זיהוי וכימות של מטבוליטים מטורפים בחולים קריטיים באמצעות מטבולומיקה מבוססת NMR

Summary

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) משמשת לזיהוי חוסר ויסות במטבוליטים בחולים עם מחלות שונות. טכניקה זו מאפשרת לכמת את המטבוליטים המופרעים, ולחשוף את התובנות הפתופיזיולוגיות. כאן, אנו מתארים את ההליך שלב אחר שלב של הגישה מבוססת NMR לאפיון מטבולי של החולים.

Abstract

מטבולומיקה מסתמנת כגישה משמעותית המשקפת את תגובת הפרט לתנאים פתופיזיולוגיים. ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) התפתחה ככלי לזיהוי הפרעות מטבוליות בחולים קריטיים הסובלים ממצבים כמו תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), דלקת לבלב חריפה חמורה (SAP), פגיעה חריפה בכליות (AKI) ואלח דם. הנתונים הספקטרליים מדגימת הסרום של קבוצת המחקר והביקורת נרשמים באמצעות ספקטרומטר NMR של 800 MHz ומעובדים באמצעות כלי עיבוד וניתוח NMR. יתר על כן, ניתוח סטטיסטי קפדני, כגון בדיקות חד-משתניות ורב-משתניות, מבוצע כדי לאתר מטבוליטים משמעותיים, אשר לאחר מכן מזוהים ומכומתים במדויק באמצעות תוכנת כימות מטבוליטים NMR. בנוסף, ניתוח מסלולים מדגיש את המחזורים הביוכימיים המופרעים שגורמים לחומרת המחלה. באמצעות גישה מקיפה זו, החוקרים שואפים להשיג תובנות עמוקות יותר לגבי השינויים המטבוליים הקשורים למחלות קריטיות אלה, מה שעשוי לסלול את הדרך להבנה טובה יותר של המחלה ולשפר את אסטרטגיות האבחון והטיפול.

Introduction

למרות מאמצים מתמשכים לספק אבחון מחלות יעיל ברחבי העולם, טיפול ממוקד עדיין לא השיג את הפוטנציאל האמיתי שלו. גישות שונות, כגון תעתוק, פרוטאומיקה וכו ', הביאו לזיהוי של מספר סמנים ביולוגיים, אך אלה לא החזיקו מספיק תועלת קלינית בגלל חוסר רגישות וספציפיות ^1,2. טיפול ממוקד מטרה הוא אתגר גדול בכמה מחלות מולטיפקטוריאליות, ובסופו של דבר מוביל לתמותה גבוהה יותר. יש צורך בהבנה טובה יותר של המנגנון הבסיסי והפתופיזיולוגיה של מחלות מורכבות הקיימות עם הטרוגניות רחבה. לכן, בהקשר זה, התפתחות המטבולומיקה חוללה מהפכה בפיתוח הטיפולי, אשר בסופו של דבר עשוי לסייע בהתאמת משטרי הטיפול במחלות קריטיות שונות כגון תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), אלח דם ודלקת לבלב חריפה חמורה (SAP).

מטבולומיקה היא גישה מקיפה שמטרתה לזהות ולכמת מולקולות קטנות בעלות משקל מולקולרי (מטבוליטים כגון חומצות אמינו, שומנים, פפטידים, חומצות אורגניות וויטמינים) על פני נוזלים ביולוגיים, תאים או תמציות רקמות שונות. מטבוליטים אלה, שבדרך כלל שוקלים פחות מ -1500 Da, ממלאים תפקידים פעילים בתהליכים ביוכימיים, המשקפים מתאר מתקדם של המצב הביולוגי של האורגניזם. הם כוללים מצעים לתהליכים אנזימטיים מרכזיים, מתווכים במסלולים ביולוגיים ותוצרי לוואי של חילוף החומרים בתאים. כתוצאה מכך, מטבולומיקה לוכדת טביעת אצבע מפורטת של השפעות תזונתיות, אינטראקציות בין תרופתיות ומצבי מחלה. שינויים מטבוליטים הם אינדיקטורים רגישים מאוד של מטבוליזם ומסלולים ביולוגיים, המאפשרים קורלציות עם ביטויים פנוטיפיים והפרעות פתופיזיולוגיות הנובעות מכך ^3,4. שינויים ראשוניים במטבוליטים יכולים לשמש אינדיקטורים מוקדמים לחומרת המחלה, בעוד ששינויים זמניים עשויים לסייע במעקב אחר יעילות הטיפול, התקדמות המחלה ותוצאות קליניות ^5,6,7. מטבולומיקה משפרת אפוא את הבדיקות הקליניות וגישות אומיקס שונות אחרות על ידי הגדרה מחדש של מחלות באמצעות נקודות קצה קליניות, פיזיולוגיות וביוכימיות 8,9,10,11,12,13. היכולות האנליטיות של מטבולומיקה משמשות לניטור וקביעת רגישות המחלה באמצעות שינויים בריכוזי מטבוליטים^14,15.

בהקשר זה, הן ספקטרומטריית מסה (MS) והן ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) התפתחו כפלטפורמות האנליטיות העיקריות ליצירת פרופיל מטבוליטים בדגימות ביולוגיות. שיטות אלה משמשות לזיהוי וכימות ממוקדים ולא ממוקדים של מטבוליטים 16,17,18. לכל פלטפורמה יתרונות ומגבלות, אך האופי הלא הרסני של תמ"ג הופך אותה לעדיפה במחקרי in vivo שונים ובאפיון מבנה של תרכובות לא ידועות, במיוחד בשלבים הראשונים של מחקר המטבולומיקה. שבר הדגימה, הדה-ריווטציה והיינון הנדרשים לפני טרשת נפוצה יכולים להציג הטיות ולעתים קרובות לגרום לאובדן דגימה, המשפיעים על התכונות הדינמיות שספקטרוסקופיית NMR יכולה ללכוד עם הכנת דגימה מינימלית או ללא הכנת דגימה. המגבלה העיקרית של NMR היא רגישותו הנמוכה יותר בהשוואה לטרשת נפוצה, המציעה גבול זיהוי נמוך יותר, מה שהופך אותו למאתגר לזהות מטבוליטים פחות נפוצים¹⁹. עם זאת, פיתוחים כגון מגנטים מוליכי-על ברזולוציה גבוהה, בדיקות NMR מקוררות קריוגנית וטכניקות המשפרות את הרגישות מיתנו מגבלה זו 20,21,22. כגישה משלימה לגנומיקה ופרוטאומיקה, פרופיל מטבולי באמצעות ספקטרוסקופיית NMR צובר תאוצה כטכניקה מועדפת 23,24,25. הכנת הדגימות, יכולת השחזור והחזרתיות המינימליות של NMR הופכות אותו לכלי רב ערך ללכידת התכונות הדינמיות הטבועות במטבוליטים למרות אתגרי הרגישות שלו²⁶.

מספר קבוצות מחקר ביצעו מטבולומיקה בהצלחה, ואיתרו את הפרופיל המטבולי הלא מווסת של חולים במחלות שונות²⁷ כגון ARDS 28,29,30,31,32,33, דלקת ריאות³⁴, אלח דם⁷, אבני מרה³⁵ ודלקת הלבלב ³⁶. מחקרי מטבולומיקה מבוססי NMR על חולים במצב קריטי סייעו במעקב אחר ההתקדמות מתסמונת תגובה דלקתית מערכתית (SIRS) לתסמונת תפקוד לקוי של איברים מרובים (MODS), שהיא גורם מוביל לתמותה ותחלואה ביחידות טיפול נמרץ³⁷. במחקר שנערך על ידי Stringer et al., דגימות פלזמה שימשו לבחינת שינויים מטבוליים בחולים עם פגיעה ריאתית חריפה הנגרמת מאלח דם (ALI) בהשוואה לחולי ביקורת³⁸. מטבוליטים מרכזיים שנמצאו גבוהים במחקר פיילוט זה שיקפו את המסלולים המטבוליים המעורבים ואת הקשר שלהם לציונים קליניים. מחקר זה הורחב למטבוליזם בסרום כדי להבדיל בין אלח דם לבין השלבים המוקדמים של מנגנוני פגיעה ריאתית ב- ARDS³². בנוסף, מחקר אחר ב- ARDS זיהה סמנים ביולוגיים חזקים בסרום המבדילים באופן מובהק בין פגיעה ריאתית חריפה / ARDS לבין בקרות בריאות, ומציע תובנות לגבי שינויים מטבוליים מערכתיים המתאימים להתפרצות החריפה של פגיעה ריאתית^39,40.

ספקטרוסקופיית NMR היא טכניקה אנליטית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה המספקת מידע חזק ובלתי משוחד על טביעת האצבע המטבולית החושפת את הפתופיזיולוגיה הבסיסית³⁸. היישום הקליני והפרשנות הביולוגית של נתוני NMR תלויים בקבלת ספקטרום איכותי המכיל מידע עשיר. לכן, הבטחת איסוף, עיבוד וניתוח נתונים מדויקים, אחידים ומנוסחים היטב היא חיונית. לכן, מטרת מחקר זה היא למנף את השלבים החיוניים של מטבולומיקה מבוססת NMR לזיהוי וכימות של מטבוליטים. מחקר זה מדגיש את השלבים העיקריים של הפרוטוקול הנדרש למחקר מטבולומיקה קלינית (איור 1), כגון בחירת דגימות מתאימות, איסוף ואחסון, עיבוד והכנת דגימות, רכישה וניתוח נתונים, זיהוי וכימות המטבוליט המעניין, ובסופו של דבר, פרשנות התוצאות בהקשר קליני כדי להפיק תובנות רלוונטיות. כל אחד מהשלבים הללו חיוני למינוף ספקטרוסקופיית NMR במטבולומיקה כדי לחשוף תובנות ביולוגיות וקליניות משמעותיות.

Protocol

אישור אתי (קוד חברת החשמל: 2022-71-PhD-126) התקבל מחברת החשמל של המכון למדעי הרפואה סנג'אי גנדי (SGPGIMS), לאקנאו. הסכמות בכתב ודעת נלקחו מהמטופלים או מקרוביהם לבצע את המחקר ולפרסם את הנתונים לצורכי מחקר. יתר על כן, המחקר נערך בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. עיצוב המחקר ואישור אתי

1. קבע את גודל המדגם עבור כל קבוצה. סקור בקפידה וקבע את קריטריוני הבחירה למשתתפים. בנוסף, אם תכנון המחקר דורש הכללת דגימות אדם או בעלי חיים, יש לקבל אישור אתי מוועדת האתיקה המוסדית המתאימה (IEC) לפני תחילת איסוף הדגימות.
2. חולי ARDS נבחרים מסווגים כקלים, בינוניים וחמורים, בהתבסס על קריטריוני האבחון של הגדרת ברלין 2012 בהתבסס על הלחץ החלקי של חמצן בדם עורקי (PaO2) לשבר החמצן בהשראת (FiO2) (P / F). חולי ARDS עם טווח P/F של 300-200 נחשבים קלים, 200-100 בינוניים, ומתחת ל-100 כחמורים³⁸. כאן התמקדנו בשתי קבוצות: חולי ARDS קלים ובינוניים (ראו טבלה 1).
   הערה: המחקר כולל שימוש בסרום המתקבל מדגימות דם לביצוע מטבולומיקה מבוססת NMR. במחקר זה, המשתתפים שנכללו להתייחסות היו בגיל ממוצע של 42 שנים (± 10.9 שנים), עם התפלגות מגדרית של 2 גברים ו -6 נקבות.

קטגוריה	יחס P/F
מתון	300-200
מתון	200-100
חמור	100-0

טבלה 1: סיווג חולי ARDS.

2. בחירה, איסוף ועיבוד של דוגמאות

1. בצעו בידוד בסרום על ידי ביצוע השלבים המתוארים להלן.
   1. לצורך ניסויים, לאסוף 2 מ"ל של דגימות דם מן העורקים באמצעות מחט סטרילית רגיל (ללא תוספים) בקבוקון סטרילי. השאירו את הדגימה להיקרש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. למחקר זה נבחרו 4 חולים שאובחנו עם ARDS, ו -4 חולים עם ARDS בינוני.
   2. צנטריפוגה את הדגימה ב 3100 x גרם במשך 15 דקות כדי להפריד את הסרום²⁵. להעביר את הסרום לתוך צינורות microcentrifuge סטריליים, ביצוע aliquots של נפח קטן יותר (כלומר, 400-500 μL), לתייג אותם כראוי (שם המטופל, CR מספר, נקודת יום, וכו '), ולאחסן אותם ב -80 ° C לניתוח עתידי.
      הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי ולחדשו בזמן נוח.
2. עבד את דגימת הסרום לפני ניסויי NMR באמצעות השלבים הבאים.
   1. הפשירו את הדגימה לפני ביצוע ניסויי NMR. יש לערבב 250 μL של aliquot של הסרום עם 250 μL של תמיסת חיץ פוספט מלוחים (המכילה 100% D₂O, 0.9% NaCl, 50 mM נתרן פוספט חיץ pH, pH 7.4) כדי למזער את השונות pH.
   2. מערבבים את התערובת למשך מספר שניות (~ 15 שניות) כדי להבטיח שהיא מעורבבת בצורה הומוגנית. לבסוף, להעביר את הדגימה המוכנה לצינור NMR נקי עם תוספת קואקסיאלית המכילה trimethylsilylyl propionate (TSP) בריכוז של 0.05 mM, המשמש תקן חיצוני לכיול וכימות⁴¹.
      הערה: לשם השוואה, נעשה שימוש בתרכובת אינרטית ולא תגובתית שאינה מקיימת אינטראקציה עם האנליטים. תרכובות ייחוס נפוצות אחרות כוללות טטרמתילסילן (TMS) ונתרן טרימתילסילפרופילפרופאנסולפונט (DSS).

3. ניסויי תמ"ג

הערה: ההתמקדות היא בזיהוי מולקולות קטנות בדגימות הסרום, ולכן השתמשנו ברצף הדופק Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), המדכא אותות מקרומולקולה. כל דגימות הסרום במחקר זה תועדו באמצעות ספקטרומטר NMR של 800 MHz המצויד בראש בדיקה הפוך TCI בעל תהודה משולשת מקוררת קריוגנית, בפס רחב 5 מ"מ ובשיפוע z מסוכך.

1. הכניסו את הדגימה למגנט. כתוב את הפקודה wrpa (ציין מספר ניסוי) והקש Enter כדי להגדיר ניסוי פרוטון עם תוכנית הדופק cpmg. ציין את שם המטופל ופרטים אחרים הדרושים על ידי לחיצה על האפשרות כותרת.
2. נעל את השדה המגנטי על-ידי כתיבת הפקודה נעל, הקש Enter ובחר באפשרות 90% H₂O ו- 10% D₂O נוספים . כוונן והתאם את הגשושית באופן ידני באמצעות ATMM כדי למטב את היעילות של פולסי תדר רדיו ולמקסם את הרגישות. בצע שיימינג שיפוע 1D על ידי לחיצה על topshim.
3. הגדר את פרמטרי הרכישה הבאים, כולל עיכוב הרפיה של 5 שניות, רוחב טאטוא ספקטרלי של 12 חלקים למיליון (ppm) וזמן הד של 300 μs. כל הפרמטרים הללו ניתן לשנות בקלות על ידי בחירת האפשרות פרמטרים רכישה בחלונית העליונה.
4. החל הרחבת קו של 0.3 הרץ באמצעות פונקציית חלון מעריכי, איסוף נתונים ל- 64,000 נקודות על פני 128 סריקות. ניתן לשנות פרמטרים אלה באופן דומה על ידי בחירת האפשרות פרמטרים רכישה בחלונית העליונה. על ידי לחיצה על פרמטרים רכישה, תופיע רשימה של מפרטים, ואת התכונות שהוזכרו, יחד עם פרמטרים אחרים, ניתן לשנות במהלך אופטימיזציה.
5. רכוש את ספקטרום ה- NMR באמצעות כלי עיבוד וניתוח NMR. לאחר קבלת הספקטרום הסופי, כתוב את הפקודה apk ו - absn ולחץ על Enter כדי לבצע תיקון פאזה ותיקון קו בסיס, בהתאמה. לחץ על האפשרות כיול ציר הנמצאת בחלונית העליונה ולאחר מכן כייל את שיא TSP ל- 0 עמודים לדקה באופן אוטומטי או ידני.
6. העבר את הנתונים שנרכשו מהמערכת לתחנת העבודה, שם נעשה עיבוד וניתוח נוספים.
   הערה: שלב הניסוי הושלם כעת וניתן להשהותו. עיבוד מקדים, ניתוח ופרשנות של נתונים יכולים להתבצע בנוחות.

4. עיבוד מקדים של נתונים

1. בצע את עיבוד הנתונים מראש באמצעות כלי עיבוד וניתוח NMR ותוכנה לכימות מטבוליטים NMR.
   1. לפעמים, רק תיקון אוטומטי אינו מספיק, ובמקרה זה, תיקון ידני הוא גם הכרחי. כדי לבצע תיקון פאזה באופן ידני, לחץ על האפשרות תהליך בשורת התפריטים העליונה של כלי עיבוד וניתוח NMR. לאחר מכן לחץ על התאמת פאזה, גרור את העכבר והתבונן עד לתיקון הפאזה של הספקטרום. לאחר שתסיים, לחץ על שמור והחזיר אפשרות (קיימת בצורה של סמל) זמין באותה שורת תפריטים.
   2. כדי לבצע תיקון בסיסי ידני (שיטת Whittaker), פתח את הקובץ הספקטרלי במודול המעבד של תוכנת כימות המטבוליטים NMR. בחרו באפשרות 'תיקון קו בסיס'. לאחר מכן בחר באפשרות Whittaker Method. כעת שים את הנקודות בבסיס הפסגות בספקטרום כולו (0.0 עד 10 ppm, בדרך כלל במקרה של סרום או לפי זמינות המטבוליט בספקטרה) כדי להתאים את הבסיס. לאחר שכל הקבצים הספקטרליים תוקנו בקו הבסיס, שמור אותם בתיקיה אחת. עיבוד נוסף, באמצעות המעבד או מודול profiler של תוכנת כימות מטבוליטים NMR, יכול להתבצע באמצעות אותו קובץ שנשמר בפורמט הספציפי.
   3. בצע binning באמצעות מודול profiler של אותה תוכנה. בחר באפשרות כלים, לאחר מכן תהליך אצווה ולאחר מכן בינינג ספקטרלי.
2. ליצירת גיליון האיגוד הסופי שישמש לניתוח סטטיסטי, בחר בתיקייה המכילה את כל הקבצים הספקטרליים שתוקנו על-ידי קווי הבסיס לאחר לחיצה על Spectral binning.
3. חלק את הספקטרום למספר מוגדר של פחים בגודל שווה עם רוחב ספקטרלי מוגדר, הנע בין 0.01 ל- 0.04 עמודים לדקה (ניתן למטב בהתאם למחקר). תהליך זה מפשט ומארגן את הנתונים הספקטרליים, ומאפשר ניתוח עקבי יותר. ציין את גודל הדלי יחד עם ערכי עמודים לדקה בהתחלה ובסוף וציין את התיקיה שבה יישמרו גיליונות איחוד הפלט.
4. לא לכלול את אזורי השינוי הכימי המתאימים למים ואת TSP הממס (4.8-5.2 ו- 0.0-0.7 ppm) כדי למנוע הפרעות ספקטרליות 42,43,44.
5. גיליון אלקטרוני זה מכיל את השמות לדוגמה בשורה אחת ואת ערכי הסלים השונים יחד עם ppm בשורות האחרות. לפני השימוש בגיליון זה לניתוח סטטיסטי, שנה אותו על-ידי ארגון הדגימות לקבוצות לצורך ניתוח ושמירתו בתבנית המופרדת באמצעות פסיקים (CSV) בלבד.
   הערה: לדוגמה, כאשר השווינו את הקבוצה הקלה לקבוצה המתונה של חולי ARDS, סידרנו את הנתונים עם תוויות קלות ובינוניות, הוספנו מספר סידורי ושמרנו את הקובץ בפורמט CSV.

5. ניתוח סטטיסטי

הערה: גיליון האיגוד שהתקבל מהשלב הקודם משמש כקובץ הקלט לניתוח סטטיסטי. במחקר זה נעשה שימוש במודול הניתוח הסטטיסטי (גורם אחד) של תוכנת ניתוח סטטיסטי מטבולומי.

1. לפני ניתוח סטטיסטי, בצע את שלב הנורמליזציה באמצעות סכום, יומן ופארטו, אך הוא יכול להשתנות בין מחקרים שונים⁴⁵.
2. בצע ניתוח חד משתני ורב-משתני כדי להבחין בין הקבוצות השונות ולקבוע את דיוק המטבוליטים שזוהו.
   1. בצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), ניתוח דיסקרימיננטי חלקי הכי פחות ריבועי (PLS-DA) וניתוח דיסקרימיננטי חלקי אורתוגונלי (OPLS-DA) כדי לבחון אפליה בין הקבוצות המניבות ציוני חשיבות משתנה של היטל (VIP) עבור כל מטבוליט האחראי להבדל בפרופיל המטבולי.
   2. בצע שיטות חד משתניות, כגון מבחן t סטודנט ו- ANOVA, כדי לזהות את המטבוליטים המשמעותיים בהתבסס על הקריטריונים של בעל ערך p קטן מ -0.05. שתי הבדיקות מניבות חלקות שפם קופסה המראות את ההבדל בריכוז היחסי של המטבוליטים.
   3. בצע ניתוח סמנים ביולוגיים, אשר מניב אזור מתחת לגרף עקומת ההפעלה האופיינית של המקלט (AUROC). ערך AUC (שטח מתחת לעקומה) > 0.8 נחשב משמעותי⁴⁶.
   4. בחר את הרשימה הסופית של מטבוליטים משמעותיים באמצעות הקריטריונים ציון VIP>1, ערך p מתוקן Bonferroni<0.05⁴⁴, ו- AUC > 0.8⁴⁶.
3. זהה מטבוליטים כמתואר להלן.
   1. Binning מספק מטבוליטים משמעותיים בצורה של ערכי ppm ולא שמות. זהה את המטבוליטים המתאימים לערכי ppm ספציפיים באמצעות מסדי נתונים כגון בנק התהודה המגנטית הביולוגית (BMRB)⁴⁷ומסד הנתונים של חילוף החומרים האנושי (HMDB).
   2. מלבד אלה, השתמש בספרות^42,44 שפורסמה בעבר לצורך זיהוי ואימות.
   3. השתמש במודול profiler של תוכנת כימות מטבוליטים NMR כדי לאשר את המטבוליטים המזוהים עם ערכי ppm שלהם.

6. כימות מטבוליטים באמצעות תוכנת כימות מטבוליטים NMR

הערה: מודול הפרופיילר של התוכנה נמצא בשימוש נרחב כדי לכמת את המטבוליטים שזוהו.

1. לפני תחילת הכימות, כייל את תרכובת הייחוס שנבחרה למחקר (כפית המשמשת במחקר זה) באמצעות מודול המעבד. לחץ על האפשרות כיול CSI (מחוון צורה כימית). ציין את ריכוז תרכובת הייחוס (0.05 mM עבור מחקר זה). לאחר מכן, גרור את שיא התוכנה אל שיא הייחוס הספקטרלי והתאם את גובהו ורוחבו כראוי. ברגע ששיאי הייחוס הספקטרליים מתאימים לשיא של התוכנה, לחץ על קבל.
2. פתח את הספקטרום הרצוי במודול הפרופיילר ובחר את ספריית התרכובות המתאימה למחקר.
3. בתחתית המסך מוצגת רשימה של מטבוליטים. בחר את המטבוליט של עניין מרשימה זו. לאחר שנבחר, ppm האפשרי של המטבוליט שנבחר יופיע בפינה העליונה של הספקטרה.
4. בחר ערך Ppm בפינה העליונה והתקרב לספקטרום לקנה המידה הספציפי ppm של המטבוליט.
5. בשלב זה יופיעו על המסך שני שיאים: האחד מייצג את הנתונים המוקלטים והשני, המוצג כקו מקווקו, המייצג את שיא התוכנה. יישר את שתי הפסגות. גרור את שיא התוכנה וכוונן את גובהו ומיקומו כך שיתאימו לשיא הקיים בדגימה.
6. לאחר יישור נכון, ניתן לקבל את ריכוז המטבוליט מהערך המוצג תחת הכותרת ריכוז ב-mM עבור אותו מטבוליט (איור 1).
7. בצע את אותו הליך עבור כל המטבוליטים והדגימות וייצא את הערכים המכומתים בגיליון אלקטרוני. כדי ליצור את קובץ הפלט, לחץ על פעולות אצווה אפשרות תחת כלים תפריט. ציין את התיקייה הרצויה לשמירת קובץ הפלט.

7. ניתוח מסלול

הערה: המטבוליטים המשמעותיים שזוהו לאחר הניתוח משמשים לקביעת המסלולים העיקריים המשפיעים ישירות על התוצאה בקבוצות המחלה. מודול ניתוח המסלול של תוכנת ניתוח סטטיסטי מטבולומיקה ומסד הנתונים KEGG משמשים בדרך כלל למטרה זו.

1. הזן את הרשימה המתקבלת של מטבוליטים משמעותיים למודול. נוצרת רשימה המכילה את שמות הנתיבים.
2. בחר את המסלולים הסופיים בהתבסס על קריטריון של גורם השפעה גדול מ- 0.1. ערכי השפעה משמעותיים מצביעים על מסלולים הקשורים למחלה³⁰.
3. לנתח את המסלולים המתקבלים ביסודיות כדי להבהיר את dysregulation הקשורים לחומרת המחלה. אחד היתרונות של שיטה זו הוא חוסר היעילות שלה בזיהוי מסלולים dysregulated כאשר מטבוליטים משמעותיים הם פחות מ 3.
4. כדי להתמודד עם אותו דבר, מטבוליט מזוהה ואת הקשר שלה עם חומרת המחלה ניתן לקבוע גם באמצעות הספרות שפורסמה בעבר. בצע סקר ספרות יסודי ובדוק אם המטבוליט המזוהה עוקב גם הוא אחר אותה מגמה לפי העניין שלך.

איור 1: שלבים בסיסיים במטבולומיקה מבוססת NMR. האיור מציג שלבים מרכזיים במטבולומיקה מבוססת NMR: איסוף והכנת דגימות, ביצוע ספקטרוסקופיית NMR, עיבוד מקדים של נתונים, ביצוע ניתוח סטטיסטי, זיהוי וכימות מטבוליטים ופענוח מובהקות ביולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Results

כדי לבצע מחקר מטבולומי, חיוני לקבוע את גודל המדגם ואת הקבוצות הספציפיות שינותחו. בחירת גודל מדגם מתאים חיונית להשגת תוצאות משמעותיות המתאימות במדויק לחומרת המחלה⁴⁸. עם זאת, בעבודה ספציפית זו, השתמשנו בגודל מדגם קטן כדי להדגים את השלבים הכרוכים בזיהוי וכימות של מטבוליטים באמצעות מטבולומיקה מבוססת NMR, אשר נועדה בעיקר לייחוס. במחקר זה, בחנו את ההבדלים המטבוליים בין חולים בשלבים הקלים והמתונים של ARDS ביום הראשון לאשפוזם בטיפול נמרץ, כולל בסך הכל 8 נבדקים. בעקבות הפרוטוקול, ספקטרום NMR של כל הדגימות נרכש ועובד, ובסופו של דבר, נוצר גיליון אלקטרוני עם התוצאות המחייבות.

לאחר מכן ביצענו ניתוח סטטיסטי קפדני, שבו גיליונות האיגודים שימשו כקבצי קלט, תוך נרמול הנתונים באמצעות סכום, יומן ופארטו. ערכנו PCA (איור 2A) ו-OPLS-DA (איור 2B), כאשר הראשונים הראו התקבצות, אולם האחרונים חשפו אפליה ברורה בין הקבוצות והדגישו הבדלים מטבוליים. ניתוח סטטיסטי של בדיקת פרמוטציה (20x) הניב ערכים של R2Y=0.99 ו-Q2=0.47. לאחר מכן, ביצענו מבחן t של תלמיד (איור 2C) וניתוח סמנים ביולוגיים (איור 2D) כדי לזהות מטבוליטים לא מווסתים. בהתאם לקריטריונים המתוארים בסעיף הפרוטוקול, סיננו את התוצאות למטבוליטים המשמעותיים (טבלה 2).

איור 2: אנליזה רב-משתנית וחד-משתנית. (A) ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) ו-(B) ניתוח דיסקרימיננטי אורתוגונלי חלקי לפחות ריבועי (OPLS-DA) של חולי ARDS קלים (המיוצגים על ידי צבע אדום) וחולי ARDS בינוניים (המיוצגים על ידי צבע ירוק). (C) חלקות הקופסה מדגישות את ההבדלים בריכוז היחסי של מטבוליטים בין חולי ARDS קלים ומתונים שזוהו על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית של פרוטונים בדגימות בסרום. ציר ה-x מייצג את קבוצות המחקר, וציר ה-y מראה את הריכוז היחסי כאשר חולי ARDS קלים (המיוצגים על ידי צבע אדום) וחולי ARDS בינוניים (המיוצגים על ידי צבע ירוק) הושוו ביום הראשון לאשפוז בטיפול נמרץ. (D) השטח מתחת לעקומה (AUC) תרשים של מטבוליטים משמעותיים המנבאים את חומרתם המתקבלת לאחר ביצוע ניתוח סמנים ביולוגיים המשווה חולי ARDS קלים ובינוניים ביום הראשון לאשפוז בטיפול נמרץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

S.No.	שם	מיקום ספקטרלי (ppm)	ערך p	VIP	ערך AUC
1	לקטט	1.34	0.04	1.99	1
2	איזולאוצין	1.42	0.03	2.01	0.875

טבלה 2: רשימת מטבוליטים משמעותיים שהתקבלו לאחר השוואת חולי ARDS קלים ובינוניים ביום הראשון לאשפוז בטיפול נמרץ.

מכיוון שהתוצאות התקבלו בערכי ppm, הקצינו מטבוליטים באמצעות ספרות קודמת ותיקפנו אותם באמצעות הפרופילר. לאחר המשימה, לקטט ואיזולאוצין התקבלו כמטבוליטים משמעותיים, אשר דווחו גם בכמה מחקרי ARDS קודמים^30,40. הבטחנו את הבחירה של פסגות פתורות היטב, שאינן חופפות. לאחר הזיהוי, סיננו את רשימת המטבוליטים המשמעותיים באמצעות הקריטריונים שהוזכרו בפרוטוקול. לאחר מכן כימתנו את המטבוליטים המעניינים באמצעות מודול הפרופיילר על ידי פתיחת הספקטרה, חיפוש אחר המטבוליט המעניין, והתאמת שיא התוכנה לשיא המתקבל בספקטרה. זה סיפק את הערכים המכומתים של המטבוליטים ב- mM. גיליון אלקטרוני המכיל שמות לדוגמה, שמות מטבוליטים וריכוזים הופק לעיון. לאחר הכימות עם התוכנה ניתן לבצע ולידציה באמצעות גישות אחרות, כגון פרוטאומיקה.

יתר על כן, המטבוליטים שזוהו מנותחים ביסודיות כדי לקבוע את הקשר שלהם עם חומרת המחלה ולזהות את המסלולים הביוכימיים שבהם מטבוליטים אלה מעורבים באופן פעיל. מכיוון שרק שני מטבוליטים משמעותיים זוהו לאחר שימוש בקריטריונים שהוזכרו בסעיף החומר והשיטה, ניתוח מסלולים באמצעות התוכנה לא היה אפשרי. לכן, סקר ספרות יסודי נעשה כדי להדגיש את מחזורי חילוף החומרים המופרעים. שני המטבוליטים שזוהו במחקר זה היו בקורלציה מוצלחת עם חומרת ARDS. לקטט מוגבר ציין דלקת ריאות ונשימה אנאירובית, ואילו איזולאוצין מוגבר הצביע על קטבוליזם חלבוני הקשור לפגיעה בריאות, זיהום ומטבוליזם אנרגיה⁴⁰. הבנת מסלולים מטבוליים אלה משרתת מטרה כפולה. ראשית, הוא חושף את מורכבות המחלה, ומספק תובנות לגבי המנגנונים הביולוגיים שלה. שנית, הוא מסייע להתקדמות הטיפולית על ידי הנחיית קלינאים בהתאמת טיפולים למטופלים, ובסופו של דבר משפר את התוצאות הקליניות.

Discussion

מטבולומיקה מזהה ומכמתת ביעילות מטבוליטים, ומכוונת למחזורים המטבוליים שמשתבשים במהלך המחלה. איכות התוצאות תלויה בביצוע קפדני של כל שלב בגישה המטבולומית. כל שלב, החל מבחירת הדגימה ואיסוף ועד לזיהוי המסלולים, הוא קריטי בזיהוי מדויק של הגורמים העיקריים התורמים למחלה. לפני ביצוע מטבולומיקה, סקירה יסודית של הספרות היא חיונית, ויש להקדיש תשומת לב קפדנית בכל שלב.

בתכנון מחקר מטאבולומי, בחירת הדגימה חיונית לחילוץ מידע משמעותי ולהבטחת הכנת דגימה אידיאלית, בין אם לטביעת אצבע מטבולית ממוקדת או לא ממוקדת של המצב הקליני הנדון. עיבוד ראשוני נכון של הדגימות הוא חיוני, ויש לעקוב באופן עקבי אחר פרוטוקולים עבור כל הדגימות לאורך המחקר⁴⁹. זהירות נוספת נדרשת בעת עבודה עם דגימות קליניות. דגימות נפוצות עבור מטבולומיקה מבוססת NMR כוללות נוזלים ביולוגיים, תמציות תאים ותמציות רקמות^50,51. נוזל מוחי ושדרתי (CSF) ושתן דורשים לעתים קרובות טיפול מקדים מינימלי ונחקרים לעתים קרובות בהקשרים כגון מחלות הקשורות לכליות, מחלות נוירודגנרטיביות ורעילות סמים. דם מלא, פלזמה וסרום מספקים מידע מקיף עבור ספקטרום רחב של מחלות קריטיות והם מועדפים בגלל קלות האיסוף. מגוון רחב של נוזלים ביולוגיים אחרים, כגון נוזל זרע, רוק, מרה, נוזל דיאליזה, מי שפיר, עיבוי נשימה בנשיפה, שאיפת ריאות, נוזל סינוביאלי ונוזל שטיפה מיני ברונכואלבאולרי (mBALF), שימשו באופן נרחב עבור הספציפיות והדיוק שלהם באמצעות NMR 52,53,54. כל נוזל ביולוגי מציג את היתרונות והאתגרים שלו בנוגע לאיסוף, זמינות ותוכן מידע, בהתאם למחקר או לתכנון הניסוי⁵⁵. התמקדנו בדגימות סרום של חולי ARDS עבור מחקר זה מכיוון שדגימות דם בדרך כלל מציעות מידע ברמת הגוף כולו ואינן מושפעות באופן משמעותי משינויים יומיומיים קיצוניים. מצד שני, דגימות שתן נתונות לתנודות שונות ויכולות להיות מושפעות מתזונה, אורח חיים, תרופות וגורמים סביבתיים²⁷. אחסון דגימות נכון חשוב גם כדי למנוע פעילות אנזימטית או התפרקות מיקרוביאלית. הדגימות נשמרות בדרך כלל בהקפאה בטמפרטורה של -80°C עם מחזורי הקפאה-הפשרה מינימליים כדי למנוע התמוטטות מטבולית ולשמור על יציבות הדגימה. ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של -80°C לפרקי זמן ממושכים, מה שמאפשר לבצע ניסויי NMR בצורה נוחה. עם זאת, תכנון וביצוע הניסוי בהקדם האפשרי מומלץ לתוצאות אופטימליות.

במחקר זה, השתמשנו בספקטרומטר NMR של 800 MHz לרכישת נתונים, המספק נתונים ספקטרליים ברזולוציה גבוהה. עבור ניסוי זה, נצמדנו לאותם פרמטרים של רכישה שהוזכרו לעיל. עם זאת, חשוב לציין כי אותם פרמטרי רכישה המתוארים בפרוטוקול זה ניתנים ליישום באמצעות ספקטרומטרים של NMR הפועלים בעוצמות שדה מגנטי אחרות. ניתן להגדיל את מספר הסריקות בעת הפעלה בשדה מגנטי נמוך יותר כדי לשפר את הרזולוציה. בעוד שעוצמות שדה גבוהות יותר עשויות להציע רזולוציה משופרת, היבטי הליבה של תהליך הרכישה, כגון רצפי פולסים, עיכובי הרפיה ובקרת טמפרטורה, נשארים עקביים בין מכשירים שונים, ומבטיחים את יכולת השחזור והאמינות של התוצאות.

בעקבות הליך סטנדרטי חיוני כדי לשמור על יכולת שחזור וחוסר משוא פנים, כמו סטיות יכול לעכב ניתוח נתונים הבאים והערכה. כל שלב בניסויי התמ"ג חייב להתבצע בקפדנות, שכן איכות הספקטרום תלויה בהם. יש לתת תשומת לב מיוחדת לשיימינג, שכן הוא מגדיר את צורת השיא, ולבצע אופטימיזציה של פרמטרי הרכישה בהתאם לעיצוב המדגם והמחקר. עבור דגימות עם ריכוז מטבולי נמוך בדגימה, ניתן להגדיל את מספר הסריקות. איסוף נתונים ב- NMR כרוך באופטימיזציה סטנדרטית של ניסויים 1D ו- 2D המותאמים לבחירת הדגימה והמידע הספציפי הנדרש. ניסויי NMR שונים עברו אופטימיזציה כדי להשיג ספקטרום באיכות גבוהה מנוזלים ביולוגיים, תוך מזעור ההשפעה של מקרומולקולות לא רצויות. רצף הדופק^{CPMG 56} מועדף עבור דגימות כמו סרום, פלזמה או נוזל מוחי שדרתי. טכניקה זו מדכאת את האותות הרחבים ממקרומולקולות כגון שומנים וחלבונים, שיש להם זמני הרפיה רוחביים ארוכים ויכולים לטשטש את התהודה של מטבוליטים בעלי משקל מולקולרי נמוך.

עיבוד מקדים של נתונים מקיף את שיטות הביניים המשמשות להבטחת ניתוח נתונים אחיד והומוגני. תהליך זה כולל הימנעות מאותות לא רצויים או אזורים ספקטרליים המועדים לחוסר עקביות ותיקון שינויי שיא. בנוזלים ביולוגיים, הרחקת אזורים לא רצויים פירושה לעתים קרובות הסרת אותות, כגון אלה ממים, השולטים בטווח של 4.6 חל"מ עד 5 חל"מ. ניתן למזער את שינויי השיא, הנגרמים על ידי שינויים ב- pH, טמפרטורה, ריכוז מלחים, גורמי דילול והרכב יוני, על ידי שימוש במאגרים ב- pH הומיאוסטטי. בנוסף, השימוש בתרכובות ייחוס סטנדרטיות, יישור שיא ואינינג יכול לסייע בהפחתת שינויי שיא. יישור שיא הוא חיוני כדי לתאם דפוסים על פני ספקטרום שונים שנרכשו בתנאים זהים.

עיבוד ספקטרום חייב להיעשות כראוי כדי להבטיח כריכה מדויקת בהמשך הניתוח. כל הספקטרום צריך להיות מכויל ומיושר באופן אחיד, וניתן לבצע תיקוני בסיס ופאזה באופן ידני או אוטומטי. תיקון פאזה ובסיס נכון, כמו גם כיול, הם קריטיים. ביצוע תיקון בסיסי חיוני כדי למנוע עיוותים שיכולים להשפיע על זיהוי וכימות של מטבוליטים⁵⁷. תיקון פאזה נחוץ כדי להבטיח שלא פסגות מעוותות או הפוכות לא יוכלו להשפיע על פרשנות התוצאות. החליטו בקפידה על הקריטריונים לבחירת מטבוליטים משמעותיים וסננו את התוצאות בהתאם. מכיוון שאיגוד מספק תוצאות בצורה של ערכי ppm, זהה במדויק את שם המטבוליט באמצעות מקורות שונים המוזכרים בפרוטוקול. אם קיימים מטבוליטים מרובים באותם ערכי ppm, זהה אותם באמצעות צורת שיא.

לפני ביצוע הניתוח הסטטיסטי, הנורמליזציה נעשית כדי להפחית את השונות במערך הנתונים, בין אם מושרה או לא מושרית, בשל הבדלים בגודל ותנודות בריכוזי מטבוליטים. תהליך זה כולל שיטות שונות של מרכוז, קנה מידה וטרנספורמציה, הנבחרות בהתבסס על התפלגות הנתונים והשתנותם. המטרה היא למזער הטיות שיטתיות לא רצויות תוך שמירה על הגורמים הביולוגיים האינטרסנטיים. שיטות מרובות משתנים, כולל PCA, PLS-DA ו- OPLS-DA, משמשות להקמת מטבוליטים דיפרנציאליים עם ערכי VIP גדולים מ- 1. יכולת החיזוי של המודל והתיקוף הצולב נקבעים באמצעות ערכי R2 (התאמה טובה) ו-Q2 (טוב החיזוי), בעוד שסטטיסטיקות של בדיקות פרמוטציה מאמתות את המודל. מפת חום מבוססת מתאם פירסון מעריכה את עמידות המודל על ידי ספירת מטבוליטים מווסתים ומופחתים בתת-פנוטיפים והאנדוטיפים המתקבלים.

שיטות חד-משתניות, כגון מבחן t לתלמיד ו-ANOVA, כמו תיקון בונפרוני או מזעור FDR (שיעור גילוי כוזב) ובנימיני-הוכברג, משמשות להפחתת ההסתברות לתוצאות חיוביות שגויות. שיטות אלה מספקות מדד גס של תכונות חשובות פוטנציאליות ללא תלות בקורלציה שלהן בתוך או בין מולקולות לבין גורמים מבלבלים אחרים. מטבוליטים משמעותיים מזוהים על בסיס ערך p קטן מ-0.05, אשר משמשים לאחר מכן לביסוס אנדוטיפים מטבוליים בתת-קבוצות תוצאה⁴⁵.

חלקות שפם קופסה בודדות ו- AUROC משמשות להערכת הספציפיות והרגישות של האנדוטיפים בתת-קבוצות תוצאה. הציון הקליני משולב עם המודל ב- AUROC כדי לאמת את דיוק המודל. ערך AUC > 0.8 נחשב משמעותי⁴⁶. בדיקות שונות אחרות זמינות באינטרנט כדי לבדוק את דיוק ההבחנה והיעילות של מטבוליטים שזוהו. חלקם הם סיווג יער אקראי, מפת חום, קורלציה, וכו '⁴⁵.

גישות שונות משמשות לכימות מטבוליטים משמעותיים, כולל שילוב שיא, שיכול להיות מאתגר למתחילים בשל אופיים המתקדם. זהה פסגות אופייניות למטבוליטים על ידי התייחסות לשינויים כימיים בודדים לזיהוי מדויק. לקבוע את השטח של פסגות אופייניות אלה ביחס לאזור של שיא הייחוס, TSP. כדי לחשב את הריכוז המוחלט של מטבוליט (Cm), השתמש במשוואה הבאה:

ס"מ = Im.nr.Cr/Ir.nm

כאשר Cr הוא ריכוז תרכובת הייחוס (TSP) בתמיסה, Im ו-Ir הם אזורי השיא המשולבים (ניתן להשיג באמצעות כלי עיבוד וניתוח NMR) של המטבוליט והייחוס (TSP), בהתאמה, ו-nm ו-nr הם מספר הפרוטונים המייצגים את שיאי המטבוליט והייחוס, בהתאמה²⁴.

לחלופין, תוכנה אוטומטית לכימות מטבוליטים NMR משמשת להשגת ריכוזי מטבוליטים עבור ספקטרום יחיד או מרובים בהתבסס על ריכוז תקן הייחוס, TSP. כימות באמצעות תוכנה מפשט את התהליך ומקטין את הסבירות לטעויות בהשוואה לשיטות אחרות. בעוד מאמר מחקר זה מדגיש את השימוש בתוכנה לכימות מטבוליטים, יכולות להיות בעיות אם המטבוליט המעניין אינו קיים בספריית התוכנה. בנוסף, התוכנה בתשלום, כך שרק חוקרים בעלי רישיון מורשה יכולים להשתמש בה.

מטבולומיקה הוכיחה את עצמה כמסייעת בחשיפת המורכבויות של מחלות שונות על ידי זיהוי מחזורים מטבוליים לא מווסתים התורמים לחומרת המחלה. עם זאת, תרגום ממצאים אלה לפרקטיקה קלינית היה מאתגר. הקהילה הרפואית שמה כעת דגש על גישת רפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המחלה. בעוד שזיהוי מטבוליטים לא מווסתים היה מספיק בעבר, המאמצים הנוכחיים מתמקדים בכימות מדויק כדי להגדיר טווחים ספציפיים למחלה. מידע זה הוא רב ערך עבור קלינאים בהתאמה אישית של אסטרטגיות טיפול. ההתקדמות בטכניקות הכימות הקלה על מאמצי המחקר, כאשר קבוצות מחקר רבות ברחבי העולם יישמו בהצלחה גישות אלה באמצעות תוכנות מיוחדות.

התקדמות זו מדגישה את הפוטנציאל של מטבולומיקה להשפיע באופן משמעותי על רפואה מותאמת אישית ולשפר את התוצאות הקליניות. יתר על כן, השילוב של נתוני מטבולומיקה עם נתוני אומיקס אחרים, כגון גנומיקה ופרוטאומיקה, מבטיח לספק הבנה מקיפה יותר של מנגנוני המחלה ולחדד עוד יותר התערבויות טיפוליות. ככל שהטכנולוגיה תמשיך להתפתח, הדיוק והתועלת של מטבולומיקה במסגרות קליניות צפויים לגדול, ולסלול את הדרך לפתרונות בריאות יעילים ומותאמים אישית יותר.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR suite	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., אדמונטון, קנדה		תוכנה לכימות מטבוליט NMR
מכניס קו-אקסיאלי	סיגמא אולדריץ'	Z278513
תחמוצת דאוטרים	סיגמא אולדריץ'	151882
צינורות אפנדורף	Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Research Group		תוכנת ניתוח סטטיסטי מטבולומיקס
צינור NMR	וילמד	Z412007	קוטר 5 מ"מ
מחקר פיפטה	אפנדורף בתוספת	3123000039	0-100 μ l
בקבוקוני איסוף דוגמאות	בקבוקוני קריו צ'יל של Tarsons	523194
נתרן אזיד	סיגמא אולדריץ'	S2002
נתרן כלורי גביש	סיגמא אולדריץ	S9625
נתרן פוספט דו-בסיסי	סיגמא אלדריץ'	567550
נתרן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא אולדריץ'	S0751
Topspin 3.6.4	כלי עיבוד וניתוח NMR	של ברוקר
מלח	סיגמא אולדריץ'	269913