bsmb1 יחיד לחתוך וקטור lentiviral, LentiCRISPRv2 באמצעות פרוטוקול אופטימלי כפי שדווח בעבר7.
  2. המשך עם אריזה וריכוז לנטיויראלי באמצעות פרוטוקול סטנדרטי וממוטב7.
  3. לייצור לנטיוירוסים, זרעים HEK293T תאים (1 × 105 תאים לס"מ2) באמצעות DMEM, 10% FBS ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ודגרים לילה באינקובטור תרביות רקמה בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO2 בתנאי לחות.
  4. כאשר 90% מתמזגים, קו-טרנספקט HEK293T תאים עם וקטור כניסה (עמוד שדרה ריק או sgRNA המבטא פלסמידים) ואריזת פלסמידים באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה PEI כפי שתואר קודם לכן7.
  5. אסוף את המדיה המותנית המכילה חלקיקי סופרנאטנט לנטי-ויראלי (LVS) ב-48 שעות ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה והמשך עם אולטרה-צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז וסובב את הצינורות ב-1,25,000 x גרם במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. המשך עם ריכוז חלקיקי LVS לפחות פי 200 מהנפח המקורי ב- PBS, aliquot, ואחסן ב -80 ° C עד לשימוש.
  7. קבע את הטיטר של חלקיקים לנטי-ויראליים באמצעות ערכת הטיטר qPCR Lentivirus בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

2. זיהומים לנטי-ויראליים והתפשטות חד-תאית

  1. עבור זיהומים עם חלקיקי LVS, תרחיף תאי hESC (H9) זרע בעל 1 × 105 תאים / 0.5 מ"ל של מדיה בתרבית hESC (מדיה בזאלית + P/S + 10 מיקרומטר של מעכב סלעים) על מטריגל שלם (1:50) מצופה P24 צלחות באר ב 500 μL של מדיה ולדגור במשך הלילה כדי לאפשר לתאים להיקשר. זרע בארות נוספות שלא יהיו נגועות ב- LVS אך יטופלו בפורומיצין כדי לשמש כבקרה לא נגועה.
    הערה: ספירת תאים יכולה להתבצע באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי.
  2. למחרת, להדביק את התאים ב ריבוי של זיהום (MOI) של 10 יחד עם 8 מיקרוגרם / מ"ל של פוליברן לדגור ב 37 ° C במשך 8 שעות ולאחר מכן החלפת מדיה עם מדיה hESC טרי + P / S ללא מעכב סלע ולהמשיך בתרבית עד שהתאים הם 90% נפגשים.
  3. התחל את בחירת הפורומיצין על ידי השלמת המדיה עם ריכוז של 0.8 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, שהוא בדרך כלל 48-72 שעות לאחר ההדבקה, והמשך את הבחירה עד שכל התאים ימותו בתאים שאינם נגועים (קבוצת הביקורת).
  4. לאחר השלמת הבחירה (בדרך כלל 4-6 ימים), לפצל תאים יציבים (1:4) ולהרחיב להקפאה וניתוח נוסף.
  5. בצע בחירה של תא בודד והרחבת שיבוט באמצעות תאים המבטאים L2HGDH-sgRNA-16.
  6. לשם כך, הכינו תרחיף תאים שווה ערך ל-500 תאים/10 מ"ל של מצע גדילה שלם וזרעים של 100 מיקרוליטר של תרחיף זה בכל באר של צלחת 96 בארות.
  7. השאירו את התאים ללא הפרעה במשך 3 ימים ולאחר מכן התבוננו.
  8. סמן את הבארות המניבות שיבוטים בודדים ושנה את המדיה כל יומיים עד שיושג גודל מספיק עבור המושבות (בדרך כלל שבועיים) להתרחב עוד, להקפיא ולנתח.

3. מיצוי gDNA, MS-BSP PCR וריצוף Sanger

  1. בודד gDNA מתאים באמצעות ערכת בידוד הדנ"א הגנומי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  2. המשך במיפוי אתרי מוטציות במעלה הזרם של רצפי זיהוי PAM באמצעות ניתוח פריימרים ספציפיים מבוססי אתרי מוטציות (MS-BSP)8.
  3. לשם כך, פריימר ימני בלתי משוחד L2H-UMSBSP-R1 נועד להגביר את האזור שמחוץ ל- Exon1 כדי להגביר את כל המטרות.
  4. תכנן פריימר שמאלי מוטה L2H-BMSBSP-F1 עם רצף זהה ל-sgRNA כדי להגביר את רצף המטרה קרוב לרצפי זיהוי PAM.
    הערה: בתנאים מחמירים מאוד של PCR, המוצר ייצפה על הג'ל בשיבוטים ללא מוטציה. שום מוצר לא ייצפה בשיבוטים של CRISPR-knockout המציגים מוטציות קרובות לזרם מעלה של רצפי זיהוי PAM.
  5. על מנת למפות מוטציות של זוג בסיסים יחידים, PCR מגביר רצף של 468 bp המשתרע על פני כל האקסון 1 של L2HGDH וכפוף לריצוף Sanger ואחריו ניתוח יישור רצפים מרובים באמצעות clustalw8.

4. בדיקת התמיינות תאי גזע עובריים והיווצרות גוף עוברי (EB)

  1. המשך עם התמיינות מכוונת של בקרה ושיבוטים שונים של CRISPR של תאי גזע עובריים (H9) לקראת גורל נוירו-אקטודרם בעקבות פרוטוקולים מבוססים כפי שתוארו קודם לכן באמצעות שיטת עיכוב smad כפולה 9,10,11.
  2. כאשר במפגש של 90%, טפל בתאים עם LDN193189 (200 ננומטר) ו- SB431542 (10 מיקרומטר) למשך 24 שעות ראשוניות במדיה של 100% KSR ולאחר מכן תוספת של XAV939 (2 מיקרומטר) למשך יומיים נוספים.
  3. לאחר 3 ימים, הפחיתו את אחוז מדיית KSR (Knockout DMEM בתוספת 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-גלוטמין, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM ו-0.1% (v/v) 2-מרקפטואתנול (75%, 50%, 25%) על ידי שילוב עם מדיה N2 (DMEM/F12 בתוספת תוספת N2 1x, מכפיל רווח 1x, ) ל-100% מדיה N2 במשך תקופה של 8 ימים.
  4. בתחילת היום ה-12, תקנו את התאים לצביעת מערכת החיסון באמצעות PAX6 כסמן נוירו-אקטודרם (neuro-ectoderm).
  5. עבור מחקרים על קביעת גורל מזודרם ואנדודרמלי, השתמש בגישה מבוססת CHIR99021 מולקולה קטנה שתוארה בפרסומים קודמים12,13.
  6. לשם כך, כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%, יש לטפל עם 3 מיקרומטר של CHIR99021 במדיה Definitive Endoderm (DE) במשך 24 שעות ולאחר מכן קיבוע עבור immunostaining באמצעות Brachuary כמו סמן ספציפי mesoderm.
  7. עבור השלב האנדודרמלי, תרבית את התאים במשך 24 שעות נוספות במדיה DE בלבד ללא תוספת של CHIR99021 לפני קיבוע עבור immunostaining באמצעות FOXA2.
  8. לבדיקת היווצרות EB, זרעו את התאים על משטחי תאים בעלי התקשרות נמוכה מבלי להשתמש במטריג'ל לתרבית תאים בתנאי השעיה במשך 24 שעות לפני לקיחת מיקרוגרפים.

5. ניתוח כתמים מערביים

  1. יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות PBS וליז באמצעות חיץ RIPA אחד המכיל 1% SDS וקוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז 1x.
  2. נקה את הליזטים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ואחריו איסוף של supernatants.
  3. כמת את חלבון התא הכולל באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. התאם את הדגימות ל- 2 מיקרוגרם/מיקרוליטר באמצעות מאגר דגימת צבע טעינה של 4×.
  4. נטרלו את דגימות החלבון בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות, טענו כמויות שוות של כל דגימה ופתרו באמצעות ג'ל SDS-PAGE 7 הדרגתישל 4%-12% ולאחר מכן העבירו אותן לממברנת PVDF במתח קבוע של 100 V למשך שעה אחת ב-4°C.
  5. לחסום את הממברנות באמצעות חלב 5% ללא שומן ולדגור בדילול נוגדנים ראשוני ב 4 ° C במשך הלילה עם סיבוב.
  6. לאחר מכן, יש לשטוף את הממברנות 5x באמצעות חיץ PBST ולדגור בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  7. לשטוף את הממברנות שוב עם PBST 5x, לדגור עם מצע chemiluminescent, ולהתפתח באמצעות יריעות רנטגן.

6. Immunostaining

  1. זרעו את התאים על צלחות באר P4 ודגרו לפחות 24 שעות לפני הקיבוע כדי לאפשר חיבור תקין של תאים למשטחים.
  2. שטפו את התאים 3x עם PBS כדי להסיר תאים מתים כמו גם רכיבי מדיה, ולאחר מכן קיבוע באמצעות 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. חדרו את התאים באמצעות 0.3% טריטון X-100 ולאחר מכן חסמו עבור קשירה לא ספציפית על ידי שימוש ב-2% BSA ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. דגרו על הדגימות עם נוגדנים ראשוניים (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) מדוללים ב-1% BSA למשך הלילה ב-4°C.
  5. יש לשטוף את התאים 3x עם PBS ולדגור עם נוגדנים משניים מתאימים (עז נגד עכבר 488, עז נגד ארנב 488, עז נגד עכבר 546, עז נגד ארנב 546) מדולל ב 1% BSA במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  6. לבסוף, שטפו את הדגימות עם PBS 3x והכתימו אותן נגדית עם DAPI ותמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיבוט של L2HGDH sgRNA ב-lentiCRISPRv2 puro
וקטור הפורו lentiCRISPRv2 הושג באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ועוכל עם BsmB1, מה שהביא לשחרור של קטע פוחלץ של 1.8 Kb. כפי שניתן לראות באיור 2A, נצפה עיכול מלא של הווקטור. עבור כל מבנה, שישה שיבוטים נבדקו לנוכחות או היעדר החדרה באמצעות רצף sgRNA הפוך כפריימר ופריימר קדמי (U6-459F) מתוך הרצף הווקטורי. באמצעות גישה זו, רק השיבוטים שקיבלו את האינסרט הניבו תוצר PCR של 288 bp, ושיבוטים שליליים שלא הכילו את הרצף ההפוך של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה תיקן שיטה המאפשרת מחיקות גנים יעילות וחסכוניות ביותר בתאי גזע עובריים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. שיטה זו השיגה בהצלחה מחיקה הומוזיגוטית של הגן L2HGDH בתאי גזע עובריים עובריים תוך 3-4 שבועות, החל מזיהום בתאי גזע עובריים עובריים ועד לבחירה והתפשטות של תא בודד (טבלה 1). למרות שמניפולציות גנטיות בתיווך CRISPR-Cas9 יכולות להיות מושגות על ידי טרנספקציות חולפות ברוב התאים, זה הופך למאתגר בתאי גזע עקב יעילות טרנספקציה ירודה ורעילות תאים גבוהה. מחקרים שונים דיווחו על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מאוניברסיטת איחוד האמירויות הערביות (UAEU) - #12M105 מענקים, #12R167 מענקים (מרכז זאיד למדעי הבריאות), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)), ו- ASPIRE, עמוד התווך לניהול תוכניות הטכנולוגיה של מועצת המחקר לטכנולוגיה מתקדמת של אבו דאבי (ATRC), באמצעות מכון המחקר לרפואה מדויקת ASPIRE אבו דאבי (ASPIREPMRIAD) מספר מענק VRI-20-10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנול Invitrogen31350010
38.5 מ"ל, סטרילי + מאושר בחינם פתוח
צינורות דקים Ultra-Clear		Beckman CoulterC14292
AccutaseStem Cell Technologies7920
bFGF רקומביננטי אנושיInvitrogenPHG0261
Brachyury Rabbit mAbAbclonalA5078
BsmBI-v2NEBR0739S
chir99021Tocris4423/10
קורנינג מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף,קורנינגללא
טכנולוגיות תאי גזעציקלופמין72074
DMEM מדיהInvitrogen11995073
DMEM NUTRIENT MIX F12 Invitrogen11320033
DPBS עם: Ca ו-MgPAN BiotechP04-36500
סרום בובי עובריInvitrogen10270106
FoxA2/HNF3β  CST8186
GAPDH (14C10) נוגדן mAb ארנבCST2118S
טכנולוגיות תאי גזעמגיב דיסוציאציה עדינה של תאים7174
HyClone חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) 100x SolutionGE healthcareSH30238.01
Ki-67 (D3B5) Rabbit mAbCST9129
החלפתסרום נוקאאוטInvitrogen10828028
L GLUTAMINE, 100xInvitrogen2924190090
L2H-BMSBSP-F1MacrogenCGTGCGGTCGCTGGG
L2HGDH נוגדן פוליקלונליProteintech15707-1-AP
L2HGDH-SgRNA1-FMacrogenCACCGCGTGCGG
GTTCGCGTCTGGG
L2HGDH-SgRNA1-RMacrogenAAACCCCAGACGC
GAACCCGCACGC
L2HGDH-SgRNA2-FMacrogenCACCGCCCGCGG
GCTTTTCGCCGG
L2HGDH-SgRNA2-RMacrogenAAACCCGGCGAA
AAGCCCGCGGGC
L2H-seqF1MacrogenGCTAAAGAGCGC
GGGTCCTCGG
L2H-SeqR1MacrogenGTGGACGGGTTG
TTCAAAGCCAGAG
L2H-UMSBSP-R1מקרוגןGTGGACGGGTTG
TTCAAAGCCAGAG
LentiCRISPRv2Addgene52961
mTesR1 מדיה מלאהטכנולוגיות תאי גזע85850
נוגדן ננוגCST3580
מדיום נוירובזאלי 1x CTSInvitrogenA1371201
Neuropan 2 תוסף 100xPAN BiotechP07-11050
Neuropan 27 תוסף 50xPAN BiotechP07-07200
Oct-4 נוגדןCST2750
Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAbCST60433
PENICILLIN STREPTOMYCIN SOLInvitrogen15140122
pMD2.GAddgene12259
מגיב זיהום פוליברןסיגמאTR1003- G
פוליאתילנימין, סיגמא מסועף408727
psPAX2.0Addgene12260
PuromycinInvitrogenA1113802
qPCR ערכת טיטר לנטיווירוסABMLV900
מעכב סלע Y-27632
דיהידרוכלוריד 		טוקריס1254
SB 431542טוקריס1614/10
נוגדן Sox2 CST2748
סוכרוזסיגמא57-50-1
טריפסין .05% EDTA Invitrogen25300062
U6-459FמקרוגןGAGGGCCTATT
אשף TCCCATGATTC
ערכת טיהור DNA גנומי פרומגהA1120
XAV 939טוקריס3748/10
LDEV 354234 ,

מקורות

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  5. Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
  6. Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
  7. Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
  8. Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
  9. Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
  10. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
  11. Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
  12. Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
  13. Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
  14. Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
  15. Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
  16. Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  17. Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
  18. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

עריכה באמצעות CRISPR-Cas9השתקת גן (Gene Knockout)תרבית ללא תאי מאכילה (Feeder-Free)הובלת גנים באמצעות לנטי-וירוסשיבוט תא בודדסלקציה באמצעות פוּרומיציןWestern Blotסממני צביעה אימונוהיסטוכימיתיצירת גופי אמביריואיד (Embryoid Body)
CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.