מאמר שיטה

ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי גורמי רקמה בטסיות בבני אדם

DOI:

10.3791/67356

⸱

22 בנובמבר 2024

 ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מפרט את הפרוטוקול לכימות אחוז הטסיות החיוביות לפקטור רקמה (TF) באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלאה, תוך הערכת החלבון: (1) תוך-תאית במצבי מנוחה, ו-(2) על פני התא, הן במנוחה והן בתנאי פעילות. ניתנת גם הנחיות להערכת טסיות חיוביות TF בפלזמה עשירה בטסיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תת-קבוצה של טסיות דם במחזור הדם, מאחסנת את פקטור הרקמה (TF) תוך-תאי, שהוא המפעיל המרכזי של מפל קרישת הדם והיווצרות הקריש. עם הפעלת הטסיות, TF נחשף על ממברנת התא, שם הוא נקשר ל-FVII, ובסופו של דבר מוביל ליצירת טרומבינים. בהתחשב בכך ש-(1) רמות הטסיות החיוביות ל-TF עולות בסביבות קליניות שונות, התורמות לפנוטיפ הפרותרומבוטי של המטופל, ו-(2) תרופות שונות יכולות לווסת את ביטוי ה-TF הקשור לטסיות, שיטה סטנדרטית להערכת טסיות חיוביות ל-TF היא בעלת ערך, שכן הערכתה הייתה שנויה במחלוקת בעבר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אחוז הטסיות החיוביות ל-TF באמצעות ציטומטריית זרימה בדם מלא ובפלזמה עשירה בטסיות (PRP)/טסיות שטופות. פרוטוקול זה נועד לספק הוראות מפורטות לכמת אחוז הטסיות החיוביות ל-TF על ידי הערכת החלבון (1) תוך-תאית בתנאי מנוחה, ו-(2) על פני התא, הן במנוחה והן בתנאי פעילות. החלק הראשון מספק מידע חיוני לביצוע נכון של גזילת דם, כדי להבטיח שפרוצדורות טרום-אנליטיות לא ישפיעו על התוצאות. לאחר מכן, הפרוטוקול מתמקד בהליכי הכנת דגימות וסימון לניתוח ציטומטריית זרימה. מפורטים שלבים מפורטים לגירוי תאים, תיוג, קיבוע וחדירות – במידת הצורך. לבסוף, מתוארות הוראות להגדרות ציטומטריית זרימה לזיהוי נכון של אוכלוסיית הטסיות ולניתוח אירועים חיוביים ל-TF. לבסוף, השיטה כוללת את ההליך להכנת PRP אם טסיות חיוביות ל-TF אמורות להימדד בטסיות מבודדות. מכיוון שרק תת-קבוצה של טסיות מכילה TF, חשוב לוודא שהטסיות הללו לא יאבדו במהלך שלבי הצנטריפוגה הנדרשים לקבלת PRP.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורם רקמה (TF), גליקופרוטאין טרנסממברנלי ומפעיל מפתח של מפל קרישת הדם, מבוטא על ידי תת-קבוצה, ~20%-30%, של טסיות אדםבמחזור 1, במיוחד כאלה עם גודלגדול יותר 2. עם הפעלה על ידי אגוניסטים קלאסיים כמו אדנוזין דיפוספט (ADP) ותרומבין, הטסיות חושפות TF פעיל פונקציונלית על פני השטח שלהם באופן תלוי בריכוז, מה שמאפשר להם להיקשר לפקטור VII/VIIa, מה שמוביל בסופו של דבר ליצירת תרומבינים 1,3,4,5,6. במיוחד, במצבים פתולוגיים כגון מחלת עורקים כליליים (CAD)7, זיהום תסמונת נשימתית חריפה חמורה - קורונה-2 (SARS-CoV-2)8, מיגרנה עם אאורה הקשורה לפורמן ביצי פטנט (MHA-PFO)9, סרטן10 וספסיס11, מספר הטסיות החיוביות TF עולה משמעותית, מה שתורם לסיכון הקרישי הגבוה יותר שנצפה בהקשרים קליניים אלו.

למרות הראיות המשכנעות הללו, גילוי טסיות חיוביות ל-TF נותר נושא לדיון בקהילה המדעית 6,12,13. אתגרים מתודולוגיים, כולל משתנים טרום-אנליטיים, הכנת דגימה וספציפיות נוגדנים, הוצעו כסיבות אפשריות לתוצאות הסותרות שדווחו בספרות 2,4,12,14. לכן, חשוב לקבוע מבחן סטנדרטי המבוסס על פרוטוקול מוגדר היטב למדידת TF בטסיות בבני אדם.

בהקשר זה, ציטומטריית זרימת דם מלאה היא הטכנולוגיה היחידה שמאפשרת ניתוח טסיות חיוביות ל-TF עם טיפול מינימלי בדגימה, דבר קריטי למניעת אובדן תת-הטסיות הללו.

במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול למדידת TF הקשור לטסיות באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלאה, תוך הערכת החלבון (1) תוך-תאית בתנאי מנוחה ו-(2) על פני התא הן במנוחה והן בתנאי פעילות. ניתנות גם הוראות אם נדרשת הערכה של טסיות חיוביות TF בפלזמה עשירה בטסיות (PRP).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד (מס' 70/24, CE 18.06.24), והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל תורמי הדם. הפרוטוקול ינחה את המשתמש דרך שבעה שלבים עיקריים (איור 1). השלב הראשון עוסק בתהליך ביצוע דגימת דם. שלבים 2 ו-3 מתארים את פרוטוקול טיטרציית הנוגדנים והכנת הדגימה לניתוח ביטוי TF תוך-תאי באמצעות נוגדן מונוקלונלי (mAb) המסומן על ידי phycoerythrin (PE) αCD142/HTF1. שלב 4 מתאר את הפרוטוקול להערכת החלבון החשוף על פני הטסיות באמצעות שיטת צביעה עקיפה עם αCD142/HTF1 mAb. עקב ההפרעה הסטרית של הפלואורוכרום, ה-mAb המסומן ב-PE המשמש לצביעה תוך-תאית אינו נקשר לתחום הקטליטי של החלבון החשוף על פני השטח. לכן, מוצע פרוטוקול לצביעה עקיפה עם mAb משני מסומן ב-Alexa Fluor 633. שלבים 5 ו-6 מפרטים את שלבי ניתוח ציטומטריית הזרימה. השלב האחרון מפרט את ההליך להכנת פלזמה עשירה בטסיות (PRP) כדי למנוע אובדן תת-אוכלוסיית הטסיות בגודל גדול. פרטי הריאגנטים והציוד בהם השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

1. גמילה מדם

הערה: איסוף דם אנושי צריך להתבצע רק לאחר קבלת אישור הוועדה האתית.

  1. אספו דגימות דם באמצעות דגימת ורידי פריפריאלית או מחטים-קנולה מזרוע שאינה מושפעת מעירוי ורידי היקפי, רצוי מהווריד האנטקוביטלי.
    1. לדגימה ורידית היקפית, יש להניח את חום העורקים ולאחר הכנסת מחט פרפר G19 לווריד, להסיר אותו כדי למנוע הפעלת טסיות (איור 2).
      הערה: אין להשתמש במחט פרפר קטנה מ-G21 כדי למנוע הפעלת טסיות.
    2. לדגימה ורידית עם מחט-קנולה, אין להניח את החוסם בשום שלב במהלך הדגימה. אם צריך, שטוף את הדגימה בתמיסת תמיסת מלח של 0.9% לפני הלוקחה. תמיד זורקים את 5 מ"ל הדם הראשונים לפני שמתחילים למלא את הצינורות.
  2. שואב 2 מ"ל דם לשואב אבק EDTA (לשימוש בספירת תאי דם). ערבבו בעדינות את הצינור שלוש פעמים כדי להבטיח ערבוב מלא של הדם ונוגד הקרישה.
  3. משוך דם לשאיב אבק נתרן ציטראט בנפח 0.129 מ' לניתוח ביטוי TF הקשור לטסיות. מלא בזהירות את השואב לרמה הרצויה כדי לשמור על יחס דם לנוגדי קרישה נכון. הפוך בעדינות את הצינורות חמש פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי של הדם עם נוגד הקרישה, ולמנוע יצירת קרישים וההמוליזה של הדגימות.
    הערה: מומלץ להשתמש בנוגד קרישה ציטראט 0.129 M כדי למקסם את זיהוי TF הקשור לטסיות עם שיבוט HTF1 של αCD142 mAb. אם יש צורך לבודד טסיות מדם מלא, יש למשוך שואב אבק שני בנפח 0.129 M נתרן ציטראט להכנת פלזמה עשירה בטסיות (PRP).
  4. שמור על שואבי אבק זקופים במחזיק צינור. אל תנער אותם על לוחות מסתובבים או מוטים, והימנע ממערכות העברה פנאומטיות. אין לקרר את דגימות הדם כדי למנוע הפעלת טסיות.
    הערה: דגימות דם צריכות לעבור עיבוד רצוי תוך 15 דקות לאחר הגמילה אם יש למדוד סמן הפעלה נוסף הקשור לגרנולים יחד עם TF. אחרת, יש לעבד דגימות לא יאוחר מ-3 שעות מהאיסוף (איור 3).

2. טיטרציה של נוגדן האנטי-TF (להערכת TF תוך-תאי)

הערה: קביעת TF המאוחסן תוך-תאית מתבצעת באמצעות PE-αCD142/HTF1 mAb.

  1. טיטרציה של נוגדנים באמצעות חרוזים
    הערה: השימוש בחרוזים מאפשר להגדיר את כמות הנוגדן הנכונה לשימוש (כלומר, ריכוז הנוגדנים שמייצר את ההפרדה הגדולה ביותר בין שיאי פלואורסצנציה בין דגימות חיוביות לשליליות). ניתוח זה מתבצע באמצעות שני מדגמים, אחד חיובי באמת ואחד שלילי באמת. ריכוז הנוגדנים אינו מדווח על ידי היצרן (ראו טבלת חומרים), ולכן מתבצעת טיטרציה של נוגדנים באמצעות חמש נקודות דילול.
    1. צנטריפוגה את הנוגדן ב-17,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. להכנת חמש נקודות דילול הנוגדנים, פיפטה של 40 מיקרוליטר נוגדן לצינור 1 ו-20 מיקרוליטר PBS לצינורות 2 עד 5. יש לבצע ארבעה דילול סדרתיים רצופים של 1:2 על ידי העברת 20 מיקרוליטר מצינור 1 לצינור 2 ומשם הלאה.
    2. הכינו מבחנה אחת לכל נפח נוגדנים לבדיקה. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים וטיפה אחת של חרוזים חיוביים לכל מבחנה. הוסף 20 מיקרוליטר מכל דילול נוגדנים למבחנה ולמערבולת מיד. דגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    3. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, לכל צינור ומערבולת.
    4. רכוש את הדגימות על ציטומטר הזרימה לפי הוראות היצרן ורשום קובץ נתונים של 10,000 אירועים בשער ה"חרוזים". ריכוז הנוגדנים האופטימלי הוא זה שמספק את ההפרדה הגדולה ביותר בין שיאים חיוביים לשליליים.
  2. טיטרציה של נוגדנים על טסיות
    הערה: ככלל, ריכוז הנוגדנים האופטימלי שזוהה באמצעות החרוזים צריך להיות מאומת על התאים שצובעים - במקרה זה, טסיות דם מלא.
    1. קיבוע
      1. הפכו בעדינות את שואב הנתרן ציטראט חמש פעמים כדי לערבב היטב את הדם ונוגד הקרישה. העבר 50 מיקרוליטר דם לצינור בנפח 1.5 מ"ל, הוסיף 950 מיקרוליטר של 1% פאראפורמלדהיד (PFA), ערבב בעדינות, ודגר את הדגימה במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. צנטריפוגה את הדגימה בעוצמה של 1,500 x g למשך 5 דקות, עם בלם, בטמפרטורת החדר.
      3. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור לתלייה על ידי פיפטינג עדין של 1 מ"ל של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4.
    2. פרמיאביליזציה
      1. הכינו שפופרת אחת לכל נפח נוגדן לבדיקה (בדקו את הנפח המזוהה עם טיטרציה של החרוזים יחד עם דילול גבוה ונמוך, לדוגמה, 10 מיקרוליטר, 5 מיקרוליטר, 2.5 מיקרוליטר אם הנפח מזוהה הוא 5 מיקרוליטר) ושפופרת אחת לבקרת פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO).
      2. מזרים 100 מיקרוליטר דם קבוע לכל צינור וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 5 דקות, עם בלם, בטמפרטורת החדר.
      3. הסר את הסופרנאנט, החזיר את הכדור ל-100 מיקרוליטר של 0.1% טריטון-PBS לחדירת הדגימות, ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. כתמים
      1. צנטריפוגה את הנוגדן ב-17,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C. הוסף את נפחי הנוגדנים הנדרשים לכל מבחנה כפי שנקבע ב-2.2.2.1 ומערבב.
      2. דגרו את הדגימות ל-15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
      3. הוסף 300 מיקרוליטר של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, לכל צינור ומערבב. רכוש את הדגימות על ציטומטר הזרימה (ראו שלב 5).
      4. חשב את מדד הכתם לפי הנוסחההבאה 15:
                               figure-protocol-1
        כאשר MFIpos היא עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של האירועים החיוביים, MFIשלילי היא עוצמת האירועים השליליים, ו-SD היא סטיית התקן של האוכלוסייה השלילית.
      5. בחר את ריכוז הנוגדנים הנמוך ביותר שמספק את מדד הכתם הגבוה ביותר.
        הערה: בתנאים הניסיוניים הנוכחיים, מדד הכתם הגבוה ביותר עבור PE-αCD142/HTF1 mAb מושג באמצעות 5 מיקרוליטר נוגדן.

3. הכנת דגימה לניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי TF תוך-תאי

  1. קיבוע דם מלא וחדירות
    1. לניתוח TF תוך-תאי, יש לתקן ולחדור דם מלא בהתאם להליך המתואר בשלב 2.
  2. הליך צביעה
    הערה: בפרוטוקול הבא, אוכלוסיית הטסיות מזוהה באמצעות צביעת αCD61-PerCP. ניתן להשתמש בסמני אוכלוסייה נוספים לפי שיקול דעתו של המפעיל.
    1. הכינו שפופרת אחת לבקרת פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) ושפופרת אחת לצביעת TF. הוסף 100 מיקרוליטר דם מלא קבוע וחדיר לכל צינור יחד עם הנוגדנים המפורטים בטבלה 1.
    2. דגרו את הדגימות ל-15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    3. הוסף 300 מיקרוליטר של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, לכל צינור ומערבב. אחסן את הדגימות המוכתמות בחושך עד לניתוח ציטומטריית זרימה (ראה שלב 5).
      הערה: כדי לחשב את מטריצת הפיצוי, יש להכין את הדגימות כפי שמתואר בטבלה 2.

4. הכנת דגימה לניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי TF הקשור לפני שטח התא בטסיות מנוחה ומופעלות

הערה: לזיהוי TF הקשור לפני שטח התא, השתמש ב-αCD142/HTF1 mAb לא מתויג (1 מ"ג/מ"ל) וב-Alexa Fluor 633 נגד עכבר IgG לעזים (2 מ"ג/מ"ל) כנוגדן משני לזיהוי אותות. אדנוזין 5'-דיפוספט (ADP) משמש כאגוניסט לטסיות כדי לגרום לחשיפת TF על פני התא. נוגדן מסומן ב-PE משמש כסמן אוכלוסיית טסיות כדי למזער דליפה, אשר ייבדק באמצעות פיצוי אות.

  1. צביעת TF
    1. מדלל αCD142/HTF1 mAb 1:100 ב-1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, כדי לקבל ריכוז עבודה של 10 מיקרוגרם/מ"ל. מדלל אלקסה פלואר 633 נגד עכבר עזים IgG 1:10 ב-1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, כדי לקבל ריכוז עבודה של 200 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. הכינו את שלושת צינורות הדגימה וזרקו 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, כפי שמוצג בטבלה 3.
    3. מחלקים 7.5 מיקרוליטר של αCD142/HTF1 mAb מדולל ומוסיפים 5 מיקרוליטר ADP (200 מיקרומון) לקבלת ריכוז סופי של 10 מיקרומום ADP. הפוך בעדינות את שואב האבק הציטראטי 5 פעמים כדי לערבב היטב את הדם ונוגד הקרישה, ואז מזין 5 מיקרו ליטר דם מלא לכל צינור. מערבבים בעדינות את הדגימות.
    4. דגרו את הדגימות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. קיבוע דגימה
    1. מתקן כל דגימה על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של 1% פאראפורמלדהיד (PFA) ודגירה של הדגימות למשך שעה בטמפרטורת החדר.
      הערה: דגימות מסומנות שקבועות עם 1% PFA ומאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס נשארות יציבות עד 4 ימים.
    2. הוסף 300 מיקרוליטר של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, לכל צינור ולצנטריפוגה ב-1500 x g למשך 5 דקות עם בלימה בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור ל-95 מיקרוליטר של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, על ידי פיפטינג עדין.
  3. צביעה בנוגדן משני
    1. זרקו 5 מיקרולטר של אלקסה פלואר 633 IgG מדולל ודגרו את הדגימות למשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    2. הוסף 300 מיקרוליטר של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, לכל צינור ולצנטריפוגה ב-1500 x g למשך 5 דקות עם בלימה בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט ותלווה מחדש את הכדור ב-95 מיקרוליטר של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4.
    3. הזרקו 5 מיקרוליטר αCD41-PE לכל צינור (ראו טבלה 4). דגרו את הדגימות ל-15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    4. הוסף 300 מיקרוליטר של 1x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, pH 7.4, לכל צינור ומערבב.
    5. אחסן את הדגימות המוכתמות בחושך עד לניתוח ציטומטריית זרימה (ראה שלב 6).
      הערה: כדי לחשב את מטריצת הפיצוי, יש להכין את הדגימות לפי שלבים 4.1-4.3 וכפי שמפורט בטבלה 5 ובטבלה 6.

5. ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי TF תוך-תאי

הערה: ההליך הבא מתייחס לרכישות על ציטומטר זרימה ייחוס; לכן, הסביבות והערוצים המדווחים צריכים להיחשב מייצגים. הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל ציטומטר זרימה בעל רגישות גבוהה ודור חדש. הפעל את ציטומטר הזרימה זמן רב לפני איסוף הדגימה כדי להבטיח יציבות לייזר. שטוף היטב את הנוזלים ותאי הזרימה, שכן הטסיות קטנות, וכל פסולת תא עלולה להפריע להצגת אוכלוסיית הטסיות באזור הפיזור הקדמי/אזור הפיזור הצדדי (FSC-A/SSC-A). בצע בקרת איכות עם חרוזי QC לפי הוראות היצרן ושוטף שוב את הנוזלים כדי להסיר שאריות חרוזים.

  1. הגדרת רכישה
    1. צור גרף נקודות FSC-A/SSC-A בסולם לוגר המציג את כל האירועים (איור 4A). צור תרשים נקודות CD61-A/SSC-A על סולם לוג המציג את כל האירועים (איור 4B).
    2. כוון את הרווח של ה-PE (Y-585) ו-PerCP (B690) בהתאם לבקרת האיכות היומית. קבע את הסף לכ-2000 ב-SSC-H ול-1000 ב-PerCP (B690-H) כדי להמחיש את אוכלוסיית הטסיות. הגדר את קצב הזרימה ל-LOW.
    3. צייר אזור בין 103 ל-105 שנקרא "CD61+" כדי לזהות את אוכלוסיית הטסיות.
    4. רכש בקרות צביעה אחת כדי לחשב את מטריצת הפיצוי ואז לאסוף את הדגימות. רשם קובץ נתונים של 10,000 אירועים בתוך שער "CD61+" (איור 4D,E). תתחיל להקליט 5-10 שניות אחרי תחילת איסוף הדגימות.

6. ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי TF על פני השטח

  1. צור תרשים נקודות FSC-A/SSC-A על סולם לוגריתם המציג את כל האירועים (איור 5A), ותרשים נקודות CD41-A/SSC-A על סולם לוגריתם המציג את כל האירועים (איור 5B).
  2. כוונו את הרווח של Alexa Fluor 633 ואת העלייה ב-PE (Y-585) בהתאם לבקרת איכות יומית, קבעו את הסף לכ-1000 ב-SSC-H ול-2500 ב-PE (Y585-H) כדי להמחיש את אוכלוסיית הטסיות כפי שמוצג באיור 5B. הגדר את קצב הזרימה ל-LOW.
  3. צייר אזור בין 104 ל-105 שנקרא "CD41+" כדי לזהות את אוכלוסיית הטסיות.
  4. רכש בקרות צביעה אחת כדי לחשב את מטריצת הפיצוי ואז לאסוף את הדגימות. רשם קובץ נתונים של 10,000 אירועים בתוך שער "CD41+" (איור 5D,E). תתחיל להקליט 5-10 שניות אחרי תחילת איסוף הדגימות.

7. ניתוח טסיות חיוביות ל-TF בפלזמה עשירה בטסיות

  1. הכנת פלזמה עשירה בטסיות (PRP)
    הערה: יש לבצע בידוד טסיות בטמפרטורת החדר כדי למנוע הפעלת תאים. ודא שטמפרטורת החומרים והמכשירים היא בין 18 מעלות צלזיוס ל-22 מעלות צלזיוס. הימנע מפיפטינג מהיר וניעור חזק לאורך כל התהליך.
    1. ערבבו בעדינות את שואב הנתרן ציטראט של 0.129 M 5 פעמים ומדדו את מספר הטסיות פעמיים על מד תאי דם כדי לחשב את אחוז הטסיות שהתאוששו.
      הערה: השתמשו בערך הממוצע של שתי ההגדרות כרכוז הטסיות.
    2. צנטריפוגה את שואב הנתרן ציטראט בנפח 0.129 M ב-100 x גרם למשך 10 דקות, ללא בלם, בטמפרטורת החדר (איור 6). אסוף את ה-PRP שהתקבל, העבר אותו לצינור פוליפרופילן בנפח 10 מ"ל, ותעדו את הנפח שנאסף.
      הערה: אין להשתמש בצינורות פוליסטירן כדי למנוע הפעלת טסיות.
    3. ספירת טסיות פעמיים ב-PRP באמצעות מד תאי דם ומחשבה את אחוז ההתאוששות מהטסיות כך:
      figure-protocol-2
      הערה: אם ההחלמה נמוכה מ-65%, אוכלוסיית הטסיות אינה מייצגת במלואה את זה בדם מלא. שקול לוותר על ההכנה.
  2. הכנת דגימה לניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי תוך-תאי וביטוי TF הקשור למשטח ב-PRP
    1. לניתוח ביטוי תוך-תאי ומשטח של TF ב-PRP, השתמשו באותו פרוטוקול שתואר לניתוח דם מלא (ראו שלבים 3-6).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיכום של ניתוח ביטוי TF הקשור לטסיות מתואר בדיאגרמת הזרימה המוצג באיור 1. השלבים כוללים: (1) איסוף דם: איסוף דם מהווריד ההיקפי האנושי, רצוי מהווריד האנטקוביטלי, באמצעות מחט פרפר G19 או קנולה מחט ללא חוסם עורקים ועם ואקוטנים המכילים נוגדי קרישה. (2) עיבוד דגימות: עיבוד הדגימות לפי סוג הערכת TF שתבצע. (3) תיוג דגימה: יש לסמן את הדגימות בנוגדנים ספציפיים. (4) ניתוח ציטומטריית זרימה: ניתוח הדגימות לזיהוי TF שטחי ותוך-תאי.

במהלך גזילת דם, יש לשים לב במיוחד כדי למנוע הפעלת טסיות. לשם כך, ננקטים שני אמצעי זהירות: הסרת החוסם זמן קצר לאחר הכנסת המחט לווריד, והשלכת הדם בשואב האבק הראשון שנלקח. ללא השימוש בחוסם הדם, אוכלוסיית הטסיות, המוצגת בגרף נקודות FSC-A/SSC-A, בעלת צורה טיפוסית, כפי שמוצג באיור 2A. לעומת זאת, בשימוש בטורניקט, התכונות הפיזיקליות של אוכלוסיית הטסיות יוצרות צורה מוארכת הדומה למורפולוגיה שנצפתה לאחר גירוי עם אגוניסט טסיות קלאסי, כגון ADP (איור 2B,C).

ניסויים שנערכו להערכת יציבות ביטוי TF הקשור לטסיות לאורך זמן הראו כי הוא היה יציב במשך 3 שעות מאיסוף הדם (איור 3). כאשר משלבים מדידת ביטוי TF עם מדד של הפעלת טסיות, כגון P-selectin, מומלץ לעבד את דגימת הדם בהקדם האפשרי כדי למנוע דהגרנולציה של טסיות.

לניתוח TF המאוחסן תוך-תאי, דם מלא מקובע ב-1% PFA, מוחדר ב-PBS-Triton, ואז צובע בנוגדן מסומן ב-PE. אוכלוסיית הטסיות מזוהה בגרף לוגריתמי FSC-A/SSC-A (איור 4 A,D) ובאמצעות צביעת αCD61 mAb (איור 4 B,E). תוצאות הניתוח של TF תוך-תאי בנבדקים בריאים (n = 377) הראו כי TF נמצא בטווח של 26.8% ±-4.8% מהטסיות המסתובבות (איור 4F).

ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי TF הקשור למשטח בוצע במצבי מנוחה ולאחר גירוי תא עם ADP 10 מיקרומון. אוכלוסיית כל טסיות הדם, המסומנת ב-αCD41 mAb, זוהתה בגרף לוגריתמי FSC-A/SSC-A (איור 5A,B). התוצאות הראו כי בנבדקים בריאים (n = 377), TF מתבטא ב-2.8% ±-1.4% מהטסיות במנוחה (איור 5D-F) ועולה עד 24.5% ±-5.8% לאחר ההפעלה (איור 5G-I). TF מבוטא על ידי תת-הקבוצה של הטסיות עם הגודל הגדול ביותר (איור 5D, G, נקודות ירוקות). יתרה מזאת, ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה מדגישה שאות TF קשור רק ל-αCD61 חיובי ולא לאירועים חיוביים של αCD45 (איור 7).

כפי שצוין קודם, TF מאוחסן בתת-קבוצה של טסיות המאופיינות בגודל הגדול ביותר בתוך כל האוכלוסייה. לכן, חשוב לא לאבד את החלק הזה של הטסיות במהלך הכנת PRP. בהתאם לאינדיקציות בסעיף השיטה (שלב 7), ניתן לבודד אוכלוסיית טסיות בתוך PRP המייצגת את זו הקיימת בדם מלא. כפי שמוצג באיור 6, תרשים נקודות זרימה-ציטומטריה של אוכלוסיית הטסיות שהושג על ידי צנטריפוגציה של 100 x גרם דם מלא דומה מאוד לזה של דם מלא מבחינת התפלגות FSC (איור 6 A,B). לעומת זאת, באמצעות כוח גבוה יותר וזמן צנטריפוגציה ארוך יותר, כפי שמדווח לעיתים בספרות 12,14,16, לאוכלוסיית הטסיות שהתאוששה יש FSC נמוך יותר בהשוואה לזו של דם מלא (איור 6C), מה שמרמז על אובדן הטסיות הגדולות יותר, שהן אלו החיוביות ל-TF גבוה.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה סכמטית לניתוח ביטוי TF הקשור לטסיות ובידוד טסיות. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה רחבה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: גרפים מייצגים של צפיפות אוכלוסיית הטסיות שנותחו באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלאה. (א) אוכלוסיית טסיות שנבדקה בדגימת דם שנלקחה ללא חוסם דם או (ב) עם חוסם הדם. (ג) דווח על אוכלוסיית טסיות שגורתה באמצעות ADP להשוואה. WBC: תאי דם לבנים; תאי דם אדומים: תאי דם אדומים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: יציבות ביטוי TF הקשור לפני שטח התא לאורך זמן. ביטוי TF הקשור לטסיות דם של טסיות במנוחה נותח ב-4 נקודות זמן שונות לאחר משיכת הדם שדווח בציר ה-x כך: T0 = מיד לאחר איסוף דם; T1 = שעה אחת לאחר איסוף דם; T2 = שעתיים לאחר איסוף דם; T3 = 3 שעות לאחר איסוף הדם. הנתונים מדווחים כממוצע ± SD, n = 3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת של TF המאוחסן תוך-תאי. אוכלוסיית הטסיות (אדום) בדם מלא מזוהה בגרף הנקודה FSC/SSC-A (A,D) ועל ידי צביעת αCD61 mAb (B,E). ביטוי TF מנותח באמצעות PE-αCD142/HTF1 mAb (נקודות ירוקות). גרפים היסטוגרמיים משמשים לזיהוי אירועים שליליים (C) וחיוביים (F). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת של טסיות TF חיוביות הקשורות למשטח. דם מלא טרי מסומן ב-αCD142/HTF1 mAb, לאחר מכן מתוקן ב-1% PFA ומסומן ב-mAb המשני וב-αCD41 mAb. אוכלוסיית הטסיות (אדום) בדם מלא מזוהה בגרף הנקודה FSC/SSC-A (A,D,G) ועל ידי צביעת αCD41 mAb (B,E,H). ביטוי TF במצב מנוחה (D-F) ואחרי גירוי ADP (G-I) מכומת על ידי סימון עם αCD142/HTF1 mAb (נקודות ירוקות). מדווחים גרפים היסטוגרמים מייצגים של דגימות שליליות (C) וחיוביות (F,I). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: השפעת כוחות הצנטריפוגה השונים על הכנת PRP. (A-C) ניתוח ציטומטריית זרימה של אוכלוסיית טסיות דם מלא, PRP שהוכן ב-100 x גרם וב-350 x גרם. טווח הייחוס של אוכלוסיית הטסיות ב-FSC-H/SSC-H מסומן בקווים מקווקוים. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: הערכת ביטוי TF בטסיות ולוקוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה בהדמיה. מוצגות תמונות תעלות מייצגות של ברייטפילד (BF, אפור), Tissue Factor (TF, ירוק), αCD61 (אדום), αCD45 (אפור), צביעת גרעינים עם Hoechst (מג'נטה), והתמונה המורכבת (מיזוג), שנרכשה בהגדלה של 60x. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מזהה צינור לדוגמהתיקון/פרם דם מלא (μL)αCD142-PE (μL)αCD61-PerCP (μL)
FMO100-15
TF100515

טבלה 1: פרוטוקול צביעה לניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי TF תוך-תאי.

מזהה צינור לדוגמהתיקון/פרם דם מלא (μL)αCD142-PE (μL)αCD61-PerCP (μL)
נקי100--
αCD142-PE955-
αCD61-PerCP85-15

טבלה 2: בקרת צביעה בודדת למטריצת פיצוי של ביטוי TF תוך-תאי.

מזהה צינור לדוגמהPBS 1x (μL)αCD142 (μL)ADP (μL)דם מלא טרי (μL)PFA 1% (μL)
FMO95--5300
מנוחה87.57.5-5300
ADP מופעל82.57.555300

טבלה 3: פרוטוקול צביעה לניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי TF על פני השטח.

מזהה צינור לדוגמהPBS 1x (μL)אלקסה פלואר 633 IgG (μL)αCD41-PE (μL)
FMO9055
מנוחה9055
ADP מופעל9055

טבלה 4: פרוטוקול צביעת נוגדנים משני לניתוח TF הקשור למשטח.

מזהה צינור לדוגמהPBS 1x (μL)αCD142 (μL)ADP (μL)דם מלא טרי (μL)PFA 1% (μL)
נקי90-55300
TF + Alexa Fluor 633 IgG82.57.555300
αCD41-PE90-55300

טבלה 5: הכנת מטריצת פיצוי לניתוח TF תוך-תאי.

מזהה צינור לדוגמהPBS 1x (μL)אלקסה פלואר 633 IgG (μL)αCD41-PE (μL)
נקי100--
TF + Alexa Fluor 633 IgG955-
αCD41-PE95-5

טבלה 6: הכנת מטריצת פיצוי לניתוח TF הקשור למשטח.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדווח על פרוטוקולים מפורטים להערכת טסיות חיוביות ל-TF באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלאה, תוך התחשבות בניתוח החלבון המובע הן בתוך והן על פני השטח של הטסיות.

במהלך 20 השנים האחרונות, נוכחות TF בטסיות האדם, 1,2,3,4,5,17,18 הייתה מבוססת היטב. תת-קבוצה של טסיות, המהווות 20%-30%מסך אוכלוסיית הטסיות 2, מבטאת את החלבון, ומחזקת את רעיון ההטרוגניות של הטסיות שהופך לרלוונטי יותר ויותר בתחום19,20. ראוי לציין שלטסיות החיוביות ל-TF יש נפח טסיות ממוצע גבוה, כפי שהודגם קודם על ידי ציטומטריית זרימת הדמיהרגישה מאוד 2. חשוב מאוד לשקול תכונה זו, במיוחד כאשר יש לנתח ביטוי TF בטסיות המבודדות מרכיבי תאי דם אחרים. ייתכן ששלב הצנטריפוגה המשמש לבידוד טסיות עלול לגרום לאובדן טסיות גדולות2. סוגיה טרום-אנליטית זו היא כנראה אחד הגורמים המרכזיים למחלוקת - שנמשכה עד לפני כמה שנים - סביב נוכחות TF בטסיות 7,12,13. ציטומטריית זרימת דם מלאה היא גישה שימושית מאוד בהקשר זה, ומאפשרת ניתוח של כל תת-הקבוצות של הטסיות ללא צורך בבידדם.

סיבה שנייה שעוררה את הדיון על נוכחות TF בטסיות הייתה בחירת נוגדן TF אנטי-אנושי ששימש לניתוח. ישנם נוגדנים רבים זמינים מסחרית ששימשו להערכת TF הקשורים לטסיות דם ומזהים אפיטופים שונים של החלבון. חלק מהנוגדנים, כמו TF9-10H10 3,21,22 והשיבוטים VIC7 1,3, נקשרים לאזור לא פונקציונלי של TF מבלי להשפיע על קישור FVII/FVIIa. נוגדנים אחרים, כולל VD8 1,2,3 ושיבוטיHTF1 18 – האחרון המשמש בפרוטוקולים הנוכחיים – מזהים את האתר הקטליטי של החלבון, ומתחרים עם FVII/FVIIa על הקשירה ל-TF, וכך חוסמים את תפקוד הפרוקאגולנט שלו. חשוב לציין כי, בהתאם למצב הגליקוזילציה של הדומיין החוץ-תאי ולקונפורמציית האתר הקטליטי של TF23, שניתן לשנות בתנאים מסוימים (כגון הפעלת תאים או מחלה), חלק מהנוגדנים הללו עשויים לזהות באופן שונה, באמצעות ציטומטריית זרימה, את הביטוי השטחי של TF הקשור לטסיות. יתרה מזאת, גם תנאי הצביעה, כלומר האם הדגימה לניתוח טרייה, קבועה ו/או חדירה, עלולים להשפיע על קונפורמציית האפיטופה, ולכן גם על קישור אנטיגן-נוגדנים14.

שיקול נוסף שראוי לתשומת לב הוא בחירת הפלואורוכמות הקשורה לנוגדן. מכיוון ש-TF מבוטא רק על ידי 20%-30% מאוכלוסיית הטסיות, פלואורוכרומים בעלי פליטה נמוכה, יחד עם שימוש בציטומטרים של זרימה ברגישות נמוכה, עשויים שלא להתאים להבחנה בין אותות חיוביים נמוכים. מסיבה זו, נוגדנים המסומנים בפלואורוכרומים בהירים, כגון PE או APC, מועדפים. חשוב לציין, עם זאת, שגודלו הגדול של פלואורוכמות כמו PE עלול להפריע לקשירת הנוגדן המסומן לחלבון24. כדי להתגבר על בעיה זו, בפרוטוקול הנוכחי, צביעת TF על פני השטח בוצעה כסימון עקיף עם αCD142/HTF1 mAb לא מצומד, ולאחר מכן נחשף באמצעות נוגדן משני. המכשול ה-PE-סטרי אינו משפיע על קישור αCD142/HTF1 mAb ל-TF המאוחסן תוך-תאית, שם האתר הקטליטי נגיש יותר לקשירת נוגדנים. ברור כי הערכת ביטוי פני השטח של TF הקשור לטסיות באמצעות תיוג ישיר, לעומת תיוג עקיף, תהיה עדיפה - אם אפשר - כדי לקצר את זמן עיבוד הדגימה. עם זאת, גישה זו חייבת לקחת בחשבון את הנושאים הקריטיים שהוזכרו לעיל והקשורות ליכולת הקישור של מספר נוגדנים מסחריים ל-TF בטסיות, בשל קונפורמציית החלבון עצמו, או תנאי הצביעה, וכן המכשול הסטרי של הפלואורוכרומים השונים בהם נעשה שימוש. לכן, כדי להימנע מתוצאות שליליות שגויות, תיוג ישיר של TF הקשורים לטסיות מבטאות על פני שטח דורש תהליך אופטימיזציה מחייב וזהיר. היבטים אלו הם נושא למחקר מתמשך שמטרתו להעריך את יעילות הצביעה הישירה עם שיבוטי נוגדנים מסחריים שונים המסומנים בפלואורוכרומים בשימוש מלא.

מספר מחקרים הראו כי הביטוי של TF מוגבר במצבים פתולוגיים שונים, המאופיין בסיכון גבוה לקרישה 8,9,10,11,17. לאחרונה הוצגו ראיות לכך שרמות הטסיות החיוביות ל-TF, שנמדדות במדויק באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה, יכולות לזהות חולים קרדיווסקולריים אשר, למרות תגובה אופטימלית לטיפול תרופתי עם אספירין ואנטגוניסטים P2Y12, שומרים על סיכון גבוה לקרישה25. אכן, TF הקשור לטסיות פעיל פונקציונלית ולכן עשוי לתמוך בדור הטרומבינים 1,3,4. בהקשר זה, היכולת לבצע ניתוח ציטומטריית זרימה על כמה מיקרוליטרים של דם היא יתרון משמעותי שמאפשר להרחיב את ניתוח TF הקשור לטסיות לסביבה הקלינית. לשם כך, ראוי לציין כי אימות מדידת TF הקשור לטסיות בטסיות באמצעות ציטומטריית זרימה היה מטרת פרויקט בינלאומי שתיאמנו לאחרונה, בתמיכת החברה הבינלאומית להמוסטיסיס וטרומבוזיס, כדי לספק הנחיות מתודולוגיות להערכתה.

בניגוד לסמנים קלאסיים אחרים של הפעלת טסיות, כמו P-selectin ואגרגטים של טסיות-לויקוציטים, שיש לנתח מיד לאחר דגימת דם כדי למנוע ארטיפקטים, ביטוי TF יציב הרבה יותר. למעשה, ניתן לעבד את דגימת הדם תוך מספר שעות לאחר גמילת הדם ללא שינוי משמעותי בביטוי הטסיות-TF; יתרה מזאת, האפשרות לתקן את הדגימה ולסמן/לעבד אותה לאחר מכן הופכת את הניתוח הזה למתאים לבתי חולים/מעבדות רבים. ראוי לציין שלמרות שהפרוטוקול המתואר במאמר זה פשוט יחסית לביצוע, טכניקת ציטומטריית הזרימה עדיין דורשת הכשרה טכנית מיוחדת. מסיבה זו, הטכנולוגיה מתקדמת לפיתוח ציטומטרים פשוטים יותר המיועדים לבדיקות בנקודת טיפול.

לסיכום, הפרוטוקול המוצע מספק שיטות לניתוח נכון של TF הקשור לטסיות, ומדגיש את היתרונות של טכניקת ניתוח ציטומטריית זרימה לקביעתו. בנוסף, הוא מדגיש את המשתנים הפרה-אנליטיים שיכולים להשפיע על ניתוח החלבון הזה, ומדגיש את הצעדים שיש לנקוט כדי להימנע מהם.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענק ממשרד הבריאות האיטלקי (Ricerca Corrente 2023 to M.C.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדנוזין 5'-דיפוספט (ADP)סיגמא-אלדריץ'A-2754  אגוניסט לטסיות
Alexa Fluor 633 עז ועכבר IgGInvitrogenA21052נוגדן משני
ביוטיוב 10 מ"לביוסיגמהBSP048לאיסוף PRP
מחט הפרפר G19פתרון PIC02044019030010לטיפול בגזילת דם
תוכנת CytExpertבקמן קולטרניתוח נתוני ציטומטריית זרימה
ציטופלקס Sבקמן קולטרציטומטר זרימה
צינורות אפנדורף 1.5 מ"לאפנדורף1,20,086  קיבוע דם
ImageStreamX Mk IIסיטק ביוסיינססציטומטר זרימת הדמיה
תוכנת קלוזהבקמן קולטרניתוח נתוני ציטומטריית זרימה 
Paraformaldehyde אנטיביוטיקוס & ndash; Divisione Carlo Erba Reagenti387507לתיקון דם וטסיות דם
PerCP-α CD45BD345809סמן אוכלוסיית לויקוציטים
PerCP-α CD61BD347408סימן רישום טסיות
PE-α CD142BD550312נוגדן נגד פקטור רקמה אנושי
PE-α CD41בקמן קולטרA07781סימן רישום טסיות
מלח בופר פוספט (PBS) פעם אחת ללא סידן ומגנזיוםגיבקו10010-015לנוגדנים ודילול דגימה
טיפים לפיפט 10 ומיקרו; L   גילסון  F161630להכנת דגימות
טיפים של פיפט 1000 ומיקרו; LגילסוןF161670להכנת דגימות
טיפים של פיפט 200 ומיקרו; LגילסוןF161930להכנת דגימות
צינור עגול-תחתית 5 מ"לקורנינג352052לרכישת ציטומטר זרימה
כלוריד נתרן 0.9%BD306575לשטוף את הקנולה עם המחט לאחר גזילת דם
Sysmex XN-450דסיטמנתח תאי דם
טריטון X-100קרלו ארבה ריאג'נטי9002-93-1לחדירה לממברנת תאי הדם
צינורות Vacutainer ציטראט 0.129MBD363079לאיסוף דם
שפופרות Vacutainer K2 EDTABD368857לאיסוף דם
מתאם Luer עם דגימה מרובה VacutainerBD367300  לטיפול בגזילת דם
מחזיק Vacutainer לשימוש חד-פעמיBD364815  לטיפול בגזילת דם
ערכת חרוזי לכידת נוגדנים של Versacompבקמן קולטרB22804טיטרציה של נוגדנים
α CD142 (שיבוט HTF-1)Invitrogen16-1429-82נוגדן נגד פקטור רקמה אנושי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Camera, M., et al. Platelet activation induces cell-surface immunoreactive tissue factor expression, which is modulated differently by antiplatelet drugs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1690-1696 (2003).
  2. Brambilla, M., et al. Do methodological differences account for the current controversy on tissue factor expression in platelets. Platelets. 29 (4), 406-414 (2018).
  3. Zillmann, A., et al. Platelet-associated tissue factor contributes to the collagen-triggered activation of blood coagulation. Biochem Biophys Res Commun. 281 (2), 603-609 (2001).
  4. Camera, M., Brambilla, M., Toschi, V., Tremoli, E. Tissue factor expression on platelets is a dynamic event. Blood. 116 (23), 5076-5077 (2010).
  5. Panes, O., et al. Human platelets synthesize and express functional tissue factor. Blood. 109 (12), 5242-5250 (2007).
  6. Camera, M. Response: functionally active platelets do express tissue factor. Blood. 119 (18), 4339-4341 (2012).
  7. Brambilla, M., et al. Tissue factor in patients with acute coronary syndromes: Expression in platelets, leukocytes, and platelet-leukocyte aggregates. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (5), 947-953 (2008).
  8. Canzano, P., et al. Platelet and endothelial activation as potential mechanisms behind the thrombotic complications of COVID-19 patients. JACC Basic Transl Sci. 6 (3), 202-218 (2021).
  9. Trabattoni, D., et al. Migraine in patients undergoing PFO closure: Characterization of a platelet-associated pathophysiological mechanism: The LEARNER study. JACC Basic Transl Sci. 7 (6), 525-540 (2022).
  10. Falanga, A., Schieppati, F., Russo, D. Cancer tissue procoagulant mechanisms and the hypercoagulable state of patients with cancer. Semin Thromb Hemost. 41 (7), 756-764 (2015).
  11. Tsantes, A. G., et al. Sepsis-induced coagulopathy: An update on pathophysiology, biomarkers, and current guidelines. Life (Basel). 13 (2), 350(2023).
  12. Osterud, B., Olsen, J. O. Human platelets do not express tissue factor. Thromb Res. 132 (1), 112-115 (2013).
  13. Bouchard, B. A., Krudysz-Amblo, J., Butenas, S. Platelet tissue factor is not expressed transiently after platelet activation. Blood. 119 (18), 4338-4339 (2012).
  14. Basavaraj, M. G., Olsen, J. O., Osterud, B., Hansen, J. B. Differential ability of tissue factor antibody clones on detection of tissue factor in blood cells and microparticles. Thromb Res. 130 (3), 538-546 (2012).
  15. Maecker, H. T., Frey, T., Nomura, L. E., Trotter, J. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry A. 62 (2), 169-173 (2004).
  16. Butenas, S., Bouchard, B. A., Brummel-Ziedins, K. E., Parhami-Seren, B., Mann, K. G. Tissue factor activity in whole blood. Blood. 105 (7), 2764-2770 (2005).
  17. Camera, M., et al. Tissue factor and atherosclerosis: Not only vessel wall-derived TF, but also platelet-associated TF. Thromb Res. 129 (3), 279-284 (2012).
  18. Siddiqui, F. A., Desai, H., Amirkhosravi, A., Amaya, M., Francis, J. L. The presence and release of tissue factor from human platelets. Platelets. 13 (4), 247-253 (2002).
  19. Munnix, I. C., Cosemans, J. M., Auger, J. M., Heemskerk, J. W. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb Haemost. 102 (6), 1149-1156 (2009).
  20. Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: Different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  21. Brambilla, M., et al. Human megakaryocytes confer tissue factor to a subset of shed platelets to stimulate thrombin generation. Thromb Haemost. 114 (3), 579-592 (2015).
  22. Vignoli, A., et al. Tissue factor expression on platelet surface during preparation and storage of platelet concentrates. Transfus Med Hemother. 40 (2), 126-132 (2013).
  23. Rao, L. V., Kothari, H., Pendurthi, U. R. Tissue factor encryption and decryption: facts and controversies. Thromb Res. 129 (Suppl 2), S13-S17 (2012).
  24. Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
  25. Brambilla, M., et al. Cell surface platelet tissue factor expression: Regulation by P2Y(12) and Link to residual platelet reactivity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (10), 2042-2057 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets
Posted by JoVE Editors on 4/09/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67356-v

תגיות

מאמרים קשורים