מאמר שיטה

גרימת כניסתם של צעירי פיזור שלב שלישי של Bursaphelenchus xylophilus לקריפטוביוזיס באמצעות ויסות אוסמוטי

859 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67350

⸱

27 בדצמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להשראת פיזור של צעירים בשלב השלישי (צעירים טרום-דאואר, JIII.) של Bursaphelenchus xylophilus לקריפטוביוזיס באמצעות ויסות אוסמוטי של יוני אשלגן כלורי (KCl). שיטה זו יכולה לספק תמיכה טכנית למחקר על מנגנוני עמידות הלחץ של B. xylophilus.

תקציר

קריפטוביוזיס הוא מצב שבו אורגניזמים מאבדים כמעט את כל המים הפנימיים שלהם ונכנסים לאנהידרוביוזה תחת לחץ סביבתי קיצוני. הצעירים בשלב השלישי של פיזור (צעירים טרום-דאואר, figure-abstract-1) של Bursaphelenchus xylophilus יכולים להיכנס לקריפטוביוזיס באמצעות התייבשות ולהתעורר לתחייה עם התייבשות כאשר תנאי הסביבה משתפרים. ויסות אוסמוטי חיוני להישרדותם בתהליך זה. במחקר זה, דגימות של figure-abstract-2 B. xylophilus נאספו מאורן מסוניאנה מת עקב מחלת נבילת אורן בנינגבו, מחוז ג'ג'יאנג, סין. לאחר טבילה בתמיסת אשלגן כלורי 8% (KCl), figure-abstract-3 B. xylophilus נכנס למצב קריפטוביוטי לאחר התייבשות הדרגתית עקב לחץ אוסמוטי חיצוני מוגבר על ידי אידוי מים טבעי. figure-abstract-4 B. xylophilus יכול לעמוד בפני לחץ בטמפרטורה נמוכה ב-20 מעלות צלזיוס. figure-abstract-5 B . xylophilus יכול להתעורר לחיים עם התייבשות, עם שיעור הישרדות של 92.1%. תהליך זה יכול לווסת את כניסתו של figure-abstract-6 B. xylophilus לקריפטוביוזיס, ולאפשר להם להתנגד לסביבות קיצוניות. שיטה זו המתוארת במחקר שלנו היא פשוטה ואמינה, ומספקת תמיכה טכנית לחקר מנגנוני עמידות הלחץ של B. xylophilus.

מבוא

מחלת נבילת האורן היא אחת ממחלות היער הקשות ביותר בסין1. נמטודת עץ האורן Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) מהווה איום משמעותי על מיני אורנים כגון Pinus massoniana (P. massoniana) על ידי רבייה בתוך הפונדקאי, מה שמוביל לנבילה מהירה ומוות. בתנאים סביבתיים לא נוחים לאחר מות הפונדקאי, צעירי הרבייה של B. xylophilus עשויים להיכנס לצעירים טרום-דאואר (figure-introduction-1). צעירים אלה מחפשים וקטורים של חרקים כדי להמשיך את העברתם והתפשטותם, מה שגורם למוות נרחב של יערות אורנים2.

קריפטוביוזיס הוא מצב שבו אורגניזמים מאבדים כמעט את כל המים הפנימיים שלהם ונכנסים לאנהידרוביוזה תחת לחץ סביבתי קיצוני3. בתהליך זה, אורגניזמים מתייבשים בהדרגה, וכתוצאה מכך תנועה נעצרת, חילוף חומרים מופחת ומחזור חיים מושעה4. בתנאים מתאימים, הם יכולים להתאושש עם החזרת נוזלים. קריפטוביוזיס מאפשרת לאורגניזמים להתנגד לסביבות קיצוניות, כגון טמפרטורות נמוכות, ולהאריך את תוחלת החיים שלהם5. נמטודות ששרדו בקריפטוביוזה במשך 30,000 שנה נמצאו בקפאת-עד6 באנטארקטיקה.

מחקרים קודמים הראו כי נמטודות יכולות להסתגל לגורמי לחץ אביוטיים שונים - כגון טמפרטורה נמוכה, בצורת ולחץ אוסמוטי גבוה - במהלך התייבשות על ידי התאמת חדירות פני השטח שלהן7. בנוסף, נמטודות יכולות לסלסל את גופן כדי להקטין את שטח הפנים ולמזער את קצב אובדן המים. לדוגמה, Caenorhabditis elegans מווסת את האיזון האוסמוטי, ומאפשר ליונים ומולקולות קטנות לעבור בחופשיות דרך הקוטיקולה שלו, בעוד שמולקולות גדולות יותר אינן יכולות8. figure-introduction-2 B. xylophilus מציג גם קריפטוביוזיס. במהלך שלבי ההתייבשות וההתייבשות של קריפטוביוזיס, ויסות אוסמוטי חיוני לשליטה על חילופי החומרים על פני הציפורן, מה שהופך אותו למרכזי לכניסה או התאוששות מקריפטוביוזיס9.

המחקר הנוכחי מציג שיטה להשראת קריפטוביוזיס ב-B figure-introduction-3 . xylophilus באמצעות ויסות אוסמוטי. שיטה זו פשוטה, יעילה ואמינה ביותר, ומספקת תמיכה טכנית לחקר מנגנוני עמידות הלחץ של figure-introduction-4 B. xylophilus.

פרוטוקול

1. אוסף B figure-protocol-1 . xylophilus

  1. אוסף דיסקים נגועים של P. massoniana
    הערה: כל הנהלים עמדו באמצעים המנהליים לאזור מגפת מחלת נבילת אורן ועץ נגוע ותקנות רלוונטיות אחרות. יער P. massoniana נגוע ב-B. xylophilus במחוז שיאנגשאן, העיר נינגבו, מחוז ג'ה-ג'יאנג, נבחר כאתר הדגימה. P. massoniana, שמת ממחלת נבילת האורן, נכרת באתר הדגימה.
    1. אוספים בולי עץ עגולים (בעובי 5 ס"מ) מהחלקים העליונים, האמצעיים והתחתונים של הגזע הראשי של העצים הכרותים.
    2. חותכים את בולי העץ העגולים שנאספו של P. massoniana לפרוסות בעובי 0.5-1 ס"מ, ואז חותכים אותם לרצועות קטנות באורך 2-3 ס"מ.
    3. מניחים את רצועות העץ הקטנות בשקיות אטומות ומאחסנים אותן במעבדה לשימוש נוסף.
  2. מיצוי של figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. חבר צינור גומי לקצה הצר של משפך זכוכית ארוך צוואר בקוטר משוער של 15 ס"מ. אבטח את צינור הגומי בעזרת פינצ'ק. הנח את המשפך המורכב על מעמד משפך.
    2. עטפו את רצועות העץ הקטנות לחלוטין בשכבה אחת של נייר טישו ולאחר מכן הניחו אותן במשפך. הוסף מים מזוקקים למשפך עד שכל רצועות העץ שקועות.
      הערה: לאחר עמידה של 12-24 שעות, הנמטודות נדדו מתוך רצועות העץ והתיישבו בתחתית המשפך10. נייר טישו מנע מפסולת עץ לשקוע תוך שהוא מאפשר לנמטודות לעבור דרכו.
    3. משחררים את הפינצ'קוק בתחתית המשפך לאט, ונותנים ל-2000-5000 מיקרוליטר מהתערובת לדלוף לתוך צלחת פטרי (בקוטר 5 ס"מ) לבדיקה מיקרוסקופית וזיהוי מורפולוגי.
    4. זהה figure-protocol-3 את B. xylophilus על ידי התבוננות בתכונות כגון סגנונות, פקעות הוושט החציוניות, טיפות שומן וצורות זנב "דמויות אצבע"11.
    5. תחת מיקרוסקופ, העבירו B. xylophilus בודד figure-protocol-4 לשקופית על ידי שאיבת 10 מיקרוליטר של נוזל יחד עם נמטודה אחת באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר בכל פעם. חזור על תהליך זה 30 פעמים כדי לאסוף כ-300 מיקרוליטר מהתערובת המכילה נמטודות.
    6. לאחר מיצוי B figure-protocol-5 . xylophilus, יש לעקר את רצועות העץ הנותרות וחומרי העץ הנגועים כדי למנוע זיהום נוסף.

2. בקרת תהליכי ויסות אוסמוטי

  1. הכנת תערובת ויסות אוסמוטי
    1. הכן תמיסה מימית של 8% KCl.
    2. בעזרת פיפטה, הוסיפו 10 מיקרוליטר מהתמיסה המימית של 8% KCl לשקופית המכילה את התערובת של figure-protocol-6 B. xylophilus, והניבו כ-310 מיקרוליטר של תערובת של הנמטודות ותמיסת KCl.
  2. ויסות לחץ אוסמוטי מוגבר והתייבשות של figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ, ואפשר למים להתאדות באופן טבעי. זה יגביר בהדרגה את הלחץ האוסמוטי של הסביבה הסובבת, ויגרום לנמטודות להתייבש במשך כ-30-60 דקות.
      הערה: המפעיל צריך רק לחכות שהמים יתאדו באופן טבעי עד שגבישי ה-KCL ישקעו ולהתבונן במצב הנמטודות במיקרוסקופ. לוקח בערך 30-60 דקות עד ש-310 מיקרוליטר מהתערובת מתאדה באופן טבעי עד שגבישי ה-KCL משקעים.
    2. התבוננו בתהליך ההתייבשות (למשל, סלסול הגוף, צבירה וכו') של figure-protocol-8 B. xylophilus תחת המיקרוסקופ. כאשר המים מתאדים לחלוטין וגבישי KCl משקעים, figure-protocol-9 B. xylophilus מפסיק לנוע ונכנס לקריפטוביוזיס.
  3. טיפול במאמץ בטמפרטורה נמוכה של קריפטוביוטיקה figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. מקמו את הקריפטוביוטיקה figure-protocol-11 B. xylophilus בסביבת טמפרטורה קבועה של -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  4. ויסות ירידה בלחץ האוסמוטי והחזרת נוזלים של figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. הוסיפו כ-300 מיקרוליטר של מים מזוקקים סביב הצעירים שעברו טיפול בטמפרטורה נמוכה על ידי פיפטה. תהליך ההתייבשות, הנמשך כ- 30-60 דקות, מפחית בהדרגה את הלחץ האוסמוטי של הסביבה הסובבת אותם.
    2. התבוננו בתהליך ההתייבשות של figure-protocol-13 B. xylophilus (למשל, מתיחת הגוף, חידוש התנועה וכו') תחת המיקרוסקופ. חשב את שיעור ההישרדות לאחר 24 שעות.

תוצאות

בתמיסת 8% KCl, כאשר המים התאדו, figure-results-1 B. xylophilus הראה בתחילה "סלסול" ניכר בעודו נשאר תנועתי (איור 1A). ברגע שהמים התאדו לחלוטין, הנמטודות הפסיקו את תנועתן והתכרבלו, עם משטחים מדוכאים וטיפות שומנים שהצטברו (איור 1B), מה שמצביע על כניסתן למצב קריפטוביוט. עם הוספת מים מזוקקים לסביבה הסובבת אותן, הנמטודות התייבשו והתעוררו לתחייה (איור 1C). אחרי שהמים מתאדים, יופיעו גבישי KCL (איור 1D). איור 1E מראה את המאפיינים המורפולוגיים של figure-results-2 B. xylophilus.

ניסוי התייבשות הראה כי בתמיסה ראשונית של 8% KCl, אידוי מים גרם figure-results-3 ל-B. xylophilus לאבד מים. לאחר התייבשות, figure-results-4 B. xylophilus היה נתון ללחץ בטמפרטורה נמוכה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות; שיעור ההישרדות הממוצע היה 92.1%11. בהשוואה לשיעור הישרדות של 0% בקבוצת הביקורת שלא נכנסה למצב קריפטוביוטי, הנתונים לעיל הצביעו על כך שהתייבשות יכולה לשפר משמעותית את שיעור ההישרדות של figure-results-5 B. xylophilus בתנאי טמפרטורה נמוכה.

במהלך שלב ההתייבשות לאחר הקריפטוביוזה של figure-results-6 B. xylophilus, ראינו ש-100% מהנמטודות הראו "בועות" in vivo כאשר הועברו מתמיסת 40% KCl למים מזוקקים (איור 2).

figure-results-7
איור 1: תהליך התייבשות-קריפטוביוזיס-החזרת נוזלים של figure-results-8 B. xylophilus. תמונה זו ממחישה את תהליך הקריפטוביוזיס ב-B figure-results-9 . xylophilus, כולל (A) שלב ההתייבשות, (B) שלב הקריפטוביוזה, (C) שלב ההתייבשות, (D) שלב ההתגבשות של KCL, ו-(E) figure-results-10 B. xylophilus. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11
איור 2: הצטברות של גרגירי שומן ב-B. xylophilus שלא הוקם לתחייהfigure-results-12. תמונה זו מציגה את מצבו של figure-results-13 B. xylophilus לאחר התייבשות, המאופיין בנוכחות גרגירי שומן בצורת בועה in vivo. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

במחקר זה, figure-discussion-1 B. xylophilus נאסף מ-P. massoniana מת בנינגבו, מחוז ג'ג'יאנג. יש לציין כי figure-discussion-2 B. xylophilus נבחר מאוכלוסייה מעורבת עם כוכבים שונים. באופן ספציפי, נבחרו בולי עץ עגולים עם צפיפות גבוהה של B. xylophilus, ואחריהם הקרנה של figure-discussion-3 B. xylophilus. במהלך החורף, כאשר הטמפרטורה המינימלית היומית במחוז ליאונינג היא בסביבות -20 מעלות צלזיוס, ניתן להשיג מספר רב של B. xylophilus חד-כוכב figure-discussion-4 מ-Pinus tabuliformis מת, מה שפשט את תהליך הברירה בניסוי זה12.

במהלך התהליך הקריפטוביוטי, קצב ההתייבשות האיטי של הנמטודות מועיל להישרדותן ומונע נזק מבני לחלבונים שלהן13. זמן ההתייבשות הוא קריטי בקביעת שיעור ההישרדות של figure-discussion-5 B. xylophilus. במחקר זה נעשה שימוש בתמיסת KCl בריכוז התחלתי של 8%, וריכוזו עלה בהדרגה עם אידוי טבעי של מים, מה שאפשר figure-discussion-6 ל-B. xylophilus להתייבש לאט ולהיכנס לקריפטוביוזיס. אם מים מתאדים מהר מדי או שהנמטודות ממוקמות ישירות בתמיסת KCl בריכוז גבוה, שיעור ההישרדות שלהן יורד משמעותית.

לשיטה המתוארת במחקר זה מספר יתרונות. חומרי הניסוי נגישים בקלות, ודורשים רק תמיסת KCl ומים מזוקקים כדי לווסת את ההתייבשות וההתייבשות של figure-discussion-7 B. xylophilus. ההליכים פשוטים: התייבשות התרחשה באמצעות אידוי טבעי, והחזרת נוזלים הושגה על ידי הוספת מים מזוקקים. ניתן להשלים את התהליך כולו תוך שעתיים. שיטה זו מתגאה בשיעורי הצלחה והישרדות גבוהים, כאשר רוב B figure-discussion-8 . xylophilus נכנס לקריפטוביוזיס לאחר התייבשות ורובם מתעוררים לאחר התייבשות, בהתאמה.

השיטה המוצעת ישימה לוויסות המצב הקריפטוביוטי הן של B. xylophilus והן figure-discussion-9 של צעירי הפיזור בשלב הרביעי (figure-discussion-10)14. עם זאת, ייתכן שהוא לא יהיה יעיל עבור B. xylophilus המתפשט.

בשנים האחרונות, מחלת נבול האורן הנגרמת על ידי B. xylophilus התפשטה מדרום סין לאזורים צפוניים. figure-discussion-11 B. xylophilus, המאכלס את עצי האורן באזורים הצפוניים הקרים יותר, נוטה להפגין עמידות גדולה יותר לקור15. השיטה המוצעת יכולה לגרום לקריפטוביוזיס ב-B figure-discussion-12 . xylophilus, ולשפר את עמידותם לקור ובצורת. באופן קולקטיבי, שיטה זו יכולה לספק תמיכה טכנית לחקר מנגנוני העמידות ללחץ של B. xylophilus ומנגנון ההעברה של מחלת נבילת האורן.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי קרן המחקר הבסיסית של המוסד המדעי המרכזי לאינטרס ציבורי של מעבדת המפתח הממלכתית לגנטיקה והשבחה של עצים (מענק מספר CAFYBB2020ZY001-2), פרויקטי מחקר ארגוניים (202404016-4320) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 32271896).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגלשת זכוכיתביולנדGS7101-752575 מ"מ ופיתו; 25 מ"מ ופיתו; 1 מ"מ
משפך זכוכית ארוך צווארנאנג'ינג Kangluoda טכנולוגיה ניסיוניתלא ישים150 מ"מ
מיקרוסקופפניקסXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
צלחת פטרינאנג'ינג Kangluoda טכנולוגיה ניסיונית  ט.ב.-62493579274550 מ"מ ופעמים; 50 מ"מ
פינצ'קוקנאנג'ינג Kangluoda טכנולוגיה ניסיונית  ט.ב. -62497331174336 מ"מ ופעמים; 11 מ"מ  וזמנים; 55 מ"מ
פיפטהאפנדורף312300001210– 100 ומיקרו; L
אשלגן כלורי (KCL)סולארביו מדעי החייםעמ' 9921500 גרם
צינור גומינאנג'ינג Kangluoda טכנולוגיה ניסיוניתט.ב.-6249234570947 מ"מ ופעמים; 5 מ"מ
סטריליזטורבין-ג'יאנג https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu<> _score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75 ליטר
נייר טישו חותם מלב אל לבM322.5 ס"מ ופעמים; 21.5 ס"מ

מקורות

  1. Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
  2. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
  3. Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
  4. Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
  5. Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
  6. Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
  7. Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
  8. Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
  9. Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
  10. Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
  11. Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
  12. Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
  13. Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
  14. Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
  15. Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Juvenile

מאמרים קשורים