השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.
מאמר שיטה
CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכת CRISPR-Cas9 לעריכת גנום חוללה מהפכה במחקרי תפקוד גנים בתאי יונקים, כולל תאי גזע. עם זאת, היישום המעשי של טכניקה זו, במיוחד בתאי גזע פלוריפוטנטים, מציב אתגרים מסוימים, כגון היותה עתירת זמן ועבודה ויעילות עריכה נמוכה. במאמר זה אנו מתארים את היצירה של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) המבטא ביציבות sgRNA עבור הגן L2HGDH, תוך שימוש במערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ויציבה ביותר. ה-sgRNA המכוון לאקסון 1 של הגן L2HGDH סונתז כימית ושוכפל לווקטור lentiCRISPR v2-puro, המשלב את הביטוי המכונן של sgRNA עם Cas9 במערכת וקטורית יחידה יעילה ביותר להשגת טיטרים לנטי-ויראליים גבוהים יותר עבור זיהום hESC ובחירה יציבה באמצעות פורומיצין. תאים שנבחרו בפורומיצין הורחבו עוד יותר, ושיבוטים חד-תאיים התקבלו בשיטת הדילול המוגבלת. השיבוטים הבודדים הורחבו, והתקבלו מספר שיבוטים הומוזיגוטיים עבור הגן L2HGDH, כפי שאושר על ידי הפחתה של 100% בביטוי L2HGDH באמצעות ניתוח כתמים מערביים. יתר על כן, באמצעות MSBSP-PCR, אתר מוטציית CRISPR מופה במעלה הזרם של רצף זיהוי PAM של Cas9 בשיבוטים הומוזיגוטיים שנבחרו. בוצע ריצוף סנגר לניתוח ההחדרות/מחיקות המדויקות, ובוצע אפיון פונקציונלי של השיבוטים. שיטה זו יצרה אחוז גבוה משמעותית של מחיקות הומוזיגוטיות בהשוואה לשיטות העברת גנים לא נגיפיות שדווחו בעבר. למרות שדו"ח זה מתמקד בגן L2HGDH, גישה חזקה וחסכונית זו יכולה לשמש ליצירת נוקאאוטים הומוזיגוטיים עבור גנים אחרים בתאי גזע פלוריפוטנטיים למחקרי תפקודי גנים.
מבוא
תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הם תאי גזע בעלי פוטנציאל להתמיין לכל סוגי התאים בגוף. תאים אלה משמשים כלים רבי ערך לחקר ההתפתחות האנושית, כמו גם להבנת המנגנונים העומדים בבסיסן של מחלות שונות, ובכך מציעים הבטחה עצומה לרפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וגילוי תרופות. מחקרים כאלה כוללים חקירה כיצד גנים מסוימים תורמים להתפתחות, תפקוד וויסות של אורגניזמים 1,2.
טכניקות וגישות שונות משמשות לפענוח תפקוד גנים, כולל מניפולציה גנטית, כגון נוקאאוט גנים או ביטוי יתר, ועריכת גנום. בין אלה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 התגלתה כגישה היעילה ביותר למחקרי נוקאאוט גניםועריכת גנים 1,2,3. מערכת CRISPR-Cas9 פועלת על ידי שימוש במולקולת RNA מנחה יחידה (sgRNA) שתוכננה במיוחד לזהות ולהיקשר לרצף DNA מסוים של עניין. כמדריך מולקולרי, ה-sgRNA מכוון את האנזים Cas9 למיקום המדויק בגנום הדורש שינוי. לאחר הקשירה, Cas9 יוזם שבירה דו-גדילית בדנ"א באתר המיועד. בעקבות פיצול הדנ"א מופעלים מנגנוני התיקון הטבועים בתא. אלה כוללים שני מסלולי תיקון עיקריים: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ גורם לעתים קרובות להחדרות או מחיקות (indels) באתר ההפסקה, מה שמוביל לשיבוש או השבתה של גנים. לעומת זאת, HDR מאפשר החדרה של רצפי DNA חדשים באתר ההפסקה, מה שמקל על הכנסת שינויים גנטיים ממוקדים4.
בהתחשב בחשיבות של מחיקות גנים בתאי גזע פלוריפוטנטים, פורסמו מספר פרוטוקולים על נוקאאוטים גנטיים בתיווך CRISPR-Cas9 בתאי גזע עובריים עובריים/iPSCs. עם זאת, רבים מהפרוטוקולים הללו עומדים בפני מגבלות משמעותיות, כגון היותם גוזלים זמן רב, דורשים עבודה רבה ויעילות נמוכה עקב השימוש בשיטות העברת גנים שאינם נגיפיים5. אתגרים אלה בולטים עוד יותר בתאי גזע עובריים/iPSCs, שכן תאים אלה ידועים כבעלי יעילות עריכה נמוכה יותר בהשוואה לסוגי תאים אחרים5. ניתן לטפל בחלק ממגבלות אלה על ידי הגברת היעילות של העברת פלסמיד המכיל Cas9 ו- sgRNAs. ניתן להשיג זאת בהצלחה באמצעות מערכת וקטורית לנטיויראלית, אשר יכולה לשפר באופן משמעותי את תוצאות עריכת הגנים. פרוטוקולי האריזה של Lentivirus מבוססים היטב ופשוטים, ומאפשרים אימוץ קל במעבדות, אפילו על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל. לנטי-וירוסים מפגינים יעילות זיהום גבוהה בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע עובריים (עוברי עובר) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC). לכן, שימוש במערכת לנטי-ויראלית לביטוי Cas9-sgRNA הוא אידיאלי לניסויים שגרתיים בעריכת גנים בתאי גזע עובריים/iPSCs עבור מחקרי תפקוד גנים.
כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה ופשוטה למחיקות גנים יעילות ביותר המבוססות על CRISPR-Cas9 בתאי גזע עובריים עובריים (תאי גזע עובריים) במשך זמן קצר יחסית מאשר פרוטוקולים קונבנציונליים (איור 1). למרות שנעשה שימוש בווקטור לנטי-ויראלי עם ביטוי מכונן של Cas9 ו-sgRNA, ניתן בקלות להחליף אותו בביטוי Cas9 הניתן להשראת תרופות עבור ביטוי Cas9 הניתן לשליטה.
פרוטוקול
פרטי רצפי הגנים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. תכנון RNA מדריך יחיד (sgRNA), שיבוט וייצור וקטורים לנטי-ויראליים
הערה: נעשה שימוש בשני רצפי sgRNA שונים המכוונים לאקסון 1 של הגן L2HGDH , שניהם מותאמים מ-Qiu et al.6עם אתרי PAM של AGG ו-TGG עבור רצפים 1 ו-2, בהתאמה. אורכם של שני ה-sgRNA היה 20 bp, והקצוות שונו כדי להוסיף רצפי קישור עבור אנזים הגבלה Bsmb1 שישוכפל בווקטור המטרה (LentiCRISPRv2) כפי שתואר בדו"ח הקודם6. רצפי לינקר נוספו במהלך תכנון sgRNA למטרות שיבוט.
- אנלי מסנתז כימית sgRNAs6 ומשובט לתוך Bsmb1 יחיד לחתוך וקטור lentiviral, LentiCRISPRv2 באמצעות פרוטוקול אופטימלי כפי שדווח בעבר7.
- המשך עם אריזה וריכוז לנטיויראלי באמצעות פרוטוקול סטנדרטי וממוטב7.
- לייצור לנטיוירוסים, זרעים HEK293T תאים (1 × 105 תאים לס"מ2) באמצעות DMEM, 10% FBS ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ודגרים לילה באינקובטור תרביות רקמה בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO2 בתנאי לחות.
- כאשר 90% מתמזגים, קו-טרנספקט HEK293T תאים עם וקטור כניסה (עמוד שדרה ריק או sgRNA המבטא פלסמידים) ואריזת פלסמידים באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה PEI כפי שתואר קודם לכן7.
- אסוף את המדיה המותנית המכילה חלקיקי סופרנאטנט לנטי-ויראלי (LVS) ב-48 שעות ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה והמשך עם אולטרה-צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז וסובב את הצינורות ב-1,25,000 x גרם במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
- המשך עם ריכוז חלקיקי LVS לפחות פי 200 מהנפח המקורי ב- PBS, aliquot, ואחסן ב -80 ° C עד לשימוש.
- קבע את הטיטר של חלקיקים לנטי-ויראליים באמצעות ערכת הטיטר qPCR Lentivirus בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. זיהומים לנטי-ויראליים והתפשטות חד-תאית
- עבור זיהומים עם חלקיקי LVS, תרחיף תאי hESC (H9) זרע בעל 1 × 105 תאים / 0.5 מ"ל של מדיה בתרבית hESC (מדיה בזאלית + P/S + 10 מיקרומטר של מעכב סלעים) על מטריגל שלם (1:50) מצופה P24 צלחות באר ב 500 μL של מדיה ולדגור במשך הלילה כדי לאפשר לתאים להיקשר. זרע בארות נוספות שלא יהיו נגועות ב- LVS אך יטופלו בפורומיצין כדי לשמש כבקרה לא נגועה.
הערה: ספירת תאים יכולה להתבצע באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי. - למחרת, להדביק את התאים ב ריבוי של זיהום (MOI) של 10 יחד עם 8 מיקרוגרם / מ"ל של פוליברן לדגור ב 37 ° C במשך 8 שעות ולאחר מכן החלפת מדיה עם מדיה hESC טרי + P / S ללא מעכב סלע ולהמשיך בתרבית עד שהתאים הם 90% נפגשים.
- התחל את בחירת הפורומיצין על ידי השלמת המדיה עם ריכוז של 0.8 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, שהוא בדרך כלל 48-72 שעות לאחר ההדבקה, והמשך את הבחירה עד שכל התאים ימותו בתאים שאינם נגועים (קבוצת הביקורת).
- לאחר השלמת הבחירה (בדרך כלל 4-6 ימים), לפצל תאים יציבים (1:4) ולהרחיב להקפאה וניתוח נוסף.
- בצע בחירה של תא בודד והרחבת שיבוט באמצעות תאים המבטאים L2HGDH-sgRNA-16.
- לשם כך, הכינו תרחיף תאים שווה ערך ל-500 תאים/10 מ"ל של מצע גדילה שלם וזרעים של 100 מיקרוליטר של תרחיף זה בכל באר של צלחת 96 בארות.
- השאירו את התאים ללא הפרעה במשך 3 ימים ולאחר מכן התבוננו.
- סמן את הבארות המניבות שיבוטים בודדים ושנה את המדיה כל יומיים עד שיושג גודל מספיק עבור המושבות (בדרך כלל שבועיים) להתרחב עוד, להקפיא ולנתח.
3. מיצוי gDNA, MS-BSP PCR וריצוף Sanger
- בודד gDNA מתאים באמצעות ערכת בידוד הדנ"א הגנומי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- המשך במיפוי אתרי מוטציות במעלה הזרם של רצפי זיהוי PAM באמצעות ניתוח פריימרים ספציפיים מבוססי אתרי מוטציות (MS-BSP)8.
- לשם כך, פריימר ימני בלתי משוחד L2H-UMSBSP-R1 נועד להגביר את האזור שמחוץ ל- Exon1 כדי להגביר את כל המטרות.
- תכנן פריימר שמאלי מוטה L2H-BMSBSP-F1 עם רצף זהה ל-sgRNA כדי להגביר את רצף המטרה קרוב לרצפי זיהוי PAM.
הערה: בתנאים מחמירים מאוד של PCR, המוצר ייצפה על הג'ל בשיבוטים ללא מוטציה. שום מוצר לא ייצפה בשיבוטים של CRISPR-knockout המציגים מוטציות קרובות לזרם מעלה של רצפי זיהוי PAM. - על מנת למפות מוטציות של זוג בסיסים יחידים, PCR מגביר רצף של 468 bp המשתרע על פני כל האקסון 1 של L2HGDH וכפוף לריצוף Sanger ואחריו ניתוח יישור רצפים מרובים באמצעות clustalw8.
4. בדיקת התמיינות תאי גזע עובריים והיווצרות גוף עוברי (EB)
- המשך עם התמיינות מכוונת של בקרה ושיבוטים שונים של CRISPR של תאי גזע עובריים (H9) לקראת גורל נוירו-אקטודרם בעקבות פרוטוקולים מבוססים כפי שתוארו קודם לכן באמצעות שיטת עיכוב smad כפולה 9,10,11.
- כאשר במפגש של 90%, טפל בתאים עם LDN193189 (200 ננומטר) ו- SB431542 (10 מיקרומטר) למשך 24 שעות ראשוניות במדיה של 100% KSR ולאחר מכן תוספת של XAV939 (2 מיקרומטר) למשך יומיים נוספים.
- לאחר 3 ימים, הפחיתו את אחוז מדיית KSR (Knockout DMEM בתוספת 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-גלוטמין, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM ו-0.1% (v/v) 2-מרקפטואתנול (75%, 50%, 25%) על ידי שילוב עם מדיה N2 (DMEM/F12 בתוספת תוספת N2 1x, מכפיל רווח 1x, ) ל-100% מדיה N2 במשך תקופה של 8 ימים.
- בתחילת היום ה-12, תקנו את התאים לצביעת מערכת החיסון באמצעות PAX6 כסמן נוירו-אקטודרם (neuro-ectoderm).
- עבור מחקרים על קביעת גורל מזודרם ואנדודרמלי, השתמש בגישה מבוססת CHIR99021 מולקולה קטנה שתוארה בפרסומים קודמים12,13.
- לשם כך, כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%, יש לטפל עם 3 מיקרומטר של CHIR99021 במדיה Definitive Endoderm (DE) במשך 24 שעות ולאחר מכן קיבוע עבור immunostaining באמצעות Brachuary כמו סמן ספציפי mesoderm.
- עבור השלב האנדודרמלי, תרבית את התאים במשך 24 שעות נוספות במדיה DE בלבד ללא תוספת של CHIR99021 לפני קיבוע עבור immunostaining באמצעות FOXA2.
- לבדיקת היווצרות EB, זרעו את התאים על משטחי תאים בעלי התקשרות נמוכה מבלי להשתמש במטריג'ל לתרבית תאים בתנאי השעיה במשך 24 שעות לפני לקיחת מיקרוגרפים.
5. ניתוח כתמים מערביים
- יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות PBS וליז באמצעות חיץ RIPA אחד המכיל 1% SDS וקוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז 1x.
- נקה את הליזטים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ואחריו איסוף של supernatants.
- כמת את חלבון התא הכולל באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. התאם את הדגימות ל- 2 מיקרוגרם/מיקרוליטר באמצעות מאגר דגימת צבע טעינה של 4×.
- נטרלו את דגימות החלבון בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות, טענו כמויות שוות של כל דגימה ופתרו באמצעות ג'ל SDS-PAGE 7 הדרגתישל 4%-12% ולאחר מכן העבירו אותן לממברנת PVDF במתח קבוע של 100 V למשך שעה אחת ב-4°C.
- לחסום את הממברנות באמצעות חלב 5% ללא שומן ולדגור בדילול נוגדנים ראשוני ב 4 ° C במשך הלילה עם סיבוב.
- לאחר מכן, יש לשטוף את הממברנות 5x באמצעות חיץ PBST ולדגור בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הממברנות שוב עם PBST 5x, לדגור עם מצע chemiluminescent, ולהתפתח באמצעות יריעות רנטגן.
6. Immunostaining
- זרעו את התאים על צלחות באר P4 ודגרו לפחות 24 שעות לפני הקיבוע כדי לאפשר חיבור תקין של תאים למשטחים.
- שטפו את התאים 3x עם PBS כדי להסיר תאים מתים כמו גם רכיבי מדיה, ולאחר מכן קיבוע באמצעות 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- חדרו את התאים באמצעות 0.3% טריטון X-100 ולאחר מכן חסמו עבור קשירה לא ספציפית על ידי שימוש ב-2% BSA ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- דגרו על הדגימות עם נוגדנים ראשוניים (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) מדוללים ב-1% BSA למשך הלילה ב-4°C.
- יש לשטוף את התאים 3x עם PBS ולדגור עם נוגדנים משניים מתאימים (עז נגד עכבר 488, עז נגד ארנב 488, עז נגד עכבר 546, עז נגד ארנב 546) מדולל ב 1% BSA במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- לבסוף, שטפו את הדגימות עם PBS 3x והכתימו אותן נגדית עם DAPI ותמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תוצאות
שיבוט של L2HGDH sgRNA ב-lentiCRISPRv2 puro
וקטור הפורו lentiCRISPRv2 הושג באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ועוכל עם BsmB1, מה שהביא לשחרור של קטע פוחלץ של 1.8 Kb. כפי שניתן לראות באיור 2A, נצפה עיכול מלא של הווקטור. עבור כל מבנה, שישה שיבוטים נבדקו לנוכחות או היעדר החדרה באמצעות רצף sgRNA הפוך כפריימר ופריימר קדמי (U6-459F) מתוך הרצף הווקטורי. באמצעות גישה זו, רק השיבוטים שקיבלו את האינסרט הניבו תוצר PCR של 288 bp, ושיבוטים שליליים שלא הכילו את הרצף ההפוך של sgRNA לא הניבו מוצר PCR, כפי שמוצג באיור 2B.
זיהומי H9, בחירות יציבות וכתם מערבי
תאי גזע עובריים (hESCs) היו נגועים בחלקיקים לנטי-ויראליים המבטאים שני sgRNA שונים המכוונים לאקסון 1 של הגן L2HGDH ונבחרו באמצעות פורומיצין. ניתוח כתמים מערביים בוצע מאוכלוסיות הטרוגניות של תאי sgRNA ו-Cas9 בעלי ביטוי משותף יציב כדי לקבוע איזה משני ה-sgRNA שנעשה בהם שימוש היה יעיל יותר בגרימת מחיקת גנים. כפי שניתן לראות באיור 3A, L2HGDH-sgRNA-1 היה יעיל יותר מהרצף האחר בהפחתת הביטוי של L2HGDH באוכלוסיות תאים הטרוגניות.
בחירת השבטים, הרחבתם וניתוחם של חלבונים
בחירה של תא בודד והרחבת שבטים נעשו עבור תאים המבטאים L2HGDH-sgRNA-1. הבארות שהניבו שיבוטים בודדים סומנו וגדלו עד שהושג גודל מספיק עבור המושבות (בדרך כלל שבועיים) כדי להתרחב עוד, לשמר בהקפאה ולנתח (איור 3B). בסך הכל נותחו 22 שיבוטים באמצעות ניתוח כתמים מערביים, שהניבו חמישה נוקאאוטים הומוזיגוטיים (23%) עבור L2HGDH. תוצאה זו מראה יעילות גבוהה של נוקאאוט גנים באמצעות העברת גנים בתיווך לנטיויראלי לביטוי משותף יציב של sgRNA ו- Cas9 מקלטת יחידה. איור 4 מראה ניתוח כתם מערבי של חמשת שיבוטי הנוקאאוט ההומוזיגוטיים יחד עם תאי ביקורת, ומראה ביטוי מופחת ב-100% בהשוואה לבקרה בשיבוטים שנבחרו.
ניתוח ברמת ה- DNA
על מנת למפות את אתר מוטציית הקריספר במעלה הזרם של רצף זיהוי PAM של Cas9, בוצעה תגובת שרשרת של פריימרים פולימראז ספציפיים (MS-BSP PCR) המבוססת על אתרי מוטציה באמצעות DNA גנומי מתאי ביקורת ומחמישה שיבוטים שונים. כפי שניתן לראות באיור 5, לשני שיבוטים (A5 ו-B4) יש מוטציות קרובות באופן מיידי לרצף זיהוי ה-PAM, בעוד ששלושת השיבוטים האחרים (A1, A9 ו-B12) הראו שהמוטציה עשויה שלא להיות קרובה מאוד לאתר PAM והיא נמצאת במעלה הזרם של רצף sgRNA של 20bp בתוך האקסון 1 של הגן L2HGDH .
על מנת למצוא את המוטציות המדויקות בדנ"א, תוצרי PCR מטוהרים מתאי ביקורת (וקטור נגוע רק H9) כמו גם שלושה שיבוטים שונים של קריספר, A5, A1 ו-B4, עברו ריצוף סנגר, ואתרי מוטציות מופו באמצעות כלי היישור המרובים clustalw במעלה הזרם של אתר PAM8. התוצאות חשפו מוטציית מחיקה בשיבוט A5 במעלה הזרם של אתר PAM. שני השיבוטים האחרים, A1 ו-B4, הראו מוטציה החדרתית במעלה הזרם של אתר PAM, כפי שמודגש באיור 6.
ניתוח פונקציונלי של שיבוטים
עם יצירת שורות תאי נוקאאוט של CRISPR בתאי גזע עובריים עובריים, השלב הבא הוא לאשר את פוטנציאל הריבוי וההתמיינות שלהם. לשם כך, בדקנו סמני פלוריפוטנציה שונים עבור שלושה שיבוטים שונים, A1, A5 ו-B4, והשווינו את התוצאות לתאי בקרה (H9 נגועים וקטוריים בלבד). התוצאות לא הראו שינוי בפוטנציאל הפלוריפוטנציה של קווי תאי נוקאאוט כפי שנקבע על ידי צביעה חיסונית עבור סמנים OCT4, NANOG ו-SOX2. לאחר מכן, קווי תאי הבקרה והנוקאאוט הוכתמו גם עבור סמן התפשטות התא, KI67, שגם הוא לא הראה שינוי בקווי תאי הנוקאאוט בהשוואה לביקורת. תוצאות אלה מראות כי נוקאאוט CRISPR לא השפיע על תכונות ההתחדשות העצמית של תאים אלה. נוסף על כך, EB והיווצרות מושבות לא הושפעו גם הם (איור 7). באמצעות שיטות במבחנה שהוקמו במעבדה שלנו, כל השיבוטים התמינו בהצלחה לשלושה תאי שכבת נבט כפי שאושר על ידי צביעה חיסונית עבור PAX6 (סמן נוירואקטודרם), Brachyury (סמן מזודרם) ו- FOXA2 (סמן אנדודרם). לא נצפה שינוי בפוטנציאל ההתמיינות של שורות תאי נוקאאוט בהשוואה לתאי ביקורת, מה שהראה שתאי נוקאאוט שמרו על פוטנציאל ההתמיינות שלהם (איור 8).
איור 1: תרשים סכמטי המציג את תכנון המחקר ב-5 שלבים. שלב 1: תכנון ושכפול של sgRNA לווקטור V2 CRISPR מעוכל Bsmb1. שלב 2: יצירת חלקיקים לנטי-ויראליים באמצעות וקטור כניסה הנושא sgRNA יחד עם פלסמידים אריזה על ידי העברה משותפת של תאי HEK293T באמצעות פוליפקציות וריכוז נגיפים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. שלב 3: זיהום של תאי גזע עובריים באמצעות חלקיקים לנטי-ויראליים ב-MOI של 10-20 ובחירת תאים יציבה באמצעות פורומיצין ואחריו ניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגניים כדי לראות את היעילות של sgRNAs. שלב 4: שיבוט תא בודד על ידי הגבלת שיטת דילול מהתאים שהראו הפלה מקסימלית באוכלוסיות הטרוגניות ובחירת שיבוטים בודדים. שלב 5: הרחבת שיבוטים בודדים וניתוח ברמת ה- DNA, חלבון וניתוח פונקציונלי של שיבוטים עבור פוטנציאל גזע והתמיינות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיבוט של sgRNA בווקטור lentiCRISPR V2.puro. (A) עיכול של וקטור lentiCRISPR V2.puro עם אנזים ההגבלה, BsmB1. החץ מציין קטע פוחלץ של 1.8 Kb המשתחרר עם עיכול הווקטור. (B) ניתוח PCR מושבה עבור שיבוטים שונים של L2HGDH sgRNA מבנים 1 ו -2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כתמים מערביים והתפשטות שבטים באמצעות ברירה של תא בודד. (A) ניתוח כתמים מערביים משני שכפולים ביולוגיים שונים (S1 ו-S2) של אוכלוסיות הטרוגניות של sgRNA בעל ביטוי משותף יציב (L2H-1 ו-L2H-2) ו-Cas9 יחד עם בקרה (C) H9 hESCs. (B) בחירה של תא בודד והתפשטות שבטית של תאי H9 המבטאים ביציבות L2HGDH-sgRNA-1. החיצים מצביעים על בארות של 96 לוחות בארות המציגים רק שיבוטים בודדים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח כתמים מערביים משיבוטים שונים של H9. (A-C) ניתוח כתמים מערביים מכלל ליזטים של תאים של 22 שיבוטים הניב חמישה נוקאאוטים הומוזיגוטיים (23%) עבור L2HGDH. (D) אישור נוקאאוטים L2HGDH מניסוי העתקה ביולוגי אחר באמצעות כתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח MSBSP PCR של שיבוטים שונים של H9. (A) ניתוח רצף של L2HGDH exon 1 המשמש לניתוח MSBSP PCR. (B) אופטימיזציה של טמפרטורת חישול עבור ניתוח MSBSP PCR באמצעות בקרה ו- H9 V2 L2HGDH KO Clone B4. ב- 96.8, הפקד מציג פס, אך B4 אינו מציג פס, כפי שמוצג על-ידי חצים. (C) ניתוח של כל שיבוטי KO הומוזיגוטיים הביא למיפוי להלן של אתר המוטציה בתוך אקסון 1. A1 = In/Del לא קרוב לאתר PAM; A5 = In/Del קרוב לאתר PAM; A9 = in/del קרוב למדי לאתר PAM; B4 = In/Del קרוב מאוד לאתר PAM B12 = In/Del לא קרוב לאתר PAM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: יישור מוצרי PCR ברצף Sanger עם ייחוס לרצף L2HGDH exon 1. יישור מרובה של מוצרי PCR ברצף Sanger מ-A1, A5 ו-B4, ותאי בקרה נעשו יחד עם רצף ייחוס בתוך האקסון הראשון של L2HGDH ממסד הנתונים של NCBI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אפיון פונקציונלי של קווי תאי נוקאאוט מסוג CRISPR. (A) התאים עברו חיסון עבור סמני פלוריפוטנציה (OCT4, NANOG, SOX2), התחדשות עצמית (KI67), EBs והיווצרות מושבה ביחס לתאי H9 hESC הנגועים בביקורת. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) אחוז התאים המבטאים באופן חיובי (+ve) חושב ביחס לצביעת DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: פוטנציאל התמיינות של קווי תאי נוקאאוט של CRISPR. אפיון פונקציונלי של קווי תאי נוקאאוט CRISPR מבחינת פוטנציאל ההתמיינות שלהם באמצעות סמנים עבור PAX6 (neuroectoderm), Brachyury (mesoderm) ו-FOXA2 (Endoderm) ביחס לתאי H9 הנגועים בביקורת. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שלב הפרוטוקול | הזמן הדרוש |
| שיבוט sgRNA ב-LentiCRISPRv2 | 4 ימים |
| ייצור Lentivirus וקביעת טיטר | 5 ימים |
| זיהומי תאי גזע עובריים עובריים, בחירת תאים יציבים והתרחבות | שבועיים |
| בחירה והרחבה של תא בודד | שבועיים |
| ניתוח פונקציונלי של שיבוטים | שבועיים |
טבלה 1: ציר הזמן עבור שלבי הפרוטוקול והזמן המשוער הנדרש.
דיון
מחקר זה תיקן שיטה המאפשרת מחיקות גנים יעילות וחסכוניות ביותר בתאי גזע עובריים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. שיטה זו השיגה בהצלחה מחיקה הומוזיגוטית של הגן L2HGDH בתאי גזע עובריים עובריים תוך 3-4 שבועות, החל מזיהום בתאי גזע עובריים עובריים ועד לבחירה והתפשטות של תא בודד (טבלה 1). למרות שמניפולציות גנטיות בתיווך CRISPR-Cas9 יכולות להיות מושגות על ידי טרנספקציות חולפות ברוב התאים, זה הופך למאתגר בתאי גזע עקב יעילות טרנספקציה ירודה ורעילות תאים גבוהה. מחקרים שונים דיווחו על עד 10% מהשיבוטים שנמצאו והראו מחיקות. לדוגמה, Mali et al. דיווחו על יעילות עריכת גנום של 2% עד 4% בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאחר שהתמקדו במוקד AAVS13. מחקר אחר דיווח על יעילות עריכה של 1.3%-8.4% בתאי גזע עובריים נאיביים כדי להתמקד ב-TUNA, RNA ארוך שאינו מקודד ומעורב בפלוריפוטנציה ובהתמיינות עצבית14. יעילות של עד 10% דווחה לאחר מיקוד הגן CFTR בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי Ocana et al.15לפיכך, נדרשת שיטת העברה יעילה של Cas9-gRNA כדי להשיג עריכת גנים יעילה, וזה נכון במיוחד עבור תאי גזע מכיוון שתאים אלה מפגינים רמה מוגברת של רגישות ועמידות לשיטות העברה חולפות בהשוואה לתאים סומטיים טיפוסיים וקווי תאים אימורטליים5.
במחקר הנוכחי, דווח על דרך יעילה ביותר להשיג קווי תאי נוקאאוט הומוזיגוטיים מסוג CRISPR באמצעות שימוש בהעברה בתיווך לנטי-ויראלי של sgRNA לתוך תאי גזע עובריים עובריים. שימוש בווקטורים לנטי-ויראליים כדי להעביר CRISPR-Cas9 לתוך תאי גזע עובריים הוכיח את עצמו כיעיל הרבה יותר וגוזל פחות זמן בהשגת מחיקת גנים מאשר שימוש בטרנספקציות וקטוריות שאינן נגיפיות באמצעים כימיים או מכניים (הנתונים לא מוצגים). התוצאה הייתה יעילות גבוהה משמעותית של עריכת גנום (~23%) לאחר בחירת השבטים והתפשטותם של שיבוטים בודדים. לכן, על ידי שילוב של אספקה מתווכת לנטי-ויראלית של sgRNA ו-Cas9 לתוך תאי גזע עובריים, כמו גם גישה חסכונית לייצור לנטיוירוס, השיטה הנוכחית היא לא רק יעילה מאוד וגוזלת פחות זמן, אלא גם חסכונית.
להלן כמה מההמלצות לגישה מוצלחת: (1) שימוש במערכת וקטורית לנטיויראלית יחידה המבטאת הן Cas9 והן sgRNA. (2) נוכחותו של סמן ברירה אנטיביוטי, כגון פורומיצין, על אותו פלסמיד המבטא Cas9 ו-sgRNA מבטיחה שכמעט 100% מהתאים חיוביים לביטוי Cas9-sgRNA. זה מגדיל באופן משמעותי את הסיכוי לאירועים מוצלחים של עריכת גנים. (3) על מנת להיות שימושיים עבור זיהומים בתאי גזע עובריים, הכרחי לרכז את הווקטורים הלנטי-ויראליים כדי להניב טיטרים גבוהים של וירוסים. בין הטכניקות השונות המשמשות, הגישה החסכונית ביותר היא להשתמש בכמויות גדולות של LVS ולרכז אותם פי 100-500 מהנפח המקורי כדי להשיג טיטרים בטווח של 107 עד 108 IU / mL. (4) עבור השיטה החסכונית והיעילה של HEK293T טרנספקציות תאים עם פלסמידים, שימוש PEI (polyethyleneimine) עבור transfection וקטור lentiviral עבור אריזת וירוס הוא יעיל באותה מידה, ולכן, חסכוני בהשוואה למגיב transfection נפוץ lipofectamine7. (5) טיטרים לנטי-ויראליים ממוצעים חייבים להיות בטווח של 5 × 107 IU/mL. (6) התפשטות השבט על ידי ברירה של תא בודד נדרשת כדי להשיג מחיקות הומוזיגוטיות של הגן המעניין בתאים אלה. (7) למרות שמחקרים קודמים הצביעו על כך שעריכת גנים בתיווך CRISPR-Cas9 בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים גורמת למעט מאוד מוטציות מחוץ למטרה16,17, עדיין נבון לבדוק אם יש אתרים מחוץ למטרה. ניתן להשיג זאת באמצעות כלים יעילים לתכנון gRNA כדי למזער השפעות מחוץ למטרה וריצוף גנומי רחב של שורות תאים ערוכות18, במיוחד עבור ניסויים בעלי חשיבות קלינית. (8) לבסוף, יש לאמת את הקריוטיפ הרגיל של שיבוטים נבחרים באמצעות שיטות כגון G-banding וניתוח ברזולוציה גבוהה כדי להבטיח שאין שינויים גנומיים בקנה מידה גדול. ניתן לבצע בדיקת מיקרו-גרעינים גם כדי להעריך את תדירות היווצרות המיקרו-גרעינים, מה שעשוי להצביע על חוסר יציבות גנומית.
אחת המגבלות העיקריות של שיטה זו היא השימוש במערכת וקטורית לנטיוויראלית, שהובילה לאינטגרציה גנומית יציבה של Cas9 ו-sgRNAs, מה שהוביל לביטוי המכונן שלהם לאחר העריכה, דבר שאינו רצוי. בעתיד, ניתן יהיה לשפר שיטה זו על ידי החלפת מקדמים מכוננים במקדם תרופתי המניע את ביטוי הגן Cas9, כגון מערכת Tet-on בטיפול דוקסיציקלין לביטוי מבוקר של Cas9.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מאוניברסיטת איחוד האמירויות הערביות (UAEU) - #12M105 מענקים, #12R167 מענקים (מרכז זאיד למדעי הבריאות), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)), ו- ASPIRE, עמוד התווך לניהול תוכניות הטכנולוגיה של מועצת המחקר לטכנולוגיה מתקדמת של אבו דאבי (ATRC), באמצעות מכון המחקר לרפואה מדויקת ASPIRE אבו דאבי (ASPIREPMRIAD) מספר מענק VRI-20-10.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-מרקפטואתנול | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 מ"ל, סטרילי + מאושר בחינם פתוח צינורות דקים Ultra-Clear | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF רקומביננטי אנושי | Invitrogen | PHG0261 | |
| Brachyury Rabbit mAb | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| קורנינג מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף, | קורנינג | ללא | |
| טכנולוגיות תאי גזע | ציקלופמין | 72074 | |
| DMEM מדיה | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM NUTRIENT MIX F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS עם: Ca ו-Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| סרום בובי עוברי | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) נוגדן mAb ארנב | CST | 2118S | |
| טכנולוגיות תאי גזע | מגיב דיסוציאציה עדינה של תאים | 7174 | |
| HyClone חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) 100x Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) Rabbit mAb | CST | 9129 | |
| החלפת | סרום נוקאאוטInvitrogen | 10828028 | |
| L GLUTAMINE, 100x | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGTCGCTGGG | |
| L2HGDH נוגדן פוליקלונלי | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Macrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Macrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC | |
| L2H-seqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | מקרוגן | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 מדיה מלאה | טכנולוגיות תאי גזע | 85850 | |
| נוגדן ננוג | CST | 3580 | |
| מדיום נוירובזאלי 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 תוסף 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 תוסף 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 נוגדן | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb | CST | 60433 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| מגיב זיהום פוליברן | סיגמא | TR1003- G | |
| פוליאתילנימין, סיגמא מסועף | 408727 | ||
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR ערכת טיטר לנטיווירוס | ABM | LV900 | |
| מעכב סלע Y-27632 דיהידרוכלוריד | טוקריס | 1254 | |
| SB 431542 | טוקריס | 1614/10 | |
| נוגדן Sox2 CST | 2748 | ||
| סוכרוז | סיגמא | 57-50-1 | |
| טריפסין .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | מקרוגן | GAGGGCCTATT אשף TCCCATGATTC | |
| ערכת טיהור DNA גנומי | פרומגה | A1120 | |
| XAV 939 | טוקריס | 3748/10 |
מקורות
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
- Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
- Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
- Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
- Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
- Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
- Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
- Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
- Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
- Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
- Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
- Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
- Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).
הדפסות חוזרות והרשאות
