מאמר שיטה

הקמת מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט שמקורם בחולה לגידולי מוח באמצעות מכשיר סטריאוטקסי

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67349

⸱

2 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Cancer Institute Australia, Lowy Cancer Research Centre, UNSW Sydney, 2School of Clinical Medicine, Faculty of Medicine & Health, UNSW Sydney, 3Kid's Cancer Centre, Sydney Children's Hospital

במאמר זה

סיכום

פיתוח מודלים אורתוטופיים של גידולי מוח בילדים דורש דיוק קפדני, תוך שימוש במכשיר סטריאוטקסי להשתלת תאים סרטניים בצורה מדויקת. המתודולוגיה המוצגת כאן מתארת את השלבים הכרוכים בהכנת תאי גידול במוח, ביצוע זריקות תוך גולגולתיות ויישום מערכת ניטור לאחר ניתוח להערכת השתלת גידול מוח.

תקציר

הפיתוח של מודלים רלוונטיים ואמינים מבחינה קלינית לגידולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) היה מרכזי בקידום תחום הנוירו-אונקולוגיה. אחת הטכניקות הנפוצות ביותר היא הזרקה תוך גולגולתית אורתוטופית, שיטה המאפשרת לחקור צמיחה, פלישה והתפשטות של גידול בסביבה מבוקרת. טכניקה זו כוללת השתלת תאי גידול מאזור חולה ספציפי לאתר האנטומי המתאים בבעל חיים. על ידי כך, מודלים אלה של גידולי מוח אורתוטופיים מציעים יתרון ייחודי, מכיוון שהם משכפלים בצורה מדויקת יותר את ההתנהגות הביולוגית של הסרטן ואת האינטראקציות שלו עם סביבת המוח הנראית בחולים אנושיים. זה הופך אותם לבעלי ערך במיוחד עבור בדיקות טיפוליות פרה-קליניות, שבהן דמיון רב לתרחיש הקליני חיוני להערכת טיפולים פוטנציאליים. פרוטוקול זה חולק חוויות בפיתוח מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה עבור גידולי מוח בילדים, כולל גליומה מפושטת של קו האמצע (DMG), גליובלסטומה (GBM), מדולובלסטומה ואפנדימומה. שיטה זו מתארת את הנוהל לביצוע הזרקות סטריאוטקסיות תוך גולגולתיות בעכברים, ומבטיחה מיקוד נכון של אתר ההזרקה בתוך המוח. בנוסף, אנו מתארים את מערכת הניטור הפוסט-פרוצדורלית המשמשת לאיתור סימנים של השתלת גידול מוצלחת. לאחר הזרקת הגידול, מיושמת מערכת ניטור קפדנית למעקב אחר בעלי החיים לאיתור סימנים של ליקוי נוירולוגי, שינויים התנהגותיים ו/או ירידה במשקל, שהם אינדיקטורים נפוצים להתקדמות הגידול. מערכת זו מאפשרת התערבות בזמן ומספקת נתונים קריטיים לגבי דינמיקת הגדילה של הגידול. על ידי חידוד המודלים והפרוטוקולים הללו, אנו שואפים לשפר את האמינות ואת פוטנציאל התרגום של מחקרים פרה-קליניים, ולתרום לפיתוח טיפולים יעילים יותר לגידולי מערכת העצבים המרכזית בילדים.

מבוא

גידולי מערכת העצבים המרכזית בילדים (CNS) הם הגידולים המוצקים השכיחים ביותר בילדים, המהווים כ-20%-25% מגידולי ילדים ראשוניים, עם מאפיינים מובהקים מגידולי מבוגרים מבחינת שכיחות ותגובה לטיפול 1,2. גליומות בדרגה גבוהה (HGGs), כגון גליובלסטומה (GBM) וגליומה פונטינית פנימית מפושטת/גליומה מפושטת של קו האמצע (DIPG/DMG), הן אגרסיביות במיוחד, עם פרוגנוזות עגומות, ולמרות ההתקדמות בשיטות הטיפול, שיעורי ההישרדות נותרו נמוכים 3,4,5. מדולובלסטומות, המהוות כמעט 20% מגידולי מערכת העצבים המרכזית בילדים, השיגו שיעור הישרדות גבוה של 5 שנים עם טיפול סטנדרטי, אך תת-סוגים מסוימים מהווים אתגרים, במיוחד בתרחישי הישנות 6,7. אפנדימומות, המהוות כ-10% מגידולי מערכת העצבים המרכזית בילדים, מציגות פרוגנוזה מגוונת בהתאם למאפיינים המולקולריים ומיקום הגידול, כאשר הישנות מציגה אתגרים קליניים משמעותיים 8,9. הבנת הנוף המולקולרי ופיתוח מודלים של גידולי מוח אורתוטופיים (BT) מציעים הבטחה לפיתוח טיפולים יעילים לשיפור התוצאות עבור חולים ילדים.

פיתוח מודלים רלוונטיים קלינית של BT חיוני לקידום המחקר הנוירו-אונקולוגי והגילוי הטיפולי. הזרקות אורתוטופיות באמצעות מכשיר סטריאוטקסי הן מרכזיות בגישה זו, מכיוון שהן מאפשרות מיקום מדויק של תאי גידול בתוך המוח, ומחקות מקרוב את הסביבה הטבעית של גידולי מוח10. שיטה זו משפרת את האמינות והשחזור של מודלים של גידולים, ומאפשרת מחקרים מדויקים יותר של הביולוגיה של הגידול ומאפייני מפתח כגון פלישה ואנגיוגנזה, כמו גם הערכת התערבויות טיפוליות11. היכולת של המכשיר הסטריאוטקסי לשלוט במיקום ובעומק המדויק של הזרקות התאים מבטיחה שתאי הגידול ממוקמים באופן עקבי באזורי המוח המיועדים, ובכך משפרת את תוקף תוצאות הניסוי10. מודלים תת עוריים מספקים אפשרות נגישה וחסכונית יותר לסינון ראשוני של חומרים טיפוליים. במודלים אלה, תאי גידול מושתלים מתחת לעור, מה שמאפשר ניטור ישיר של צמיחת הגידול ותגובות הטיפול12. למרות שהם חסרים את היכולת לשכפל את המיקרו-סביבה המורכבת של המוח, מודלים תת עוריים נשארים בעלי ערך רב עבור סינון תרופות בתפוקה גבוהה והערכות יעילות ראשוניות12,13.

מחקרים מרובים הוכיחו פיתוח מוצלח של מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט שמקורם בחולה (PDX) מדגימות גידולי מוח, כולל השתלת רקמה ישירה מדגימות נתיחה או ביופסיה ותרביות גידול מוח ראשוניות 11,14,15. עם זאת, חיוני להכיר בכך שהזרקה תוך גולגולתית של רקמה מנותקת מגידול או תאי גידול לא תמיד מבטיחה השתלה, כאשר הסיבות לכישלון אינן מובנות במלואן15. מעניין שדגימות ביופסיה HGG נוטות להציג אחוזי הצלחה גבוהים יותר בהשוואה לתת-סוגים אחרים של גידולי מוח. לדוגמה, He et al. הראו שיעור הצלחה של 56% עבור מודלים אורתוטופיים של HGG, בעוד שהמחקר של Brabetz et al. דיווח על שיעורי השתלה נמוכים יותר, כגון 43% ו-30%, בהתאמה, עבור דגימות אחרות של גידולי מוח בילדים כמו אפנדימומה ומדולובלסטומה 11,14,16. יש לציין כי מודלים של PDX של גידולי מוח מציגים מגוון רחב של תקופות חביון, המשתנות בין חודש אחד ל-11 חודשים, כאשר השתלות מאוחרות יותר מראות תועלת פרה-קלינית מופחתת. למרות יכולתם לסכם מחלה ברמה המולקולרית, נצפו כמה הבדלים גנומיים בין ביופסיות למודלים מבוססים 14,16.

דגמי PDX משמשים ככלים הכרחיים בחיפוש אחר אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד BTs ילדים. הם נחשבים לסטנדרט הזהב לביצוע מחקרי יעילות תרופות שכן המודלים מסכמים נאמנה את המחלה האנושית במונחים של צמיחת גידול, תסמינים ופרמקוקינטיקה של תרופות עקב נוכחות מחסום הדם-מוח (BBB). מחקרים הוכיחו בתחום גליומה בגזע המוח בילדים כי שלמות ה-BBB הנשמרת והיעדר חדירת תרופות היא תכונה המובילה ליעילות טיפולית מופחתת עבור גידולים אלה 17,18,19. עם זאת, ניתן לראות יעילות בטיפולים נבחרים המדגימים חדירה מספקת של תרופות, כגון מעכבים אפיגנטיים ומטבוליים17,20.

מחקר זה מציג שיטה לביצוע הזרקות תוך גולגולתיות של תאי גידול מוח בבעלי חיים מדוכאי חיסון, שמטרתה להעריך את ההשתלה לפיתוח PDX ו/או להעריך את יעילות התרופות הטיפוליות. כמו כן ניתנים כלים מקיפים לניטור התקדמות הגידול עד להגעה לנקודת הקצה הניסוי האתית.

פרוטוקול

הפרוטוקול המתואר להלן עוקב אחר ההנחיות האתיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים כפי שהותוו על ידי אוניברסיטת ניו סאות' ויילס, וכל הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. רווחת בעלי החיים הייתה בראש סדר העדיפויות, ונעשו כל המאמצים למזער את סבלם של בעלי חיים ששימשו במהלך הליך ההזרקה התוך גולגולתית.

1. תרבית להרחבת תרביות גידולי מוח יוצרות נוירוספרה

הערה: הדרישות הספציפיות עשויות להשתנות בהתאם לתרביות המוח בהן נעשה שימוש. השלבים הבאים מתארים פרוטוקול תרבית כללי לתאי גידול מוח ראשוניים כנוירוספרות. ניתן להשיג תרביות גידול מוח מספקים מסחריים או לקבוע כתרביות ראשוניות מביופסיות גידול מוח של מטופלים או נתיחות שלאחר המוות. הנוהל לקביעת תרביות ראשוניות מביופסיה של מטופל או מדגימות נתיחה שלאחר המוות מתואר בספרות שפורסמה15,21.

  1. הניחו את בקבוקון הציר השמור בהקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד להפשרת התכולה. נגב את המשטחים החיצוניים של הבקבוקון עם 70% אתנול כדי להבטיח סטריליות.
  2. הכן מדיה נוירוספירית לתאי גידול מוח ראשוניים כמתואר ב- Mayoh et al.21. בארון בטיחות ביולוגי (BSC), השתמש בפיפטה סטרילית של 1 מ"ל כדי להעביר את התאים המופשרים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיה נוירוספרית מחוממת מראש.
  3. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב-300 x גרם למשך 3 דקות כדי לגלול את התאים. השליכו בזהירות כמה שיותר מהסופרנטנט עם פיפטה של 10 מ"ל.
  4. השעו מחדש את כדור התא ב-10 מ"ל או 25 מ"ל של מדיה נוירוספרית. צלחת את תרחיף התא לבקבוק T25 או T75, בהתאם למספר התא הצפוי מהשימור בהקפאה. בדרך כלל, תאי התחלה בצפיפות של 5x 105 תאים ממוקמים בבקבוק T25.
  5. מניחים את הבקבוק באינקובטור המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. החלף את המדיה במדיה חדשה פעם או פעמיים בשבוע. לחלופין, יש להגביר את גורמי הגדילה ו-B27 לפי הצורך, בהתאם לקצב הגדילה של התאים.
  6. ברגע שנוירוספרות נוצרו בבקבוק T25, ניתן להרחיב אותן בצלוחיות T75. העבירו את תכולת בקבוק T25 עם פיפטה של 10 מ"ל לצינור חרוטי של 15 מ"ל. התבוננו בנוירוספרות תחת מיקרוסקופ אור, וברגע שהן גדלות מספיק (כ-500 מיקרומטר), הן עשויות להיות גלויות גם לעין בלתי.
  7. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם למשך 3-5 דקות. שאפו את המדיום מעל כדור התא והשאירו כ -1 מ"ל בצינור.
  8. פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה 12x-15x עם פיפטה של 1 מ"ל כדי לנתק את גלולת התא. השתמש במסננת תאים (40 מיקרומטר) כדי לפרק נוירוספרות לתערובת של תא בודד.
  9. הנח את המסננת על החלק העליון של צינור חרוטי של 50 מ"ל והוסף ספרואידים מנותקים עם פיפטה של 10 מ"ל על המסננת. רוב התאים הבודדים יעבירו את הרשת לתוך הצינור, וחומרים גושים יישארו על הרשת.
  10. ספור תאים עם תא ספירת תאים. העריכו את כדאיות התא על ידי ערבוב כמות שווה של תרחיף תאים (למשל, 5 מיקרוליטר) עם טריפן כחול (5 מיקרוליטר). תאים מתים ייראו כחולים תחת מיקרוסקופ האור, בעוד שתאים חיים יישארו ללא כתמים.
  11. חשב את צפיפות התאים באופן הבא:
    ריכוז תאים = מספר תאים ממוצע לרשת × גורם דילול / נפח של רשת אחת (מ"ל). נפח הרשת מתא ספירת תאים סטנדרטי הוא 0.0001 מ"ל.
  12. כדי לתאי מעבר, השעו מחדש 1 x 106 תאים ב-25 מ"ל של מדיה טרייה ומחוממת בבקבוק T75. לאחר שתאים מונחים בבקבוק T75, דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO2 עד שהנוירוספרות גדלות.
  13. כדי לשמר בהקפאה תאי גידול במוח, השעו מחדש 1 x 106 תאים ב-1 מ"ל של תמיסת שימור בהקפאה והניחו למשך הלילה במיכל הקפאה בקצב מבוקר ואחסנו ב-80 מעלות צלזיוס. הנח מלאי שמור בהקפאה במיכל חנקן נוזלי -180 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: מדיום השימור בהקפאה כולל 90% סרום עגל עוברי ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).

2. הכנת תאי גידול מוח להזרקה תוך גולגולתית

הערה: בעוד שהפרוטוקול הבא מתאר את הכנת התאים המתורבתים מתרבויות מבוססות או קצרות טווח להזרקה תוך גולגולתית, ניתן להתאים אותו גם לסוגי תאים אחרים, כולל רקמה מנותקת טרייה מגידולי מוח אנושיים22,23.

  1. בארון בטיחות ביולוגית העבירו בזהירות את התאים ומדיום התרבית מבקבוק תרבית הרקמה עם פיפטה סרולוגית לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב-300 x גרם עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו עם פיפטה של 25 מ"ל את המדיום מעל הגלולה, והשאירו כ-0.5 מ"ל בצינור.
  3. פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה פי 10 עם פיפטה של 1 מ"ל כדי לנתק את גלולת התא. ספור תאים באמצעות טריפן כחול והמוציטומטר.
  4. לאחר שספירת התאים הרצויה מוכנסת לתוך צינור טרי, שטפו פעמיים עם PBS על ידי השעיית התאים וכדוריהם ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן לקבוע את ספירת התאים כמתואר. לדוגמה, אם צריך להזריק 10 בעלי חיים בצפיפות תאים של 200,000 תאים, אז מספר התאים המינימלי הדרוש הוא 2 x 106.
  5. במהלך הכביסה הסופית, הסר כמה שיותר PBS. הניחו בעדינות את כדור התא ואת ההידרוג'ל של 50 מיקרוליטר מטריצה חוץ-תאית (ECM) על קרח.
    הערה: ניתן לחלק מראש את ההידרוג'ל ECM למנות של 50 מיקרוליטר על קרח באמצעות פיפטות מקוררות של 4 מעלות צלזיוס ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד הצורך. ניתן לשמור באופן זמני הידרוג'ל ECM על קרח כדי להפשיר לאט לשימוש ניסיוני לאחר מכן.
  6. מערבבים את כדור התא עם הידרוג'ל ECM להזרקה, במטרה להשלים שלב זה בהקדם האפשרי לפני תחילת הזרקות תוך גולגולתיות. כהליך סטנדרטי, השתמש ב -2 מיקרוליטר של התרחיף המכיל 200,000 תאים תלויים בהידרוג'ל ECM.
    הערה: אם הזרקות תוך גולגולתיות נמשכות יותר מ-2-3 שעות, יש להכין מלאי חדש של תאים, שכן דגירה ממושכת על קרח עלולה להפחית את כדאיות התאים. אפשר להזריק תוך גולגולת עד 1,000,000 תאים ובנפחים של עד 10 מיקרוליטר; עם זאת, זה ידרוש השעיה מחדש של התאים ב-PBS במקום בהידרוג'ל ECM ולהוסיף אותם בקצב הזרקה איטי מאוד.

3. הקמת ציוד סטריאוטקסי והרדמה

הערה: ההליך המפורט להלן עשוי להשתנות מעט בהתאם ליצרן הציוד הסטריאוטקסי ולסוג ההרדמה המועדף.

  1. התחל את ה-BSC על ידי חיטוי פני השטח שלו תחילה עם חומר ניקוי פוליסורבט 20 והניח לו לשבת במשך 10 דקות. לאחר מכן, נגב את המשטח עם 80% אתנול. לפני ההצבה בתוך מכסה המנוע של BSC, נגב כל ציוד עם 80% אתנול (הימנע מהרטבת כניסות חשמליות).
  2. מקם את לוחית הבסיס בתוך מכסה המנוע של BSC לפי איור 1, כאשר חרוט האף ממוקם בצד ימין (למשתמשים ימניים). ודא שהמניפולטורים XYZ כבר מודבקים על לוחית הבסיס ומאובטחים.
  3. חבר את קונסולת התצוגה הדיגיטלית לכניסה בחלק האחורי של לוחית הבסיס וחבר את כבל החשמל שלה לאספקת החשמל המסופקת בתוך מכסה המנוע של BSC (ראה איור 1). קונסולה זו רושמת את הקואורדינטות של תנועות המניפולטור XYZ.
  4. אבטח את מיכל מסנן הפחמן (לפלט הרדמה) ואת כניסת ההרדמה לשני השסתומים באף הניתן להסרה. החלק את חתיכת האף על חלק ההרכבה והדק את הבורג על המנגנון הסטריאוטקסי.
  5. חבר את מוטות האוזניים למחזיקים שלהם בכל צד של קטע ההרכבה, ואבטח אותם למקומם על ידי הידוק הברגים המוצמדים למחזיקים. ניתן לכסות את מוטות האוזניים ברפידות גזה או סרט חשמלי.
  6. הכניסו את מיטת הניתוח למכשיר, והתאימו את גובהה כך שיתיישר עם מוטות האוזניים, המאבטחים את החיה במקומה. עטפו את מיטת הניתוח בכרית מד כדי לשמור על חום החיה.
  7. חבר את כרית החימום לאספקת החשמל ומקם אותה מתחת לבעל החיים כדי לשמור על חום במהלך הליך ההרדמה.
  8. בתוך מכסה המנוע של BSC, מסדרים קצות כותנה סטריליים, קצות פיפטה של 20 מיקרוליטר, משחת עיניים, מגבוני איזופרופנול ארוזים בנפרד, דבק כירורגי ופיפטה של 20 מיקרוליטר. הרטיבו פד גזה ב-80% אתנול והניחו עליו מלקחיים סטריליים ואזמל.
  9. נקה את מזרק הזכוכית על ידי שטיפתו פי 5 באתנול 80% קר ולאחר מכן בתמיסת מלח קרה של 0.9%.
  10. למטרות קידוח, חבר את מנוע המקדחה לאספקת החשמל והתקן את המקדחה על מניפולטור XYZ, תוך הבטחת התאמה בטוחה על ידי הברגה הדוקה.
  11. החלף את רכיב המקדחה במחזיק המיקרו-מזרק מזכוכית למטרות הזרקת תאים. הסר את המקדחה על ידי שחרור הבורג במניפולטור XYZ והחלפתו במחזיק המזרק. ודא שהבורג מהודק לפני יישור מזרק הזכוכית עם החור שנקדח קודם לכן.
  12. לאחר השימוש במכשיר הסטריאוטקסי, פרק את כל הרכיבים וחטא אותם עם 80% אתנול לפני אחסונם בקופסת אחסון נקייה או בארון נטול אבק. השלך את כל החדים בצורה בטוחה ומתאימה למיכל חדים ייעודי.

4. הזרקה תוך גולגולתית

הערה: ניתן לבצע זריקות תוך גולגולתיות בעכברים זכרים ונקבות כאחד, אם כי בדרך כלל עדיפות עכברים נקבות, מכיוון שהן פחות מועדות לסיבוכי פצעים הנגרמים מתוקפנות בקרב זכרים. ההליך מבוצע בדרך כלל בעכברים בגילאי 7-10 שבועות, מה שמאפשר מספיק זמן להתפתחות הגידול. בדרך כלל, בעלי חיים מחולקים באופן אקראי בקבוצות של 4-6 לכלוב. זנים מדוכאי חיסון כגון BALB/c Nude, NOD-SCID ו-NSG משמשים בדרך כלל לפיתוח קסנוגרפט (PDX) שמקורו בחולה, מכיוון שמצבם החסר במערכת החיסון תומך בהשתלת גידול וצמיחתו24. בעוד שפרוטוקול זה מפרט את השימוש באיזופלורן להשראת הרדמה, ניתן להשתמש גם בחומרי הרדמה חלופיים כגון קטמין וקסילזין25. אם לא נעשה שימוש באיזופלורן, ניתן להשמיט מההליך שלבים הכוללים את תא ההרדמה והציוד הנלווה.

  1. שקלו ועקבו אחר הרווחה הכללית של בעלי החיים לפני ההליך התוך גולגולתי. יש לתת לבעלי החיים משכך כאבים כלוב אחד בכל פעם (למשל, בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג, תוך צפק) למשך עד שעה אחת לפני תחילת ההזרקה התוך גולגולתית.
  2. הגדר ציוד הרדמה בהתאם להנחיות המצורפות למכשיר. לפני תחילת ההליך, ודא שהוופורייזר מלא לפחות במחצית הדרך. ודא שאספקת החמצן פתוחה.
  3. אם לבעלי חיים יש פרווה, ניתן להסיר אותה יום לפני ההליך התוך גולגולתי או בו זמנית. הסר את הפרווה מאתר הניתוח בגב או בגולגולת העכבר בעזרת קוצץ חשמלי או סכין גילוח.
  4. העבירו את החיה לתא האינדוקציה להרדמה. ודא שמד הזרימה במכונת ההרדמה מוגדר לקצב זרימה של 1 ליטר לדקה, ומווסת החמצן הוא בין 40-50 psi. ודא שהרדמה בינונית נשמרת על ידי בדיקה שהשרירים רפויים והרפלקסים נעדרים.
  5. עקוב אחר תגובת החיה לגירויים והתבונן בתנועת דופן החזה כדי להבטיח נשימה יציבה. אם ההזרקות התוך גולגולתיות עולות על 10 דקות, עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית ומערכת ניטור טמפרטורה ועקוב אחר הדופק באמצעות אוקסימטר דופק
  6. הרכיבו את החיה על המכשיר הסטריאוטקסי, וודאו שהשיניים הקדמיות מקובעות במוט החתך וחרוט האף אבטח את החיה במקומה.
  7. חטא את ראש העכבר עם קצה כותנה ספוג יוד ולאחר מכן מגבון איזופרופנול. יש למרוח משחת עיניים קרנית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך הניתוח.
  8. התחל את החתך בבסיס המוח הקטן והאריך אותו על פני הגולגולת עד לנקודת האמצע, תוך יצירת חתך קטן באורך של כ -1 ס"מ לאורך ההיבט העליון של הגולגולת.
  9. הדק את העור בין האוזניים כדי לחשוף את הגולגולת ואבטח את הראש על ידי הידוק מוטות האוזניים. נקו את משטח הגולגולת וייבשו אותו עם צמר גפן.
  10. אבטח את המקדחה על המסגרת הסטריאוטקסית ואתר את הברגמה (או מבנה הכבש) באמצעות המקדחה.
    הערה: קואורדינטות סטריאוטקסיות ספציפיות נבחרות על סמך האזור האנטומי הנדרש למחקר החריטה. ניתן לקבל את הקואורדינטות המדויקות הללו מהספרות שפורסמה או לקבוע באמצעות משאבים כמו מוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקסיות26 אטלס, מה שמבטיח מיקוד מדויק להשתלה מוצלחת.
  11. לאחר קביעת הקואורדינטות, השתמש במקדחה כדי ליצור בזהירות חור קטן בעצם באתר המיועד לגליומה מפושטת של קו האמצע (DMG): X = +0.5, Y = -5.5, Z = -3.1 מברגמה; גידול מוח סופראטנטוריאלי (GBM או אפנדימומה): X = +1.5, Y = +1, Z = -3 מברגמה; גידול מוח אינפראטנטוריאלי (מדולובלסטומה, אפנדימומה): X = +2, Y = - 2, Z = -2 ממבנה למבדואיד.
  12. השעו את התאים מספר פעמים בעזרת פיפטה תוך הימנעות מבועות אוויר. שואבים 2 מיקרוליטר מתערובת התאים למזרק מיקרו זכוכית קרה שטוף מראש. חבר את המזרק למסגרת הסטריאוטקסית והתאם את המחט לקצה הגולגולת.
  13. הזרקו את התאים תוך 30 שניות לאזור הקדוח, וייבשו כל תרחיף תאים עם ריפלוקס במהלך ההזרקה.
    הערה: מכיוון שהתאים תלויים בהידרוג'ל ECM, ההזרקה צריכה להתרחש מהר מספיק כדי שתרחיף התאים לא יתמצק במזרק. ניתן להשתמש בצפיפות תאים משתנה כדי להעריך שיעורי השתלה שונים, כאשר צפיפות תאים גבוהה יותר מובילה בדרך כלל להשתלת גידול מהירה יותר.
  14. השאירו את המזרק במקומו למשך דקה אחת כדי למנוע זרימה חוזרת ולאפשר להידרוג'ל ECM להתייצב. הסר את המזרק ונגב את הפצע במגבון איזופרופנול. השתמש בדבק עור או בקליפסים לפצע כדי לאטום את החתך במידת הצורך.
  15. הנח את החיה במצב שכיבה בכלוב התאוששות נקי עם מנורת חום או על כרית חימום כדי להתחמם עד להתאוששות. עקוב אחר החיה ברציפות עד שהיא מתחילה לנוע בכוחות עצמה ולעתים קרובות לאחר מכן עד שהיא מראה התנהגות נורמלית.
  16. אם נמצא שבעל חיים נפתח מחדש פצע אטום בעבר במהלך ההחלמה, הרדמו את החיה שוב, נקו את הפצע עם מגבון איזופרופנול כדי להסיר את כל הדבק שנותר, ולאחר מכן אבטחו מחדש בעזרת סיכות.

5. ניטור לאחר ניתוח לחריטה

  1. לאחר ההזרקה התוך גולגולתית, התחל לעקוב אחר עכברים 5 ימים בשבוע (או יותר במידת הצורך). ספק טיפול עוקב, כגון זרעים או מזון רך, במהלך השבועיים הראשונים לאחר ההזרקה התוך גולגולתית. עקוב אחר בעלי חיים בקפידה עבור כל פתח פצע פוטנציאלי.
    הערה: אם נקבות חיות קצצו את פצעיהן, הן נשארות בארגז החול, מכיוון שלעתים רחוקות הן מפגינות תוקפנות. עבור בעלי חיים זכרים, אנו מספקים שני איגלואים בכלוב יחד עם העשרה נוספת כדי לסייע בהפחתת תוקפנות. במקרה הנדיר שבו מתרחשת תוקפנות ומובילה לפתיחת פצעים מחדש, הפצעים מאובטחים מחדש בעזרת סיכות, והתוקף מוסר מהקבוצה ושוכן בנפרד.
  2. רשום פרמטרים כלליים של רווחה כגון ירידה במשקל, רמת פעילות, יציבה, סימני התייבשות ומצב פרווה על גיליון הניטור.
  3. רשום בגיליון הניטור תסמינים נוירולוגיים לסירוגין, קלים או חמורים כגון הטיית ראש, אטקסיה ו/או התנהגות מעגלית.
  4. זהה תסמינים נוירולוגיים באופן הבא:
    1. התבונן וסווג את הדברים הבאים כתסמינים לסירוגין: הטיית ראש: נצפה 1-2 פעמים במהלך בדיקה של 5 דקות, רווחה כללית משביעת רצון. אטקסיה: נצפתה 1-2 פעמים במהלך בדיקה של 5 דקות; רווחה כללית משביעת רצון. מעגלי: נצפה 1-2 פעמים במהלך בדיקה של 5 דקות; רווחה כללית משביעת רצון. התנהגות: עכברים מראים התנהגות נורמלית, מסוגלים להגיע למזון/מים ולטפס.
    2. התבונן וסווג את הדברים הבאים כתסמינים קלים: הטיית ראש: מוצג באופן קבוע במהלך בדיקה של 5 דקות, רווחה כללית משביעת רצון. אטקסיה: מוצג באופן קבוע במהלך בדיקה של 5 דקות, רווחה כללית משביעת רצון. מעגלי: מוצג באופן קבוע במהלך בדיקה של 5 דקות, רווחה כללית משביעת רצון. התנהגות: לעכברים עשויה להיות פרווה פרועה או עור יבש, אך עדיין יכולים להפגין התנהגות נורמלית, להאכיל ולטפס.
    3. התבונן וסווג את הדברים הבאים כתסמינים חמורים: הטיית ראש: מוצג ברציפות במהלך הבדיקה, הטיה של כמעט 90 מעלות, פרווה פרועה ופחות פעילה. אטקסיה: מוצג ברציפות במהלך הבדיקה, תנועות שיכורות, פרווה פרועה ופחות פעילה. מעגלי: מוצג ברציפות במהלך הבדיקה, פרווה פרועה ופחות פעילה. התנהגות: לעכברים עשויה להיות פרווה פרועה מאוד או עור יבש. הם עשויים להפגין ירידה במשקל של מעל 15%. ספקו לבעלי חיים זרעים או מזון רך בשלב זה.
  5. קבע את נקודת הקצה ההומאנית עבור העכברים כאשר הם מציגים אחד מהסימנים הקליניים הבאים המעידים על צמיחת גידול המשפיעה על רווחתם: ירידה במשקל של 20% או יותר ממשקלם ההתחלתי, הטיית ראש חמורה, אטקסיה חמורה, מעגלים חמורים, עייפות או נשימה מאומצת. בשלב זה, המתת חסד אנושית של העכברים באמצעות חנקCO2 .

6. קצירת מוחות

  1. ודא שהחיה מורדמת באופן אנושי על ידי חנקCO2 או פריקת צוואר הרחם.
  2. בצע חתך בקו האמצע של 2 ס"מ לאורך הקרקפת בעזרת מספריים או אזמל. יש להפריד בזהירות ולקלף את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
  3. בעזרת מספריים עדינים או אזמל, בצע חתך זהיר של 2 ס"מ לאורך קו האמצע של הגולגולת. פתחו בעדינות את הגולגולת בעזרת מלקחיים, עבדו מהחלק האחורי של הראש לכיוון האף.
  4. המשיכו לחתוך לאורך צידי הגולגולת, תוך הקפדה על כך שלא ייגרם נזק לרקמת המוח שמתחתיה. לאחר פתיחת הגולגולת במלואה, נתק בזהירות את המוח מעצבי הגולגולת וכלי הדם באמצעות מלקחיים ומספריים.
  5. הרם את המוח בעדינות מחלל הגולגולת, החל מהגב והתקדם. אחסן את המוח בתנאים מתאימים בהתבסס על הדרישות של הליכי ניסוי עוקבים, כגון הקפאה או קיבוע. ניתוח אימונוהיסטוכימי של מוחות עשוי להשתנות בין מעבדות שונות. זרימת עבודה טיפוסית לסמן תאים מתפשט KI67 מתוארת בספרות שפורסמה20.

תוצאות

הזרקות אורתוטופיות באמצעות מכשיר סטריאוטקסי הפכו חיוניות לפיתוח מודלים של גידולי מוח. טכניקה זו מאפשרת מיקום מדויק וניתן לשחזור של תאי גידול, דבר חיוני להפקת נתונים עקביים ואמינים במחקר נוירו-אונקולוגי. היישום המוצלח של הזרקות אורתוטופיות מסתמך במידה רבה על הגדרה מדויקת של ציוד סטריאוטקסי, שכולל בדרך כלל מסגרת סטריאוטקסית, מיקרומניפולטור דיגיטלי לתנועות מדויקות, מזרק הזרקה ומערכת הרדמה כדי לשתק את החיה (איור 1A,B). השימוש במיקרו-מזרק זכוכית מאפשר הזרקה תוך גולגולתית של נפחים קטנים, בדרך כלל בין 2-5 מיקרוליטר. תחזוקה נכונה ושטיפה תכופה חיוניים למניעת הצטברות של חומר ביולוגי, שיכול לחסום את ההזרקה (איור 1C).

ההליך להזרקה תוך גולגולתית של תאי גידול מוח באמצעות ציוד סטריאוטקסי בעכברים כולל מספר שלבים מרכזיים. ראשית, העכבר מורדם כדי להישאר דומם ונוח לאורך כל ההליך. רמזים אופייניים המצביעים על כך שהחיה מורדמת כוללים היעדר תנועה ורפלקסים בעת צביטת הבוהן, כמו גם נוכחות של דפוס נשימה קבוע. לאחר מכן, העכבר ממוקם במסגרת סטריאוטקסית, ומאבטח את ראשו במצב קבוע (איור 2A). באמצעות ציוני דרך על הגולגולת, כגון ברגמה ולמבדה, נקבעות קואורדינטות מדויקות להזרקה. חתך קטן נעשה בקרקפת, וחור קוצים נקדח דרך הגולגולת בקואורדינטות שנבחרו (איור 2B). מחט מיקרו-הזרקה המחוברת לזרוע הסטריאוטקסית מוחדרת דרך חור הבור כדי להעביר את תאי הגידול לאזור המוח הרצוי (קליפת המוח, המוח הקטן או גזע המוח; איור 2C). ניטור והתאמה קפדניים של מיקום המחט מבטיחים מיקוד מדויק. לאחר ההזרקה, המחט נשלפת באיטיות, והחתך נסגר (איור 2D). הפצע האטום צפוי להחלים תוך שבועיים לאחר הזרקה תוך גולגולתית.

לאחר הזרקה תוך גולגולתית, בעלי חיים זקוקים לניטור קפדני לרווחה הכללית ולהתפתחות תסמינים נוירולוגיים, המצביעים לעתים קרובות על התקדמות הגידול (טבלה משלימה 1). בדרך כלל, בעלי חיים עשויים לחוות ירידה קלה במשקל במהלך השבוע הראשון לאחר ההזרקה (עד 10% ממשקלם הגבוה ביותר), אשר בדרך כלל מתייצב לאחר שאתרי ההזרקה אטומים לחלוטין עד סוף השבועהשני . בדרך כלל, בעלי חיים מציגים עלייה מתמדת במשקל ושומרים על בריאות כללית טובה עד להתקדמות הגידול. הביטוי של תסמינים נוירולוגיים משתנה בהתאם לגורמים כמו סוג הגידול במוח, אתר ההזרקה וזן בעלי החיים. לדוגמה, גליומות קליפת המוח עשויות להופיע עם ירידה מתקדמת במשקל והגדלה פוטנציאלית של המוח הקדמי, בעוד שגליומות בגזע המוח ומדולובלסטומה עשויות להפגין תסמינים כמו אטקסיה והטיית ראש, במיוחד בחיות מדוכאות חיסון (איור 3A). בנוסף, ניתן להבחין בהתנהגות מעגלית בבעלי חיים עם גידולים בגזע המוח, במיוחד בזני NSG או NOD/SCID. התקדמות התסמינים הנוירולוגיים עולה בקנה אחד עם ירידה הדרגתית במשקל. אמצעים נאותים לאחר הטיפול, כגון אספקת בקבוקי מים עם חרירים ארוכים או הצעת מזון רך (כדורי מזון רטובים) או זרעים, חיוניים לתמיכה ברווחת בעלי החיים. עם הגעה לנקודת הסיום של הניסוי והמתת החסד ההומאנית של החיות, שינויים פוטנציאליים במוח עשויים להתגלות, כולל הגדלה באתר ההזרקה ו/או נוכחות של אזורים דימומים (איור 3B).

גרפים של קפלן-מאייר משמשים בדרך כלל כדי לתאר את תוצאות ההישרדות של מודלים של בעלי חיים של גידולי מוח. הם מציעים תיאור חזותי של הסתברות ההישרדות לאורך זמן לאחר הזרקה תוך גולגולתית או טיפולים אנטי סרטניים. גרפים אלה משמשים ככלים חיוניים לניתוח והצגה של נתוני הישרדות במסגרות מחקר פרה-קליניות15,27. ביצענו זריקות תוך גולגולתיות של תרבית תאי מדולובלסטומה D425 בצפיפות תאים משתנה במוח הקטן. כל בעלי החיים שהוזרקו תוך גולגולת פיתחו גידולים. התוצאות שלנו הצביעו על כך שצפיפות תאים גבוהה יותר, במיוחד 50,000 ו-100,000 תאים לעכבר, הושתלו מהר יותר מ-10,000 תאים לעכבר (איור 4). יתר על כן, הזרקנו תוך גולגולת תאי גליומה בדרגה גבוהה (HGG) שמקורם בחולה לקליפת המוח ולגזע המוח כדי להשוות את ההישרדות הכוללת ואת דפוס צמיחת הגידול, כמו גם תכונות אימונוהיסטוכימיות, במיקומים שונים אלה. ללא קשר למיקום, לכל בעלי החיים הוזרקו גידולים שפותחו תוך גולגולת. התרבות של תאי HGG בוצעה בהתאם לפרוטוקול המפורט בשלבים 1.1 עד 1.10. הכנת התאים להזרקה תוך גולגולתית בוצעה כמתואר בשלבים 2.1 עד 2.6, בעוד שהליך ההזרקה התוך גולגולתית דבק בשיטה המתוארת בשלבים 4.1 עד 4.1627. כאשר הוזרקו לקליפת המוח, תאי HGG הראו הישרדות חציונית של כ-25 יום לאחר הזרקה תוך גולגולתית (איור 5A). בעלי החיים נוטרו כמתואר בשלבים 5.1 עד 5.4. בעלי חיים אלה לא הראו תסמינים נוירולוגיים כלשהם אך הראו ירידה מתקדמת במשקל. בעלי חיים הומתו באופן הומני עם הגעתם לנקודת הקצה ההומאנית המתוארת בשלב 5.5. המוחות נאספו בהתאם לפרוטוקול המפורט בשלבים 6.1 עד 6.5 ונשלחו לניתוח נוסף27. ניתוח אימונוהיסטוכימי חשף מסת גידול גדולה ובעלת גרעין גבוה עם עדות לכלי דם מוגברים (איור 5B) ותאי Ki67 מתרבים רבים (איור 5C). כאשר הוזרקו לגזע המוח, תאי HGG הראו הישרדות חציונית של כ-26 ימים לאחר ההזרקה התוך גולגולתית (איור 5D). ניתוח אימונוהיסטוכימי הצביע על מסת גידול גדולה באזור החדר הרביעי/פונס העליון, כמו גם חדירת לפטומנינגיאלית לחדר הצדדי (איור 5E). ניתוח אימונוהיסטוכימי נוסף הצביע על תאים מתרבים רבים בגזע המוח ובאזורים אחרים שחדרו אליהם (איור 5F). ניסוי זה מדגיש כי הזרקת אותם תאי גידול למיקומים אנטומיים שונים אינה משפיעה על קצב גדילת הגידול, אם כי נצפים כמה הבדלים בדפוס הגידול.

figure-results-1
איור 1: תמונות מייצגות של המערך הסטריאוטקסי להזרקה תוך גולגולתית של תאי גידול במוח. (A) מנגנון ההרדמה ממוקם בדרך כלל ליד מכסה המנוע של BSC, מה שמחייב מתן כפול של הרדמה הן לתא האינדוקציה והן למנגנון הסטריאוטקסי. (ב) תחנת שטיפת מיקרו-מזרק מזכוכית ומחזיק סטריאוטקסי; המזרק דורש שטיפה במי מלח, אתנול ולאחר מכן מים לאחר כל הזרקה תוך גולגולתית. (C) מערך סטריאוטקסי בתוך מכסה המנוע של BSC, הממחיש את תא ההרדמה, מכונת הקידוח, המכשיר הסטריאוטקסי, קונסולת הקואורדינטות הסטריאוטקסית, קצות הכותנה, אזמל, פינצטה, פיפטה וקצוות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות מייצגות של הזרקה תוך גולגולתית המבוצעת על עכבר מדוכא חיסון. (A) בעל חיים מורדם הממוקם בקונוס הרדמה. (B) חתך בעור ואחריו אבטחת העור לכל צד באמצעות מוטות אוזניים. (C) מיקרו-מזרק זכוכית הממוקם על גבי החור הקדוח להזרקה. (D) העור יוצר סגנון מוהוק לאחר ההדבקה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תסמינים נוירולוגיים פוטנציאליים שנצפו לאחר השתלה של תאי גידול במוח. (A) בעל חיים המציג הטיית ראש בעקבות הזרקה תוך גולגולתית של תאי DMG בגזע המוח. (B) הגדלה של ההמיספרה הימנית של קליפת המוח כאשר צד ההזרקה חושף היווצרות גידול. לחיה הוזרקו תאי אפנדימומה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: השתלה של תרבית המדולובלסטומה D425 בצפיפות תאים שונה. תאי מדולובלסטומה הוזרקו תוך גולגולתית באמצעות ציוד סטריאוטקסי בצפיפות של 10,000 תאים ב-2 מיקרוליטר של הידרוג'ל ECM, 50,000 תאים ו-100,000 תאים. בעלי חיים היו במעקב אחר ירידה מתקדמת במשקל והורדמו באופן אנושי ברגע שהגיעו ל-20% מתחת למשקל הגבוה ביותר שתועד שלהם. ההישרדות החציונית של בעלי חיים שהוזרקו עם 10,000 תאים הייתה 29 ימים, בעוד שההישרדות החציונית עבור אלה שהוזרקו עם צפיפות תאים גבוהה יותר של 50,000 ו-100,000 תאים הייתה 17.5 ימים ו-15 ימים, בהתאמה. כל בעלי החיים שהוזרקו במחקר זה פיתחו בהצלחה גידולים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: עקומות הישרדות מייצגות וניתוח היסטולוגי של חיות NSG שהוזרקו תוך גולגולת עם תאי HGG בקליפת המוח ובגזע המוח. כ-100,000 תאי HGG (מעבר 3) הוזרקו ל-2 מיקרוליטר של הידרוג'ל ECM באמצעות ציוד סטריאוטקסי. בעלי חיים היו במעקב אחר ירידה מתקדמת במשקל והורדמו באופן אנושי ברגע שהגיעו ל-20% מתחת למשקל הגבוה ביותר שתועד שלהם. לא נצפו תסמינים נוירולוגיים עבור תת-סוג זה של גידול מוח. (A) ההישרדות החציונית של חיות עם תאי HGG שהוזרקו לקליפת המוח היא כ-25 ימים לאחר ההזרקה (N=2). (B) צביעת H&E של קליפת המוח מראה אזור בעל גרעין גבוה עם כלי דם מוגברים, שמסומן על ידי נוכחות של תאי דם אדומים. (C) האזור המושתל בגידול בקליפת המוח מציג רמה גבוהה של תאים מתרבים, כפי שמוצג על ידי צביעת KI67. (D) ההישרדות החציונית של חיות עם תאי HGG שהוזרקו לגזע המוח היא כ-26 ימים לאחר ההזרקה (N=2). כל בעלי החיים שהוזרקו במחקר זה פיתחו בהצלחה גידולים. (E) צביעת H&E של גזע המוח מראה אזור בעל גרעין גבוה עם חדירת גידול שנצפתה בלפטומנינגים בחדר הצדדי. (F) האזור המושתל בגידול בגזע המוח מציג רמה גבוהה של תאים מתרבים, כפי שמוצג על ידי צביעת KI67. פס קנה המידה השחור בתמונות הראשיות מציין 2 מ"מ, בעוד שהתמונות המוגדלות מציינות 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: טופס ניטור המשמש לבדיקת זריקות פוסט-גולגולתיות של בעלי חיים וטיפול פוטנציאלי בתרופות אנטי-סרטניות. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

דיון

בעוד שטכניקת ההזרקה התוך גולגולתית המפורטת במחקר זה מספקת שיטה חזקה להקמת מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט שמקורו בחולה (PDX) לגידולי מוח בילדים, מספר תחומים זקוקים לשיפור. גישה אחת לשיפור הטכניקה כוללת אופטימיזציה של תהליך הכנת תאי הגידול. זה כולל זיקוק החומרים המשמשים להשתלת תאי הגידול. בעוד שהידרוג'ל ECM נחשב לתקן הזהב, שימוש בהידרוג'לים המורכבים מרכיבים הדומים יותר לאלה של המוח או הגידול ECM יכול לשפר את ההישרדות וההשתלה של תאי BT. גישה זו מועילה במיוחד לסוגי גידולים עם תקופות השתלה ארוכות יותר, כגון מדולובלסטומה ואפנדימומות. לדוגמה, הוכח כי קולגן ממלא תפקיד קריטי בצמיחה של מדולובלסטומה מקבוצה 3, ואילו למינין תומך בסוג SHH של מדולובלסטומה28. בנוסף, הנוקשות של ה-ECM עשויה גם להשפיע על צמיחת הגידול. גליובלסטומה בדרגה גבוהה, למשל, מציגה נוקשות גבוהה יותר בליבה בהשוואה לרקמת מוח רגילה, מה שעשוי לתמוך בצמיחת הגידול ובהישרדותו29. על ידי התאמת הרכב ה-ECM והקשיחות כך שיתאימו לדרישות הספציפיות של סוגי גידולים שונים, ניתן לשפר משמעותית את ההשתלה והצמיחה של דגמי PDX.

כמה מחקרים שנערכו לאחרונה סיפקו תובנות חשובות לגבי טיפול בדגימות גידול של מטופלים ופיתוח מודלים של PDX. צולי ועמיתיו הדגישו כי השתלה ישירה של רקמת DMG מביאה בדרך כלל לשיעורי השתלה גבוהים יותר מאשר תרביות ראשוניות15. סמית ועמיתיו הקימו 37 מודלים של PDX באמצעות הזרקה תוך גולגולתית של ביופסיות גידול מוח או דגימות נתיחה שלאחר המוות, ודיווחו על שיעור הצלחה כולל של 43%, כאשר HGGs הראו את שיעור ההשתלה הגבוה ביותר (100%), ואחריהם מדולובלסטומה (45%) ואפנדימומות (25%). חביון הגידול השתנה מאוד, בין חודש ל-11 חודשים, כאשר גידולים אגרסיביים יותר השתרשו מהר יותר11. לעומת זאת, ברבץ ועמיתיו דיווחו על שיעור הצלחה כללי נמוך יותר של 30%, כאשר HGGs הציגו שיעור השתלה של 31% ושיעורים נמוכים יותר עבור מדולובלסטומה (37%) ואפנדימומות (17%)16. למרות ההבדלים הללו, שני המחקרים האחרונים שנערכו על ידי Smith et al. ו-Brabetz et al. אישרו כי מודלי ה-PDX סיכמו בדרך כלל את גידולי החולים ברמות אימונוהיסטוכימית ומולקולרית, אם כי נצפו פערים גנומיים קלים בין דגימות הגידול המקוריות למודלים המבוססים. ממצאים אלה מדגישים את האתגרים בפיתוח מודלים מייצגים של PDX ומדגישים את השונות בהצלחת ההשתלה בין סוגי הגידולים11,16.

מגבלה משמעותית אחת של הגישה האורתוטופית היא חוסר היכולת למדוד במדויק את גודל הגידול אלא אם כן נעשה שימוש במערכת הדמיה, כגון הדמיית קסנוגן, אם תאי הגידול מתויגים בלוציפראז או הדמיית תהודה מגנטית (MRI). תיוג תאי גידול עם לוציפראז יכול לספק פתרון על ידי מתן אפשרות להדמיה ביולוגית כדי לאשר את ההשתלה ולעקוב אחר התקדמות הגידול באופן לא פולשני. שיטה זו תשפר את היכולת לעקוב אחר התגובה לטיפול באופן דינמי, ובכך תציע הערכה מדויקת יותר של יעילות הטיפול17,30. שיטה חלופית כוללת שימוש בטכנולוגיית MRI; עם זאת, יכולת הגילוי של גידולים תלויה בגודלם. גידולים גדולים יותר מזוהים בקלות רבה יותר, וזה לרוב בנקודת הסיום של הניסוי, והגילוי עשוי להשתנות גם בהתאם לתת-סוג הגידול, כאשר GBM מזוהה בקלות רבה יותר מאשר גליומות מפוזרות27,31. במיוחד עבור גליומות מפושטות, נוכחות של מחסום דם-מוח שלם (BBB) מובילה לחוסר שיפור ניגודיות. ב-GBM, לעומת זאת, כלי דם דולפים ונוכחות בצקת יכולים להגביר את הניגודיות בין רקמת הגידול לרקמת המוח הבריאה שמסביב, מה שעשוי לסייע בתהליך הזיהוי. בדרך כלל, יש צורך בחומרים מנוגדים כדי לשפר את הזיהוי 30,31,32. טכניקות הדמיה חלופיות כגון הדמיה משוקללת דיפוזיה (DWI) והתאוששות היפוך מוחלש נוזל (FLAIR) משמשות לפעמים לשיפור הזיהוי של אזורי גידול שאינם משפרים. עם זאת, לשיטות אלה יש גם מגבלות והן עשויות לא תמיד לספק תיחום מדויק של גבולות הגידול33. הדמיית Amide Proton Transfer-weighted (APTw) היא טכניקת MRI לא פולשנית המזהה גליומות מפוזרות על ידי מעקב אחר חילופי פרוטון חלבון-מים, ומסייעת בדירוג הגידול. למרות שהוא מבטיח, הוא מתמודד עם אתגרים כמו רגישות לחפצים ועדיין לא הותאם להדמיה של בעלי חיים קטנים, מה שמגבילאת היישום הרחב יותר שלו.

היבט מכריע נוסף שיש לקחת בחשבון בעת שימוש במודלים אורתוטופיים של BT PDX למחקרי יעילות תרופות הוא שלמות ה-BBB במודלים של PDX המשמשים. החדירות של ה-BBB משפיעה באופן משמעותי על אספקת התרופות ועל היעילות בטיפול בגידולי מוח. לדוגמה, שלמות ה-BBB הנשמרת בגליומות בגזע המוח מביאה לעתים קרובות לחדירה לקויה של תרופות, מה שמגביל את היעילות של טיפולים מערכתיים17. מצד שני, במדולובלסטומות מקבוצה 3, שלמות ה-BBB נצפתה כהטרוגנית בהדמיית MRI, והיא נמצאה דולפת במודלים של קסנוגרפט שמקורו בחולה (PDX)35. לכן, אפיון מצב ה-BBB - בין אם הוא שלם או דולף - בכל מודל PDX חיוני לתכנון אסטרטגיות טיפוליות מתאימות ולפירוש מדויק של תוצאות מחקרי יעילות התרופות.

בסך הכל, הליך ההזרקה התוך גולגולתית המתואר מציע גישה חזקה לביסוס מודלים של BT PDX וביצוע מחקרי יעילות עבור חומרים טיפוליים. המשך שיפורים, יחד עם הבנה מקיפה של מודלים אלה, יגדילו את התועלת שלהם ויאפשרו פיתוח התערבויות טיפוליות לחולי BT ילדים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים למטופלים, לרופאים ולחוקרים של רשת בתי החולים לילדים של סידני, רשת בנק הגידולים לילדים של סידני ותוכנית אפס סרטן בילדים על שסיפקו בנדיבות את הדגימות החיוניות לביסוס מתודולוגיה זו. המכון לסרטן ילדים באוסטרליה מזוהה עם אוניברסיטת ניו סאות' ויילס סידני ורשת בתי החולים לילדים של סידני. פרוטוקול זה נובע ממאמצי מחקר הנתמכים על ידי מענקים מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (מענק סינרגיה #2019056, מענק מנהיגות APP2017898 ל-DZ) ומענק תוכנית המכון לסרטן ניו סאות' ויילס (TPG2037 ל-DZ ו-MT), כמו גם תמיכה מפרויקט ליוויס, פרויקט סרטן הילדים, הריפוי מתחיל עכשיו, שיתוף פעולה של DIPG, הקרן לריפוי סרטן המוח, קרן רוברט קונור דאוס וקרן בני ווילס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומר הרדמה (למשל איזופלורן)מרק792632
100% אתנולמרק459844
70% אתנולנהנההכינו 70% אתנול מ-100% אתנול ודיללו אותו במים סטריליים
80% אתנולנהנההכינו 80% אתנול מ-100% אתנול ודיללו אותו במים סטריליים
שקופיות מיקרוסקופ דבקמרקZ681156
משכך כאבים (בופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"ל)ג'ורוקסנה
מיכל מסנן פחמןציוד וטרינרי931401
צינורות חרוטיים 15 מ"ל (פלקון)פישר סיינטיפיק14-959-53א
צינורות חרוטיים 50 מ"ל (פלקון)פישר סיינטיפיק14-432-22
DMSOמרק472301
מוטות אוזנייםקופף1921
הידרוג'ל ECM (מטריג'ל, קורנינג)מרקE1270
משחת עיניים (Poly Visc)כימאי ישיר 719986
סרום עגל עוברימרקF0926
מיקרו-מזרק זכוכיתהמילטון7002
מגבוני איזופרופנולמדיסהSUL_LWMS-1
נוגדן KI67אבקםab209897
צינורות מיקרוצנטריפוגהאפנדורף211-2130
מקדחה מיקרו-מקדחת  0.028 אינץ'קופף8170
יחידת מיקרו-הזרקהקופף5004
PBSמרקעמ' 4474
פיפטה 10 מ"לקורנינגCLS4488
פיפטה 1 מ"ל אפנדורף3123000063
פיפטה 200uLאפנדורף3123000055
פיפטה 20uLאפנדורף3123000098
פיפטה 25 מ"לקורנינגCLS4489
קצה פיפטה 1 מ"לקורנינגCLS4868
קצה פיפטה 200uLקורנינגCLS4860
חומר ניקוי פוליסורבט 20 (F10SC)בריאות והיגיינהG3070
אוקסימטר דופק (MouseSTAT)קנט סיינטיפיקSPO2-MSE
ריודין (פובידון-יוד)מרקY0000466
אזמל (חד פעמי)מדיסהSUL_SCALPEL
דבק עור Vetbondמדיסה3M_1469SB
מכשיר סטריאוטקטי לחיות קטנות עם קונסולת תצוגה דיגיטלית קופף940
תרגיל סטריאוטקטי  קופף1474
מערכת ניטור טמפרטורה מנגנון הרווארד55-7020
טריפאן כחולמרק93595

מקורות

  1. Mueller, S., Chang, S. Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches. Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).
  2. Packer, R. J. Brain tumors in children. Arch Neurol. 56 (4), 421-425 (1999).
  3. Paugh, B. S., et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. 28 (18), 3061-3068 (2010).
  4. MacDonald, T. J., Aguilera, D., Kramm, C. M. Treatment of high-grade glioma in children and adolescents. Neuro Oncol. 13 (10), 1049-1058 (2011).
  5. Rutka, J. T. Malignant brain tumours in children : Present and future perspectives. J Korean Neurosurg Soc. 61 (3), 402-406 (2018).
  6. Cho, Y. J., et al. Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome. J Clin Oncol. 29 (11), 1424-1430 (2011).
  7. Thomas, A., Noel, G. Medulloblastoma: optimizing care with a multidisciplinary approach. J Multidiscip Healthc. 12, 335-347 (2019).
  8. Pajtler, K. W., et al. Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups. Cancer Cell. 27 (5), 728-743 (2015).
  9. Thorp, N., Gandola, L. Management of ependymoma in children, adolescents and young adults. Clin Oncol. 31 (3), 162-170 (2019).
  10. Upton, D. H., Ziegler, D. S., Tsoli, M. Development of orthotopic patient-derived xenograft models of pediatric intracranial tumors. Methods Mol Biol. 2806, 75-90 (2024).
  11. Smith, K. S., et al. Patient-derived orthotopic xenografts of pediatric brain tumors: a St. Jude resource. Acta Neuropathol. 140 (2), 209-225 (2020).
  12. Akter, F., et al. Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1875 (1), 188458(2021).
  13. Stribbling, S. M., Ryan, A. J. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 17 (9), 2108-2128 (2022).
  14. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nat Commun. 12 (1), 4089(2021).
  15. Tsoli, M., et al. International experience in the development of patient-derived xenograft models of diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. 141 (2), 253-263 (2019).
  16. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nat Med. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  17. Khan, A., et al. Dual targeting of polyamine synthesis and uptake in diffuse intrinsic pontine gliomas. Nat Commun. 12 (1), 971(2021).
  18. Chen, Y., et al. Preclinical evaluation of protein synthesis inhibitor omacetaxine in pediatric brainstem gliomas. Neurooncol Adv. 6 (1), vdae029(2024).
  19. Ung, C., et al. Doxorubicin-loaded gold nanoarchitectures as a therapeutic strategy against diffuse intrinsic pontine glioma. Cancers (Basel). 13 (6), 1278(2021).
  20. Ehteda, A., et al. Dual targeting of the epigenome via FACT complex and histone deacetylase is a potent treatment strategy for DIPG. Cell Rep. 35 (2), 108994(2021).
  21. Mayoh, C., et al. High-throughput drug screening of primary tumor cells identifies therapeutic strategies for treating children with high-risk cancer. Cancer Res. 83 (16), 2716-2732 (2023).
  22. Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). J Vis Exp. (121), e55360(2017).
  23. Whitehouse, J. P., et al. In vivo loss of tumorigenicity in a patient-derived orthotopic xenograft mouse model of ependymoma. Front Oncol. 13, 1123492(2023).
  24. Hermans, E., Hulleman, E. Patient-derived orthotopic xenograft models of pediatric brain tumors: In a mature phase or still in its infancy. Front Oncol. 9, 1418(2019).
  25. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  26. Paxinos, G., Franklin, K. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 5th edn, Academic Press. (2019).
  27. Tsoli, M., et al. Integration of genomics, high throughput drug screening, and personalized xenograft models as a novel precision medicine paradigm for high risk pediatric cancer. Cancer Biol Ther. 19 (12), 1078-1087 (2018).
  28. Yang, H., et al. Roles and interactions of tumor microenvironment components in medulloblastoma with implications for novel therapeutics. Genes Chromosomes Cancer. 63 (4), e23233(2024).
  29. Kondapaneni, R. V., et al. Glioblastoma mechanobiology at multiple length scales. Biomater Adv. 160, 213860(2024).
  30. Mahmoudian, E., Jahani-Asl, A. Establishing brain tumor stem cell culture from patient brain tumors and imaging analysis of patient-derived xenografts. Methods Mol Biol. 2736, 177-192 (2024).
  31. Oudin, A., Moreno-Sanchez, P. M., Baus, V., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Magnetic resonance imaging-guided intracranial resection of glioblastoma tumors in patient-derived orthotopic xenografts leads to clinically relevant tumor recurrence. BMC Cancer. 24 (1), 3(2024).
  32. Bauer, S., Wiest, R., Nolte, L. P., Reyes, M. A survey of MRI-based medical image analysis for brain tumor studies. Phys Med Biol. 58 (13), R97-R129 (2013).
  33. Lasocki, A., Gaillard, F. Non-contrast-enhancing tumor: A new frontier in glioblastoma research. AJNR Am J Neuroradiol. 40 (5), 758-765 (2019).
  34. Nichelli, L., Zaiss, M., Casagranda, S. APT weighted imaging in diffuse gliomas. BJR Open. 5 (1), 20230025(2023).
  35. Genovesi, L. A., et al. Patient-derived orthotopic xenograft models of medulloblastoma lack a functional blood-brain barrier. Neuro Oncol. 23 (5), 732-742 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גידול מוח אורתוטופיהזרקה תוך-גולגוליתגידול מוח פדיאטריגליומה מידלינית מפושטתמחסום דם-מוחהשתבשות גידולתרבית נוירוספירותאנליזה אימונוהיסטוכימית
הקמת מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט שמקורם בחולה לגידולי מוח באמצעות מכשיר סטריאוטקסי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.