מאמר שיטה

גידול לפי תכנון לאורז פונקציונלי עם טכנולוגיות עריכת גנום

DOI:

10.3791/67336

⸱

3 בינואר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Bellagen Biotechnology Co. Ltd, 2School of Life Sciences, Shandong Normal University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר גידול זני אורז עמילן עמידים על ידי תכנון באמצעות טכנולוגיות עריכת גנום בצורה מדויקת, יעילה ופשוטה מבחינה טכנית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישות הקונבנציונליות לגידול יבולים, המסתמכות בעיקר על שיטות גוזלות זמן ועבודה אינטנסיביות כגון הכלאה מסורתית וגידול מוטציות, מתמודדות עם אתגרים בהחדרה יעילה של תכונות ממוקדות ויצירת אוכלוסיות צמחים מגוונות. לעומת זאת, הופעתן של טכנולוגיות לעריכת גנום הובילה לשינוי פרדיגמה, המאפשר מניפולציה מדויקת ומזורזת של גנומים צמחיים כדי להציג באופן מכוון את המאפיינים הרצויים. אחד מכלי העריכה הנפוצים ביותר הוא מערכת CRISPR/Cas, אשר שימשה חוקרים לחקר בעיות חשובות הקשורות לביולוגיה. עם זאת, זרימת העבודה המדויקת והיעילה של עריכת גנום לא הוגדרה היטב בגידול יבולים. במחקר זה הדגמנו את כל התהליך של גידול זני אורז מועשרים ברמות גבוהות של עמילן עמיד (RS), תכונה פונקציונלית הממלאת תפקיד מכריע במניעת מחלות כגון סוכרת והשמנת יתר. תהליך העבודה כלל מספר שלבים מרכזיים, כגון בחירת גן SBEIIb פונקציונלי, תכנון הרנ"א המנחה היחיד (sgRNA), בחירת וקטור עריכת גנום מתאים, קביעת שיטת העברת הווקטור, ביצוע תרבית רקמת צמחים, מוטציה גנוטיפית וניתוח פנוטיפי. בנוסף, מסגרת הזמן הנדרשת לכל שלב בתהליך הודגמה בבירור. פרוטוקול זה לא רק מייעל את תהליך הרבייה, אלא גם משפר את הדיוק והיעילות של החדרת תכונות, ובכך מאיץ את הפיתוח של זני אורז פונקציונליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גידול מסורתי מסתמך על החדרת תכונות לגידולים או על ייצור אוכלוסיות צמחים עם מספיק שונות, מה שדורש תצפית שדה ארוכת טווח 1,2. בשל מגבלות הרבייה המסורתית, פותחה טכנולוגיית עריכת גנים, אשר יכולה לשנות במדויק את הגנום של גידולים כדי להשיג תכונות רצויות של אוכלוסיות צמחים3. מערכת עריכת הגנים הנפוצה ביותר בצמחים היא CRISPR/Cas (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), אשר מסתמכת על אנדונוקלאז מונחה רנ"א הניתן לתכנות כדי ליצור שברים דו-גדיליים ממוקדים (DSB) בדנ"א 4,5. DSB אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנוני תיקון הדנ"א הטבעיים של התא 6,7, ולעתים קרובות התוצאה היא הכנסת השינויים הגנטיים הרצויים. למרות שטכנולוגיה זו יושמה בגידולים שונים, כולל חיטה8, תירס9, סויה10 ואורז11, היא משמשת בעיקר לחשיפת בעיות ביולוגיות. בהשוואה ליישומו הנרחב בהבהרת תפקודי גנים של צמחים, המחקר על יישום טכנולוגיות עריכת גנים להשבחת יבולים נותר נדיר יחסית12.

תהליך עריכת הגנים בגידולים מתבצע בדרך כלל באמצעות זרימת עבודה מוגדרת היטב הכוללת מספר שלבים מרכזיים:13. הצעד הראשון כרוך בזיהוי הגן או האזור הגנטי הספציפי שיש לשנות כדי להשיג את התכונה הרצויה. שנית, מתוכננת אסטרטגיית עריכת גנים, הכוללת בחירה של מערכת עריכת גנים מתאימה (למשל, CRISPR-Cas9 או CRISPR-Cas12) ועיצוב של רנ"א מנחה ספציפי שיכוון את האנדונוקלאז לאתר המטרה. שלישית, מערכת עריכת הגנים משולבת לאחר מכן בווקטור מסירה, המשמש להחדרת מכונות העריכה לתאי הצמח. וקטורים אלה יכולים להיות קומפלקסים של DNA, RNA או ריבונוקלאו פרוטאין (RNP). לאחר מכן, וקטורי עריכת הגנים מועברים לתאי הצמח בשיטות שונות, כולל טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום, הפצצת חלקיקים או אלקטרופורציה. באופן מיידי, תאי הצמח שעברו טרנספורמציה מתורבתים בתנאים מתאימים כדי ליצור יבלות ערוכות גנטית או רקמות עובריות. רקמות אלה מתחדשות לאחר מכן לצמחים שלמים באמצעות טכניקות תרבית רקמות. הצמחים המתחדשים עוברים אפיון מולקולרי קפדני כדי לאשר את קיומם של השינויים הגנטיים הרצויים.

מאמר קודם של Tsakirpaloglou et al.14 מספק סקירה רחבה של תהליך עריכת הגנים, מתכנון וקטורי ועד ליצירת שתילים ערוכים, אך הוא אינו מתעמק בניתוח מפורט של תכונות ספציפיות הקשורות לגן היעד ולא בהערכה שלאחר מכן של ביצועים אגרונומיים או אימות פונקציונלי של הגידולים הערוכים. הלכנו מעבר להדגמת ההיתכנות של עריכת גן באורז. עבודתנו מעריכה באופן מקיף את ההשפעה של עריכה זו על התכונות הביוכימיות, המולקולריות והאגרונומיות של קווי האורז הערוכים. זה כולל הערכת הרכב עמילן, גורם קריטי המשפיע על איכות הדגנים וערכם התזונתי, שלא נחקר בהרחבה במחקרים קודמים על עריכת גנים.

עמילן אורז מורכב בדרך כלל ~ 20% עמילוז ו~ 80% עמילופקטין15. SBEIIb הוא אנזים חיוני לסינתזה של עמילופקטין ומתבטא באנדוספרם16. הפלת OsSBEIIb על ידי RNA סיכת שיער (RNAi) וביטוי מיקרו-רנ"א הגדילה את תכולת העמילן העמיד17,18. עמילן עמיד הוא עמילן מצע שאינו יכול להתעכל ולהיספג במעי הדק, אך מסוגל להתפרק לחומצות שומן וגזים קצרי שרשרת על ידי חיידקי עיכול מסוימים במעיים. מכיוון שלא ניתן לפרק אותו במהירות, יש לו אינדקס גליקמי נמוך יותר בהשוואה לעמילנים אחרים ואינו גורם לעלייה מהירה ברמת הסוכר בדם תוך פרק זמן קצר לאחר האכילה, מה שיכול להקל על סוכרת במידה מסוימת בתזונה19. בנוסף, עמילן עמיד יש פונקציות פיזיולוגיות יותר, כגון הפחתת תגובת אינסולין, ויסות תפקוד המעי, מניעת הצטברות שומן, להקל על בקרת משקל, וקידום ספיגת יונים מינרליים. לכן, הוא נרדף באופן נרחב כמו סוג חדש של סיבים תזונתיים20.

כדי להתגבר על אתגרים אלה ולהשתמש בהצלחה בטכנולוגיות עריכה גנטית לגידול זני אורז פונקציונליים, שיפרנו וביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקולים התפעוליים בתוך האורז. המיקוד שלנו היה לנתח בקפידה את העיצוב של אתר גן המטרה, לבחור בקפידה את כלי עריכת הגנים המתאימים ביותר, ולבצע ניתוח פנוטיפי קפדני לאורך כל תהליך הרבייה. כעדות לעוצמה וליעילות של טכנולוגיות אלה, אנו מציגים מקרה בוחן המציג את ההתפתחות המהירה של זן אורז פונקציונלי המועשר בעמילן עמיד במיוחד. דוגמה זו מדגישה את הפוטנציאל של עריכת גנים בהאצת גידול אורז פונקציונלי, תוך מתן מענה למחסור הנוכחי במחקר בתחום זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נערך בחברת Bellagen Biotechnology Co. Ltd בסין בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי. לפני ההשתתפות, פרוטוקול המחקר הוסבר ביסודיות לנבדקים, שסיפקו הסכמה מדעת.

1. תכנון sgRNA ווקטור בנייה (תזמון 5-7 ימים)

הערה: וקטור בינארי שימש לביטוי מערכת CRISPR/Cas-SF0121. אין פחות מ-3 נוקלאוטידים (nt) לא מתאימים לאתר פוטנציאלי מחוץ למטרה עבור sgRNA. מתאם sgRNA צריך להשלים את הקצה הדביק, אשר נוצר על ידי עיכול האנזים Bsa I של וקטור העריכה. בחירת התוכנה התבססה על היעילות הגבוהה והספציפיות המדווחת של התוכנה באורז14, כמו גם קלות השימוש והנגישות שלה לקבוצת המחקר.

  1. נווט אל אתר NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) כדי לאחזר את הגן OsSBEIIb (LOC4329532) בג'פוניקה. הורד את גנום הייחוס וגש אליו בתוכנת SnapGene.
  2. נתח את ההחדרות/מחיקות (InDel) ואת פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNP) ברצף האקסון של OsSBEIIb מזן X134, והשווה אותו לגנום הייחוס. השתמש ב- NCBI Primer Blast22 כדי לעצב פריימרים הצמודים לאזורי האקסון (טבלה משלימה 1).
  3. כדי לאמת את רצף האקסון של הגן OsSBEIIb ב- X134 על ידי ריצוף Sanger, הכינו את התגובה באופן הבא: 10 μL של חיץ תערובת פולימראז עם 1 μL של פריימר קדמי, 1 μL של פריימר הפוך, 1 μL של gDNA מרקמות X134 ו -7 μL של מים מזוקקים. הפעל תוכנית PCR כדלקמן: 95 °C, 3 דקות; (95°C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) עם 35 מחזורים, ו- 72°C, 5 דקות.
  4. תכנן את sgRNA על רצף האקסון OsSBEIIb של X134, תוך הקפדה על פרוטוקול Tsakirpaloglou et al.14והבטחת רצף PAM הוא TTN.
  5. שנה את רצף sgRNA על ידי הוספת -ACAC- אוליגוס בקצה 5' של הפריימר הקדמי והוספת -GGCC- אוליגוס בקצה 5' של הפריימר ההפוך. סינתזה מסחרית של פריימרים קדימה/אחורה (עבור sgRNA).
  6. ממיסים את הפריימרים קדימה ואחורה לריכוז של 10 μmol/L, לוקחים 1 μL מכל אחד, ומוסיפים ל-8 μL של חיץ אנאלי (חיץ Tris-EDTA + 50 mM NaCl) ומערבבים על ידי פיפטינג. הכנס למכונת ה-PCR והפעל את תוכנית החישול באופן הבא במכשיר PCR: תהליך קירור איטי 95°C עד 16°C ב-0.1°C/s.
  7. הרכיבו את ה-sgRNA לתוך וקטור עריכת הגנום. הכן את התגובה באופן הבא: 20 μL של חיץ תערובת עם 0.5 μL של T4 DNA ligase, 1 μL של Bsa I, 2 μL של 10x מאגר הגבלה, 2 μL של 10x T4 DNA ligase buffer, 2 μL של פריימרים חישול, 2.5 μL של וקטור (נפח שלה מותאם כדי להתאים את היחס) ו 10 μL של מים מזוקקים. בכל המקרים, השתמש ביחס הוספה לווקטור של 2:1 כדי להשיג יעילות הרכבה. הפעל את תוכנית הרכבת ה- PCR כ- (37 ° C, 2 דקות; 16 ° C, 3 דקות) עם 30 מחזורים, ו- 55 ° C, 30 דקות.
  8. הפוך את הווקטור שנוצר לתאי E. coli כמתואר23.
  9. תכננו פריימרים הצמודים לאתר החדרת ה-gRNA בתוך הפלסמיד. באמצעות פריימרים אלה, בצע הגברה PCR על מושבות בודדות כדי לסנן החדרות מוצלחות. בצע ריצוף Sanger של מוצרי PCR כדי לאשר את השיבוט המוצלח ולבודד פלסמיד24.

2. טרנספורמציה של אגרובקטריום (תזמון 4 ימים)

  1. הפשיר EHA105 Agrobacterium Competent Cell על קרח. הוסף 1-2 μL של DNA פלסמיד (המכיל ~ 100-200 ng של DNA) לתרחיף התא וערבב בעדינות.
  2. בצע טרנספורמציה של הלם חום על ידי הנחת הצינור על קרח במשך 5 דקות, חנקן נוזלי במשך 5 דקות, שוק חום ב 37 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן באמבט הקרח במשך 5 דקות.
  3. הוסיפו 700 מיקרוליטר של חומר פפטון תמצית שמרים (YEP), ללא אנטיביוטיקה, לצינור וערבבו בעדינות. לשחזר את התאים באינקובטור רועד ב 28 ° C, 200-250 סל"ד, במשך 2-3 שעות.
  4. צנטריפוגה את התרבית ב 2,800 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את רוב הסופרנטנט, השאירו כ-100 מיקרוליטר, והשעו מחדש את התאים. מורחים את התאים על צלחות אגר YEP המכילות אנטיביוטיקה 1% (קנמיצין ורימפפיצין) לבחירת פלסמיד. לדגור על הצלחת ב 28 ° C במשך 24-48 שעות.
  5. פזרו את צלחת YEP (עם עמידות לאנטיביוטיקה) עם קצה פיפטה המכיל מושבה אחת של אגרובקטריום המכיל את הקריספר/Cas והעבירו את התאים ל-5 מ"ל של מדיה נוזלית YEP עם אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור את הנוזל ב 28 ° C במשך 3 ימים.
  6. אחסנו את זני אגרובקטריום שעברו טרנספורמציה כמאגרי גליצרול בטמפרטורה של -80°C לשימוש נוסף.

3. טרנספורמציה אורז על ידי Agrobacterium (תזמון 3 חודשים)

הערה: דווח על מספר שיטות טרנספורמציה של צמחים להעברה ולביטוי של רצף הדנ"א הזר בתא הצמח25. בהתחשב בשילוב עותק יחיד ותדירות נמוכה של DSB בגנום, טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום היא השיטה המועדפת לשילוב ביטוי מקטע DNA בכרומוזומי אורז.

  1. בצע טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של אורז בהתאם לפרוטוקול בשנת25. הקלי הגדל באופן פעיל (לבן צהבהב, יבש יחסית, וקוטר 1-3 מ"מ) הוא נקודת מפתח לשינוי יעיל. השליכו את הזרעים עם התפתחות שתיל או יבלת חומה לפני הדבקת היבלת באגרובקטריום.

4. גנוטיפ צמחים טרנסגניים וקציר זרעים (תזמון 8 חודשים)

הערה: שני דורות של אורז יטופחו כדי להשיג מוטציה הומוזיגוטית וקווים נטולי דנ"א זר.

  1. דגימת רקמת שתיל: השתילו את הצמחים הטרנסגניים בעציצים וגידלו אותם במשך חודש בחממה. כדי להעריך את סוג המוטציה, לאסוף 2-3 מ"ג של עלים טריים מכל עיבוד של שתיל יחיד ולשלב אותם לתוך דגימה אחת.
  2. מיצוי DNA גנומי: עקוב אחר פרוטוקול מבוסס למיצוי DNA של גנום הצמח26.
  3. תכנון פריימרים למוטציה (טבלה משלימה 1): תכנון פריימרים PCR להגברת אזור הגן SBEIIb המקיף את אתר היעד sgRNA14. אורכו של השבר המוגבר הוא 493 bp.
  4. גנוטיפ המוטציה: ריצוף ישיר של מקטעי PCR או שכפול שלהם לווקטור ורצף שיבוט T בשיטת סנגר לזיהוי מוטציות14.
  5. קצירת זרעים: בחרו את קווי E0 המציגים מוטציות הומוזיגוטיות בשינוי מסגרת ושתלו אותם בחממה כדי להשיג זרעים.
  6. תכנון הפריימרים לזיהוי T-DNA: תכנון שלושה פריימרים ספציפיים לקלטת היגרומיצין, קלטת UBI וקלטת Cas של המבנה כדי לזהות קווים נטולי דנ"א זרים בין המוטציות (טבלה משלימה 1).
  7. אישור קווים נטולי T-DNA זרים: קציר עלים משתילים בני שבועיים והפקת DNA של גנום הצמח כמתואר בשלב 4.2. בצע PCR גנומי עם התוכנית הבאה: 95 °C, 3 דקות; (95°C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) עם 35 מחזורים, ו- 72°C, 5 דקות. זה מאפשר זיהוי של hygromycin, UBI, וקלטת Cas בגנום הצמח.
  8. נתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל ובחר קווים שאינם מראים פסים, המציין שהם קווי E1 נטולי טרנסגן. קצרו את הזרעים מהקווים שנבחרו האלה.

5. מדידת תכולת עמילן עמיד (תזמון 4 ימים)

  1. קצרו זרעים של צמחים מוטנטיים ו-X134 ואפשרו להם להתייבש באופן טבעי בטמפרטורת החדר, תוך שמירה על תכולת לחות של כ-13%-15%. קבע את תכולת העמילן העמיד באמצעות הליך הלבלב α-עמילוז/עמילוגלוקוזידאז (AMG) המתואר להלן.
  2. הפעל את מכונת הפילינג והכנס 10 גרם של גרגרי אורז לתוך מזין כדי להסיר ביעילות את קליפת גלומה, וכתוצאה מכך זרעי אורז מעובדים.
  3. מעבירים את זרעי האורז הקלופים לטחנת האורז ומפעילים אותם במשך 60 שניות כדי לחסל את שכבת האלורון, מה שמניב אורז מלוטש.
  4. הכניסו את האורז המלוטש למטחנת הרקמות, והתאימו את תדירות הטחינה ל-60 הרץ. הפעילו את המטחנה במשך 15 שניות, חזרו על המחזור 2x כדי לייצר אבקת אורז.
  5. מניחים את אבקת האורז הטחון בצלחת פטרי ומכניסים לתנור שחומם מראש. כוונו את הטמפרטורה ל-37°C ואפשרו לה להתייבש במשך 12 שעות.
  6. במדויק לשקול 100 מ"ג ± 5 מ"ג של דגימות ויוצקים ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל. הקש בעדינות על הצינורית כדי לוודא שהדגימה שוקעת בתחתית.
  7. הוסף 180 μL של מים מטוהרים לצינור והרתיח את הדגימות במשך 20 דקות באמבט מים.
  8. אפשר לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הכנס 4 מ"ל של AMG (3 U / mL) המכיל α-עמילאז הלבלב (10 מ"ג / מ"ל) לתוך כל צינור.
  9. סגור היטב את הצינורות, ערבב אותם על מתנד מערבולת, ודגר על הצינורות ב 37 ° C במשך 16 שעות עם תסיסה מתמשכת.
  10. מוסיפים 4 מ"ל אתנול ומערבבים באמצעות מערבולת. צנטריפוגה את הצינור ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות.
  11. מרוקנים את הסופרנטנט, מוסיפים 2 מ"ל של 50% אתנול ואחריו 6 מ"ל של 50% IMS, ומערבבים באמצעות מערבולת וצנטריפוגה.
  12. בזהירות לשפוך את supernatant ולהפוך את הצינור כדי לנקז כל נוזל עודף. מניחים את הצינורות באמבט קרח, מוסיפים 2 מ"ל של 2 M KOH לכל צינור, ומערבבים את הדגימות במשך 20 דקות כדי להשהות מחדש את floc ולהמיס עמילן עמיד.
  13. יש להוסיף 8 מ"ל של 1.2 מ"ל סודיום אצטט (pH 3.8) לכל מבחנה ולערבב באמצעות מערבל מגנטי.
  14. יש להכניס מיד 0.1 מ"ל AMG (3300 U/mL), לערבב היטב ולדגור במשך 30 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 50°C עם ערבוב לסירוגין באמצעות מערבולת. לאחר מכן, צנטריפוגו את הצינור ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות.
  15. מעבירים 0.1 מ"ל של הסופרנאטנט לצינור זכוכית, מוסיפים 3 מ"ל של מגיב גלוקוז אוקסידאז/פרוקסידאז (GOPOD) ודגורים ב-50°C למשך 20 דקות. הכינו ריאגנט ריק על ידי ערבוב 0.1 מ"ל של 100 mM נתרן אצטט חיץ ו 3 מ"ל של מגיב GOPOD. הכן תקנים על ידי ערבוב 0.1 מ"ל של D-גלוקוז עם 3 מ"ל של מגיב GOPOD.
  16. בזהירות פיפטה 200 μL של כל פתרון ריק, הפתרון להיבדק, ואת הפתרון הסטנדרטי לתוך צלחת 96 באר.
  17. מדוד את הספיגה של כל דגימה ב- 510 ננומטר כנגד התמיסה הריקה וחשב את תכולת העמילן העמיד באמצעות הנוסחה שסופקה.
    עמילן עמיד (גרם/100 גרם) = ΔA × F/W ×9.27
    כאשר ΔA = ספיגה לקרוא כנגד הריאגנט ריק; F = המרה מספיגה למיקרוגרמים (הספיגה המתקבלת עבור 100 מיקרוגרם של גלוקוז D בתגובת GOPOD נקבעת); W = משקל יבש של הדגימה שנותחה.

6. תגובת גלוקוז בדם לאחר הלידה (תזמון 5 ימים)

  1. השתמש בקריטריוני ההכללה הבאים עבור המשתתפים: מבוגרים סינים אסיאתיים בריאים בגילאי 18 עד 60 שנים, לא מעשנים, מדד מסת גוף (BMI) בין 18.5 ל -25 ק"ג / מ"ר2, ולחץ דם תקין (< 140/90 מ"מ כספית). השתמש בקריטריוני ההחרגה הבאים: מחלות מטבוליות (כגון סוכרת, יתר לחץ דם וכו '), הפרעות במערכת העיכול, הפרעות במערכת האנדוקרינית או מחלות נפש. בסך הכל נבדקו וגויסו 10 משתתפים.
  2. הליך הבחינה (נמשך יומיים רצופים)
    1. יום 0 (יום הכנה): בקשו מהמשתתפים לשמור על דפוסי שינה קבועים ועל תזונה תקינה במשך 3 הימים הראשונים שקדמו לבחינה. בערב שלפני הבחינה (לאחר השעה 20:00) בקשו מהמשתתפים להימנע מארוחות עתירות סיבים וסוכר. פעילות גופנית נמרצת אינה מומלצת בבוקר היום הראשון.
    2. יום 1 (יום המבחן): מכינים אורז לבן על ידי טחינת זרעי האורז, ואז שוטפים את האורז הלבן פי 2. ממלאים סיר ב-1.5 חלקים מים עד 1 חלק אורז לבן. מרתיחים את האורז עד שהמים נספגים במלואם. מכבים את האש, מכסים את הסיר ונותנים לו לנוח 10 דקות.
    3. הקצו באופן אקראי את 10 המשתתפים לשתי קבוצות שוות: קבוצת בדיקה אחת שתוזן באורז לבן עמילן עמיד וקבוצת ביקורת אחת שתוזן באורז לבן X134. בקשו מהמשתתפים לנוח במשך 10 דקות לפני תחילת הבדיקה.
    4. יש לעקר את קצות האצבעות עם 75% אלכוהול רפואי. לחץ בעדינות על מכשיר lancet כנגד קצה האצבע ושחרר את הקפיץ כדי לדקור את העור. לחץ בעדינות את האצבע כדי לייצר טיפת דם קטנה וגע בטיפה זו בקצה סופג הדם של רצועת הבדיקה במטר. המונה שואב באופן אוטומטי את הדם ומתחיל את תהליך הבדיקה. המתן להצגת קריאת רמת הסוכר בדם.
    5. צריכת אורז ודגימת דם: הציגו למשתתפים 50 גרם מהאורז המוכן עם 200 מ"ל מים ובקשו מהם לאכול זאת בקצב נוח תוך 5-10 דקות. לאחר הארוחה, אספו דגימות דם ורידי בנקודות הזמן הבאות: 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות ו-120 דקות מתחילת הארוחה. בצע ניתוח גלוקוז בדם כמו בשלב 6.2.4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר הנוכחי, כל ההליכים של גידול אורז פונקציונלי הודגמו על ידי עריכת גנום כדי להשיג זני אורז עמילן עמיד יציב. שילבנו sgRNA המכוון ל-SBEIIb ב-CRISPR/Cas-SF01 (איור משלים 1), החדרנו לאורז באמצעות טרנספורמציית אגרובקטריום, וקיבלנו צמחים מדור E0 לאחר שלבי סינון והשתרשות. צמחים עם אובדן תפקוד גנים נבדקו, ותכולת העמילן העמיד שלהם נקבעה לאחר קציר הזרעים (איור 1). מוטציות הומוזיגוטיות (20.8%) נמצאו בצמחי E0 על ידי ריצוף Sanger, ו-sbeIIb-1 (-2bp, CC), ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתהליך הבנייה של וקטורים מבוססי CRISPR/Cas-SF01, בחירה קפדנית של רנ"א חד-מנחה (sgRNA) היא חיונית. זה מחייב אימוץ של רצפים המציגים יעילות עריכה גבוהה עם מינימום אפקטים מחוץ למטרה. בנוסף, הסינתזה של פריימרים ממוקדים משלבת אוליגוס מתאם קצר התואם לאתרי splice של הווקטור, ומבטיח אינטגרציה חלקה. יש לציין כי בניגוד למתודולוגיות קודמות שדרשו עיכול אנזימטי רציף, טיהור ג'ל וקשירה, המחקר שלנו מייעל את התהליך על ידי שילוב חיתוך אנזימים וקשירה במערכת All-in-One. שיפור זה משפר את היעילות התפעולית ומקצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מימון של פרויקטים ביולוגיים עיקריים (2023ZD04074).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2 x Taq Plus מאסטר מיקס IIVazyme ביוטק ושות', בע"מP213  איתור פולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד (SNP) של גנים
2,4-דיכלורופנוקסיאציטי (2,4-D) חומצה SolutioPhyto TechnologyD309
AAM בינונישאנדונג Tuopu Biol-engineering Co., LtdM9051C
BsaI-HFמעבדות ביולוגיות ניו אינגלנדR3535Bsa I עיכול אנזים של וקטור העריכה
אנטיביוטיקה קרבניציליןApplygenAPC8250-5מבחר  בינוני, מדיום התחדשות
CasaminoacidBBI-Life SciencesCorporationA603060-0500מדיום אינדוקציה יבלות, מדיום גידול משותף, מדיום בחירה, מדיום התחדשות
DH5 ואלפא; תא מוכשר כימיתWeidi Biotechnology Co., Ltd.DL1001E. coli תאים מוכשרים
D-סורביטולBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
EDTA, מלח דיסודיום,דיהידראט יהלוםA100105-0500CTAB מאגר
EHA105 תא מוכשר כימיתWeidi Biotechnology Co., Ltd.AC1010Agrobacterium תאים מוכשרים
FastPure Plasmid Mini KitVazyme Biotech Co., LtdREC01-100מבודדת פלסמיד
Yeasen60224ESמדיום גידול משותף, מדיום בחירה, מדיום התחדשות ושורש
בינוני Kanamycin אנטיביוטיקהYeasen60206ES10Selection agrobacterium
KOHמאגר מקליןP766798CTAB
L-גלוטמיןPhyto TechnologyG229מדיום אינדוקציה יבלות, מדיום גידול משותף, מדיום בחירה, מדיום התחדשות
L-ProlinePhyto TechnologyP698מדיום אינדוקציה יבלות, מדיום גידול משותף, מדיום בחירה, מדיום התחדשות
זרעי אורז יבש Mautre (Xiushui134)-זני Japonica עבור גידול אורז
RS טחנת אורז מכיןMARUMASUMHR1500Aלייצור אורז לבן
Murashige SkoogPhyto TechnologyM519מדיום שורש, מדיום התחדשות
מיו-אינוזיטולPhyto TechnologyI703מדיום התחדשות
NaClMacklinS805275עבור  מדיה YEP
NB בסיסי בינוניפיטו טכנולוגיהN492מדיום אינדוקציה יבלות, מדיום גידול משותף, מדיום בחירה, מדיום התחדשות
פפטון SolarbioLA8800עבור  YEP מדיה
Phytogelשנחאי yuanye ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מS24793
סיר קבוצת מידאה ושות'MB-5E86לבישול אורז
מקררHaierBCD-170אחסון
ערכת בדיקת עמילן עמידMegazymeK-RSTARמדידה וניתוח עמילן עמיד
Rifampicin אנטיביוטיקהSigmaR3501-250MGבחירה אגרובקטריום
נתרן היפוכלוריט תמיסתמקליןS817439לעיקור זרעים
סוכרוזשנחאי yuanye ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מB21647מדיום אינדוקציה יבלות, מדיום גידול משותף, מדיום בחירה, מדיום התחדשות
T4 DNA Ligaseמעבדות ביולוגיות ניו אינגלנדM0202הצטרפות sgRNA לווקטור CEISPRY/Cas-SF01
מוניטור הגלוקוזציוד רפואי & אספקה ושות', בע"מXuetang 582איתור הגלוקוז בדם
Tris-HCLMacklinT766494CTAB מאגר
שמרים אגרSolarbioLA1370עבור  מדיה YEP
מדיה YEP -גידול אגרובקטריום
אנטיביוטיקה Hygromycin בינוני

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review. Front Genet. 12, 643761(2021).
  3. Khalil, A. M. The genome editing revolution: review. J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68(2020).
  4. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  5. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117, 119-128 (2015).
  6. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).
  7. Koonin, E. V., Makarova, K. S. Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back. Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).
  8. Zhang, Y., et al. Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits. Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).
  9. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Comm. 7, 13274(2016).
  10. Li, Z., et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean. Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).
  11. Li, M., et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front Plant Sci. 7, 377(2016).
  12. Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences. Plants. 10 (10), 2055(2021).
  13. Hua, K., et al. Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding. Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).
  14. Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops. Plants. 12 (20), 3564(2023).
  15. Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).
  16. Crofts, N., et al. Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes. J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).
  17. Butardo, V. M., et al. Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing. J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).
  18. Baysal, C., et al. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).
  19. Keenan, M. J., et al. Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance. Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).
  20. Shen, L., Li, J., Li, Y. Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond. Plant Comm. 3 (3), 100329(2022).
  21. Duan, Z., et al. An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants. Innovation (Camb). 5 (2), 100564(2024).
  22. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 13, 134(2012).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  25. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).
  26. Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent. 43, 25(2019).
  27. Li, P., et al. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice. 15 (1), 18(2022).
  28. Huang, X., et al. Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2. Nat Commun. 11 (1), 5241(2020).
  29. Lv, P., et al. Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3. Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).
  30. Čermák, T., et al. A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants. Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR CasSBE2bRNA

מאמרים קשורים