מאמר שיטה

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67360

⸱

4 באוקטובר 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול להעברת ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA בזחלי בומביקס מורי תולעי משי כדי לגרום להשתקת גנים באמצעות בליעה.

תקציר

תולעת המשי, Bombyx mori, היא חרק כלכלי חשוב עם אלפי שנות היסטוריה בסין. בינתיים, תולעת המשי היא חרק מודל של Lepidoptera עם הצטברות טובה של מחקר בסיסי. זהו גם החרק הראשון בלפידופטרה, שהגנום המלא שלו רוצף והורכב, מה שמספק בסיס מוצק למחקר תפקודי גנים. אף על פי שהתערבות RNA (RNAi) נמצאת בשימוש נרחב במחקר פונקציונלי של גנים הפוכים, היא עמידה בתולעי משי ובמינים אחרים של לפידופטרנים. מחקר מוצלח קודם הקשור ל-RNAi להעברת RNA דו-גדילי (dsRNA) בוצע באמצעות הזרקה בלבד. אספקת dsRNA באמצעות הזנה לעולם אינה מדווחת. במאמר זה, אנו מתארים הליכים שלב אחר שלב להכנת חלקיקי chitosan/dsRNA, אשר מוזנים לזחלי תולעי המשי על ידי בליעה. הפרוטוקול כולל (i) בחירת השלב הנכון של זחלי תולעי משי, (ii) סינתזה של dsRNA, (iii) הכנת ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA, ו-(iv) הזנת זחלי תולעי המשי בננו-חלקיקים chitosan/dsRNA. מוצגות תוצאות מייצגות, כולל אישור שעתוק גנים ותצפית פנוטיפית. הזנת dsRNA היא טכניקה פשוטה עבור RNAi בזחלי תולעי משי. מכיוון שזחלי תולעי משי קלים לגידול וגדולים מספיק לתפעול, הוא מספק מודל טוב להדגמת RNAi זחל בחרקים. בנוסף, הפשטות של טכניקה זו מעוררת מעורבות רבה יותר של התלמידים במחקר, מה שהופך את זחלי תולעי המשי למערכת גנטית אידיאלית לשימוש במסגרת כיתתית.

מבוא

תולעת המשי, Bombyx mori, היא חרק מבוית לפני יותר מ -5000 שנה בסין. בשל יכולתה לייצר משי, תולעת המשי היא חרק כלכלי חשוב בחקלאות ובחקלאות הסינית. תולעת המשי שנייה רק לזבוב הפירות כחרק המודל. כחרק מודל בלפידופטרה, תולעת המשי קלה לגידול, עם גודל גוף גדול והרבה מוטנטים. בינתיים, תולעת המשי היא החרק הלפידופטרני הראשון שהגנום המלא שלו מרוצף1. מאגרי מידע רבים המספקים מידע עבור גנום2, שעתוק3, תג רצף מבוטא (EST)4,RNA 5 שאינו מקודד ומיקרו-לוויין6 זמינים גם הם לציבור. העובדות הנ"ל הופכות את תולעת המשי למודל מושלם למחקר גנטי.

RNA interference (RNAi) הוא תהליך תאי שבו מולקולות RNA דו-גדילי (dsRNA) נקשרות ופורסות את הרנ"א השליח המשלים (mRNA), ובכך משיגות את אפקט ההשתקה של גן המטרה. מנגנון זה קיים באופן טבעי בחיידקים כדי להגן מפני פלישת וירוסים7. מאוחר יותר נמצא כי RNAi נשמר בבעלי חיים, צמחים ומיקרובים. בשל אפקט ההשתקה הספציפי לרצף החזק שלו, RNAi משמש במחקר בסיסי כדי לתפעל ביטוי גנים ולחקור תפקוד גנים. RNAi מושג באמצעות העברת dsRNA לתוך תאים.

בחרקים, ישנן שלוש דרכים נפוצות להעביר dsRNA, שהן מיקרו-הזרקה, האכלה והשריה8. כרגע, דיווחי RNAi מוצלחים בתולעי המשי באמצעות משלוח dsRNA עירום מתבצעים על ידי הזרקת dsRNA9. היתרונות של מיקרו-הזרקה הם העברה מיידית של dsRNA לתוך ההמולימפה ובקרת כמות dsRNA מדויקת. עם זאת, קיימים גם חסרונות מסוימים של מיקרו-הזרקה. לדוגמה, זה זמן רב, וזה דורש מכשירים עדינים. חשוב גם לייעל את מחטי ההזרקה, נפח ההזרקה וכמות ה-dsRNA. לכן, יש צורך בדרך חלופית להעביר dsRNA לתולעי משי. מכיוון שהשלד החיצוני של חרק הוא מחסום אטום למים העשוי מכיטין, כמעט ולא מדווחים על השריית זחלי חרקים להשגת RNAi, וזו אינה אפשרות טובה עבור RNAi בחרקים. הזנת dsRNA חוסכת עבודה, חסכונית וקלה לביצוע10. שיטה זו ישימה גם לבדיקת גנים בתפוקה גבוהה11. עם זאת, נמצא כי נוקלאז לא ספציפי של DNA/RNA, כלומר BmdsRNase, נמצא במיץ אמצע המעי ואמצע המעיים של זחלי תולעי המשי12. נוקלאז זה מוצג לעיכול dsRNA, רצוי13. לכן, הזנת dsRNA עירום לתולעת המשי כדי להשתיק את ביטוי הגן נראית קשה.

לאחרונה, dsRNA מוגן ננו-חלקיקים הוכח כחלופה טובה להגברת יעילות ה-RNAi על ידי הזנת14. צ'יטוזן הוא פולימר זול, לא רעיל ומתכלה, שניתן להכין על ידי דה-אצטילציה של כיטין, ביופולימר טבעי והשני בשכיחותו אחרי תאית15. מכיוון שקבוצת האמינו בצ'יטוזן טעונה חיובית וקבוצת הפוספט בעמוד השדרה של ה-dsRNA טעונה שלילית, ננו-חלקיקי הכיטוסן/dsRNA יכולים להיווצר על ידי הרכבה עצמית של פוליקטונים16. ננו-חלקיקי Chitosan/dsRNA יעילים בהשגת RNAi באמצעות הזנת זחלים ביתושים Aedes aegypti ו-Anopheles gambiae17, תולעת כותנה מנומרת Earias vittella18 וקרדית עכביש קרמין Tetranychus cinnabarinus19.

על מנת לפתח מתודולוגיה להעברת dsRNA על ידי הזנה בתולעי משי כדי להשיג יעילות RNAi מוצלחת, דוח זה מתמקד בתיאור הליכים שלב אחר שלב כיצד להכין את חלקיקי הצ'יטוזן/dsRNA ולהזין את הננו-חלקיקים לזחלי תולעי המשי. מתודולוגיה זו זולה יחסית, חוסכת עבודה וקלה לביצוע, וניתן להתאים אותה למחקרי השתקת גנים בחרקים אחרים. אנו שואפים לספק פרוטוקול קל יותר עבור שיטת העברת dsRNA Lepidopteran עם יעילות RNAi גבוהה יותר.

פרוטוקול

1. מיני תולעי משי וגידול

  1. מאחור לפחות 120 זחלי תולעי משי1st st בקעו טריים מזן B. mori P50 עם עלי תות טריים ב 25 ± 1 °C, photoperiod 12 שעות אור: 12 שעות כהה, ו 75% ± 5% לחות יחסית.

2. בחירת זחלי תולעי משי

  1. בחרו את היום הראשון מתוך זחלי הכוכבהחמישי לניסוי ה-RNAi; זחלי תולעי המשי גדלים מהר לאחר היום השלישי של הכוכבהחמישי , שהוא אידיאלי להשוואת ההבדלים במראה הזחל.
    הערה: לחלופין, שלבים צעירים יותר, כגון הכוכבהשלישי אוהרביעי , יכולים לשמש לניסוי RNAi. עם זאת, הוא דורש טיפול קבוע ב- dsRNA עד הכוכבהחמישי , שהוא יקר יחסית ועולה חומר.

3. סינתזה של dsRNA

  1. זיהוי מקטע יעד dsRNA: בחר את רצף הקידוד של גן מטרה ויישר אותו עם גנים הומולוגיים אחרים כדי לקבוע את האזור השמור. תכננו פריימרים ספציפיים לגן באזור הלא שמור עבור הגברה עוקבת של מקטע המטרה dsRNA. עבור ניסויי RNAi בחרקים, מקטע המטרה הטיפוסי של dsRNA הוא בדרך כלל 400-600 bp. הגודל המינימלי יכול להיות 200 bp.
    הערה: כדי לשפר את היעילות ואת הקצב המוצלח של ניסויי RNAi, ניתן להשתמש בכלי מבוסס אינטרנט כלשהו כדי לתכנן את יעד dsRNA, כגון dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
  2. הפקת תבנית מוצר PCR: הוסף מקדם T7 RNA פולימראז (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') לקצה 5' של כל פריימר שתוכנן לעיל. בצע PCR סטנדרטי כדי להגביר את מקטע היעד dsRNA. הפעל ג'ל אגרוז 1% ב- 1x TAE כדי לאמת מוצר PCR יחיד בגודל הצפוי. לאחר מכן, לטהר את מוצר PCR עם ערכת טיהור (טבלה של חומרים) ולהשתמש בו לתמלול הבא.
    הערה: כדי לאחסן את מוצר היעד PCR לטווח ארוך ולקבל תשואות גבוהות, מומלץ לקשור את מוצר ה- PCR לפלסמיד. פלסמיד צריך להיות ליניארי לפני תגובת PCR.
  3. יצירת dsRNA: השתמש במערכת T7 RNAi (רשימת חומרים) כדי ליצור את dsRNA. הגדר את התגובה על ידי הוספת הרכיבים בטמפרטורת החדר בהתאם להוראות היצרן. מערבבים את התגובה על ידי פיפטינג עדין ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
    הערה: כדי למקסם את התפוקה, הדגירה ב 37 ° C ניתן להאריך עד 2-6 שעות. עבור תבניות המכילות מבנה משני או עשיר ב-GC, ניתן לבצע דגירה ב-42°C במקום זאת כדי לשפר את התפוקה של dsRNA.
  4. חישול ליצירת dsRNA: יש לדגור על התגובה בטמפרטורה של 70°C למשך 10 דקות, ואז לקרר לאט לטמפרטורת החדר (~20 דקות). זה יבטל את ה-dsRNA.
  5. טיפול DNase ו- RNase: פיפטה 1 μL של תמיסת RNase שסופקה ל 199 μL של מים ללא nuclease כדי ליצור תמיסת RNase מדוללת טרייה. הוסף 1 μL של תמיסת RNase מדוללת טרייה ו- 1 μL של DNase ללא RQ1 RNase המסופק לכל נפח תגובה של 20 μL, ערבב בעדינות ודגר ב- 37 ° C למשך 30 דקות. הרנ"א החד-גדילי (ssRNA) והדנ"א התבנית בתגובה יוסרו לאחר טיפול זה.
  6. משקעים אלכוהוליים: הוסף נפח אחד של איזופרופנול או 2.5 כרכים של 95% אתנול יחד עם נפח 0.1 של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) לתגובה. מערבבים את התגובה על ידי מערבולות ודגרים על קרח במשך 5 דקות ליצירת מסה מעוננת. מסתובבים במהירות מרבית בצנטריפוגה במשך 10 דקות כדי לאסוף גלולה לבנה בתחתית הצינור. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה עם 0.5 מ"ל אתנול קר 70% כדי להסיר את שאריות המלח. מוציאים את האתנול לאחר הכביסה. הניחו לגלולה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. השהה מחדש את הגלולה עם מים נטולי נוקלאז פי 2-5 מנפח התגובה הראשונית. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C או -70°C.
    הערה: כדורי dsRNA לא צריכים להיות מיובשים יתר על המידה, שכן זה יכול להקשות על השעיה מלאה. כדי להבטיח השעיה מספקת, יש צורך במינימום של 2 כרכים.
  7. בדיקת כמות ואיכות של dsRNA: לדלל את ה-dsRNA במים נטולי נוקלאז ביחס של 1:100 עד 1:300. לקבוע את ריכוז dsRNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח (טבלה של חומרים) בהתאם להוראות היצרן. כדי לכמת dsRNA, הכפילו את הריכוז בנפח. כדי להעריך את איכות dsRNA, השתמש אלקטרופורזה ג'ל agarose. הכינו ג'ל אגרוז 1% ב-1x TAE ודללו את ה-dsRNA בשעה 1:50 במים נטולי נוקלאז. יש להשתמש ב-5 μL של dsRNA מדולל לכל נתיב ולהכתים את הג'ל ב-0.5 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד למשך 15 דקות לפחות לצורך הדמיה.
    הערה: dsRNA נודד לאט יותר מאשר dsDNA.

4. הכנת ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA

  1. הפוך 100 mM נתרן אצטט (0.1 M NaC2H3O2 ו 0.1 M חומצה אצטית, pH 4.5 במים deionized) ו 100 mM נתרן סולפט (100 mM Na2SO4 במים deionized) חיץ בטמפרטורת החדר.
  2. להמיס צ'יטוזן ממוסחר (מקליפות שרימפס, ≥75% deacetylated; טבלת חומרים) ב 100 mM נתרן אצטט מאגר כדי להפוך 0.02% (w / v) chitosan פתרון.
  3. להמיס 20 מיקרוגרם של dsRNA ב 50 μL של מים נטולי nuclease ולהוסיף אותו 50 μL של 100 mM נתרן סולפט חיץ כדי ליצור 100 μL dsRNA פתרון.
  4. הוסף 100 μL של תמיסת chitosan ל 100 μL של תמיסת dsRNA. במקביל, להכין בקרה על ידי הוספת 100 μL של תמיסת chitosan ל 100 μL של 50 mM נתרן גופרתי. מערבבים ומחממים את התערובות ב-55°C למשך דקה אחת.
  5. מערבלים את התערובת מיד עם מערבולת במהירות גבוהה במשך 30 שניות כדי לאפשר היווצרות של ננו-חלקיקים.
  6. צנטריפוגה את התערובת ב 13,000 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לקבל גלולה לבנה. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי בנפח 1.5 מ"ל. תנו לגלולה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  7. לקבוע את ריכוז dsRNA בסופרנאטנט באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח (טבלה של חומרים). השתמש ב- supernatant מהפקד כ- blank. הכפל את הריכוז בנפח כדי לחשב את הכמות הכוללת של dsRNA שנותרה בסופרנטנט. חשב את אחוז ה-dsRNA העטוף בננו-חלקיקים בכמות שנותרה בסופרנאטנט חלקי הכמות ההתחלתית של dsRNA.
    הערה: למרות שניתן לשמור את הננו-חלקיקים במשך 4-37 מעלות צלזיוס לפחות 15 יום לפני השימוש14, מומלץ להשתמש בננו-חלקיקים בהקדם האפשרי.

5. הזנת זחלי תולעי המשי בננו-חלקיקים chitosan/dsRNA

  1. בחרו זחלי תולעי משימותכים טריים (כלומר, יום 1 של הכוכבהחמישי ) באותו גודל לניסוי ההאכלה. מניחים את הזחלים בנפרד לתוך כל באר של צלחת 6 בארות לפני סגירת הכיסוי ורעב במשך 24 שעות.
  2. שטפו עלי תות טריים במים נטולי יונים, וייבשו אותם בנייר מטבח נקי. עלי התות צריכים להיות יבשים ללא טיפות מים. חותכים לדיסקיות עלי תות בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ.
  3. יש להמיס ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA במים נטולי נוקלאז ב-500 ננוגרם/μL לפני השימוש. לדלל את חלקיקי chitosan הבקרה (מוכן ב 4.4) עם אותו נפח של מים נטולי nuclease. הכינו dsRNA עירומים ל-500 ננוגרם/מיקרוליטר במים נטולי נוקלאז.
  4. השתמש בננו-חלקיקי chitosan/dsRNA לניסוי הפלה של RNAi, ננו-חלקיקי צ'יטוזן הבקרה כבקרה ריקה/שלילית. השתמש ב- dsRNA העירום כדי להשוות את ההבדלים עם חלקיקי chitosan/dsRNA.
  5. ציפוי 10 μL של חלקיקי chitosan/dsRNA, chitosan, ו- dsRNA עירום על פני השטח של כל דיסקת עלה, בהתאמה. יבשו באוויר את תמיסת הננו-חלקיקים ותמיסת dsRNA על דיסקיות העלה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  6. האכילו כל זחל בדיסק עלים אחד מצופה ננו-חלקיקים או dsRNA ליום. ספק דיסקיות עלים מצופות ננו-חלקיקים או dsRNA לזחלים ברציפות במשך 5 ימים. ניתן לספק עלי תות טריים לאחר שדיסקית העלים המצופה נאכלת במלואה על ידי הזחלים בכל יום.
  7. ביום 6, מרדימים את הזחלים על קרח עד שהם לא זזים ומנתחים את הזחלים לדגימה. חותכים את בית החזה עם מספריים על צלחת פטרי נקייה. שלפו את הבטן האמצעית עם טוויטר. מוציאים את התוכן במרכז המעי ושוטפים את המעי בצלחת פטרי אחרת מלאה במים נטולי נוקלאז. יש לאחסן את המעי התיכון בצינור של 1.5 מ"ל ולשמור בטמפרטורה של -70°C.

6. אישור השתקת גנים

  1. בצע PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) כדי לחשב את כימות התמליל היחסי. נדרשים לפחות שלושה משכפלים ביולוגיים ושלושה שכפולים טכניים לכל שכפול ביולוגי. מומלץ לפחות שני גני ייחוס כדי לנרמל את התעתיק היחסי. הגן Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) נבדק. להעריך את יעילות השתקת הגן על ידי השוואת הערך הממוצע של התמליל היחסי לקבוצת הביקורת ולהמיר אותו לאחוזים.
    הערה: ניתן למצוא את תנאי הגברה qRT-PCR, מידע פריימר וחישוב תמלול יחסי בפרסום האחרון שלנו20.
  2. לנתח את הפנוטיפ RNAi כדי להעריך את אפקט השתקת הגנים. שימו לב לגודל הזחלים והפקעות. צלם תמונות מדי יום כדי להקליט הופעות.
    הערה: RNAi יכול להשפיע על מורפולוגיה, מטמורפוזה, פיזיולוגיה והתנהגות. התצפית של פנוטיפים הקשורים ל-RNAi תלויה בגנים הממוקדים.

תוצאות

כדי להעריך את יעילות ה-RNAi, נבחר לניתוח גן חיסוני המכוון ל-BmToll9-2 . הגן BmToll9-2 מאופיין היטב במעבדה, והשתקת גנים על ידי הזרקת dsRNA גורמת לזחלים קלים וקטנים יותר בפרסום האחרון שלנו20. כדי לאשר את יעילות ה-RNAi על ידי בליעה באמצעות ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA, ננו-חלקיקי צ'יטוזן שימשו כבקרה, ו-dsRNA עירום הושווה באותו הזמן.

בהשוואה לקבוצת הביקורת, ננו-חלקיקי צ'יטוזן ללא dsRNA, dsRNA עירום המכוון לגן BmToll9-2 אינו מראה אפקט השתקה. הזנה של ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA בתולעי המשי מעכבת באופן משמעותי את התעתיק עם הפלה של 79% (איור 1). עיכוב התמליל היחסי מצביע על כך שהגן BmToll9-2 הושתק בהצלחה באמצעות בליעת chitosan/dsRNA.

הפלת הגן BmToll9-2 משפיעה באופן משמעותי על צמיחת טוואי המשי. כשמתבוננים בזחלים, הזחלים המושתקים BmToll9-2 קטנים יותר מזחלי הביקורת (איור 2A). כאשר משווים בין הפקעות, הפקעות המושתקות BmToll9-2 גם קטנות יותר (איור 2B). ננו-חלקיקי Chitosan/dsRNA מראים השפעות RNAi מוצלחות הן בתעתיק והן בפנוטיפ בתולעת המשי.

figure-results-1
איור 1: תעתיק יחסי של BmToll9-2 לאחר בליעת ננו-חלקיקים מסוג chitosan/dsBmToll9-2 בזחלי B. mori 5th instar. רמות ה-mRNA היחסיות של BmToll9-2 בזחלים הניזונים מננו-חלקיקי צ'יטוזן כביקורת, dsRNA עירום, וננו-חלקיקים chitosan/dsRNA. הנתונים הוצגו כאמצעים ± סטיית תקן של שלוש שכפולים ביולוגיים. עבור כל שכפול ביולוגי, היו שלושה שכפולים טכניים. אותיות שונות על הסורגים מצביעות על הבדלים משמעותיים בהתבסס על ניתוח ANOVA חד-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תצפית פנוטיפ לאחר הזנה בננו-חלקיקים chitosan/dsBmToll9-2. ננו-חלקיקי צ'יטוזן משמשים כבקרה. (A) הופעתם של זחלי תולעי משי לאחר בליעה של ננו-חלקיקים. (B) הופעתם של פקעות תולעי משי לאחר בליעה של ננו-חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

שלב נכון חשוב לתצפית פנוטיפ RNAi, בהתאם לגנים הממוקדים. התוצאות הראשוניות שלנו הראו כי Toll9-2 מעורב בגידול של תולעת המשי. גודלם ומשקלם של זחלי תולעי המשי גדלים במהירות בכוכבהחמישי 21. לכן, זחלי הכוכבה-5 נבחרים כשלב לניסוי הזנת ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA. ניתן גם לבחור את זחלי הכוכבה-3 אוה-4 לניסויי האכלה ולצפות בהבדלים ההתפתחותיים בכוכבה-5 . עם זאת, ניסויי הזנת ננו-חלקיקים דורשים הזנה רציפה מדי יום14. האכלת הזחלים בשלב צעיר יותר דורשת הכנה רבה יותר של dsRNA, שהיא יחסית יקרה יותר. מהסיבות לעיל, אנו מציעים לבחור את זחלי תולעי המשי המותכים הטריים של הכוכבהחמישי כנקודת ההתחלה של ניסוי הזנת הננו-חלקיקים.

אופטימיזציה של פרמטרי הזנת ננו-חלקיקים חשובה גם היא. הזנה קבועה של ננו-חלקיקים במשך 5-7 ימים להשגת RNAi יעיל נפוצה במחקרים הנוכחיים 14,18,22,23. מכיוון ש-dsRNA הוא המרכיב היקר ביותר בניסויי RNAi, ננו-חלקיקים יכולים להיות מוזנים לזחלים פעם ביומיים, מה שעשוי לעזור להפחית מחצית מעלות הכנת dsRNA. דרך נוספת לקצץ בעלות היא לייעל את כמות dsRNA המשמש להאכלה. בפרוטוקול זה, 5 מיקרוגרם של ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA משמשים עבור כל זחל, שהוא המינון האוניברסלי להזרקת dsRNA במעבדה. בהתחשב בכך ש-5 מיקרוגרם של dsRNA הוא מינון גבוה ועיכוב על ידי הזנת ננו-חלקיקים הוא משמעותי. הוא הציע להפחית את כמות dsRNA בניסוי. עם זאת, ההשפעה של שני הפרמטרים לעיל על יעילות RNAi צריכה להיות מוערכת בניסויים עתידיים.

היחס בין chitosan ו- dsRNA יכול להיות אופטימלי. בפרוטוקול זה, 20 מיקרוגרם של chitosan ב 100 μL של נתרן אצטט מעורבב עם 20 מיקרוגרם של dsRNA ב 100 μL של נתרן גופרתי. בדו"ח הראשון של ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA, 20 מיקרוגרם של chitosan ב-100 μL של נתרן אצטט מעורבב עם 32 מיקרוגרם של dsRNA ב-100 μL של נתרן גופרתי16. בכמה דיווחים אחרים, 1 מיקרוגרם של chitosan ב 100 μL של נתרן אצטט מעורבב עם 1 מיקרוגרם של dsRNA ב 100 μL של נתרן גופרתי18,23. לכן, כמות הצ'יטוזן וה-dsRNA יכולה להיות אופטימלית כדי להשיג את יעילות ההעמסה הטובה ביותר של ננו-חלקיקים ואת אפקט השתקת ה-RNAi האופטימלי.

יש לקחת בחשבון את האחסון של ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA. ננו-חלקיקי chitosan/dsRNA מוכנים לפני ניסוי ההזנה, ומוצע להשתמש בהם באופן מיידי. דו"ח שנערך לאחרונה הראה כי חלקיקי chitosan/dsRNA אוחסנו ב 4 ° C, 24 ° C ו 37 ° C במשך 15 ימים ועדיין היו יציבים19. לפיכך, חלקיקי chitosan/dsRNA יכולים להיות מוכנים מראש ומאוחסנים ב 4 ° C במקרר מאז dsRNA יציב יותר בטמפרטורות נמוכות.

מלבד dsRNA, כמה RNA קטן, כגון RNA מפריע קטן (siRNA) ו RNA סיכת שיער קצרה (shRNA), יכול לשמש להכנת ננו-חלקיקים לניסויים RNAi. לדוגמה, ננו-חלקיקי siRNA משפרים את עמידות הצמח למזרקי Pseudomonas24. העברת חלקיקי shRNA גרמה לאפקט RNAi מוצלח בחיידק הסירחון החום הניאוטרופי Euschistus heros25. לכן, ננו-חלקיקים יכולים להיות מיושמים על כל מולקולות RNA המשמשות בניסוי RNAi.

יעילות ה-RNAi בלפידופטרה, כולל תולעי משי, מדווחת כעקשנית26. משלוח של dsRNA הוא רק באמצעות הזרקה בתולעי משי, אשר גוזל זמן ועולה עבודה. בשיטת העברת ננו-חלקיקים זו של chitosan/dsRNA, נצפתה השפעה השתקה משמעותית בתעתיק או בפנוטיפ בזחלי תולעי המשי ובפקעות, המתאפשרת הודות לפירוק מופחת של dsRNA על ידי ההגנה של chitosan19. שיטה זו חוסכת עבודה וקלה לביצוע, אותה ניתן להתאים לחרקים אחרים. הקלות של פרוטוקול זה יכולה להיות מיושמת לא רק במחקר מדעי, אלא גם בהוראה בכיתה, הדגמה ותרגול. שיטת העברת הננו-חלקיקים היא כיוון חדש להדברה ביולוגית והדברה עתידית27.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31501898), תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגזו (202102010465), פרויקט איכות ההוראה והרפורמה בהוראה בהשכלה הגבוהה בגואנגזו (2022JXGG057), ופרויקט המחקר של ועדת ההיגוי של הקורס המקוון הפתוח של אוניברסיטאות מחוז גואנגדונג (2022ZXKC381).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לF601620 סנגוןלתגובת dsRNA או ננו-חלקיקים
10 μ l פיפטהאפנדורףP13473Gלשאוב או להשעות נוזל
100 μ l פיפטהאפנדורףQ12115Gלשאוב או להשעות נוזל
2.5 μ l פיפטהאפנדורףP20777Gלשאוב או להשעות נוזל
20 μ l פיפטהEppendorfH19229Eלשאוב או להשעות נוזל
200 μ l פיפטהאפנדורףH20588Eלשאיבה או השעיה מחדש של נוזל
6 בארות שקופות TC שטופלו צלחות מרובותCostar3516לגידול תולעי משי בנפרד
חומצה אצטיתאלאדיןA116165להכנת TAE
Agarose MBBI Life SciencesA610013לאלקטרופוזיס ג'ל אגרוז
איזון אנליטיSartoriusBSA224Sלמשקל מרכיבים
צנטריפוגה SartoriusCentrisart A-14Cלצנטריפוגה ליצירת dsRNA או ננו-חלקיקים
ChitosanSigma-AldrichC3646לשילוב עם dsRNA להכנת ננו-חלקיקים
EDTASangonA500895להכנת TAE
אתנולאלאדיןE130059לייצור TAE, או למשקעי dsRNA
מקפיאסימנסiQ300לאחסון dsRNA או ננו-חלקיקים
GoTaq Green Master MixPromegaM712לתגובת PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002לתגובת qRT-PCR
איזופרופנול I112011 אלאדיןלמשקעי dsRNA
NanoDrop מיקרונפח UV-Vis ספקטרופוטומטרThermoFisherOneלקביעת ריכוז מד ה-pH dsRNA
Sartorius  PB-10להכנת מאגרים
SanPrep טור PCR ערכת טיהור מוצרסנגוןB518141לטיהור מוצר PCR
נתרן אצטטSigma-AldrichS2889להכנת 100 מ"מ מאגר נתרן אצטט
נתרן סולפט סיגמא-אולדריץ'239313לייצר 100 מ"מ נתרן גופרתי מאגר
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700לסינתזת dsRNA
ThermoMixerEppendorfCלייצור dsRNA או חימום ננו-חלקיקים
TrisSangonA501492לייצור TAE
Vortex IKAVortex 3להכנת ננו-חלקיקי צ'יטוזן/dsRNA

מקורות

  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370(2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225(2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316(2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523(2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161(2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021(2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467(2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677(2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446(2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

dsRNARNAiRNALepidoptera

מאמרים קשורים