מיקרוביוטה של גני נמלים אטיין: הדמיה של נוף מיקרוביאלי על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

סיכום

אנו מציעים פרוטוקול מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אופטימלי להדמיית דגימות הטרוגניות ועדינות ביותר המכילות ביומסה צמחית ופטרייתית, יחד עם מיקרוביוטה וביופילם. פרוטוקול זה מאפשר לתאר את הממדים המרחביים של ארגון המיקרוביוטה.

תקציר

במערכות אקולוגיות בקנה מידה מאקרו, כגון יערות גשם או שוניות אלמוגים, הלוקליזציה המרחבית של אורגניזמים היא הבסיס להבנתנו את האקולוגיה הקהילתית. גם בעולם המיקרוביאלי, מערכות אקולוגיות מיקרובסקליות רחוקות מלהיות תערובת אקראית והומוגנית של אורגניזמים ובתי גידול. גישה להתפלגות המרחבית של מיקרובים היא בסיסית להבנת התפקוד והאקולוגיה של המיקרוביוטה, שכן מינים החיים יחד נוטים יותר לתקשר ולהשפיע זה על הפיזיולוגיה של זה.

מערכת אקולוגית מיקרוביאלית בין-ממלכותית נמצאת בליבה של מושבות נמלים המגדלות פטריות, המגדלות פטריות בזידיומיצט כמשאב תזונתי. נמלים אטין מחפשות מצעים מגוונים (בעיקר צמחיים), עוברים מטבוליזם על ידי הפטרייה המתורבת תוך יצירת מבנה ספוגי, "גן מיקרוביאלי" הפועל כמעי חיצוני. הגן הוא רשת שזורה של קורים פטרייתיים הגדלים על ידי חילוף חומרים של המצע, פתיחת גומחות להקמת מיקרוביוטה אופיינית ומותאמת. המיקרוביוטה נחשבת כתורמת לפירוק המצע ולצמיחת פטריות, אם כי הארגון המרחבי שלה טרם נקבע.

במאמר זה אנו מתארים כיצד אנו משתמשים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לחקור, בפירוט חסר תקדים, את הארגון המרחבי של המיקרוביוטה והביופילם במערכות שונות של גידול פטריות של נמלים מגדלות פטריות. הדמיית SEM סיפקה תיאור של המבנה המרחבי והארגון של המיקרוביוטה. SEM גילה כי מיקרוביוטה מתאספת בדרך כלל בביופילמים, מבנה נפוץ של נופים מיקרוביאליים בגידול פטריות. אנו מציגים את הפרוטוקולים המשמשים לתיקון, ייבוש, ייבוש, ציפוי מרזב ודימוי קהילה כה מורכבת. פרוטוקולים אלה הותאמו להתמודדות עם דגימות עדינות והטרוגניות, הכוללות ביומסה של צמחים ופטריות, כמו גם המיקרוביוטה והביופילם.

מבוא

מערכות אקולוגיות מורכבות מאורגניזמים המחוברים ביניהם על ידי תהליכים במיקום גיאוגרפי מסוים (כלומר, הסביבה). אורגניזמים מתקשרים עם סביבתם לאורך זמן, ומהם נוצרים דפוסים מרחביים מורכבים והטרוגניים. תבניות מרחביות קובעות את המגוון והיציבות האקולוגיים, ובסופו של דבר, את תפקוד המערכת האקולוגית 1,2,3,4. במערכות אקולוגיות בקנה מידה מאקרו, כגון ביצות, סוואנות, שוניות אלמוגים ומערכות אקולוגיות צחיחות, דפוסים מרחביים מתואמים עם זרימת משאבים וריכוז. התרת אופטימיזציה של משאבים, הטרוגניות מרחבית ודפוסים מביאים למערכות אקולוגיות עמידות יותר מאשר מערכות הומוגניות². הלוקליזציה המרחבית של אורגניזמים העומדת בבסיס האקולוגיה הקהילתית מתורגמת גם לעולם המיקרוביאלי.

מערכות אקולוגיות מיקרוביות, רחוקות מאורגניזמים המעורבבים באופן אקראי והומוגני ברחבי מיקרו-בתי גידול, מציגות תבניות מרחביות המגדירות חלק ניכר מתפקודן ^5,6,7. מעמודות וינוגרדסקי ועד מיקרוביוטה הקשורה לסביבה ולפונדקאי, מערכות אקולוגיות אלה מאורגנות באופן הטרוגני בחלל, עם סידורים מרחביים המעוררים תגובות פנוטיפיות שונות. מינים החיים יחד נוטים יותר לתקשר ולהשפיע זה על הפיזיולוגיה של זה. לפיכך, הארגון המרחבי הקהילתי, יותר מהרכבו כשלעצמו, תוחם תכונות מערכת אקולוגית ונישות אקולוגיות ^5,7,8. להמחשת מושגים אלה, שינויים בדפוסים מרחביים נראים מתואמים עם התקדמות פתולוגית של פלאקים דנטליים, עששת, מחלות חניכיים ^9,10, מחלות מעי דלקתיות¹¹, דלקות ריאה של סיסטיק פיברוזיס, זיהומים כרוניים בפצעים^12,13, סרטן המעי הגס והחלחולת ואדנומות¹⁴.

תחת ההיקף של ביוגאוגרפיה מיקרוביאלית (חקר התפלגות המגוון הביולוגי ודפוסים על פני מרחב וזמן בקנה מידה מיקרוביאלי), הידע של מערכות אקולוגיות מיקרוביאליות מועיל במידה רבה על ידי הבנת הדפוסים המרחביים שלהם 6,13,15,16,17. בחנו דפוסים מרחביים של מערכת אקולוגית מיקרוביאלית הבנויה על ידי חרקים, הנמצאת בליבה של נמלת אטין כריזמטית המגדלת פטריות (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). שם שוכן "גן מיקרוביאלי", שבמרכזו פטריית בזידיומיצט בשבט Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) או במשפחה Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. הגן הוא מבנה ספוגי הבוקע מרשת שזורה של קורים שגדלה על-ידי חילוף חומרים של המצע הצמחי ברובו ששולבו על-ידי הנמלים (איור 1). אלה עשויים לכלול, על פי סוג האטין: חלקי צמחים יבשים, פרשים ופגרים של חרקים, עלים טריים, זרעים וחלקי פרחים^23,24. בדומה למעי אוכל-עשב חיצוני, הגינה ממירה באופן אנזימטי וכימי פולימרים סרבנים למשאבים תזונתיים חיוניים, ומספקת לנמלים חומצות אמינו חיוניות, שומנים וסוכרים מסיסים 21,25,26,27,28.

ניתוחים אולטרה-מבניים, אנזימטיים ושעתוק שבוצעו עבור גנים מהסוגים Atta ו-Acromyrmex החותכים עלים מצביעים על כך שסביבות אלה מבנות רצף של התפרקות המצע וטלאים תזונתיים 26,29,30,31,32. חלקים צעירים של הגן נוטים להיות כהים יותר בשל מצע טרי ששולב לאחר שפוצל. מצעים אלה שנוספו לאחרונה מאוכלסים לעתים קרובות מהקצוות, שנחתכו על ידי עובדי נמלים וחוסנו בגושי תפטיר. קורים פטרייתיים, המוקרנים מקצוות חתוכים, מתפשטים על המצע 29,32,33. השפע ההיפאלי עולה ככל שהשפלת המצע מתקדמת, וכתוצאה מכך אזורים לבנבנים ופעילים מטבולית 30,31,32. אזורים ישנים יותר, עם מצע מפורק יותר ומיקרוביוטה שופעת^29,32, נוטים להציג גוונים חומים ולחות גבוהה יותר. העובדים מסירים שברים מאזור זה, ומפרידים אותם בערימות פסולת, שם הם גם לוקחים מצעים הפוגעים בסימביונט הפטרייתי 34,35,36. ערימות פסולת, למרות שהן מנותקות פיזית מהגינה, הן נקודה של התפרקות מתמשכת של המצע ומחזור חומרי מזון על ידי המיקרוביוטה השופעת של התושבים 29,32,37,38,39.

מיקרוביוטה המורכבת בעיקר מאנטרובקטר, קלבסיאלה, פנטואה, פסאודומונאס וסרטיה, מאכלסת גם היא את הגן, ככל הנראה משותפת למערכות פטריות אטיניות מגוונות. קידוד מסלולים מטבוליים שיכולים להשלים מטבוליזם פטרייתי, המיקרוביוטה עשויה להשתתף בתגובות הפיזיולוגיות של הגן 40,41,42,43,44^. לא רק שנתונים מטאגנומיים הצביעו על כך שהמיקרוביוטה הייתה שם^41,42, אלא גם ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של פטריות נמלים חותכות עלים הראה בעיקר חיידקים בצורת מוט מעל מצע צמח³². אף על פי שחיידקים (כולל זנים צלולוליטיים) בודדו מכל הגן, הם הודגמו רק בחלקים ישנים יותר של הגן ובערימות פסולת, כמו גם בגלולה הראשונית שנישאה על ידי מלכות המייסדים^29,32. כמו כן, לא היה בטוח אם המיקרוביוטה יכולה ליצור ביופילמים in vivo (כלומר, בגינה ובפסולת), כפי שהוצע על ידי היכולת המטבולית שלהם⁴² ונצפה במבחנה⁴⁴.

כאן, השתמשנו ב- SEM כדי להבין עוד יותר את הארגון המרחבי של המיקרוביוטה ברחבי אזורי הגנים, תוך פירוט אינטראקציות פיזיות של מיקרוביוטה-מצע ומיקרוביוטה-קורים. על ידי מתן תמונות עם עומק מוקד גדול יותר, SEM מאפשר תצפיות של מבנים מיקרוסקופיים תלת ממדיים ברזולוציה גבוהה, המאפשר ניתוח מעמיק של דפוסי המיקרוביוטה המרחבית של הגן. אנו מפרטים שלבים לתיקון, ייבוש, ייבוש, התזה של הפרווה ותמונה של דגימות הטרוגניות ועדינות כאלה המבוססות על פטריות. על ידי הסרת שלב הפוסט-קיבוע באמצעות אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄) והפחתת זמן ההתייבשות, פישטנו את הפרוטוקולים 32,33,45 להכנת דגימות גינה ופסולת לניתוח SEM. פרוטוקול מותאם זה משמר דפוסים מבניים היפאליים, כמו גם את הארגון המרחבי של המיקרוביוטה והביופילם, וניתן ליישם אותו במערכות אקולוגיות מיקרוביאליות עדינות אחרות ובביופילמים.

איור 1: גנים מיקרוביאליים של אטין. הגן הוא מבנה דמוי ספוג הנובע מרשת שזורה של קורים הגדלה על ידי חילוף חומרים של המצע הצמחי ברובו המשולב על ידי הנמלים. בגן שוכנת גם המיקרוביוטה, המקודדת מסלולים מטבוליים שיכולים להשלים את חילוף החומרים הפטרייתי. נתונים מטאגנומיים וניתוחים קודמים של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק הצביעו על נוכחותו, אם כי היה לנו ידע מועט על הארגון המרחבי שלו ועל האינטראקציות הפיזיות שלו עם המצע וקורי הפטרייה. השתמשנו ב-SEM כדי לחשוף את הארגון המרחבי והתבניות של המיקרוביוטה והביופילם. איורים מאת מריאנה ברקוטו (גינה ומיקרוביוטה שאומצו מברקוטו ורודריגז ⁹⁴), ותצלומים מאת מריאנה ברקוטו ואנצו סורנטינו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

1. דיגום מושבות שדה

הערה: בעת איסוף מושבות נמלים, יש לוודא כי כל ההרשאות הנדרשות על פי החקיקה המקומית מתקבלות לפני האיסוף. במקרה שלנו, היתר האיסוף #74585 הונפק על ידי Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio). כאשר הדגימות מגיעות ממושבת מעבדה, עבור לסעיף 2.

1. איתור וסימון המושבה. חפרו תעלה המקיפה את אזור הקן עד לחשיפת חדר הגן (איור 2A).
   הערה: חלק ממיני האטין עשויים לבנות את מושבותיהם מתחת לפסולת העלים או בתוך בולי עץ רקובים. במקרים כאלה, בזהירות לסובב את המלטה או בזהירות לשבור את יומני לאיסוף הדגימות. למידע מפורט על איתור, איסוף ותחזוקה של מושבות חיות של מיני נמלים אטיניים מגוונים, ראו Sosa-Calvo et ^al.46.
2. פתחו את תא הגינה לרוחב כדי למנוע מהאדמה ליפול על משטח הגינה. אספו בזהירות דגימות גינה באמצעות מלקחיים אנטומולוגיים, כף או רחפן מטבח, בהתאם לגודל הגינה.
   הערה: הקפד לעקר את הכלים לפני האיסוף. בעת איסוף גינות נמלים חותכות עלים, יש ללבוש כפפות בד עבות כדי למנוע (או לפחות להחליש) עקיצות עובדים. עבור מינים אחרים של אטין כפפות בד הן אופציונליות.
3. מעבירים את דגימות הגינה לנמען פלסטיק נקי המכיל שכבת טיח לאיזון לחות הגינה. לאחר העברת עובדי הגינה והנמלים, סגרו הרמטית את הנמען כדי למנוע ייבוש דגימה. אחסנו דגימות גינה בטמפרטורה של 23-25 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
4. סגור את התעלה עם אדמה שהוסרה בעבר.

איור 2: פרוטוקול הכנת מדגם. (א) דגימה של מושבות שדה. (B) עיבוד דגימה. (ג) יסודות קצרים וזרימת עבודה להכנת הדגימה: 1. קיבוע: לחיזוק ושימור מבנה המדגם. 2. התייבשות: תכולת המים של הדגימות מוחלפת באתנול. 3. ייבוש נקודה קריטית: CO₂ נוזלי מחליף אתנול ומתאדה. 4. הרכבה: המדגם מוצג לניתוח. 5. ציפוי מרזב בזהב: למנוע טעינת דגימה. 6. הדמיה. איורים וצילומים מאת מריאנה ברקוטו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ריאגנטים

הערה: זכור כי יש להכין מראש את הפתרונות הבאים.

1. הכינו מאגר נתרן קקודילט 0.2 מ'. לשם כך, להמיס 42.8 גרם של נתרן cacodylate ב 800 מ"ל של מים מזוקקים, תוך ערבוב עד המסה וייצוב pH ב 7.2 (אם נדרש, להתאים pH באמצעות חומצה הידרוכלורית). לפצות את נפח התמיסה ל 1 L על ידי הוספת מים מזוקקים. אחסן את התמיסה ב 4 ° C (למשך ~ חודש אחד).
   אזהרה: גלוטראלדהיד ופרפורמאלדהיד רעילים ויש לטפל בהם בתוך מכסה אדים. ללבוש כפפות ניטריל משקפי מגן כל הזמן בעת טיפול ריאגנטים כאלה.
2. הכינו את הקיבוע של קרנובסקי (שונה מקרנובסקי)⁴⁷. לשם כך, להוסיף 10 מ"ל של 25% תמיסה מימית גלוטראלדהיד ו 10 מ"ל של 20% תמיסה מימית paraformaldehyde ל 25 מ"ל של 0.2 M נתרן cacodylate חיץ ולערבב. הוסף 1 מ"ל של 0.1 M סידן כלורי (CaCl₂) והשלם את הנפח ל 100 מ"ל על ידי הוספת מים מזוקקים. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C (עד חודש אחד).
   אזהרה: הקיבוע של קרנובסקי מזיק בשאיפה ועלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. לכן, הימנע נשימה אדים, באמצעות רק בחוץ או באזור מאוורר היטב. יש ללבוש כפפות ניטריל ומשקפי מגן כל הזמן בעת הטיפול בתמיסה.
3. באמצעות אתנול מוחלט (כיתה אנליטית), להכין 30%, 50%, 70%, ו 90% אתנול תמיסות במים מזוקקים; 100% אתנול נדרש גם.

3. קיבוע לדוגמה

הערה: מקבעים מקשיחים ומשמרים דגימות, תוך שמירה על תכונות מורפולוגיות. אלדהידים (כגון פרפורמאלדהיד וגלוטראלדהיד) הם מקבעים לא קרישה מסוג קישור צולב, הגורמים לקשרים צולבים בתוך ובין חלבונים וחומצות גרעין⁴⁸.

1. הוציאו פועלים, ביצים, גלמים וזחלים מדגימות הגינה באמצעות מלקחיים אנטומולוגיים (איור 2B). יש להפריד בין שברי גינה שגודלם אינו עולה על 5 מ"מ³. הוסיפו את השברים לצינור בנפח 2 מ"ל (איור 2C).
2. לצינורות המכילים את הדגימות, השתמש פיפטה זכוכית פסטר כדי להוסיף ~ 1 מ"ל של פתרון קיבוע Karnovsky (ודא שהדגימה מכוסה לחלוטין). ערבבו על-ידי תסיסה עדינה כדי לעזור לדגימה להשרות ולדגור בטמפרטורה של 4°C במשך 24 שעות לפחות לפני המשך עיבוד הדגימה (איור 2C.1).
   הערה: כאשר שלבי ההתייבשות הבאים לא יבוצעו מיד לאחר הקיבוע, הפרוטוקול עשוי להיות מושהה בשלב זה, ודגימות עשויות להיות מאוחסנות במשך ~1 שנה ב 4 ° C.
   אנו ממליצים להשתמש בפיפטה מזכוכית פסטר, מכיוון שהיא מורכבת מחומר אינרטי וקל יותר לנקות אותה לשימוש חוזר לאחר מכן. חומר הגינה הוא הידרופובי מאוד, נוטה לצוף על פני השטח של התמיסה המקבעת. זה בדרך כלל לוקח עד 5 דקות כדי להיות ספוג לחלוטין fixative. יש לוודא שהקיבוע מכסה את שברי הגינה מכיוון שנפחו נוטה להצטמצם ככל שהוא נכנס לנקבוביות הדגימה. וידאנו אמפירית שלאחר שהדגימה הושרה ונרטבה, מרכיביה (בפרט, התפטיר הפטרייתי העדין) הפכו רגישים להתנפצות כאשר ערבבו אותה עוד יותר. לכן, אנו ממליצים להימנע ככל האפשר מטלטול הדגימות.

4. התייבשות מדגם

הערה: סדרת שטיפת האתנול מחליפה בהדרגה את המים בדגימות לאתנול. חשוב להתחיל עם תמיסת אתנול בריכוז נמוך (ראה להלן) כדי למנוע נזק מוגזם או קריסה של דגימות עדינות כאלה⁴⁹.

1. הסירו לחלוטין את הפתרון המקבע של קרנובסקי באמצעות פיפטה מזכוכית, תוך זהירות שלא לשבש את הדגימה (איור 2C.1).
   הערה: יש להשליך את הקיבוע של קרנובסקי במושתל המסומן כראוי לטיפול בשאריות כימיות רעילות.
2. מיד לאחר הסרת הקיבוע, הוסיפו 1 מ"ל של אתנול 30%, נזהרו לא לשבש את הדגימה, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2C.2).
   הערה: דוגמאות צריכות תמיד להיות ספוגות בתמיסה. הקפידו להחליף במהירות תמיסות במהלך סדרת השטיפה ההדרגתית של אתנול. כאשר הגן מאבד את ההיבט הנקבובי שלו ומצטבר בתחתית הצינור, 1 מ"ל אתנול נוטה להספיק כדי לכסות את הדגימה (כאשר הדגימה אינה גדולה מ -5 מ"מ³). עם זאת, אם הדגימות אינן מכוסות לחלוטין, להוסיף אתנול עד הדגימה מכוסה לחלוטין.
3. לחלוטין להסיר 30% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 30% אתנול כראוי.
   הערה: עבור כל סדרת השטיפה ההדרגתית של אתנול, יש להשליך אתנול לנמען שסומן כראוי לטיפול בשאריות כימיות רעילות.
4. מוסיפים 1 מ"ל אתנול 50% ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחלוטין להסיר 50% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 50% אתנול כראוי.
5. מוסיפים 1 מ"ל של 70% אתנול ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחלוטין להסיר 70% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 70% אתנול כראוי.
   הערה: בשלב שטיפת אתנול 70%, המשתמש רשאי להשהות את הפרוטוקול במידת הצורך, מכיוון שצינורות דגימה עשויים להיות מאוחסנים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס, כאשר החומר לא יעובד באופן מיידי.
6. מוסיפים 1 מ"ל של 90% אתנול ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר לחלוטין 90% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 90% אתנול כראוי.
7. מוסיפים 1 מ"ל של 100% אתנול ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחלוטין להסיר 100% אתנול עם פיפטה זכוכית, נזהר לא לשבש את המדגם. יש להשליך 100% אתנול כראוי.
8. בעזרת מלקחיים ו/או מרית, העבירו בזהירות את הדגימות למיכלי הדגימה של מייבש הנקודות הקריטיות (CPD), המכילים תוויות זיהוי דגימה (שיוצרו בעבר בנייר ועיפרון). כדי למנוע ייבוש דגימות, העברה זו מתבצעת עם המיכל ממוקם בצלחת פטרי מכוסה 100% אתנול.
9. הניחו את המכסים על המיכלים וטבלו אותם בכוס זכוכית מדורגת המכילה 100% אתנול מספיק כדי לטבול את המיכלים. מכסים את הזכוכית ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר; ואז כראוי להשליך 100% אתנול.
10. העבירו את מיכלי הדגימה לכוס זכוכית מדורגת אחרת המכילה מספיק אתנול 100% כדי לטבול את המיכלים. מכסים את הזכוכית ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר מכן, העבירו את מיכלי הדגימה למייבש הכביסה Critical Point.
    הערה: לאחר סדרת הכביסה, פיפטות זכוכית וכוסות יש לשטוף בשפע במים מזוקקים, ואת שאריות המים האלה יש להשליך במקבל המסומן כראוי לטיפול בשאריות כימיות רעילות. לאחר השטיפה, ניתן לשטוף פריטי זכוכית בחומר ניקוי ניטרלי, לשטוף במי ברז ולייבש באוויר.

5. ייבוש נקודה קריטית

הערה: מייבש כביסה Critical Point מחליף את האתנול בדגימות בפחמן דו-חמצני נוזלי (_CO2), שמתאדה מהדגימה בטמפרטורה ולחץ גבוהים יותר. פעל בהתאם להוראות היצרן עבור הליכים אלה.

1. הפעל את הציוד.
2. פתחו את התא, הניחו את מיכלי הדגימה בתוכו והוסיפו 100% אתנול עד שהוא מכסה את המיכלים. סגור את החדר.
3. הפעל את האפשרות קירור והמתן עד שהטמפרטורה תגיע ל -10 מעלות צלזיוס.
4. פתח את שסתום צילינדר CO₂ והפעל את האפשרות Stirrer .
5. הפעל את CO₂ באפשרות , תמיד לבדוק את התא כדי לוודא כמה CO₂ כבר מילא אותו. כאשר התא כמעט מלא, בטל את האפשרות CO₂ ב והפעל את אפשרות Exchange , תוך שמירה על הפעלתו עד שיהיה מספיק CO₂ רק כדי לכסות את המיכלים. ודא שהמכולות מכוסות תמיד ב- CO₂ (כלומר, בטל את אפשרות Exchange לפני שכל CO₂ עזב את התא). חזור על שלב 5.5 6x.
6. הפעל CO₂ בפעם האחרונה ומלא את התא עד שהמכלים מכוסים.
7. הפעילו את האפשרות 'חימום' ובטלו את האפשרות 'בוחש'. סגור את שסתום צילינדר CO₂.
8. המתן עד שהטמפרטורה תעלה ל 35 °C (75 °F); לאחר מכן, הפעל את האפשרות יציאת גז .
   הערה: בסביבות 30 מעלות צלזיוס, התא מגיע ללחצים של 70-80 בר, ומשיג את הנקודה הקריטית, שבה הנוזל נעלם.
9. כאשר לחץ התא מגיע לבר אחד, כל תכולת הגז הוסרה. פתח את התא והסר את המיכלים.
10. כבה את הציוד.

6. הרכבה

1. הכינו מחזיקי דגימות SEM (כלומר, גבעולי אלומיניום; איור 2ג.4).
   1. עטפו את הגבעולים בחתיכת רדיד אלומיניום, המכסה רק את החלק העליון, כדי להקל על ניקוי הגבעולים לאחר הניתוח.
   2. זהה את הספסלים על ידי כתיבת קוד / מספר לדוגמה בתחתית המחזיק, הבטחת זיהוי של מה ממוקם על גבי.
   3. מכסים את החלק העליון בסרט פחמן דו-צדדי. הניחו את הגבעולים במחזיק דגימה.
2. פתחו את מכסה מיכל הדגימה, והעבירו בזהירות את הדגימה המיובשת לצלחת פטרי מזכוכית באמצעות מלקחיים ומרית.
   הערה: גינות קריטיות מיובשות בנקודה נוטות להצטבר וליצור דגימות צפופות מאוד שיש להפריד בזהירות כשברים בגודל שאינו עולה על 1 מ"מ³.
3. מניחים בזהירות שברים על המשטח הדביק של הספח המכוסה בסרט. ברגע שקטע הגינה נוגע בקלטת, קשה מאוד להזיז אותו (מחדש), לכן היזהרו לא למקם אותו במקומות או בתנוחות לא רצויות. הוסיפו עד תשעה שברים לכל גיבוב.
4. חזור על שלבים 6.2 ו- 6.3 עבור כל דגימה.

7. ציפוי מרזב בזהב

הערה: ציפוי הדגימה נדרש כדי למנוע את טעינתה. עקוב אחר הוראות היצרן להתאמת הגדרות כגון לחץ גז הפעולה (0.5 × 10-1 מ"מ כספית של לחץ גז בפרוטוקול זה), זמן הגמגום (220 שניות), עובי שכבת הזהב (~ 120 Å), הזרם (50 mA) ואספקת המתח. גמגום נוטה לעקוב אחר זרימת עבודה משותפת, אם כי הציוד של יצרנים שונים עשוי לפעול מעט אחרת.

1. פתחו את זרוע המטרה בעלת הצירים והניחו את הגבעולים על שולחן הדגימות.
2. סגרו את זרוע המטרה בעלת הצירים ובדקו אם מגן הרסיסים של תא ואקום הזכוכית מוטבע כראוי.
3. פתח את שסתום צילינדר הארגון והפעל את מתג ההפעלה הראשי.
4. עקוב אחר הוואקום העולה בתצוגת הציוד עד שהוא מגיע לסימן 0.5 × ^10-1 מ"מ כספית בתצוגה; לאחר מכן, הפעל את שטיפה. חזור על הפעולה 5x.
5. הפעל את מערכת זרימת המים, הפעל את האפשרות HV On ופתח את מכסה סרט הזהב. אשר כי צבע הפלזמה הוא ורדרד. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, הגדר 220 שניות של התזה עם מתח של 50 mA, אשר יפקיד שכבת זהב של ~ 120 Å (12 ננומטר).
6. HV מופעל כבוי באופן אוטומטי. כבה את מערכת זרימת המים וסגור את מכסה סרט הזהב.
7. כבה את מתג ההפעלה הראשי, ואפשר לאוויר להיכנס לתא הוואקום. עבור דגימות גינה ואשפה, חזור על שלבים 7.1-7.7 3x.
   הערה: אם ההדמיה לא תתרחש מיד לאחר הכנת הדגימה, אחסנו את הגבעולים במיכל הרמטי מלא בשכבת סיליקה כדי למנוע התייבשות של הדגימות.

8. הדמיה

הערה: בצע את הוראות היצרן לכוונון הגדרות SEM, כגון קוטר צמצם אובייקטיבי, מתח הפעלה, יישור מערכת קרן האלקטרונים, יישור צירית וסטיגמטורים.

1. הניחו את הספסלים במחזיק הדגימה, ורשמו הערות על מיקום כל דגימה.
   הערה: יש ללבוש כפפות בעת הכנסה או הסרה של מחזיק הדגימה, ולשמור על המחזיק נקי ככל האפשר.
2. הפעל את תוכנת הפעולה משולחן העבודה.
3. בחר את הגדרות המכשיר. דמיינו דגימות גינה בקוטר צמצם אובייקטיבי של 30 מיקרומטר (כלומר, בשלב השני), הפועלות בוואקום גבוה, איתור אותות מאלקטרונים משניים (SED), מתח תאוצה של 20 קילו וולט, מרחק עבודה של 15 - 20 מ"מ, זרם בדיקה של 40.0 (במצב זרם גבוה), ושינוי ההגדלה בהתאם לדגימה.
4. בהתאם להוראות הניווט, לחץ על סמל פתח האוורור והמתן לאוורור תא הדגימה. מד התקדמות מציין את מצב הוואקום.
5. כאשר הגיע ללחץ אטמוספרי, פתח את תא הדגימה והכנס בזהירות את מחזיק הדגימה.
6. סגור בעדינות את דלת התא ולחץ על סמל Evac כדי לפנות את המכשיר, בהתאם למצב הוואקום דרך סרגל ההתקדמות. מערכת הניווט תציג את מיקום השלב הנע ותספק גרף מחזיק בעת השלמת המעבר. לחץ על סמל המצלמה כדי להקליט תמונה של המחזיק כדי לקבל תצוגה עליונה שתסייע לנווט בין דגימות בזמן ההדמיה.
7. לחץ על סמל התצפית כדי להפעיל את אקדח האלקטרונים והמתן עד להיווצרות התמונה. השתמש בממשק המשתמש הידני (בקרה ידנית) כדי להזיז ידנית את ציר Z לגובה המתאים (בהתבסס על גובה הדגימה ומרחק העבודה שנקבע).
   הערה: להארכת חיי חוט הטונגסטן, השהה את פונקציית התצפית בכל פעם שאינה מבצעת הדמיה פעילה.
8. השתמש באפשרויות המוצגות על המסך או בפקד הידני כדי לשנות את קצב הרסטר ואת מיקום התמונה. הזז את הבמה כדי לקבל תצוגה מעמיקה של הדגימה, תוך שימוש בפונקציה RDC כדי להתמקד באזורים ספציפיים. כאשר מתבוננים במבנה מטרה (או מבנה מעניין), התאימו את ההגדלה, המיקוד, הבהירות, הניגודיות והסטיגמה בהתאם. תקן סטיגמה באמצעות ממשק המשתמש הידני כדי להזיז את הבמה לכיווני X ו- Y.
   1. התאם את ההגדלה בין 100x ל- 700x כדי להמחיש היבטים כלליים של הגן (כגון צפיפות hyphal, מצע ודפוסי התיישבות).
   2. התאימו את ההגדלה בין 700x ל-1,500x כדי להמחיש את הדפוסים המרחביים של המיקרוביוטה.
   3. התאימו את ההגדלה בין 1,500x ל-3,000x כדי לצפות באינטראקציות הפיזיות של המיקרוביוטה והביופילם.
   4. התאימו את ההגדלה בין 3,000x ל-4,000x כדי להתמקד בצבירי חיידקים ספציפיים.
9. כדי לשמור תמונה, השתמש בפונקציה Freeze , לחץ על סמל התמונה והגדר את נתיב הקובץ. כסטנדרט, נתח לפחות שלושה שברי גן, הדמיה כל אחד בכל טווחי ההגדלה המוזכרים בשלב 8.8. התוצאה היא לפחות 12 תמונות לדגימה, אם כי תמונות רבות יותר עשויות לתמוך בתיאורים מפורטים יותר. אנו מציעים כי 15-25 תמונות לדגימה, הנעות בין כל ההגדלות בשלב 8.8 נוטות לספק פרטים עדינים לתיאור המדגם.
   הערה: הוספת רסטר ושמירה של תמונה אורכת מספר שניות שבמהלכן יש להימנע מכל רטט בשולחן הצף של SEM.
10. לאחר סיום ההדמיה, לחץ על האפשרות פתח אוורור כדי לאוורר את התא, בהתאם למצב הוואקום דרך מד ההתקדמות. הסר בזהירות את המחזיק, סגור בעדינות את דלת התא ולחץ על Evac כדי לפנות את החדר.
11. מיד עם השלמת הפינוי, צא מתוכנת ההפעלה.
12. התאם את הבהירות והניגודיות כדי לשפר את התצוגה החזותית באמצעות עורך תמונות.

תוצאות

כאן, הצגנו פרוטוקול פשוט כדי להמחיש את המרכיבים של דגימות גינת אטין ופסולת, כגון קורים פטרייתיים, מצע, מיקרוביוטה וביופילמים. SEM שיפר את ההבנה שלנו לגבי האופן שבו הגינה והפסולת מפיגמים את התבניות המבניות של המיקרוביוטה (איור 3). בגינות אטיניות, קורים פטרייתיים הם מבנים דמויי ענפים המכסים חלקים משטח המצע. מאז hyphae פטרייתי נוטים להיות רגישים מאוד להתייבשות וקרע, המשתמש עשוי להיות מונחה על ידי היבט hyphae כדי להעריך את התוצאות של הכנת דגימה. כפי שנצפה גם בעבודות קודמות 32,33,45, hyphae להציג היבט צינורי; קורים שלמים בצורת צינור מצביעים על הכנת דגימה יעילה (איור 3A ואיור 4C). כאשר קורים הם בצורת סרט, שיטוח כזה הוא אולי תוצר של הטכניקה (איור 4C).

ניתן לזהות את משטחי מצע הצמח על ידי שכבות הקוטיקולה והאפידרמיס, כמו גם פיוניות וטריכומות. מבנים כאלה ניתנים לזיהוי יותר כאשר מצעים עדיין לא מאוכלסים על-ידי קורי הפטרייה והמיקרוביוטה (איור 3A ואיור 4C). כאשר המצע מאוכלס, המיקרוביוטה ו/או קורי הפטרייה מכסים את פני השטח שלו כך שלא ניתן להבחין בקלות במבנים מסוימים של צמחים (איור 3A). המיקרוביוטה עשויה ליישב את קורי הפטרייה או את המצע, כל אחד מהם בארגון מרחבי מובחן לכאורה. באיור 3, תבניות מרחביות כאלה הודגמו באופן סכמטי ונארזו בתמונות SEM בהתאמה שבהן הן זוהו; זה עשוי להקל על הקשר בין תוצאות SEM לבין הפרשנות שלהם.

מיקרוביוטה המתיישבת בהיפאל נפוצה פחות, וכאשר היא נמצאת, היא מורכבת מתאי מוט או קוקואיד המבודדים או בקבוצות קטנות המחוברות לפני השטח של ההיפל. ניתן לראות מטריצה אקסופוליסכרידית ביופילם (EPS), שנראית כמו מבנה של "בד תחרה", סביב קורים בגושים קטנים (איור 3A). נפוצה יותר היא המיקרוביוטה המיישבת את המצע, המצויה בגינות של מיני נמלים אטיניות שונות. נראה כי דפוסי ההתיישבות מוגדרים במידה מסוימת על ידי שלבי הידרדרות המצע. לכן, בעת התיישבות מצעים שעדיין לא התפרקו, המיקרוביוטה עשויה להופיע כתאים בודדים או להתאסף בקבוצות קטנות. המיקרוביוטה עשויה לשכב את המצע כאשר היא מציגה סימנים מיקרוסקופיים של בליה (כלומר, כאשר לא ניתן להבחין בשכבות עור/אפידרמיס של צמחים ובמבנים צמחיים אחרים, ויש תלמים ושקעים בשפע).

ב"מחצלות מיקרוביאליות" אלה, המורפולוגיה של התאים ניתנת לזיהוי טוב יותר כאשר מטריצת EPS נעדרת. במקרים שבהם תאים מיקרוביאליים מוטמעים במטריצת EPS, המורפולוגיה שלהם אינה ניתנת להבחנה בקלות. על פי הארגון המרחבי שלהם, אפיינו את הביופילמים כ"מתפשטים" או כ"תלת-ממדיים". כאשר הביופילם מתפשט, תאים מיקרוביאליים ומטריצת EPS מכסים לסירוגין את פני המצע, ויוצרים שכבה שטוחה בעובי 1-3 תאים (איור 3B). כאשר הביופילם הוא תלת-ממדי, תאים מיקרוביאליים ומטריצת EPS נערמים ויוצרים אשכולות בעובי של כמה תאים. אזורי גן שמורכבים ממצעים שהתדרדרו (כמו למשל גינה ישנה ופסולת) מחסים על המיקרוביוטה בתלמים ובשקעים שלה, שם הם יוצרים קהילות עבות (איור 3C). בפרט, המצעים המפורקים באופן נרחב בדגימות פסולת מאכלסים מיקרוביוטה שופעת, המגוונת ביותר מבחינה מורפולוגית מבין כל האזורים. שמרים מוסיפים מורכבות רבה יותר לקהילה זו, באינטראקציה פיזית עם הפרוקריוטים באמצעות ביופילם. בדגימות פסולת של Atta sexdens ו-Acromyrmex sp., מטריצות EPS נצפו יוצרות רשת פיברילרית בולטת סביב פרוקריוטים בצורת מוט וקוקואיד, כמו גם שמרים פיוזיפורם וכדוריים (איור 3C).

כתוצאה מרשת שזורה של קורים, המבנה הספוגי של הגן דורש גמגום נוסף כדי לצפות את הדגימה בצורה אחידה יותר. צעדים כאלה נמנעים מפיזור אלקטרונים שמעוות את התמונה ופוגע ברזולוציה שלה (איור 4A). שלבי הכנת הדגימות שימרו את רוב מבנה הגן, וחשפו את הפיזור המרחבי והארגון של המיקרוביוטה. ראוי לחזור ולהדגיש, עם זאת, כי מבנים כגון hyphae פטרייתי ומטריצת EPS רגישים מאוד להתייבשות וקשה מאוד לשמר, במיוחד עבור SEM. המבנה ההיפאלי השתמר טוב יחסית, אך סביר להניח שהביופילם שהודגם בכמה דגימות גינה יכול היה להיות חסר כמה מרכיבים מבניים של מטריצת EPS. אף על פי שהשכבה החיצונית החלקה ביותר של רב-סוכרים התוחמת את המיקרוביוטה נשמרה בחלק מהדגימות (איור 3A, B), לחלקן היו תכונות מורפולוגיות של מיקרוביוטה, אולם לא הייתה להן מטריצת EPS. עם זאת, לא ברור אם מטריצת EPS אכן נעדרה או שהיא הוסרה במהלך הכנת הדגימה.

מצד אחד, הסרת השכבה החלקה של הביופילם פוגעת בהבנת מבנה הביופילם המדויק. מצד שני, הוא חושף את המורפולוגיה, הארגון המרחבי והאינטראקציות הפיזיות של תאים השוכנים מתחת לשכבה, שהיא מוקד המחקר העיקרי שלנו. מחקרים קודמים דיווחו על שימור הן של קורים פטרייתיים והן של מטריצת הביופילם על ידי שימוש באדי אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄) כקיבוע העיקרי 44,50,51,52,53,54. לאחר מכן, ערכנו ניסוי השוואתי שבו קיבענו דגימות גינה טריות עם אדי OsO₄, שככל הנראה שימרו את ההיבט החלק של ביופילמים (איור 4B). שיטה זו, לעומת זאת, גרמה להשטחה נרחבת של קורים ומיקרוביוטה. שיטוח זה הביא לאובדן היבטים מרחביים כלליים של הגן שתוארו קודם לכן 29,33,32,45, ובכך הגביל מחקרים נוספים על דפוסי מבנה הגן. התיקון עם OsO₄ הקשה הן על ההבחנה בין המורפולוגיה והתפוצה המיקרוביאלית והן על ההבחנה בין מבני תאים לבין ממצאים טכניים, ובכך סיבך את פירוש הנתונים.

איור 3: תבניות ארכיטקטוניות של מיקרוביוטה. המיקרוביוטה מאכלסת את קורי הפטרייה ואת המצע בארגון מרחבי מובהק. תבניות מרחביות כאלה הודגמו באופן סכמטי והוצמדו לתמונות SEM בהתאמה שבהן הן זוהו (מופרדות באיור על ידי ריבועים לבנים): (A) מיקרוביוטה המתיישבת בהיפאל מורכבת מקבוצות תאים מבודדות או קטנות, עם מטריצה אקסופוליסכרידית של ביופילם הניתנת לזיהוי בחלק מהדגימות. (B) מיקרוביוטה המתיישבת במצע מתפשטת בכל המצע, כאשר מטריצת EPS מכסה את התאים כך שלא ניתן להבחין בקלות במורפולוגיה שלהם. (C) מיקרוביוטה מיישבת מצע היוצרת קבוצות תלת-ממדיות, המהוות ביופילמים מונו-מורפולוגיים או רב-מורפולוגיים, במקרים מסוימים המהווים את מטריצת EPS. איורים מאת מריאנה ברקוטו. קיצור: EPS = מטריצה אקסופוליסכרידית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיה עקרה. תמונות באיכות נמוכה יוצרות תוצאות לא יעילות ו/או פוגעות בפרשנות של תבניות אדריכליות. (A) פיזור אלקטרונים מעוות את התמונה ופוגע ברזולוציה שלה וכתוצאה מכך בזיהוי מורפולוגי. זה נצפה לעתים קרובות בדגימות שצופו רק פעם אחת והופחת על ידי ציפוי נוסף. (B) קיבוע דגימות גינה טריות עם אדי אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄) כקיבוע ראשוני 44,50,51,52,53,54 שימר ככל הנראה את ההיבט החלק של ביופילמים. עם זאת, הוא גרם להשטחת קורים ומיקרוביוטה נרחבת, ופגע בדפוסים אדריכליים של גנים. (C) הכנת הדגימה באמצעות הקיבוע של קרנובסקי הניבה תמונות באיכות גבוהה יותר בהשוואה להכנות באמצעות OsO₄, תוך שמירה על רוב המבנה ההיפאלי, פיזור המיקרוביוטה והדפוסים המרחביים של הגנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

SEM משתמש בקרן אלקטרונים כדי לסרוק את הדגימה, ויוצר תמונה מוגדלת שלה כך שניתן לדמיין מיקרו-מבנים תלת מימדיים ברזולוציה גבוהה. מכיוון ש- SEM פועל תחת ואקום גבוה, נדרשת הסרה של עד / יותר מ -99% מהמים מהדגימות. בתוך תא ואקום SEM, דגימות לחות חלקית עלולות להתייבש ולקרוס, מלבד פיזור אלקטרונים. עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ב- SEM, הכנת הדגימה צריכה לכלול נהלים להסרת מים תוך שמירה על שינויים בנפח ובמורפולוגיה מינימליים, כמו גם ציפוי למניעת טעינה במהלך הדמיה 55,56,57.

ראשית, הדגימה מקובעת כימית על ידי הצלבת החלבונים וחומצות הגרעין שלה, המושגת על ידי טכניקות מגוונות. שיטה נפוצה כוללת שילוב של גלוטראלדהיד ופורמלדהיד (או פרפורמלדהיד) בחיץ, כגון פיפרזין-1,4-ביס [2-אתנסולפוני חומצה] (PIPES); N-[2-hydroxyethyl]-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES); מלח חוצץ פוספט (PBS); או נתרן קקודילט. קיבוע כימי מחזק את הדגימה ומשמר את המבנה שלה לייבוש. בהתאם לטבעם, דגימות עשויות להזדקק לקיבוע משני (באוסמיום טטרוקסיד) ואפילו קיבוע שלישוני (באורניל אצטט). שנית, הדגימות חייבות להיות מיובשות. מכיוון שייבוש באוויר גורם לקריסה נרחבת של מבנים עדינים, טכניקה חלופית נפוצה היא ייבוש נקודתי קריטי (CPD). ב- CPD, הדגימה אינה נשלחת למתח פני השטח, מה שמונע היווצרות ממצאים. מצד אחד, המים מגיעים לנקודה הקריטית ב 228,5 בר ו 374 מעלות צלזיוס, אשר בקלות להרוס את הדגימה. מצד שני, הנקודה הקריטית CO₂ היא 73,8 בר ו 31 ° C, המצדיק את השימוש בו כנוזל מעבר. בעת העלאת הטמפרטורה, CO₂ מומר לצורה גזית ומוסר מהדגימה 58,59,60,61,62,63. שלישית, יש לצפות דגימות לא מוליכות כדי למנוע את טעינתן ולהגדיל את תפוקת האלקטרונים המשניים, מה שתורם כתוצאה מכך לקבלת אותות תמונה חדים⁶⁴.

הפרוטוקול המוצג כאן משלב נהלים לשימור דגימות מבוססות פטריות 32,33,45,65,66,67,68 וביופילמים ^69,70, אם כי מפשט את התהליך על ידי הסרת שלבים לאחר הקיבוע וקיצור זמן ההתייבשות. עם זאת, הוא שימר את מבנה הגן העדין, פירט עוד יותר את האינטראקציות הפיזיות של המיקרוביוטה וחשף את המבנה המרחבי של הביופילם. הרכבה מרחבית של מיקרוביוטה חיונית הן ליצירת אינטראקציות והן לקביעת דפוסי הבקרה שלהן. התפלגות מרחבית מעצבת את הדינמיקה החברתית המיקרוביאלית, שממנה עשויות לצמוח תכונות פנימיות. אלה נדרשים כדי להתמודד עם השונות והמורכבות הניצבות בפני מערכות אקולוגיות מיקרוביאליות 71,72,73. הממצאים שלנו מחזקים את המיקרוביוטה המשלבת דפוסים מבניים בגינה, ותומכים בהשתתפותם המשוערת בתגובות פיזיולוגיות 32,42,43,44^. סיפקנו את הראיות באתרן לכך שביופילמים רלוונטיים לאינטראקציות מיקרוביאליות בגידול פטריות אטין ^42,44. ביופילמים הם מערכות רב-תאיות מורכבות והטרוגניות, שבהן מיקרואורגניזמים המשובצים במטריצת EPS המופרשת מעצמה יוצרים רשתות חברתיות. בשיתוף פעולה ו/או באנטגוניזם, אינטראקציות בתוך הביופילם קובעות נישות פתיחה, כיבוש ושינוי 71,72,73,74. SEM אפשרה הבנה נוספת של הארגון המרחבי של המיקרוביוטה ברחבי אזורי הגנים, תוך פירוט אינטראקציות פיזיות של מיקרוביוטה-מצע ומיקרוביוטה-קורים, תוך פישוט השיטות למחקר עתידי בתחום זה.

המחקר על מיקרוביוטת הגן זוכה לתשומת לב הולכת וגוברת, בפרט, תוך התמקדות בתהליכים שיכולים לעצב את הרכבן של קהילות ייחודיות אלה^75,76, כמו גם את תפקודן ואת יחסי הגומלין ביניהן 42,43,44. אינטראקציות בין יבולים חיידקיים-פטרייתיים יכולות לסייע לפטרייה להמיס פוספט, לייצר סידרופורים ולפרק תאית וכיטין. אינטראקציות כאלה, שעשויות להתרחש כרצף הדדי-אנטגוניזם, יכולות לווסת את תפקוד הגן⁴⁴ . הגישה המתודולוגית שאנו מציגים כאן מאפשרת להציץ באתרו אל הממד המבני שבו יכולות להתקיים אינטראקציות. הוא מדגיש כי, כמו רוב המערכות האקולוגיות המיקרוביאליות שכבר נחקרו, גני אטין הם מעוצבים, מאורגנים בצורה הטרוגנית בחלל ^5,7,8. SEM כבר סיפק פרספקטיבה מרחבית באתרו על דינמיקת מיקרוביוטה בקהילות מארחות מגוונות, כגון ציאנוספוגים⁷⁷, עור לווייתן גדול-סנפיר⁷⁸, פטריות⁶⁶, קנידארים⁷⁹, מעיים אנושיים⁸⁰, חזזיות⁸¹, ותרם גם לתיאור הפלסטיספירה (מערכת אקולוגית חדשה שמקורה אנתרופוגנית)⁸². עם זאת, כל אחד מהמחקרים הללו השתמש בשיטה מעט שונה להכנת דגימות.

דגימות הגן הן עדינות והטרוגניות מאוד, עם קורים פטרייתיים הנחשבים כמותאמים לאי איבוד מים²⁶, מלבד מערך מגוון של מצעים משולבים²⁴, המיקרוביוטה והביופילם שלה. עם זאת, פרוטוקול הכנת הדגימות שהתאמנו שימר את רוב המבנים הללו ואפשר לנו להרחיב את אפיון המבנה המרחבי של המיקרוביוטה. אנו רואים בקיבעון עם הפתרון של קרנובסקי את השלב הקריטי בפרוטוקול, שכן ההיבט התלת ממדי של מדגם כה עדין יכול לקרוס ו/או להשתטח בשלב זה. דגימות מורכבות מבוססות פטריות מוכנות בדרך כלל עבור SEM על ידי תיקון עם גלוטראלדהיד ו postfixing עם OsO₄ 65,66,67,68. עם זאת, שילוב אלדהידים (פרפורמאלדהיד וגלוטאראלדהיד), לעומת זאת, דווח כמשפר את שימור הביופילם עבור SEM^69,70. שיטות לשימור ביופילמים עשויות לכלול גם 0.15% כחול אלקיאני או 0.15% אדום רותניום לקיבוע הראשוני של קרנובסקי, כמו גם 1% חומצה טאנית עד 1% אוסמיום לקיבוע שלאחר הקיבוע. תיקון גינות אטין ופסולת עם קרנובסקי ותיקון עם אוסו₄ שימרו חיידקים בדגימות גינה ופסולת ישנות, אם כי לא הגדירו את הביופילם³². מכיוון שבדגימות שלנו נשמרו מבנה הגינה, המיקרוביוטה והביופילמים ללא שלב הפוסט-קיבוע של אוסמיום שהיה בשימוש בפרוטוקולים קודמים 32,33,69,70, העדפנו לפשט את הפרוטוקול על ידי הסרת שלב זה. OsO₄ הוא חומר מחמצן המשמש לתיקון (במיוחד) רכיבי תאים ליפידים⁸³. מכיוון שהוא קורוזיבי מאוד, OsO₄ עלול לגרום לכוויות חמורות כאשר הוא בא במגע עם העור והרירית, מלבד פגיעה במערכת הנשימה או העיכול בעת שאיפה או בליעה^84,85. על ידי הסרת OsO₄ לאחר הקיבוע, הפרוטוקול כתוצאה מכך מפחית את מספר העוצרים הרעילים שיש לתמרן.

אנו מציעים גם את סדרת שטיפת אתנול במקום להשתמש באצטון, אשר עשוי להיות קשה מדי עבור דגימות עדינות⁸⁶. סדרת שטיפת אתנול עם צעדים באורך 10 דקות גם מפשטת פרוטוקולי SEM⁴⁵ לשעבר מבלי לפגוע ברזולוציית התמונה. חוץ מזה, וידאנו אמפירית ששלבי התזה נוספים יצרו תמונות באיכות גבוהה יותר, מה שהיה עקבי עבור דגימות גינה של כל המינים שבדקנו. ייתכן שצעדים נוספים כאלה ציפו את הדגימות באופן אחיד יותר, מאחר שפיזור אלקטרונים היה שכיח הרבה יותר בדגימות שצופו רק פעם אחת (איור 4A). לפיכך, אנו מעודדים עבודה עתידית של בדיקת תוספים ותנאים שיכולים לספק פרוטוקול משופר להדמיית ביופילם בדגימות גינה.

SEM הוא כלי רב עוצמה לפירוט המורפולוגיה התאית של המיקרוביוטה והסידור המרחבי של EPS במשטחים, וחושף את הטופוגרפיה והמרקם של דגימות גינה ברזולוציה גבוהה ובהגדלה^70,87. עם זאת, הוא אינו מספק אפליה טקסונומית לחברי הקהילה, ולכן אין לנו הבחנה של מי נמצא איפה. יתר על כן, למרות עומק המוקד הגדול של SEM, הוא אינו מודיע על התכונות התלת-ממדיות של המדגם. לקבלת תיאור מלא של הגן המיקרוביאלי האטין, כולל ביוגאוגרפיה טקסונומית ורזולוציה מרחבית תלת-ממדית, ניתוח SEM יכול להיחשב כהליך ראשון בטכניקות הדמיה הדרגתיות עבור דגימות גן. עבור רזולוציה טקסונומית, SEM יכול להיות משולב עם הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH)^88,89 וגרסאותיה, כגון FISH ברזולוציה פילוגנטית גבוהה (HiPR-FISH)⁹⁰, תיוג קומבינטורי והדמיה ספקטרלית FISH (CLASI-FISH)^9,91, והקרנות תלת-ממדיות⁹². ניתוח מיקרו-מבנה תלת-ממדי יכול להיות מפורט עוד יותר על ידי מיקרוטומוגרפיה של קרני רנטגן (μCT רנטגן)⁹³. עד כה, SEM איפשר לנו לצפות בפירוט בארגון המרחבי של המיקרוביוטה סביב קורים ובפני השטח של המצע, התלמים והשקעים. דפוסים מיקרוביאליים כאלה בונים את הידע שלנו על אינטראקציות מיקרוביאליות משוערות בגני אטין. אנו מאמינים כי צעדי ההכנה שהצגנו יכולים להיות מיושמים באופן נרחב כדי לחדד מחקרים על ארגון מרחבי מיקרוביאלי במערכות אקולוגיות מיקרוביאליות עדינות אחרות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור 2 מ"ל	Axygen	MCT-200-C-BRA	לתיקון וייבוש דגימות
סידן כלורי נטול מים	Merck	C4901	CaCl2 נטול מים להכנת קרנובסקי s מייבש
נקודה קריטית	Leica	EM CPD 300	לייבוש נקודה קריטית
סרט מוליך פחמן דו צדדי, 12 מ"מ (W) X 5 M (L)	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	77819-12	להרכבת דגימות
מלקחיים אנטומולוגיים	אין ספק		למניפולציה של דגימות
גינה אלכוהול אתילי (=אתנול), טהור (≥ 99.5%)	סיגמא-אולדריץ'	459836	למלקחיים התייבשות
	אין ספק		למניפולציה של דגימות
גינה זכוכית	אין ספק		להתייבשות
צלחת פטרי זכוכית	אין ספק		למניפולציה של דגימות
גינה פיפטה זכוכית	אין ספק		לתיקון וייבוש דגימות
גלוטראלדהיד (גלוטראלדהיד מימי EM דרגה 25%)	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	16220	להכנת קרנובסקי יעד
זהב קבוע	טד פלה, בע"מ	8071	להתיז ציפוי בזהב
חומצה הידרוכלורית	סיגמא-אולדריץ	320331	להתאמת פתרונות עורך תמונות pH
	פוטושופ	כל גרסה	להתאמת תמונות
פרפורמלדהיד (פרפורמלדהיד 20% תמיסה מימית דרגת EM)מדעי	מיקרוסקופיה אלקטרונית	15713	להכנת קרנובסקי' s
נמען מקבע Propilene	אין ספק		לשמירה על מושבות נמלים חיות
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	JEOL	IT300 SEM	להדמיה לדוגמה
נתרן קקודילאט טריהידראט	סיגמא-אולדריץ'	C0250	להכנת מרית מאגר נתרן קקודילאט
	אין ספק		למניפולציה של דגימות גינה
מיכלי דגימה בקוטר 15 מ"מ. x 10 מ"מ גובה	טד פלה, בע"	4591	לייבוש נקודה קריטית
ציפוי מקרטע	Baltec	SCD 050	לציפוי זהב
בדל (תושבת אלומיניום, סיכה שטוחה) 12.7 מ"מ x 8 מ"מ	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	75520	להרכבת דגימות