מאמר שיטה

תכני מיקרופלואידיקה למינציה פוליאתילן טרפתלט בעלות נמוכה עבור הדמיית דג זברה מרובה

DOI:

10.3791/67313

⸱

27 בספטמבר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Bindley Bioscience Center, Purdue University, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה חדשנית לייצור מכשירים מיקרופלואידיים באמצעות למינציה של פוליאתילן טרפתלט (PET) מפחיתה משמעותית את העלות והמורכבות של לכידה והדמיה של עוברי דג זברה חיים מרובים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עוברי דג הזברה שקופים ולכן מתאימים באופן ייחודי להדמיה תוך-חיונית לא פולשנית של תהליכים בסיסיים, כגון ריפוי פצעים ונדידת תאי חיסון. מכשירים מיקרופלואידיים משמשים ללכידה כדי לתמוך בהדמיה ארוכת טווח של אורגניזמים רב-תאיים, כולל דג זברה. עם זאת, ייצור מכשירים אלה באמצעות ליתוגרפיה רכה דורש מתקנים מיוחדים ומיומנות בהדפסת תלת מימד, שאולי לא תהיה נגישה לכל מעבדה. ההתאמה שלנו לשיטת למינציה פוליאתילן טרפתלט בעלות נמוכה שפותחה בעבר לבניית התקנים מיקרופלואידיים מגדילה את הנגישות על ידי מתן אפשרות לייצור ואיטרציה של עיצוב עבור חלק מההשקעה הטכנית של טכניקות קונבנציונליות. אנו משתמשים במכשיר המיוצר בשיטה זו, העוזר הסיבובי להדמיית דניו של ריפוי עוקב (RADISH), כדי להתאים לטיפול תרופתי, פציעה ידנית והדמיה ארוכת טווח של עד ארבעה עוברים באותו שדה ראייה. עם עיצוב חדש זה, אנו לוכדים בהצלחה מאפיינים מורפולוגיים גסים של אות הסידן סביב אבלציה בלייזר ופצעי חתך ידני עבור עוברים מרובים בשעתיים מיד לאחר הפציעה, כמו גם גיוס נויטרופילים לקצה הפצע למשך 24 שעות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת להגיב כראוי לפציעה היא קריטית להישרדותו של כל אורגניזם בכל קנה מידה, מתא בודד ועד לרקמות מרובות. פציעה והתגובות הנלוות אליה, כגון גיוס פגוציטים לאזורים פגועים1 הם, אם כן, נושאים משמעותיים בביולוגיה של התא והרקמות. פצעים מורגשים מיד לאחר פריצת מחסום הרקמה, וגורמים לתגובת שיפוע רקמה הכוללת התכווצות פצע 2,3 המתאמת את ריפוי הפצע וצמיחה מחדש לאחר מכן4. בשל האופי המכני של התכווצות זו, אסור לכלים המשמשים במהלך ניסויים לעכב פיזית את תנועת התאים ליד אתר הפגיעה.

עוברי דג הזברה הם מודל מצוין לחקר התפתחות ומחלות, כולל תגובת פצעי החולייתנים, בשל קלות הטיפול שלהם, יכולת המעקב הגנטית והשקיפות האופטיתשלהם 5,6. עם זאת, יש צורך בשיתוק האורגניזם כולו לתקופה ממושכת כדי לחקור את ההתנהגות ארוכת הטווח של תאים ליד אתר פציעה. הטמעת עוברים באגרוז נמס נמוך מספיקה להדמיה לטווח קצר של רקמה לא פצועה. עם זאת, מטריצת הג'ל שמסביב מגבילה את ההתכווצות וההרפיה של הפצעים ומעכבת את צמיחת העוברים המתפתחים לאורך זמן 7,8,9.

מכשירי מיקרופלואידיקה יכולים לשתק עוברי דג זברה בשלבי התפתחות שונים 10,11,12,13,14,15,16, וחלקם, כגון zWEDGI 7, מתאימים לפציעה ידנית. עם זאת, ישנם מספר חסרונות לתכני התקנים זמינים. לדוגמה, מכשירים רבים המודפסים ישירות על פלסטיק אינם תואמים להדמיה במערכות מיקרוסקופ הפוך בגלל שקיפות אופטית ירודה. יתר על כן, ערוצים מקבילים מאפשרים הדמיה רב-מיקומית10,11, אך התנועה הפיזית של שלב המיקרוסקופ מציגה פיגור ברכישת התמונה. איטרציה ואופטימיזציה חוזרות ונשנות כדי לפתור בעיות אלה קשות כאשר בוחנים את ההשקעה הכספית והטכנית הנדרשת עבור כל עיצוב חדש, במיוחד עבור השיטות הנוכחיות בתקן הזהב לייצור מכשירים באמצעות ליתוגרפיה רכה של פולידימתילסילוקסן (PDMS). השלב הראשון, יצירת תבנית מאסטר, דורש לרוב ידע בתוכנת מידול תלת מימד, גישה לציוד ייצור מיוחד, ו(בהתאם לחומר המשמש) טיפול נוסף נגד הידבקות כגון סילאניזציה לפני השימוש בתבנית. ריפוי ה-PDMS לאחר שנשפך לוקח לפחות שעה בטמפרטורות גבוהות, ובדרך כלל, חייב להיעשות תחת ואקום או עם מהדק לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לרוב בחדר נקי 7,17,18. כמו בביולוגיה התפתחותית, עלויות אלה יכולות להתגלות במהירות כאוסרות עבור ניסויים הדורשים סביבות מיקרופלואידיות ייחודיות רבות על פני מספר מודלים.

מבין חומרי הבנייה החלופיים הזמינים, פוליאתילן טרפתלט (PET) הוא עמיד, לא רעיל וקל למניפולציה. יריעות PET הן שקיות למינציה מפלסטיק הזמינות באופן נרחב הנישאות ברוב חנויות הציוד המשרדי, עם דבק מופעל תרמית (בדרך כלל אתילן ויניל אצטט). על ידי עיצוב יריעות PET אלה באמצעות חותכי מלאכה זמינים מסחרית (כלומר, פלוטרים לחיתוך מבוקרים על ידי מחשב המיועדים לבעלי מלאכה ביתית) והדבקת השכבות זו לזו באמצעות ציוד למינציה תרמית סטנדרטי, ניתן ליצור ולחזור במהירות על מגוון רחב של עיצובים פוטנציאליים. לכן אימצנו שיטת תכנון ובנייה שתוארה קודם לכן הכוללת PET18 מוערם כדי ליצור את ה-Rotational Assistant עבור Danio Imaging של Subsequent Healing (RADISH) (איור 1A,B). סידור סיבובי של מספר תעלות ריסון בצורת טריז מייעל את הקרבה תוך מתן מקום לחתך ידני של סנפיר הזנב, מאפשר הדמיה מיד לאחר הפציעה והדמיה סימולטנית לטווח ארוך של עוברי דג זברה פצועים מרובים באותו שדה ראייה. בנוסף, שיטת בנייה זו מפחיתה באופן דרסטי את עלויות ההון מראש ואת הזמן הנדרש לבניית מכשירים תוך שמירה על שימוש חוזר.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה השתמש בעוברים 3 ימים לאחר ההפריה (dpf) אך ניתן לתכנן אותו לשימוש בעוברים של 2-14 dpf. ניסוי דג הזברה נערך בסטנדרטים בינלאומיים מקובלים. פרוטוקול הטיפול והשימוש בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של פרדו (PACUC), תוך הקפדה על ההנחיות לשימוש בדגי הזברה בתוכנית המחקר הפנימי של ה-NIH (מספר פרוטוקול: 1401001018).

1. הרכבת מכשיר המיקרופלואידיקה PET

הערה: ניתן להשהות כל חלק בפרוטוקול זה בכל עת למעט שלבים 1.8 ו-1.9, הרגישים לזמן הייבוש של ציאנואקרילט.

  1. עצב את התבנית עבור ההתקן בתוכנה לבחירתך (לדוגמה, Adobe Illustrator, איור 1A). בהתאם לגיל וגודל העובר, התאם את רוחב התעלה ואת גודל תא ההדמיה המרכזי להתאמה הטובה ביותר.
    1. שמרו כל שכבה כקובץ תמונה נפרד עם מידות זהות. תן שם לכל קובץ כך שעובי הגיליון שישמש וסדר ההרכבה יהיו ברורים.
  2. אתחל את מכונת החיתוך על פי הוראות היצרן.
  3. העלה כל דפוס מעוצב לתוכנת העיצוב לחיתוך.
    1. בסביבת העבודה של העיצוב, בחר את העיצובים החדשים שהועלו. קבצו תבניות המיועדות לאותו עובי של יריעת PET יחד באותו חיתוך (איור 2A). במידת הצורך, התאם מחדש את גודל התבניות בתוכנת העיצוב למידות הנכונות.
    2. אשר את מספר וסוג הדפוסים בחיתוך, ולאחר מכן בחר את החומר החתוך.
      הערה: יריעות PET עשויות שלא להיות בחירה מהותית בתוכנת העיצוב, כולל תחת שמות כגון "נרתיק למינציה מפלסטיק". ניתן לבחור במקום זאת כל חומר בעובי ומרקם דומים (למשל, יריעות שקיפות או ויניל לא דביק).
    3. חבר את יריעות ה-PET למחצלת החיתוך, לחץ בחוזקה כדי להסיר בועות אוויר, וטען את המחצלת למכונת החיתוך. עקוב אחר ההוראות שעל המסך כדי להנחות את מכונת החיתוך להתחיל בחיתוך.
    4. הסר חתכים מוגמרים ממחצלת החיתוך. במידת הצורך, התאם את דפוסי החיתוך באמצעות סכין מלאכה או להב אזמל.
      הערה: קבצי התמונה המשמשים ליצירת עיצוב RADISH (איור 1A) זמינים להורדה כפורמטים וקטוריים ו-PNG file (קובץ משלים 1). אם מכונת החיתוך מרימה, קורעת או לא מצליחה לחתוך בצורה נקייה את יריעת ה-PET, שקול להחליף את שטיח החיתוך.
  4. יישר את השכבות על זכוכית כיסוי, ללא סיוע או עם סימני רישום חתוכים מראש. אם ניתן להדק מספר שכבות יחד לפני הלמינציה, יישר אותן בו זמנית.
  5. אבטח את השכבות עם סרט משרדי כדי למנוע תזוזה במהלך הלמינציה (איור 2B). בהתאם לגודל ההתקן ולקיבולת הלמינציה, הרכיבו תכנים קטנים על גב גדול יותר עם יותר סרט כדי למנוע חסימה או סתימה של הזנת הלמינציה (איור 2C).
    הערה: הגיבוי המשמש בלמינציה אינו זהה למחצלת החיתוך, ומשמש בעיקר לספק מתיחה ללמינציה. כל חומר עמיד בחום בעובי זניח יעבוד כגיבוי (כולל, אך לא רק, קרטון, נייר משרדי מקופל או גיליון PET גדול יותר).
  6. הפעל את הלמינציה והלמינציה בהתאם להוראות היצרן. הסר סרט משרדי לפני יישור השכבה הבאה (איור 2D).
  7. חזור על שלבים 1.4 עד 1.6 עד להדבקה בכל השכבות.
  8. אבטח את המכשיר לצלחת 35 מ"מ שנקדחה עם חור בגודל 3/4 אינץ' באמצעות דבק ציאנואקרילט (איור 2E,F). התאם את צורת וסוג המנה בהתאם לצרכי הניסוי (למשל, כל מיכל גדול מספיק כדי להכיל את המכשיר - באר אחת בצלחת של 24 בארות או צלחת פטרי גדולה יותר). השתמש במספיק דבק כדי לאטום את המכשיר במלואו לכלי מבלי להציף אותו.
    הערה: אבטחת המכשיר לכלי אחיזה אינה נדרשת לתפקוד המכשיר. זהירות: ציאנואקרילט קושר את העור והעיניים תוך שניות ומגרה את מערכת הנשימה, העיניים והעור. יש ללבוש מגן ידיים ועיניים ולעבוד באזור מאוורר היטב.
  9. אטום למים את לרבד ה-PET על ידי ציפוי יסודי של קצוות המכשיר החיצוניים בדבק ציאנואקרילט (איור 2F). השתמש במספיק דבק כדי לכסות את הקצוות החיצוניים במלואם. הניחו לדבק להתרפא לפחות שעתיים לפני השימוש.
    הערה: הקפידו על מקום מספיק לאדי ציאנואקרילט לאוורור. הצטברות אדים עלולה לגרום לציאנואקרילט להצטבר על המכשיר, ולטשטש חומר שקוף אופטית.

2. מיקום העוברים בתוך הצנון והכנה להדמיה

  1. לגדל עוברי דג זברה במדיום גידול העוברים הסטנדרטי E319. במידת הצורך, יש לבצע דה-כוריונטציה של העוברים לפחות שעה אחת לפני ההדמיה כדי לאפשר להם להשתטח. הניסוי הזה השתמש בעוברים בריזולוציה של 3 dpf, אולם עוברים יכולים להיות עד 14 dpf (איור 1E).
  2. לצבוע או לטפל בעוברים בהתאם לצרכי הניסוי.
    הערה: בניסויים אלה, קרומי התאים של שכבת האפיתל החיצונית נצבעו במידת הצורך על ידי דגירה עם 100 ננומטר MemGlow 560.
  3. להרדים עוברים באמצעות 164 מ"ג/ליטר MS-22220.
    הערה: ניתן להתאים את הריכוז וההרדמה המדויקים בהם נעשה שימוש בהתאם להעדפת הנסיין. ניתן להפחית את ריכוז ההרדמה כדי לאפשר התפתחות מוצלחת במהלך תמונות ארוכות טווח (ראה שלב 4.1).
  4. מלאו את צלחת האחיזה המכילה את המכשיר המותקן ב-5 מ"ל של E3 המכיל 164 מ"ג/ליטר MS-222.
  5. בעזרת פיפטת העברה, הפקידו עובר מורדם אחד בכל תא החזקה של המכשיר. ודא שהעוברים יישארו שקועים בנוזל למשך ההדמיה.
    הערה: עיצוב הצנון יכול לשתק 1-4 עוברים.
  6. באמצעות לולאת שיער, כוונו את העוברים כך שזנב העובר יבלוט לתוך תא ההדמיה המרכזי והחלמון ישותק היטב בתעלה בצורת טריז (איור 1C).
    הערה: ניתן לבצע הכוונת עוברים תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להקל על המניפולציה.
  7. אם תרצה, אבטח את ראש העובר על ידי הוספת 1.5% אגרוז נמס נמוך לתא ההחזקה באמצעות מיקרופיפטה.
  8. העבר את המכשיר עם העוברים למערכת ההדמיה לבחירתך כדי להתחיל בהדמיה.

3. הדמיה של מעברי סידן לאחר פציעה

הערה: סעיף זה וסעיף 4 הם אופציונליים ומסופקים כניסויים מדגמיים פוטנציאליים.

  1. בחר את המערכת והמטרה המתאימה להדמיה.
    הערה: כאן, קונפוקלי סריקת לייזר הפוך היה מצויד במטרה פי 20.
  2. התאם את מיקוד הדגימה ופרמטרי ההדמיה (למשל, עוצמת לייזר: 5, הגבר: 90, גודל חור סיכה: 2 AU, זמן חשיפה [מהירות סריקה: 1 פריים/שניות]) ליחס אות לרעש אופטימלי ומהירות רכישה.
    הערה: מומלץ למקד מראש את הדגימות ולהתאים את הפרמטרים עבור כל ערוץ במערכת ההדמיה לבחירתכם לפני הפציעה כדי להפחית את הפיגור בין היווצרות הפצע לרכישת התמונה.
  3. פצע עובר Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821,22.
    1. כדי לפצוע את העובר באמצעות חתך ידני, הפעל לחץ עם להב אזמל על רקמת סנפיר הזנב בקצה הנוטוכורד תחת סטריאומיקרוסקופ (וידאו 1), ולאחר מכן החזר את המכשיר לבמה.
      זהירות: הפעלת לחץ מוגזם עם להב האזמל עלולה לסדוק את הזכוכית שמתחתיה. אם הזכוכית נסדקת, השלך את המכשיר והפעל מחדש משלב 1.2.
    2. כדי לפצוע את העובר באמצעות גירוי לייזר, הגדר אזור עניין (ROI) ליד קצה קפל סנפיר הזנב ועורר בהתאם לעוצמת הלייזר הזמינה.
      הערה: כאן, הספק לייזר של 2.4 וואט למשך 30 שניות ב-800 ננומטר הספיק כדי לגרום לפצע בעובי מלא.
  4. תמונה בטמפרטורת החדר באמצעות ערוצי GFP (עירור 488 ננומטר, פליטה 510 ננומטר) ו-RFP (עירור 561 ננומטר, פליטה 610 ננומטר) באמצעות מרווח פריימים של דקה אחת למשך שעה בסך הכל.
  5. (אופציונלי): במידת הצורך, שחרר את העוברים לשליפה לאחר הדמיה באמצעות יניקה עדינה ליד הראש באמצעות פיפטת העברה או סיבוב הצלחת.

4. הדמיה של גיוס נויטרופילים לאחר פציעה

  1. לפחות שעה אחת לפני ההדמיה, העבירו את העוברים ל-E3 המכיל מחצית מהריכוז הסטנדרטי של חומר הרדמה, במקרה זה, 82 מ"ג/ליטר MS-222.
  2. בחר את המטרה המתאימה להדמיה (כאן, קונפוקלי סריקת לייזר הפוך המצויד במטרה פי 10).
  3. התאם את מיקוד הדגימה ופרמטרי ההדמיה (למשל, עוצמת לייזר: 5, הגבר: 90, גודל חור סיכה: 2 AU, זמן חשיפה [מהירות סריקה: 0.5 פריימים/שנייה])) ליחס אות לרעש אופטימלי ומהירות רכישה.
    הערה: מומלץ למקד מראש את הדגימות ולהתאים את הפרמטרים עבור כל ערוץ במערכת ההדמיה לבחירתכם לפני הפציעה כדי להפחית את הפיגור בין היווצרות הפצע לרכישת התמונה.
  4. פצע ארבעה עוברים Tol2(mpx:Dendra2)23 באמצעות חתך ידני על ידי הפעלת לחץ עם להב אזמל על רקמת סנפיר הזנב תחת סטריאומיקרוסקופ, ולאחר מכן החזר את המכשיר לבמה.
  5. צלם את התמונה בערוץ GFP (עירור 488 ננומטר, פליטה 510 ננומטר) בטמפרטורת החדר באמצעות מרווח מסגרת של 5 דקות למשך 24 שעות.
  6. במידת הצורך, שחררו את העוברים לשליפה לאחר הדמיה באמצעות יניקה עדינה ליד הראש באמצעות פיפטת העברה או סיבוב הצלחת.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להשוואה של איכות התמונה המופקת על ידי סריקת לייזר קונפוקלית עם ובלי סיוע של ה-RADISH, עוברים המבטאים את חיישן הסידן הביולוגי האינטנסיומטרי GCaMP6f22,24 בשכבת האפיתל החיצונית נצבעו באמצעות MemGlow 560 וצולמו עם סריקת לייזר קונפוקלית הפוכה המכסה את כל עובי קפל סנפיר הזנב במרווח זמן של דקה אחת למסגרת (וידאו 2). ללא ההתקן (איור 3A), הדגימות נסחפו באופן משמעותי והציגו חפצי פסים, כתוצאה מהגבלת מחסנית ה-Z ל-25 פרוסות כדי להתאים לרזולוציה הזמנית שצוינה בהשוואה להדמיה עם ההתקן (איור 3B). הצנון שימש גם לבדיקת מעברי סידן מיד לאחר הפציעה בעוברים המבטאים Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821, תוך הדגשת E-cadherin אנדוגני באדום וסידן ציטופלזמי באפיתל האפיקלי בירוק. העוברים נפצעו במקביל לצידי החדר המרכזי באמצעות להב אזמל (איור 4A ווידאו 3) או באמצעות אבלציה ישירה בלייזר אינפרא-אדום (איור 4B), ואז צולמו דרך העובי המלא של קפל סנפיר הזנב.

כדי להדגים את יעילות ה-RADISH להדמיה ארוכת טווח, חקרנו גיוס תאי חיסון לקצה הפצע במשך 24 שעות לאחר הפציעה. ארבעה עוברי דג זברה ב-3 dpf המבטאים Tol2 (mpx:Dendra2) לסימון נויטרופילים בירוק23 נפצעו על ידי חתך זנב וצולמו במשך 24 שעות רצופות (איור 5). חפצי הדמיה הקשורים בדרך כלל לעוברים מאוחרים של 3 dpf עד 4 dpf, כגון הטיה וציפה, נעדרו באופן בולט (וידאו 4), וצמיחת הרקמות נמשכה ללא הפרעה לניסוי. גיוס נויטרופילים לקצה הפצע ממשיך לאורך כל התמונה (איור 5B), כאשר רוב התאים הנודדים עוזבים 24 שעות לאחר הפציעה (איור 5C), בהתאם לרזולוציית הדלקת הצפויה25,26.

figure-results-1
איור 1: תכנון ושימוש בהתקן מיקרופלואידיקה למינציה PET (RADISH). (A) סכמטי הממחיש את הסידור והעובי של שכבות PET בודדות, ההרכבה וההרכבה והשימוש בהתקן. (ב) מוצר סופי, מותקן בגזרה בגודל 3/4 אינץ' בצלחת 35 מ"מ. (C) 3 עוברי dpf, (D) 5 עוברי dpf, (E) 14 עוברי dpf השוכנים בתוך המכשיר. פסי קנה מידה = 1,000 מיקרומטר (C,D,E). קיצורים: PET = פוליאתילן טרפתלט; צנון = עוזר סיבובי להדמיית דניו של ריפוי לאחר מכן; dpf = ימים לאחר ההפריה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: איור צילומי צעד-אחר-צעד של מכלול התקן PET. (A) שכבות PET בודדות לפני למינציה. (B) שכבת PET מאובטחת לכיסוי של 25 מ"מ באמצעות סרט משרדי. (ג) מכשיר בביצוע מאובטח לגב פלסטיק למינציה. (ד) מכשיר למינציה PET שהושלם. (E) צלחת 35 מ"מ שונה לפני הרכבת המכשיר. (ו) מכשיר שהושלם. קיצור: PET = פוליאתילן טרפתלט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: איכות משופרת של סריקת לייזר תמונות קונפוקליות של 3 עוברי dpf בעיצוב RADISH. (A) תמונה מייצגת של עובר 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) צבוע ב-MemGlow 560 ללא שימוש ב-RADISH. (B) תמונה מייצגת של עובר Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) מוכתם ב-MemGlow 560 המותקן ב-RADISH. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: RADISH = עוזר סיבובי להדמיית Danio של ריפוי לאחר מכן; dpf = ימים לאחר ההפריה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תאימות של עיצוב RADISH עם טכניקות פציעה מרובות. (A) 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 עובר שנפצע באמצעות חתך ידני של סנפיר הזנב. (B) עובר שנפצע באמצעות אבלציה בלייזר. (ג,ד) אותם עוברים 4 דקות לאחר מכן, המראים את התקדמות מעברי הסידן לאחר הפציעה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: RADISH = עוזר סיבובי להדמיית Danio של ריפוי לאחר מכן; dpf = ימים לאחר ההפריה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: לכידה ארוכת טווח של עוברים לצורך הדמיה של נדידת פגוציטים. (A) עוברי Tol2(mpx:Dendra2) מיד לאחר הפציעה, ואותם עוברים (B) 25 דקות, (C) 12 שעות ו-(D) 24 שעות לאחר מכן. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

משלים file 1: וקטור ו-PNG files עבור עיצוב התקני RADISH כפי שמוצג באיור 1A. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון 1: סרטון Brightfield של חתך ידני של סנפיר זנב באמצעות עיצוב מכשיר RADISH. קיצור: RADISH = עוזר סיבובי להדמיית Danio של הריפוי שלאחר מכן. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 2: השוואה בין עוברים לא רכובים לעומת 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) מאיור 3, שנרכשו ב-1 פריים/דקה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 3: ארעי סידן בעוברים Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 שנפצעו באמצעות חתך אזמל או אבלציה בלייזר מאיור 4, שנרכשו בפריים אחד לדקה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 4: הדמיה ארוכת טווח של גיוס לויקוציטים והתחדשות סנפיר הזנב בעוברי Tol2 (mpx:Dendra2). קיצורים: RADISH = עוזר סיבובי להדמיית Danio של ריפוי לאחר מכן; HPW = שעות לאחר הפציעה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנחת היסוד של שיטת הלמינציה PET כוללת הפחתת עלויות ומזעור חסמי כניסה טכניים בהשוואה לאמצעים מסורתיים ליצירת התקנים מיקרופלואידיים, כגון ליתוגרפיה רכה או יציקת PDMS. ככזה, השלבים הקריטיים היחידים בפרוטוקול זה הם יישור מדויק של שכבות PET במהלך למינציה ואיטום של קצוות ההתקן לאחר הבנייה. ניתן לשנות את כל שאר חלקי השיטה בהתאם לצרכי הניסוי (למשל, אם נדרש קיבוע של עוברים צעירים או מבוגרים, ניתן להתאים את עובי שכבות ה-PET כדי לצמצם או להרחיב את התעלה בהתאם). ניתן ליצור עיצובים בכל צורה ולמינציה על כל חומר בסיס כל עוד החומר בטוח בחום ודק מספיק כדי להישלח דרך הלמינציה18,27. מכיוון שגיליונות PET נחתכים באמצעות חותכי מלאכה זמינים מסחרית, הקוראים קבצי תמונה דו-ממדיים ולא תלת מימדיים, העיצוב והאיטרציה של כל מכשיר נתון דורשים רק את היכולת לתפעל צורות בשחור-לבן בתוכנית עריכת תמונות, מה שמפחית באופן דרמטי את הקושי. גמישות זו בבחירת התוכנה והזמינות המסחרית של החומרים המשמשים מייצגים עלייה דרמטית בנגישות של מכשירי מיקרופלואידיקה באופן כללי, ומאפשרים את השימוש בהם בכל מעבדה או כיתה בעלות מראש של פחות מ-500 דולר בזמן כתיבת מאמר זה, בהשוואה ליותר מ-2000 דולר בעלויות ציוד התחלתי לייצור תבניות PDMS17.

יתר על כן, הזמן הנדרש ליצירת מכשיר שמיש יחיד בשיטה זו מצטמצם באופן דרמטי בהשוואה לליתוגרפיה רכה טיפוסית. בהנחה של היכרות עם התוכנה הנדרשת, ניתן להמשיג, לייצר ולהשתמש באופן מיידי במכשיר מיקרופלואידית ייחודי למינציה PET תוך ~3 שעות, כולל זמן הריפוי של ציאנואקרילט. איטרציה לוקחת אפילו פחות, בהתאם לגודל העריכות הדרושות לקבצי העיצוב המקוריים, וניתן ליצור מספר גרסאות במקביל עם מינימום זמן נוסף מושקע וללא ציוד נוסף. למרות שמכשירים שנוצרו בשיטה זו עמידים פחות מאלה המיוצרים עם PDMS ממגוון סיבות (כולל כשל בהדבקה ומתחים פנימיים לצורות עם שכבות רבות ויחסי גובה-רוחב ארוכים), האופי הזול שלהם והייצור הניתן להרחבה פירושם שהם מוחלפים הרבה יותר בקלות. מכיוון שחותכי מלאכה מסחריים משווקים עם היכולת לחזור על אותו חיתוך מדויק שוב ושוב ול-PET אין תאריך תפוגה, ניתן להכין מראש את השכבות הבודדות של עיצוב שהושלם בכמויות גדולות להרכבה ולשימוש בכל נקודה בעתיד, מה שמפחית עוד יותר את השקעת הזמן הכוללת הנדרשת.

עם זאת, מהירות ושונות באות על חשבון הדיוק. המגבלה העיקרית של למינציה PET בהשוואה לדפוס PDMS מסורתי היא רזולוציה מרחבית. חותכי מלאכה מסחריים נאבקים לעתים קרובות עם זוויות חדות בצורות קטנות מ-500 מיקרומטר בקירוב, ויריעות למינציה PET אינן זמינות בעוביים מתחת ל-33 מיקרומטר (לא כולל עובי הדבק עצמו, שאינו כלול במדידה על האריזה), מה שמגביל משמעותית את קנה המידה שבו ניתן ליישם טכניקה זו. מספר השכבות המרבי מוגבל גם על ידי גודל הלמינציה, שעשוי להשתנות מיצרן ליצרן.

הגרסה הסופית של הפרוטוקול, כולל וריאציות בטכניקת הרישום והיישור, ספקי החומרים והתוכנה, תהיה תלויה במידה רבה בהעדפת המשתמש. עם זאת, הנגישות והגמישות הכוללת של השיטה מפחיתים את עלות ההתאמה. משתמשים בודדים מוזמנים לחזור על כמה שצריך כדי להתאים את הגישה לצרכים הייחודיים שלהם.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה על ידי מימון מחקר מהמכונים הלאומיים לבריאות (R35GM119787 ל-QD). עבודה זו מבוססת על מאמצים הנתמכים על ידי מכון EMBRIO, חוזה NSF #2120200, מכון אינטגרציה לביולוגיה של הקרן הלאומית למדע (NSF). הדמיה קונפוקלית בוצעה במתקן ההדמיה של פרדו. אנו מודים לד"ר גואנגג'ון ז'אנג (אוניברסיטת פרדו) על אספקת קו Tg(UAS:GCaMP6f). אנו מודים לד"ר דיוויד טובין (אוניברסיטת דיוק) על אספקת קו (cdh1-tdtomato)xt18.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כיסוי זכוכית עגולה בקוטר 25 מ"מ #1 עוביChemglass Life SciencesCLS-1760-025חומר הרכבה בסיסי. העובי נבחר על פי המפרט של עדשת המיקרוסקופ.
Adobe Illustrator v28.5AdobeN/AVector editor לעיצוב תבנית ההתקן.
סידן כלוריד דיהידראטפישרC79להכנת E3 בינוני.
עיצוב קבצי PNG (מראה מקוונת)N/AN/Abr/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png
https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39CricutN/Aתוכנה קניינית להנעת חותך המלאכה.
פיוז'ן פלוס 7000LGBC1703098למינציה תרמית. דגם ספציפי זה נבחר עבור תכונות איכות חיים, כגון גודל מרבי של ערימת גיליונות.
להב פרימיום קרביד גרמניCricut10396595להב חלופי לחותך מלאכה.
סט כלים בסיסי אפורCricut10307854סט כלים לניכוש חתכים, ניקוי מחצלות והרכבת יריעות PET. אופציונלי. 
מגנזיום כלוריד הקסהידרטאקרוס אורגני223211000להכנת מדיום E3.
יצרן 3Cricut10669040חותך מלאכה. ה-Cricut Maker 3 נבחר על פני ה-Silhouette Cameo 4 עבור ידידותיות למשתמש בתוכנה, אך כל חותך מלאכה המסוגל לקרוא תמונות בשחור-לבן יעבוד.
MemGlow 560CytoskeletonMG02-10צבע תאים חיים אדומים לקרומי תאים. אין צורך בכביסה. בשימוש באיור 3. 
מס' 22 להב אזמל פחמןעיצוב כירורגי

22-079-697		להב אזמל להתאמות חיתוך ידניות. כל סכין יצירה דומה (למשל, סכין X-acto #2) תעבוד גם כן.
אשלגן כלוריפישרBP366להכנת E3 בינוני.
נתרן כלוריפישרBP358להכנת E3 בינוני.
מחצלת חיתוך דבק StandardGripCricut10138842מחצלת הרכבה לחותך מלאכה. שטיח החיתוך LightGrip יעבוד גם הוא, אך הימנע מחצלות החיתוך StrongGrip ו-FabricGrip מכיוון שחוזק הדבק עלול לעוות את החיתוך הסופי במהלך העשבים וההסרה. דבק על מחצלות יתבלה בסופו של דבר עם המשך השימוש; החלף מחצלות לפי הצורך.
סרט נייר מכתבים 12 מ"ממעדנייה30014קלטת משרדית. מותג המעדנייה נבחר באמצעות בדיקות כדי להקל על ההסרה לאחר למינציה.
דבק סופר, דבק לוקטיט נוזלי1364076דבק ציאנואקרילט. דבק <חזק> המשמש חייב להיות נוזלי. ניסוחים של ג'ל לא יאטמו מספיק או עמידים למים את קצוות המכשיר.
שקיות למינציה תרמיות PET,3 מיל סקוץ'TP3854עם דבק תרמי. הסדינים מגיעים כזוגות סנדוויץ' ויש להפריד אותם לפני השימוש. חותכים כשצד הדבק פונה כלפי מטה.
שקיות למינציה תרמיות PET,סקוטשTP5854עם דבק תרמי. הסדינים מגיעים כזוגות סנדוויץ' ויש להפריד אותם לפני השימוש. חותכים כשצד הדבק פונה כלפי מטה.
טריקאין (MS-222)סינדלIC10310680הרדמה לדגים.
https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png< יריעות PET יריעות PET 5 מיל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  2. Xu, S., Hsiao, T. I., Chisholm, A. D. The wounded worm. Worm. 1 (2), 134-138 (2012).
  3. Belacortu, Y., Paricio, N. Drosophila as a model of wound healing and tissue regeneration in vertebrates. Dev Dyn. 240 (11), 2379-2404 (2011).
  4. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J Cell Biol. 199 (2), 225-234 (2012).
  5. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231 (4), 693-699 (2004).
  6. Gault, W. J., Enyedi, B., Niethammer, P. Osmotic surveillance mediates rapid wound closure through nucleotide release. J Cell Biol. 207 (6), 767-782 (2014).
  7. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  8. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  9. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  10. Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
  11. Khalili, A., Rezai, P. Microfluidic devices for embryonic and larval zebrafish studies. Brief Funct Genomics. 18 (6), 419-432 (2019).
  12. Choudhury, D., et al. Fish and Chips: a microfluidic perfusion platform for monitoring zebrafish development. Lab Chip. 12 (5), 892-900 (2012).
  13. An integrated microfluidic system for zebrafish larva organs injection. Zhang, G., et al. Proceedings IECON 2017 - 43rd Annual Conference of the IEEE Industrial Electronics Society, 2017-January, , 8563-8566 (2017).
  14. Erickstad, M., Hale, L. A., Chalasani, S. H., Groisman, A. A microfluidic system for studying the behavior of zebrafish larvae under acute hypoxia. Lab Chip. 15 (3), 857-866 (2015).
  15. Mani, K., Hsieh, Y. C., Panigrahi, B., Chen, C. Y. A noninvasive light driven technique integrated microfluidics for zebrafish larvae transportation. Biomicrofluidics. 12 (2), 021101(2018).
  16. Lee, Y., Seo, H. W., Lee, K. J., Jang, J. W., Kim, S. A microfluidic system for stable and continuous EEG monitoring from multiple larval zebrafish. Sensors (Basel). 20 (20), 5903(2020).
  17. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Dev Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  18. Levis, M., et al. Microfluidics on the fly: Inexpensive rapid fabrication of thermally laminated microfluidic devices for live imaging and multimodal perturbations of multicellular systems. Biomicrofluidics. 13 (2), 024111(2019).
  19. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  20. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  21. Cronan, M. R., Tobin, D. M. Endogenous tagging at the cdh1 locus for live visualization of E-cadherin dynamics. Zebrafish. 16 (3), 324(2019).
  22. Thiele, T. R., Donovan, J. C., Baier, H. Descending control of swim posture by a midbrain nucleus in zebrafish. Neuron. 83 (3), 679-691 (2014).
  23. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  24. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  25. Li, L., Yan, B., Shi, Y. -Q., Zhang, W. -Q., Wen, Z. -L. Live imaging reveals differing roles of macrophages and neutrophils during zebrafish tail fin regeneration. J Biol Chem. 287 (30), 25353-25360 (2012).
  26. Mathias, J. R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J Leukoc Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. 2019, (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים